MASARYKOVA UNIVERZITA. Citlivost Mycoplasma hominis na antibiotika a přírodní látky

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Citlivost Mycoplasma hominis na antibiotika a přírodní látky Rigorózní práce Mgr. Markéta Vydržalová, Ph.D. Brno 2010

2 MASARYK UNIVERSITY Faculty of Science Antibacterial activity of various antibiotics and natural substances against Mycoplasma hominis Rigorous thesis Mgr. Markéta Vydržalová, Ph.D. Brno 2010

3 Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně a veškeré literární prameny a informace, které jsem v práci využila, jsou uvedeny v seznamu použité literatury. V Brně Markéta Vydržalová

4 Ráda bych poděkovala mým kolegům Doc. MVDr. Jaroslavě Mazurové, CSc., Mgr. Petře Lyskové, Ph.D. a Mgr. Radku Slehovi za pomoc při realizaci této studie. V neposlední řadě děkuji mé rodině za trpělivost a podporu.

5 Souhrn Cílem rigorózní práce bylo stanovení citlivosti Mycoplasma hominis na antibiotika a přírodní látky. Vyšetřili jsme 40 kmenů Mycoplasma hominis vykultivovaných z tampónových stěrů z krčku děložního žen. Minimální inhibiční koncentraci jsme zjišťovali zkumavkovou diluční metodou. Stanovili jsme minimální inhibiční koncentraci pro doxycyklin, ciprofloxacin, ofloxacin, linkomycin a erythromycin. Všechny kmeny byly rezistentní k erythromycinu (MIC mg/l). Pouze jeden kmen vykazoval rezistenci k doxycyklinu (MIC 8) a jeden k ofloxacinu (MIC 8). Hodnota MIC 90 ciprofloxacinu byla 2 mg/l, ofloxacinu 2 mg/l, linkomycinu 2 mg/l a doxycyklinu 0,5 mg/l. Z testovaných přírodních látek jsme zaznamenali nejnižší hodnotu MIC 90 oleje z kůry skořicovníku cejlonského (500 mg/l). Naopak nejvyšší účinnou koncentraci jsme zjistili u anetholu MIC mg/l. Hodnoty MIC 90 karvakrolu byly 600 mg/l a eugenolu 1000 mg/l. Klíčová slova: karvakrol, anethol, eugenol, olej z kůry skořicovníku cejlonského, Mycoplasma hominis, zkumavková diluční metoda

6 Summary Rigorous thesis is focused on the determination of antibacterial activity of various antibiotics and natural substances against Mycoplasma hominis. A total number of 40 Mycoplasma hominis strains isolated from cervical swabs of randomly selected women were included in this study. Minimal inhibitory concentrations (MIC) of doxycycline, ciprofloxacin, ofloxacin, lincomycin and erytromycin were determined using the broth dilution method. All Mycoplasma hominis strains were resistant to erythromycin (MIC mg/l). Only one strain was resistant to doxycycline (MIC 8) and one to ofloxacin (MIC 8). MIC 90 of ciprofloxacin, ofloxacin and linkomycin was 2 mg/l and doxycycline 0,5 mg/l. Among the most effective natural extracts used in this study was Cinnamomum zeylanicum bark oil (MIC mg/l). Carvacrol (MIC 600 mg/l) and eugenol (MIC 1000 mg/l) also exerted good effects on Mycoplasma hominis. Anethole was the least effective natural substance used against this microorganism. Keywords: carvacrol, anethole, eugenol, cinnamon bark oil from Cinnamomum zeylanicum, Mycoplasma hominis, broth dilution method

7 Seznam zkratek ATP adenosintrifosfát B. Bacillus BV bakteriální vaginóza (Bacterial Vaginosis) C. Candida DNA deoxyribonukleová kyselina E. Escherichia ELISA test enzymové imunoanalýzy (Enzyme-Linked-ImmunoSorbent-Assay) H. Helicobacter K. Klebsiella kb párů bází KFT komplement fixační test L. Listeria M. Mycoplasma MBC minimální baktericidní koncentrace MFC minimální fungicidní koncentrace MIC minimální inhibiční koncentrace (Minimum Inhibitory Concentration) N. Neisseria P. Pseudomonas PCR polymerasová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction) PPLO mikroorganismy způsobující pleuropneumonii (Pleuro-Pneumonia-Like Organisms) Pro. Proteus S. Staphylococcus Sal. Salmonella sp. druh (species) Str. Streptococcus subsp. poddruh (subspecies) U. Ureaplasma UV ultrafialové záření

