Výživa kvasinek během fermentace moštů révy vinné

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta Výživa kvasinek během fermentace moštů révy vinné Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Mojmír Baroň, Ph.D. Vypracovala: Michaela Lasotová Lednice 2014

2

3 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto práci: Výživa kvasinek během fermentace moštů révy vinné vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace jsou uvedeny v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů, a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 Autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity o tom, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Lednici dne: podpis

4 Poděkování Velmi ráda bych na tomto místě poděkovala Ing. Mojmírovi Baroňovi, Ph.D. za pomoc a cenné rady, které mi ulehčily vypracování této bakalářské práce.

5 Abstrakt Výživa kvasinek patří mezi nejdůležitější procesy při výrobě vína. Obsah asimilovatelného dusíku úzce souvisí i s váznoucí fermentací, která je v poslední době hodně diskutovaným tématem. Bakalářská práce se zabývá právě vlivem výživy kvasinek na průběh fermentace a nejběžnějšími důvody vedoucí k fermentaci váznoucí. Součástí práce je i úvodní kapitola zaměřená na význam výživy révy vinné dusíkem přímo ve vinohradě, vývoj dusíkatých látek v hroznech a jejich formu. Podstatou práce bylo zaměřit se na formy dusíku vyskytující se v moštech, jejich využití kvasinkami a samotné asimilační mechanismy dusíku, stejně tak i popsat váznoucí fermentaci a doporučit technologické postupy pro praxi. Klíčová slova: kvasinky, výživa, dusík, váznoucí fermentace Abstract The nutrition of the yeasts is one of the most important parts of wine production. The concentration of assimilable nitrogen is closely related with stuck fermentation, which is really discussed topic nowadays. Bachelor s thesis is focused on the influence of nutrition of the yeasts on progress of fermentation and on the most common reasons which leads to stuck fermentations. The part of the thesis is also an introductory chapter oriented on meaning of nutrition of grapevine straight in vineyard, the evolution of nitrogen compounds in grapes and its form. The essence of this thesis was to focus on the forms of nitrogen occurred in grape musts, its utilization by yeasts and assimilative mechanisms of nitrogen, as well as to describe a stuck fermentation and recommend a technological advance for a practice. Key words: yeasts, nutrition, nitrogen, stuck fermentation

6 Obsah 1. ÚVOD 9 2. CÍL DUSÍK A RÉVA VINNÁ Význam dusíku pro révu vinnou Nedostatek dusíku v půdě Nadbytek dusíku v půdě Příjem dusíku Hnojení dusíkem Interakce dusíku s jinými živinami Vývoj dusíkatých látek v hroznech Celkový dusík Minerální forma dusíku Různé formy organického dusíku DUSÍK ASIMILOVATELNÝ KVASINKAMI Aminokyseliny v moštu Amonné ionty v moštu Využití asimilovatelného dusíku kvasinkami ASIMILAČNÍ MECHANISMY DUSÍKU Syntéza aminokyselin Katabolismus aminokyselin Další produkty zpracování dusíku kvasinkami Vyšší alkoholy a estery Sirnaté sloučeniny Těkavé kyseliny VLIV ASIMILOVATELNÉHO DUSÍKU NA PRŮBĚH FERMENTACE Cyklus růstu kvasinek a průběh fermentace Požadavky na výživu dusíkem Vliv provzdušnění a přídavku výživy na průběh fermentace

7 7 VÁZNOUCÍ FERMENTACE Příčiny váznoucí fermentace Vysoká koncentrace cukru Extrémní teploty Nedostatek výživy Aerobní podmínky Doporučení pro praxi ZÁVĚR 48 9 SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM GRAFŮ SEZNAM TABULEK 51 LITERATURA 52 8

8 1. ÚVOD Réva vinná patří mezi historicky známé kulturní rostliny, tolik oblíbené pro víno, které je možno z ní vyrobit. Zásah člověka je v tomto směru neodmyslitelnou součástí. Moderní vinohradnictví a vinařství přináší stále nové technologie využitelné při výrobě vína, a spolu s nimi i metody stanovení nejdůležitějších parametrů jak moštů, tak i vína. Kvalita původní suroviny má největší vliv na kvalitu výsledného produktu. Je známo, že pro výrobu vína té nejlepší jakosti je důležité sledovat hlavní parametry moštu před i během fermentace a zajistit kvasinkám dostatek výživy pro přeměnu cukrů na alkohol, oxid uhličitý a další vedlejší produkty alkoholového kvašení. Kvasinky pro svůj život potřebují hlavně sacharidy, vitamíny, minerální látky, kyslík a dusík. Dusíkaté látky obsažené v bobulích jsou velmi důležité pro rozmnožování a činnost kvasinek. Listová plocha je ve vztahu k dusíkatým látkám velmi důležitá. List je významným zdrojem dusíku, a proto je kvalitní listová plocha keře důležitá pro optimální obsah asimilovatelného dusíku. Obsah asimilovatelného dusíku můžeme také ovlivnit vhodným zatravněním vinice. Jako nejvhodnější se jeví zatravnit vinici pomocí rostlin z čeledi bobovitých (Fabaceae), protože jsou schopny poutat vzdušný dusík. Nejdůležitější úlohu ve výživě kvasinek během fermentace moštů révy vinné hraje právě asimilovatelný dusík. Nedostatek asimilovatelného dusíku vede nejčastěji ke zpomalení nebo úplnému zastavení fermentace a tvorbě nežádoucích sloučenin kvasinkami. Zmíněné komplikace nejčastěji nastávají v případě nesprávného ph a teploty moštu a nedostatku výživy, důležité pro správnou činnost kvasinek. V takovýchto případech je nutné nedostatek kompenzovat přídavkem komerčně dostupných kombinovaných výživ pro kvasinky. 9

9 2. CÍL Cílem bakalářské práce je prostřednictvím dostupné literatury prostudovat danou problematiku výživy kvasinek během fermentace moštů révy vinné, popsat dusíkaté látky vyskytující se v hroznech, rozdělit složky asimilovatelného dusíku na jednotlivé skupiny látek a věnovat se jejich využití kvasinkami. Důležitou součástí této práce je i popis mechanismů asimilace a analytických možností. Na základě těchto informací pak zpracovat informace týkající se váznoucí fermentace, prostudovat možnosti její eliminace a doporučit technologické postupy pro prevenci váznoucí fermentace v praxi. Metodika této práce je rozdělena na více částí. První část je zaměřena na vinohradnickou oblast a její vliv na obsah dusíku a vývoj dusíkatých látek v révě vinné. Další část je směřována k obsahu asimilovatelného dusíku v moštech, k jeho jednotlivým složkám a způsobům využití asimilovatelného dusíku kvasinkami. V neposlední řadě se práce zabývá i vztahem obsahu asimilovatelného dusíku k průběhu fermentace a popisu váznoucí fermentace, včetně prevence. 10