8 Obsah 1 Úvod Mycoplasma hominis Taxonomie Morfologie buněk Genetická výbava Antigenní struktura Onemocnění vyvolaná Mycoplasma hominis Citlivost Mycoplasma hominis na antibiotika Kultivace a růstové vlastnosti Mycoplasma hominis Metody průkazu Mycoplasma hominis Přírodní látky Význam přírodních látek Mechanismus účinku přírodních látek na mikroorganismy Vybrané skupiny přírodních látek Testované přírodní látky a jejich charakteristika Metody stanovení citlivosti bakterií na antibiotika Kvalitativní metody Kvantitativní metody Experimentální část Materiál Kmeny Mycoplasma hominis Antibakteriální léčiva Přírodní látky Kultivační média Složky pro přípravu kultivačních médií Přístroje a pomůcky Pracovní postup Pomnožení kmenů Mycoplasma hominis Rozpouštění a ředění antibiotik Rozpouštění a ředění přírodních látek Zkumavková diluční metoda Výsledky...33

9 3.1 Testování citlivosti Mycoplasma hominis na antibiotika Testování citlivosti Mycoplasma hominis na přírodní látky Diskuse Závěr...38 Seznam literatury...39 Seznam obrázků...51 Seznam tabulek...52

10 1 Úvod Mikroflóra genitálního ústrojí ženy je velmi různorodá. Na udržování rovnováhy, mezi jednotlivými druhy mikroorganismů, se podílí především laktobacily. Snížení jejich počtu, nebo úplné vymizení, má za následek pomnožení rizikových mikroorganismů mezi které řadíme i Mycoplasma (M.) hominis. M. hominis patří mezi nejmenší známé mikroorganismy. Od ostatních se liší nejenom velikostí bakteriální buňky, ale i absencí pevné bakteriální stěny, kterou tvoří pouze třívrstevná membrána. Z tohoto důvodu je M. hominis přirozeně rezistentní na antibakteriální léčiva jejichž účinky spočívají v inhibici syntézy buněčné stěny. M. hominis se vyznačuje plasticitou, rozmanitými tvary bakteriálních buněk a charakteristickým vzhledem kolonií na povrchu agarových médií, který je přirovnáván k sázenému vejci. Uvedený druh je považován za etiologické agens infekčního onemocnění genitálního ústrojí žen s různými klinickými příznaky. Bývá izolován při bakteriální vaginóze, zánětlivém onemocnění urogenitálního traktu, horečkách po porodu či potratu a také z novorozenců infikovaných matek. Léčba onemocnění vyvolaných M. hominis spočívá nejčastěji v podávání makrolidových a tetracyklínových antibiotik. Narůstající rezistence této bakterie na uvedená léčiva proto vyžaduje hledání nových látek s antibakteriálními účinky. Za jednu z možných alternativ jsou považovány látky přírodního charakteru, jejichž kladem je vedle antibiotické aktivity i nižší toxicita. Naším cílem bylo ověření citlivosti izolovaných kmenů na vybraná antibakteriální léčiva a přírodní látky