10 3. DUSÍK A RÉVA VINNÁ 3.1. Význam dusíku pro révu vinnou Dusík se zúčastňuje jako stavební látka tvorby mnoha sloučenin v rostlinném organismu. Urychluje růst révy a působí příznivě i na plodnost, pokud je jeho obsah ve vyrovnaném poměru k ostatním živinám. Je důležitou součástí nukleových kyselin a stavební součástí chlorofylu, aminokyselin a bílkovin. Réva vinná je schopna přijímat dusík v různých formách. V hnojivech se nejčastěji vyskytuje ve formě amoniakální neboli čpavkové NH + 4, kterou je réva schopna více přijímat na zásadité půdě. Pro tvorbu proteinů se však musí v pletivech tato forma navázat na glycidy, jelikož i malá přemíra amoniakální formy dusíku je pro buňku toxická. Dusík se vyskytuje i v dusitanové, dusičnanové formě NO 2 - nebo NO 3 -. V této formě se dusík ukládá v buňkách a nijak jim neškodí. Pro tvorbu proteinů se však musí redukovat na formu NH + 4. V neposlední řadě se v hnojivech může dusík vyskytnout jako močovina NH - 2, kterou rostlina není schopna přijímat přímo (Kraus, Hubáček et al. 2010) Nedostatek dusíku v půdě Nedostatek dusíku se na rostlině projeví světlým zelenožlutým zbarvením listových čepelí, červeným zbarvením os letorostů, které jsou slabé a jejich vrcholky vzpřímené. Listové čepele jsou malé, stejně tak i hrozny. Růst révy je zpomalený, listy mají nízký sklon k asimilaci a proto je i cukernatost hroznů nízká (Baroň 2009) Nadbytek dusíku v půdě Nadbytek dusíku se na rostlině projeví hlavně zjemněním rostlinných pletiv. Proto je rostlina více náchylná k napadení houbovými chorobami a zvyšuje se riziko poškození révy suchem či mrazem. Vyzrávání dřeva se narušuje, zvyšuje se náklonnost ke sprchávání a projevuje se vadnutí třapiny spolu s hnitím bobulí. 11

11 Příjem dusíku Příjem dusíku révou vinnou je závislý jak na velikosti úrody, tak na velikosti keřů a rozdílu mezi podnoží a naštěpovanou odrůdou. Dusík réva přijímá a nutně potřebuje před rašením a během začátku růstu letorostů, dále po odkvětu při nasazování a růstu bobulí a v menší míře také při zaměkání bobulí. WUNDERER aj. (2003) uvádějí následující průběh příjmu dusíku révou: V době vegetačního klidu réva nepřijímá žádný dusík. V období od rašení do kvetení (konec dubna až polovina června) mobilizuje živiny z vlastních zásob (dřevo a kořeny) a pokrývá tím nízkou potřebu dusíku v tomto období. Příjem živin kořenovým systémem začíná teprve koncem května. Nadměrná nabídka dusíku před tímto obdobím tudíž nemá významný vliv na růst a vývoj révového keře. Po kvetení nastává v období 2-3 týdnů rozsáhlé ukládaní dusíku, který je potom potřebný v červenci k růstu bobulí. Potřeba dusíku vstoupá ještě jednou v období při jejich dozrávání. V průběhu fenofáze dozrávání bobulí až do opadu listů se ukládá dusík v bobulích a také se tvoří zásobní látky v révovém keři (Pavloušek 2011) Hnojení dusíkem Z pohledu výživy je třeba základní dávku dusíku dodávat révě vinné výhradně půdou, ať již jako kapalné nebo pevné minerální hnojivo. Listová výživa se používá pouze v případě výrazné deficience dusíku nebo za dlouhého období sucha, kdy je dusík z půdy velmi obtížně přijatelný. Nadměrná listová výživa však může zvyšovat náchylnost révy k houbovým chorobám a snižovat kvalitu hroznů. V mladé výsadbě se téměř vynechává hnojení dusíkem až do doby, kdy je zapěstován pěstitelský tvar, aby se zabránilo tvorbě velmi silných letorostů, které jsou pro vybudování kmínku nevhodné. Aplikace dusíkatých hnojiv se nedoporučuje v pozdním létě a na podzim, neboť podporují révu ve vegetativním růstu v době, kdy by měla upadat do dormance (Kurtural, Strang et al.) Interakce dusíku s jinými živinami Ve výživě rostlin se neuplatňují všechny ionty stejně. Nevhodné ph nebo nevhodné iontové složení půdního roztoku může způsobit např. hromadné vysrážení iontů. Ionty v půdním roztoku se mohou při příjmu živin vzájemně ovlivňovat. Dusík podporuje 12

12 příjem fosforu, pokud se ovšem přidává v mírných dávkách. V opačném případě dusík brzdí příjem fosforu. Vysoká hladina draslíku v révě podporuje příjem dusíku. Je-li obsah draslíku v půdě nízký, pak jeho příjem opožďují vyšší dávky dusíkatých hnojiv. Pokud hnojíme vyšší dávkou síranu draselného K 2 SO 4, pak je vhodnější použít ke hnojení dusík v amonné formě. Amonná forma dusíku je antagonistou k hořčíku, který se těžko přijímá v písčitých půdách, tudíž je vhodné na těchto půdách hnojit hlavně ledkovým dusíkem. Při výrazném nadbytku dusíku může dojít k poklesu obsahu bóru. Na vápenitých půdách je vhodné hnojit síranem amonným (NH 4 ) 2 SO 4, jelikož se při jeho použití spotřebovává vápník. Dusičnan vápenatý (ledek vápenatý) Ca(NO 3 ) 2 se používá především na kyselých a suchých půdách (Kraus, Hubáček et al. 2010) Vývoj dusíkatých látek v hroznech V hroznech se vyskytují různé skupiny dusíkatých látek. Nejvýznamnější zastoupení asimilovatelného dusíku se nachází v dužnině (60 65 %), následované slupkou (20 30 %) a semeny (10 15 %). Některé jednoduché dusíkaté látky mohou kvasinky a bakterie velmi lehce využívat pro svoji výživu. Mezi hlavní sloučeniny, které jsou součástí asimilovatelného dusíku, patří amonné ionty a volné aminokyseliny. Volnými aminokyselinami rozumíme takové aminokyseliny, které mohou kvasinky využívat pro svoji potřebu. Nejvýznamnější aminokyselinou je arginin, avšak dominantní aminokyselinou je prolin, který ale kvasinky nedokážou v anaerobních podmínkách kvašení pro svoji potřebu využívat. Nitráty se často neobjevují, protože bývají rychle redukovány v kořenovém a listovém systému. Pokud jsou hrozny nevyzrálé, je více než polovinou zastoupen amonný iont. Množství asimilovatelného dusíku v hroznech je vždy nižší u hroznů z lehčích a méně humózních půd (Baroň, Bábíková et al. 2010). Během zrání hroznů se postupně snižuje podíl amonných iontů ve prospěch volných aminokyselin. Ve zralém moštu mohou aminokyseliny dosahovat obsahu až 90 % (dominantní aminokyselinou je arginin). Obsah dusíku v hroznech nemá žádný vliv na koncentraci cukrů ani na titrovatelné kyseliny v hroznech (Bell and Henschke 2005). Minerální dusík v amonné formě je během růstu bobulí nejvíc zastoupenou formou dusíku v dužnině bobulí. Dusík v amonné formě představuje zhruba 80 % celkového 13

13 dusíku vznikajícího přeměnou dusíkatých látek asimilovatelných kořeny. V době, kdy jsou hrozny zcela zralé, je obsah minerálního dusíku méně než 10 %. Z organické formy dusíku se kromě aminokyselin v hroznech vyskytují i jiné sloučeniny. Například polypeptidy vznikající spojením různým počtem aminokyselin pomocí peptidické vazby nebo proteiny, které vznikají spojením velkým množstvím aminokyselin. Amidy, do kterých řadíme i močovinu nebo toxický etylkarbamát, také patří mezi dusíkaté sloučeniny vyskytující se jak v hroznech, tak v moštech Celkový dusík Obsah celkového dusíku v moštech zahrnuje jednu formu anorganickou a více forem dusíku organického. Množství celkového dusíku (vyjádřené v g.l -1 dusíku) v hroznovém moštu slouží jako ukazatel, jak se liší vyzrálost hroznů v závislosti na ročníku. Jednotlivé moštové odrůdy a region jejich produkce mají také vliv na koncentraci dusíkatých látek v moštu. Například v oblasti Champagne je obsah dusíku v bílých moštových odrůdách až třikrát vyšší než u bílých odrůd z oblasti Bordeaux. Červená vína mají průměrnou koncentraci dusíku téměř třikrát větší než vína bílá, a to díky technologii výroby kdy dochází k maceraci při vyšší teplotě a tím k uvolnění dusíkatých látek ze slupek i semen, stejně tak i z autolýzy odumřelých kvasinek (Ribereau-Gayon, Glories et al. 2006) Minerální forma dusíku Minerální dusík ve formě amonných solí je v hroznech nejvíce zastoupen v buňkách dužniny během vegetativní fáze růstu. Amonný dusík reprezentuje 80 % veškerého dusíku v hroznech, který vznikl z nitrátů získaných z půdy pomocí kořenů révy. Amonná forma dusíku stále převládá i v době barevné změny bobulí. Koncentrace těchto solí rychle klesá s počátkem transaminačních reakcí, kdy jsou produkovány složitější formy organického dusíku. V letech bylo analyzováno celkem 48 moštu pocházejících z hroznů z jižní Moravy. Průměrný obsah amonných iontů byl 124,4 mg.l -1 bez přídavku nutričních přídavků, což znamená, že moravské mošty většinou nemají problém s iniciací a kinetikou fermentace (Baron 2011). 14

14 Obsah minerálního dusíku představovaného především amonnou formou se postupně s dozráváním hroznů snižuje a v okamžiku sběru je jeho obsah pouhých 5 10 % Různé formy organického dusíku Existuje mnoho forem organického dusíku, z nichž nejdůležitější jsou popsány v následující části. Aminokyseliny Aminokyseliny jsou základními stavebními jednotkami bílkovin. Z chemického hlediska se jedná o substituční deriváty karboxylových kyselin, které obsahují ve svých molekulách alespoň jednu aminoskupinu. S výjimkou prolinu, obsahujícího sekundární aminoskupinu, se jedná o α aminokyseliny, protože mají karboxylovou i primární aminoskupinu na tomtéž uhlíkovém atomu. Podle obecného vzorce: má molekula aminokyseliny dvě charakteristické skupiny vázané na jednom atomu uhlíku, karboxylovou skupinu COOH, mající kyselé vlastnosti, a aminovou skupinu NH2, která je nositelem zásaditých vlastností. Ve vodném prostředí buňky jsou aminokyseliny převážně obsaženy ve formě obojetného iontu: a proto mohou aminokyseliny reagovat se zásadami jako kyseliny a s kyselinami jako zásady (Voet and Voet 1995). Kromě dvou charakteristických skupin a atomu vodíku má každá aminokyselina ještě různě velký organický zbytek R, kterým se jednotlivé aminokyseliny vzájemně odlišují. Organický zbytek může být uhlovodíkový, mající hydrofobní vlastnosti, může 15

15 však obsahovat i kyselé či zásadité skupiny nebo heterocyklický kruh. Tyto postranní řetězce udílí aminokyselinám různé vlastnosti, které se promítají do vlastností bílkovin. Aminokyseliny se rozdělují podle několika hledisek. Mezi nejpoužívanější patří rozdělení podle polarity jejich postranních řetězců: a. aminokyseliny s nepolárním postranním řetězcem mají ve svém postranním řetězci pouze uhlík a vodík, obecně nejsou reaktivní. Patří mezi ně glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, metionin, prolin, fenylalanin a tryptofan. b. aminokyseliny s polárním nenabitým postranním řetězcem mají v postranním řetězci kyslík, síru nebo dusík a proto jsou polární. Snadno interagují s vodou a jsou v ní velmi dobře rozpustné. Do této skupiny patří serin, asparagin, glutamin, treonin, tyrosin a cystein. c. aminokyseliny s polárním nabitým postranním řetězcem se dále dělí na zásadité a kyselé. Mezi zásadité aminokyseliny, které jsou za fyziologického ph kladně nabité, patří lysin, arginin a histidin. Kyselé aminokyseliny, asparagová a glutamová, jsou při ph vyšším než 3,0 nabity negativně a v tomto stavu jsou známy jako aspartát a glutamát. Z hlediska biologie je důležité jejich rozdělení na aminokyseliny esenciální a neesenciální, podle toho jak je daný organismus schopen tyto aminokyseliny syntetizovat. Živočichové musí používat k výrobě aminokyselin dusík organicky vázaný v aminokyselinách uvolněných hydrolýzou bílkovin z potravy nebo vlastních tkání. Řadu aminokyselin nedokážou vůbec syntetizovat a musí je získávat potravou nebo štěpením tkání. Říkáme jim esenciální (nepostradatelné) aminokyseliny, ostatním pak neesenciální nebo relativně postradatelné. Pro člověka jsou esenciální aminokyseliny valin, leucin a izoleucin, aromatické aminokyseliny fenylalanin a tryptofan, dále treonin, metionin a tyrosin. Histidin a arginin jsou postradatelné jen v dospělosti, v dětském věku jsou také esenciální. Další dvě aminokyseliny, tyrosin a cystein, jsou podmíněně postradatelné pouze při dostatku esenciálních aminokyselin, z nichž se tvoří. Tyrosin vzniká z fenylalaninu a cystein syntézou z metioninu (Voet and Voet 1995). 16

16 Oligopeptidy a polypeptidy Oligopeptidy a polypeptidy jsou sloučeniny, které vznikají spojením určitého množství aminokyselin pomocí peptidické vazby. Peptidická vazba, která spojuje molekuly aminokyselin v bílkovinách, se vytváří kondenzací skupiny OH z karboxylu jedné aminokyseliny a atomu H z aminoskupiny druhé molekuly aminokyseliny za současného odštěpení molekuly vody: Podle počtu aminokyselinových zbytků (jinak řečeno peptidových jednotek) rozeznáváme obecně oligopeptidy, které mají do 10 těchto zbytků, a polypeptidy, které obsahují 11 až 100 aminokyselinových zbytků. Délka polypeptidů se může pohybovat v rozmezí od 40 až do aminokyselinových zbytků. Peptidy vykazují senzorické vlastnosti, které mohou ovlivnit organoleptické vlastnosti vína. Mohou sloužit jako živiny pro kvasinky a bakterie, které mají peptidázovou činnost. Peptidové složení vína záleží na zpracovávané odrůdě a technologii výroby vína. Proteázy, které kvasinky vylučují, mohou vést k obsahu různých peptidů ve víně (různé složení aminokyseliny nebo sekvence). Ve víně se mohou objevit peptidy také díky hydrolýze proteinů kvasinek, jejichž složení aminokyselin se může mezi kvasinkami lehce odlišovat. Nejdůležitějším peptidem v moštu je glutation (Moreno-Arribas, Bartolome et al. 1998). Mléčné bakterie jsou známy tím, že obsahují aminopeptidázy, díky kterým jsou schopny asimilovat některé peptidy, konkrétně tripeptidy. Tyto sloučeniny mají vlastnosti, které ovlivňují chuť vína, ale více se tímto tématem žádná studie nezabývala. Proteiny Proteiny jsou biomakromolekulární látky, vzniklé spojením více aminokyselin. Tyto makromolekuly s molekulární hmotností vyšší než g.mol -1 se skládají 17

17 z přesně definovaných řetězců nebo sekvencí aminokyselin spojených peptidickou vazbou. Sekvence aminokyselin v polypeptidovém řetězci stanovuje bílkovinám trojrozměrnou strukturu tj. jejich prostorové uspořádání. Červená vína jen stěží obsahují volné proteiny, protože jsou vysráženy pomocí taninů, na druhé straně, bílá a rosé vína mohou mít různou koncentraci bílkovin až do několika set mg.l -1, převážně pocházejících z hroznů. Bílkoviny v moštu jsou velmi dobře známy jako příčiny nestability a ovlivňují čistotu bílých vín. Když se vysráží, způsobují tzv. bílkovinný zákal (Steidl 2010). Amidy Amidy karboxylových kyselin jsou organické sloučeniny, které vznikají náhradou skupiny OH karboxylové skupiny za amidovou skupinu NH 2. Amidy mají obecný vzorec: a řadí se mezi funkční deriváty karboxylových kyselin. Také tvoří meziprodukty při různých organických syntézách, např. jejich dehydratací vznikají velmi jedovaté nitrily. Mezi tyto sloučeniny řadíme i diamid kyseliny uhličité, močovinu: která může být považována i za amid kyseliny karbamové. Pokud močovina reaguje s amoniakem, vzniká organická molekula imidu zvaná guanidin. Močovina může být hydrolyzována na kyselinu uhličitou a amoniak, čehož se ve velké míře využívá v zemědělství (Ribereau-Gayon, Glories et al. 2006). 18

18 Obsah močoviny ve víně je méně než 1 mg.l -1 a to jistě mikrobiálního původu. V oboru vinařství je tato látka známá jako prekurzor etylkarbamátu. Etylkarbamát: je etylester kyseliny karbamové. Ve vinařství, a celkově v kvasném průmyslu, je tento ester znám pro své karcinogenní účinky. Obsah etylkarbamátu se zjišťuje pomocí plynové chromatografie. BERTRAND aj. (1991) dospěli k závěru, že koncentrace etylkarbamátu ve víně je spojená s odrůdou i nadměrným hnojením dusíku ve vinicích. Tyto faktory však nejsou velmi významné. Tito autoři také poznamenali, že některé technologie výroby vína jako je vyšší teplota při maceraci bez odstranění třapin hroznů, mohou vést ke zvýšení obsahu této karcinogenní látky (Bertrand and Barros 1988). 19

19 4. DUSÍK ASIMILOVATELNÝ KVASINKAMI Dusík je jedním z nejvíce zastoupených prvků ve vesmíru. Atmosféra Země zahrnuje téměř 80 % dusíku v molekulární formě. Přítomnost tohoto nenavázaného a elementárního prvku ukazuje, že má velmi nízkou reaktivitu. Příkladem ve vinařství může být použití dusíkové atmosféry jako ochrany vína v částečně prázdných sudech a tancích. Živočišné a rostlinné buňky nemohou asimilovat molekulární dusík, proto jej musí dostávat v minerální nebo organické formě. Dusík asimilovatelný samotnými kvasinkami najdeme v moštech ve dvou formách, jako amonné ionty a volné kyseliny. Právě tyto dvě formy slouží kvasinkám Saccharomyces cerevisiae jako hlavní zdroje dusíku. Obsah dusíkatých látek v moštu také ovlivňuje kinetiku fermentace moštu. Optimální obsah těchto složek pro bezproblémový průběh fermentace se pohybuje kolem 200 mg.l -1 moštu. Dusík má silný dopad na klíčové biologické mechanismy při kvašení moštů, ale také na syntézu látek, určujících aromatický profil vína (David, Dochain et al. 2014). Problém s nízkým obsahem asimilovatelného dusíku se častěji vyskytuje u moštů z bílých odrůd révy vinné. Při výrobě červených vín se používá technologie, zvaná macerace, při které může dojít k uvolnění dusíkatých látek ze všech částí bobule. Proto mošty z modrých odrůd trpí nedostatkem dusíkatých látek méně často. Na obsah asimilovatelného dusíku (dále YAN, z anglického výrazu yeast assimilable nitrogen ) má vliv také způsob zpracování hroznů Aminokyseliny v moštu V moštu a víně bylo zjištěno 23 různých aminokyselin (viz Tabulka 1 a 2), což představuje zhruba % celkového dusíku, v závislosti na tom, zda se jedná o mošt z bílých nebo modrých moštových odrůd. Obsah aminokyselin se zvyšuje v průběhu zrání hroznů a může dosáhnout až 90 % obsahu celkového dusíku u moštů ze stolních odrůd hroznů. Při sklizni tvoří aminokyseliny téměř 70 % organického dusíku v hroznech, dále pak 3 % tvoří proteiny a 2 % polypeptidy. Celková koncentrace aminokyselin se pohybuje od 1 do 4 g.l -1 v závislosti na ročníku (Ribereau-Gayon, Glories et al. 2006). 20

20 Volné aminokyseliny v moštu jsou nesmírně důležité nejen pro kvasinky při alkoholové fermentaci, ale i pro bakterie při malolaktické fermentaci a mohou být zdrojem aromatickým sloučenin. Podle Herraize a Ougha v některých případech mohou aminokyseliny produkovat nežádoucí látky ve víně, jako je etylkarbamát nebo biogenní aminy (Herraiz and Ough 1993). Zpravidla dochází k dominanci některých aminokyselinv moštech, nejčastěji α alaninu, serinu, argininu, prolinu, glutamové kyseliny a stejně tak i její amidové formy glutaminu. Arginin a prolin jsou charakteristické pro určité odrůdy. Například prolin je dominantní v odrůdách Chardonnay, Cabernet Sauvignon a Merlot. Na druhé straně arginin převládá u odrůd jako je Pinot Noir a Aligoté. Na rozdíl od prolinu, arginin je jednoduše asimilován kvasinkami i mléčnými bakteriemi (Baroň 2010). Koncentrace volných aminokyselin se více než zdvojnásobí od zaměkání po úplnou vyzrálost hroznů. Tento jev se objevuje každý rok, ale nemělo by tímto docházet k ukvapenému závěru, že zkvasitelnost moštu se zvyšuje společně s vyzráváním hroznů. Ve skutečnosti je potřeba udělat podrobnější analýzu jednotlivých aminokyselin, zejména argininu a prolinu, jelikož jejich koncentrace během zrání značně kolísají. Například obsah prolinu je nejvyšší v termínu dvou týdnů před sklizní. V letech, kdy jsou hrozny velmi vyzrálé, je vhodné mošt sledovat a počítat s možností přídavku fosfátu nebo sulfátu diamonného. A to především u odrůd révy vinné s vysokým obsahem prolinu, jako je Chardonnay, kde koncentrace prolinu velmi narůstá dva týdny před sběrem, přičemž koncentrace argininu je přibližně stejná (van Heeswijck, Stines et al. 2001) Amonné ionty v moštu Amonné ionty představují pro kvasinky nejsnadněji využitelný zdroj výživy. Jejich koncentrace v moštu výrazně ovlivňuje začátek fermentace. Je proto důležité testovat mošt na přítomnost amonných iontů před začátkem fermentace. Tato forma dusíku většinou zmizí ještě před koncem samotné fermentace. Pokud je obsah dusíkatých složek v moštu nižší než 50 mg.l -1, je vhodné přidat 10 g.hl -1 fosfátu nebo sulfátu diamonného pro zajištění snadného rozkvašení moštu. Systematické přidávání amonných solí bez předběžné analýzy moštu a zjištění obsahu dusíkatých látek se silně nedoporučuje. Může tak snadno dojít k tvorbě vína s nízkou 21

21 koncentrací vonných látek, zvláště pak vyšších alkoholů, esterů a etylacetátů mastných kyselin. Obsah amonných iontů v moštu by neměl přesahovat množství potřebné ke stavbě buněčných stěn kvasinek a tvorbě proteinů, protože vyšší obsah amonných iontů způsobuje vznik nežádoucích látek, jako jsou těkavé kyseliny apod. (Steidl 2010). Během stárnutí a zrání vína kvasnicích, nebo i po malolaktické fermentaci, se může ve víně objevit několik desítek mg.l -1 anorganické formy dusíku. Bakterie zajišťující průběh jablečno-mléčné fermentace amonné ionty samy neasimilují, ale mohou je případně vytvářet Využití asimilovatelného dusíku kvasinkami Amonné ionty kvasinky jednoduše asimilují a uspokojují tak své potřeby obzvlášť při syntéze aminokyselin, avšak aminokyseliny dokáží kvasinky více stimulovat. Polypeptidy a bílkoviny se nezapojují do růstu kvasinek rodu S. cerevisiae, protože je nejsou schopny hydrolyzovat. Kombinace amonných iontů a aminokyselin se proto jeví jako nejvhodnější. Kapacita kvasinek využít dusík obsažený v moštu přímo koreluje s fermentací a tempem růstu kvasinek ve všech fázích fermentace (Gutierrez, Beltran et al. 2013). Kvasinky jsou schopny využívat aminokyseliny třemi různými mechanismy: a. přímou integrací bez transformace na bílkoviny b. ziskem aminoskupiny, která je použita na syntézu jiných látek obsahujících tuto skupinu. Zbylý uhlíkový skelet je vyloučen. Jednou z cest je tvorba vyšších alkoholů ve víně: R-CHNH 2 -COOH + H 2 O R-CH 2 OH + CO 2 + NH 3 c. molekula aminokyseliny je využita jako zdroj uhlíku v metabolických reakcích, kvasinky současně získávají amoniakální dusík. Asimilace různých aminokyselin závisí na fungování transportních systémů a regulaci metabolických systémů. Asimilace aminokyselin ne vždy znamená zlepšení růstu kvasinek. Nejsnáze asimilovatelné aminokyseliny nemusí být nutně ty nejvýznamnější v buněčném složení, ale mohou být nejsnáze transformovatelné kvasinkami. 22

22 Tab. 1 Aminokyseliny v moštu révy vinné 23

23 Tab. 2 Aminokyseliny v moštu révy vinné pokračování 24

24 5. ASIMILAČNÍ MECHANISMY DUSÍKU Pronikání amonných iontů a aminokyselin do těl kvasinek uvede do pohybu množství membránových proteinových přenašečů nebo permeas. Kvasinky rodu Saccharomyces cerevisiae mají minimálně dva specifické přenašeče amonných iontů. Jejich aktivita ale bývá inhibována určitými aminokyselinami. Transport aminokyselin zajišťují dvě rozdílné skupiny přenašečů: Obecná permeasa (GAP, z anglického výrazu general amino acid permease ) přepravuje veškeré aminokyseliny. Amonný iont inhibuje a potlačuje aktivitu GAP. Proto se GAP objevuje a aktivně funguje během druhé poloviny fermentace, kdy už mošt neobsahuje amonné ionty. Prakticky tak GAP dojídá zbylé aminokyseliny (Magasanik and Kaiser 2002). Kvasinky S. cerevisiae mají také mnoho specifických permeas (nejméně 11). Každá z těchto permeas přenáší jednu nebo více aminokyselin. Na rozdíl od GAP nejsou tyto specifické permeasy limitovány aktivitou amonných iontů v moštu. Od začátku lag fáze v první fázi alkoholové fermentace zajišťují tyto permeasy rychlou asimilaci aminokyselin v moštu (Schreve and Garrett 2004). Mezi aminokyseliny, které jsou rychle asimilovány, nepatří jen glutamát a glutamin, křižovatky syntézy aminokyselin, ale většina aminokyselin je z moštu prakticky vyčerpána během vykvašení prvních 30 g cukru. Alanin a arginin jsou dvě hlavní aminokyseliny nacházející se v moštu (Schreve, Sin et al. 1998). I přesto využívají kvasinky tyto aminokyseliny a amonný iont až po vyčerpání veškerých ostatních aminokyselin. Mimoto, kvasinky asimilují podstatné množství argininu až po úplném vyčerpání všech amonných iontů z moštu. Někdy kvasinky nespotřebují ani kyselinu γ-aminomáselnou. Ve většině případů nespotřebují ani aminokyselinu prolin, která patří mezí hlavní aminokyseliny obsažené v moštu. Během fermentace spotřebují kvasinky 1 2 g-l -1 aminokyselin. Ke konci fermentace vylučují samotné kvasinky významné, ale různé množství aminokyselin. Na konci alkoholového kvašení zůstává několik set miligramů aminokyselin na litr, kdy více jak polovinu tvoří prolin. Na rozdíl od hexos, které vnikají do těl kvasinek zjednodušenou difuzí, amonné ionty a aminokyseliny vyžadují aktivní transport. Jejich koncentrace v buňkách 25

25 kvasinek je obecně vyšší než v okolním médiu. Permeasa zajišťuje transport molekul aminokyseliny (amonných iontů) s transportem protonů. Vodíkový ion se pohybuje ve směru koncentračního gradientu, koncentrace protonů v moštu je vyšší než v cytoplasmě. Aminokyseliny a protony jsou sloučeny do stejného transportního proteinu a stěnou buňky procházejí současně. Je zřejmé, že proton musí být následně vyloučen, aby nedocházelo k okyselování cytoplasmy. Tento proces je však pohybem proti koncentračnímu gradientu a je k němu tedy potřeba určitá energie. Jako protonová pumpa funguje ATP-asa, která zajišťuje vylučování vodíkových iontů přes plasmatickou membránu. Etanol silně omezuje transport aminokyselin a to mění složení a vlastností fosfolipidů v plasmatické membráně. Membrána se tak stává více permeabilní. H + ionty masivně pronikají do cytoplasmy pomocí jednoduché difuze. ATP-asa v membráně tak musí zvýšit svou aktivitu a vyrovnávat hodnotu vnitrobuněčného ph. Jakmile nastane tato situace, je transport aminokyselin zastaven. Jinými slovy, na začátku fermentace a do doby, kdy je obsah etanolu nízký, mohou kvasinky rychle asimilovat aminokyseliny a koncentrovat je do vakuol pro pozdější využití v závislosti na jejich potřebách biosyntézy (Baroň 2009) Syntéza aminokyselin Amonné ionty a aminokyseliny zásobují kvasinky dusíkem. Kvasinky také mohou syntetizovat většinu aminokyselin nezbytných pro stavbu proteinů. Fixují tak amonný iont na uhlíkatý skelet získaný z metabolismu cukrů. Využívají tedy stejný postup reakcí jako všechny organismy. V tomto procesu hrají důležitou roli glutamát a glutamin (Amaya, Kocherginskaya et al. 2005). NADP + glutamát dehydrogenáza (NADP + GDH), produkt genu GDH1, produkuje glutamát z amonného iontu a molekuly kyseliny α-ketoglutarové, která je meziproduktem cyklu kyseliny citrónové. Také kvasinky mají svou NAD + glutamát dehydrogenázu (NAD + GDH), která je produktem genu GDH2. Tato dehydrogenáza je aktivní při oxidativním katabolismu glutamátu. Doprovází také inverzní reakci osvobozující amonný iont, použitý při syntéze glutaminu (Ribaereau-Gayon, Dubourdieu et al. 2006). 26

26 Obr. 1 Syntéza glutaminu Aktivita NADP + GDH je nejvyšší, pokud mají kvasinky ve svém médiu výhradně amonný iont jako zdroj dusíku. Činnost NAD + GDH je na maximu v případě, kdy je v médiu hlavním zdrojem dusíku glutamát. Glutamin syntéza (GS) vytváří glutamin z glutamátu a amonného iontu. Tato amidace vyžaduje hydrolýzu molekuly ATP. Během transaminačních reakcí slouží glutamát jako donor aminoskupiny v biosyntéze různých aminokyselin. Pyridoxalfosfát je transaminačním kofaktorem a je získáván z pyridoxinu (vitamín B). Uhlíkový skelet aminokyselin pochází z meziproduktů glykolýzy (pyruvát, 3- fosfoglycerát, fosfoenolpyruvát), citrátového cyklu (α-ketoglutarát, oxalacetát) nebo z pentózo-fosfátového cyklu (robóza-5-fosfát, erytróza-4-fosfát). Některé z těchto reakcí jsou velmi jednoduché, jako je například formace aspartátu nebo alaninu transaminací glutamátu na oxalacetát nebo pyruvát: oxalacetát + pyruvát aspartát + α-ketoglutarát pyruvát + glutamát alanin + α-ketoglutarát Ostatní biosyntézní cesty jsou složitější, ale stále se objevují i u kvasinek stejně tak jako u celého živého světa. Aminokyseliny mohou být klasifikovány do šesti biosyntetických skupin v závislosti na jejich charakteru a uhlíkatém prekurzoru: 1. Z glutamátu a α-ketoglutarátu jsou formovány aminokyseliny glutamin, prolin a arginin. 2. Asparagin, metionin, lysin, treonin a isoleucin jsou odvozeny z aspartátu, který byl získán z oxalacetátu. ATP může aktivovat metionin ke vzniku S- adenosylmetioninu, který je posléze demetylován za vzniku S- 27

27 adenosylhomocysteinu. Hydrolýzou, která uvolňuje adenin, vzniká homocystein. 3. Pyruvát je výchozím bodem pro syntézu alaninu, valinu a leucinu fosfoglycerát vede k tvorbě serinu a glycinu. Kondenzace homocysteinu a serinu produkuje cystationin, prekurzor cysteinu. 5. Imidazolový cyklus histidinu vzniká z robózy-5-fosfátu a adeninu ATP. 6. Aminokyseliny obsahující aromatický kruh (tyrosin, fenylalanin, tryptofan) jsou odvozeny z erytrozy-4-fosfátu a fosfoenolpyruvátu. Tyto sloučeniny jsou meziprodukty pentózového cyklu a glykolýzy. Jejich kondenzace formuje šikimáty. Kondenzace této sloučeniny s molekulou fosfoenolpyruvátu produkuje chorismáty, prekurzor aromatických aminokyselin (Braus 1991) Katabolismus aminokyselin Pro syntézu aminokyselin a tvorbu pro ně nezbytných proteinů je pro kvasinky nutný amonný iont. Kvasinky ve svém prostředí ne vždy najdou dostatečné množství těchto iontů. Jsou však schopny získávat amonný iont z jiných dostupných aminokyselin prostřednictvím různých reakcí. Nejběžnější cestou je přenos α-amino skupiny, pocházející z různých aminokyselin, na α-ketoglutarovou kyselinu za vzniku glutamátu. Tato reakce je katalyzována aminotrasferázami nebo transaminázami, jejichž složkou je pyridoxalfosfát (PLP). Glutamát je pak oxidativně deaminován a vzniká NH + 4. Tyto dvě reakce mohou být shrnuty následující rovnicí: α-aminokyselina + NAD + + H 2 O α-ketokyselina + NH NADH + H + Obr. 2 Oxidativní deaminace aminokyselin 28

28 Během transaminace je pyridoxalfosfát přechodně transformován na pyridoxaminfosfát (PMP). Aldehydická skupina PLP se naváže na ε-aminoskupinu lysinové části, aktivní místo aminotransferázy. Takto vzniká meziprodukt (E-PLP). α-aminoskupina aminokyseliny nahradí ε-aminoskupinu navázanou na PLP. Štěpením tohoto meziproduktu se uvolní PMP a ketonová kyselina, která odpovídá zúčastněné aminokyselině. PMP může dále reagovat s jinou keto-kyselinou, kdy vzniká nová aminokyselina a zároveň se regeneruje PLP. Tyto reakce mohou být shrnuty do následujících rovnic: aminokyselina 1 + E-PLP keto-kyselina 1 + E-PMP keto-kyselina 2 + E-PMP aminokyselina 2 + E-PLP jinak také: aminokyselina 1 + keto-kyselina 2 aminokyselina 2 + keto-kyselina 1 Některé aminokyseliny, jako jsou serin a treonin, mají hydroxylovou skupinu na β- uhlíku a mohou tak být přímo deaminovány dehydratací. Dehydratasa katalyzuje tuto reakci za vzniku odpovídající keto-kyseliny a amonného iontu (Ribaereau-Gayon, Dubourdieu et al. 2006). Obr. 3 Úloha pyridoxalfosfátu v transaminačních reakcích 29

29 5.3 Další produkty zpracování dusíku kvasinkami Během fermentace kvasinky netvoří pouze alkohol a oxid uhličitý, ale anaerobní fermentace cukrů kvasinkami rodu Saccharomyces vytváří i různé těkavé metabolity, které se podílejí na senzorickém profilu vína. Mezi významné látky patří estery, vyšší alkoholy, těkavé kyseliny, karbonylové a sirnaté sloučeniny. Hromadění těchto látek záleží na kmeni použitých kvasinek, složení moštu (fyzikální, chemické), výživě a podmínkách fermentace Vyšší alkoholy a estery Vyšší alkoholy patří z kvantitativního hlediska mezi nejdůležitější skupinu těkavých látek produkovaných kvasinkou. Vyznačují se tím, že obsahují více než dva atomy uhlíku. Kvasinky mohou vylučovat ketonové kyseliny vyplývající z deaminace aminokyselin pouze po jejich dekarboxylaci na aldehyd a redukci na alkohol. Tento mechanismus, známý jako Ehrlichova reakce (Obr. 4), částečně vysvětluje tvorbu vyšších alkoholů ve víně. Mezi hlavní vyšší alkoholy objevující se ve víně a jejich prekurzory, tedy odpovídající aminokyseliny jsou zobrazeny v tabulce 3. Některé pokusy ukazují, že degradace aminokyselin není jedinou cestou formování vyšších alkoholů ve víně. Ve skutečnosti, některé z vyšších alkoholů jako je propan-1-ol nebo butan-1-ol, nemají jako prekurzor aminokyselinu (Ingraham and Guymon 1960). Neexistuje žádný vztah mezi množstvím aminokyseliny v moštu a množstvím odpovídajícího vyššího alkoholu ve víně. Produkce vyšších alkoholů kvasinkami je spojena nejen s katabolismem aminokyselin, ale také se syntézou přes odpovídající keto-kyseliny. Tyto kyseliny jsou odvozeny od metabolismu cukrů. Například, propan- 1-ol nemá jako prekurzor odpovídající aminokyselinu. Je odvozen od α-ketomáselné kyseliny, který může vznikat z pyruvátu a acetyl koenzymu A. Obr. 4 Ehrlichova reakce 30

30 Tab. 3 Vyšší alkoholy, jejich koncentrace ve víně a odpovídající prekurzory Vyšší alkoholy Koncentrace ve víně (mg.l -1 ) Aminokyseliny jako prekurzory 3-metylbutan-1-ol Leucin (isoamylalkohol) 2-metylbutan-2-ol Isoleucin (amylalkohol) 2-metylpropan-1ol Valin (isobutylalkohol) Fenylalkohol Fenylalanin Tyrosol Tyrosin Propan-1-ol Butan-1-ol 1-10 Tryptofol 0-1 Tryptofan γ-butyrolakton 0-5 Kyselina glutamová Metionol 0-5 Metionin S výjimkou fenyletanolu, který má charakteristickou vůni po růžích, vyšší alkoholy nevoní příjemně. Většina z nich, jako například isoamylalkohol, mají výrazný zápach po rozpouštědlech. Metionol je zvláštní alkohol, protože ve své struktuře obsahuje atom síry. Odérem připomíná vařené zelí a jeho práh citlivosti je velmi nízký (1,2 mg.l -1 ). Může být také zodpovědný za mnoho zápachů a nepříjemných vad aroma vína, především ve vínech bílých (Miller, Wolff et al. 2007). Parametry, které zvyšují produkci vyšších alkoholů ve víně, jsou velmi dobře známy. Patří mezi ně vysoká hodnota ph, vyšší teplota během fermentace a aerace kvasícího moštu. Při výrobě červeného vína, kdy dochází k maceraci rmutu, vyšší teplotě a přístupu kyslíku, nelze vzniku vyšších alkoholů zabránit. Při výrobě bílých vín je tvorba vyšších alkoholů omezena teplotou fermentace mezi 20 až 22 C. Deficience amonných iontů a aminokyselin v moštu vede k nadměrnému formování vyšších alkoholů. Tyto podmínky nutí kvasinky využít veškerý dostupný dusík dostupný z transaminací. Nevyužité uhlíkové zbytky jsou následně vyloučeny ve formě vyšších alkoholů. Vzhledem k činnosti svých esteráz, produkují kvasinky různé estery (v řádech mg.l - 1 ). Mezi nejdůležitější z těchto acetátů patří isoamylacetát (banánové aroma) a fenyletylacetát (aroma růží). I když tvorba těchto esterů není spojena s metabolismem 31

31 dusíku, patří sem i etylestery středně dlouhých mastných kyselin. Ty jsou formovány kondenzací acetyl koenzymu A. Tyto estery mají mnohem zajímavější aroma než ostatní. Hexanoát má květinovoovocné aroma připomínající zelená jablka. Etyldekanoát má vůni po mýdlu. Při výrobě bílého vína lze zvýšit obsah těchto esterů snížením teploty kvašení nebo snížením turbidity moštu Sirnaté sloučeniny V posledních letech se stal předmětem mnoha studií obsah sirnatých sloučenin ve víně, přesněji jejich identifikace a původ, stejně tak jako jejich charakter a vliv na kvalitu vína. Obecně jsou tyto látky klasifikovány jako škodící kvalitě vína. Těkavé sloučeniny síry se dělí do dvou skupin podle bodu jejich varu na vysoce těkavé (bod varu menší než 90 C) a méně těkavé sloučeniny (bod varu větší než 90 C). Vysoce těkavé sloučeniny, především sirovodík, jsou přítomny ve vínech, která byla vyrobena redukční metodou. Pokud je jejich koncentrace vyšší než prahová hodnota, jsou tyto sloučeniny cítit po zkažených vejcích, česneku, cibuli nebo zelí. Nicméně nepředstavují pro víno vážný problém. Jelikož je jejich bod varu relativně nízký, většina těchto látek vyprchá díky jednoduchému stočení nebo provzdušnění vína. Mezi jedny z méně těkavých sloučenin patří metionol. Ve víně se může objevit v koncentraci až 5 mg.l -1. Pokud obsah této látky překročí prahovou hodnotu (1,2 mg.l - 1 ), dostává aroma podobné květáku. Mechanismy tvorby sirnatých sloučenin stále nejsou velmi dobře známy. Kromě enzymatické formace, která je výsledkem metabolismu kvasinek, se mohou ostatní neenzymatické reakce vyskytnout v průběhu vinifikace vlivem teploty nebo světla. Mimo to, pesticidy obsahující síru, které se mohou dostat do moštu, mohou být použity jako prekurzory v biochemických reakcích. Nejběžnější vadou vína spojenou se stresem kvasinek díky nedostatečné výživě je zápach po sulfidech a merkaptanech, obecně nazývanou jako sirka. I přesto, že je vznik této vady stále ještě předmětem mnoha diskuzí a studií, je obecně známo, že v případě nedostatku asimilovatelného dusíku pro kvasinky je riziko vzniku sirky velmi vysoké (Spiropoulos, Tanaka et al. 2000). 32

32 5.3.3 Těkavé kyseliny Těkavé kyseliny, například acetát, mohou hrát důležitou roli v aroma vína a nadměrná koncentrace tohoto vedlejšího produktu fermentace velmi škodí kvalitě vína. Množství těkavých kyselin ve víně je většinou nízké (0,25 0,5 g.l -1 ), ale může být mnohem vyšší díky různým podmínkám fermentace. Zejména během fermentace velmi hustých moštů, jako jsou mošty z botrytických sběrů, může koncentrace těkavých kyselin vystoupat až na hodnotu 1,8 g.l -1 nebo mnohem výš (Bely, Rinaldi et al. 2003). Kyselina octová patří mezi hlavní těkavé kyseliny ve víně. Je produkována hlavně během bakteriálního znehodnocování, ale je také produkována kvasinkami během fermentace. Ve zdravém hroznovém moštu s přiměřenou koncentrací cukru (méně než 220 g.l -1 ) produkují sacharomycétní kvasinky relativně malé množství kyseliny octové ( mg.l -1 ). K těkavým kyselinám náleží kromě významné kyseliny octové také kyselina mravenčí a vyšší mastné kyseliny jako je kyselina propionová, máselná, valeriánová a jiné. Tyto kyseliny se objevují ve víně jen z části ve formě volných kyselin, z části jsou také ve formě esterů s alkoholem. Pokud je jeho obsah vyšší (nad 150 mg.l -1 ), dá se mluvit o vadě vína, projevující se octovým zápachem (Vilanova, Ugliano et al. 2007). 33

33 6 VLIV ASIMILOVATELNÉHO DUSÍKU NA PRŮBĚH FERMENTACE Hroznový mošt je vysoce fermentabilní médium, ve kterém kvasinky naleznou potřebné látky pro zajištění jejich důležitých životních funkcí. Sacharidy (glukóza, fruktóza) jsou využity jako zdroj uhlíku a energie. Etanol udává povahu vína. Organické kyseliny (vinná a jablečná) a minerální soli (fosfát, sulfát, draslík, vápník a hořčík) zajišťují vhodné ph. Sloučeniny dusíku existují v moštu v několika formách, jako amonné ionty, aminokyseliny, polypeptidy a proteiny. Mošt také obsahuje látky, které slouží jako růstové faktory (vitamíny) nebo faktory přežití. Ostatní složky hroznového moštu, jako jsou fenolické látky, přispívají k celkovému charakteru vína, nemají však zásadní vliv na kinetiku fermentace. Obecně platí, že odpovídající inokulace (10 6 buněk na 1 ml) bezpečně iniciuje fermentaci hroznového moštu. Různé faktory však mohou narušit růst kvasinek a průběh fermentace. Některé tyto faktory jsou chemické povahy a korespondují s nutričními nedostatky nebo s přítomností inhibitorů vytvořených v průběhu fermentace (acetaldehyd, mastné kyseliny). Jiné jsou povahy fyzikálně-chemické, například okysličování moštu, teplota během fermentace nebo čiření moštů. Úspěšnost fermentace závisí na všech těchto faktorech. 6.3 Cyklus růstu kvasinek a průběh fermentace V moštu, který nebyl zasířený a naočkovaný čistou kulturou kvasinek, se kvasinky začnou množit po pár hodinách stání v tanku. Nejčastěji se setkáváme s apikulátními kvasinkami rodu Kloechera a Hanseniaspora. Rozvíjejí se i aerobní kvasinky (Candida, Pichia, Hansenula), produkující kyselinu octovou a etylacetát. Brettanomyces, a jejich charakteristický zvířecí odér, jsou v moštu vzácné. Ačkoli mohou být tyto kvasinky relativně odolné vůči síře, síření s následnou inokulací ušlechtilým kmenem kvasinek Sachcaromyces cerevisiae, představuje efektivní způsob jak se vyhnout kontaminaci (Fleet and Heard 1992). Cyklus růstu kvasinek a průběh fermentace hroznového moštu jsou znázorněny v grafu č. 1. za účelem zdůraznění určitých jevů znázorňuje graf mošt, který obsahuje vysokou koncentraci cukru, který nemůže být zcela prokvašen. Křivka I označuje 34

34 celkovou populaci kvasinek, křivka II životaschopnou populaci kvasinek a křivka III znázorňuje prokvašený cukr. Graf 1 Cyklus růstu kvasinek a průběh fermentace hroznového moštu s vysokým obsahem cukru (320 g.l -1 ) Předešlý graf lze shrnout následovně: 1. Růstový cyklus kvasinek má tři hlavní fáze. Růstová fáze, která trvá 2 5 dnů, zvýší populaci kvasinek na 10 7 až 10 8 kvasinek na 1 ml moštu. Následuje fáze stacionární, trvající zhruba 8 dnů. A konečně fáze odumírání, která postupně snižuje životaschopnou populaci kvasinek na Tato fáze může trvat i několik týdnů. 2. Během tohoto obzvláště dlouhého cyklu je populace kvasinek omezena na 4-5 generací. 3. Zastavení růstu není výsledkem vymizení veškerých energetických a výživových faktorů. 4. Doba trvání těchto fází není stejná. Zejména fáze odumírání je téměř čtyřikrát delší, než je fáze růstu. 5. Průběh fermentace přímo souvisí s růstovým cyklem kvasinek. Rychlost fermentace je na svém maximu a prakticky konstantní něco málo přes 10 35

35 dnů. Tato doba odpovídá prvním dvěma fázím růstového cyklu. Rychlost kvašení se pak postupně zpomaluje, ale kvašení přesto trvá několik týdnů. V této fázi je populace kvasinek ve fázi přežití. Zastavení kvašení není jen výsledkem nedostatečného růstu kvasinek. Metabolická aktivita nemnožících se buněk může být také inhibována. Zastavení metabolické aktivity je vykládáno jako vyčerpání buněčného ATP a akumulace etanolu v buňkách, pravděpodobně kvůli zastavení transportu látek přes membrány díky vymizení sterolů. Během této fáze však stále funguje enzymatická aktivita, ale intracelulární koncentrace cukru se postupně snižuje. Při omezené koncentraci cukru v moštu (méně než 200 g.l -1 ) proběhne fermentace během prvních dvou fází cyklu. Ta probíhá většinou rychle a bez problému. Na druhé straně, v případě zvýšené koncentrace cukru v moštu (nad 200 g.l -1 ) dochází v závěru k odumírání a úplnost procesu závisí na vitalitě populace kvasinek. Některé operace aktivující fermentaci mají vliv na růst kvasinek a na průběh fermentace na jejím začátku. Ale nemají vždy vliv na kvasinky v závěrečné fázi fermentace, přinejmenším v moštu s vysokým obsahem cukru. 6.4 Požadavky na výživu dusíkem Hroznový mošt poskytuje relativně vysoký obsah dusíkatých sloučenin (0,1 1 g rozpustného dusíku na litr). Tyto složky obsahují amonný kationt (3 10 % z celkového dusíku), aminokyseliny (25 30 %), polypeptidy (25 40 %) a bílkoviny (5 10 %). Koncentrace dusíku v hroznech závisí na odrůdě, podnoži, prostředí a podmínkách pěstování, zejména hnojení dusíkem. Pro kvasinky je nezbytný přísun dusíkatých látek pro jejich růst. Amonný kationt je snadno asimilovatelný a dokáže uspokojit potřebu dusíku kvasinek, především při syntéze aminokyselin. Polypeptidy a proteiny se nepodílejí na růstu kvasinek Saccharomyces cerevisiae, protože tyto kvasinky nedokáží tyto látky hydrolyzovat. S. cerevisiae nepotřebují aminokyseliny jako součást přidané výživy, jelikož jsou schopné je individuálně syntetizovat. Ovšem jejich dodání do moštu stimuluje kvasinky mnohem více než amoniakální dusík. Komplexní směsi amonných solí a aminokyselin se prokázaly být nejúčinnější na podporu růstu kvasinek a rychlost fermentace. 36