11 1.1 Mycoplasma hominis Taxonomie M. hominis bylo poprvé vykultivováno ve 40. letech minulého století Dienesem a Edsallem (1937). Do té doby byly pleomorfní mikroorganismy, s vysokými nutričními nároky, považovány pouze za patogeny zvířat s označením PPLO. Tato zkratka byla vytvořena z anglického označení Pleuro-Pneumonia-Like Organisms a v překladu znamená mikroorganismy způsobující zánět poplicnice a plic (Cimolai, 2001). V současnosti je M. hominis řazeno do rodu Mycoplasma a společně s rodem Ureaplasma tvoří čeleď Mycoplasmataceae. Tato čeleď náleží do řádu Mycoplasmatales, třídy Mollicutes. V současné době zahrnuje rod Mycoplasma 122 druhů a 4 poddruhy ( Morfologie buněk Buňky mykoplazmat jsou pleomorfní. Jejich tvar závisí na druhu, kultivačních podmínkách a stádiu růstového cyklu. Lze pozorovat kulaté, kokobacilární, prstencovité příp. činkovité tvary, ale také krátká či dlouhá vlákna (Taylor-Robinson, 1999). Hlavní příčinou pleomorfního tvaru buněk je charakter množení, během kterého může docházet k opoždění dělení cytoplazmy za dělením jádra (obr. 1, str.12), (Bredt a kol., 1973; Peterson a kol., 1973). Výsledkem je vznik mnohojaderných vláknitých útvarů, které se mohou dále větvit a připomínat pseudomycelium. Uvnitř vláken se vytvářejí kulovitá tělíska, která jsou od sebe oddělena přepážkami. Vlákna tak nabývají vzhledu řetízků. Po jejich rozpadu na elementární tělíska se celý cyklus opakuje (Razin, 2005). Průměr nejmenší kokoidní formy schopné reprodukce je asi 300 nm. Vláknité formy mohou dosahovat délky až 100 µm a tloušťky 0,4 µm (Razin, 2005). Buněčná stěna mykoplazmat je značně odlišná od většiny ostatních bakterií. Vnitřní a vnější vrstva je složena z bílkovin a polysacharidů. Mezi nimi se nachází vrstva z fosfolipidů a cholesterolu. Buněčná stěna má tak charakter třívrstevné membrány a její tloušťka je 7,5 až 10 nm (Rottem, 1979)

12 Binární dělení Tvorba mnohojaderných vláken a následný rozpad na jednotlivé buňky Genetická výbava Obr. 1 Dělení mykoplazmat (Razin, 1981) Mykoplazmata mají nejmenší genom ze všech bakterií. Velikost genomu M. hominis je kb (Ladefoged a Christiansen, 1992). Z tohoto důvodu mají omezené metabolické pochody, což je předurčuje k ryze parazitickému způsobu života (Su a Baseman, 1990) Antigenní struktura Na povrchu M. hominis se nachází řada proteinových antigenů. Nejvýznamnější z nich je Vaa. Tento hlavní povrchový antigen je nezbytný pro adhezi k povrchu sliznic (Zhang a Wise, 1997). Dalším antigenem je P120. Antigenní variabilita tohoto antigenu umožňuje odolávat složkám imunitního systému (Nyvold a kol., 1997). Významný je také antigen Lmp, který umožňuje shlukování buněk M. hominis. Tato schopnost je významná pro kolonizaci sliznic, neboť jednotlivé buňky M. hominis jsou snadněji eliminovány z organismu (Jensen a kol., 1995; Ladefoged a kol., 1995) Onemocnění vyvolaná Mycoplasma hominis Infekce pohlavních orgánů M. hominis se spolu s dalšími druhy mikroorganismů podílí na vzniku různých patologických procesů v genitálním ústrojí žen. Často je dáváno do souvislosti s bakteriální vaginózou (Arya a kol., 2001), zánětlivým pánevním onemocněním (Taylor-Robinson a Furr, 1997), ale i bakteriemií (Madoff a Hooper, 1988). Uvedený druh se vyskytuje také v pochvě zdravých žen (Taylor-Robinson a Rosenstein, 2001)

13 Závažný je výskyt M. hominis v genitálním ústrojí těhotných žen. U této skupiny se M. hominis může podílet na předčasném porodu, poporodní horečce nebo nízké porodní váze novorozence (Taylor-Robinson a Furr, 2010). U mužů je přítomnost M. hominis v urogenitálním ústrojí spojována především se záněty nadvarlat, prostaty a močových cest. Stejně jako u žen bývá tento mikroorganismus izolován nejčastěji ve směsi s chlamydiemi a gonokoky. Význam M. hominis při rozvoji těchto onemocnění nebyl doposud zcela objasněn (Taylor-Robinson a McCormack, 1980). M. hominis bylo izolováno také z rektálních a krčních výtěrů od homosexuálů (Taylor-Robinson, 2003). Studiem výskytu M. hominis v pohlavním ústrojí žen se zabývají skupiny vědců po celém světě. Arya a kol. (2001) z Velké Británie uvádějí 21,7% výskyt M. hominis v klinickém materiálu žen s různými diagnózami. Podobné údaje publikovali i Belkum a kol. (2001) z Nizozemí, kteří M. hominis prokázali ve 24 % vyšetřovaných vzorků. Schlicht a kol. (2004) z USA prokázali M. hominis v 15,6 % vzorků. Extragenitální infekce Přesto, že je M. hominis nejčastěji dáváno do souvislosti s infekcemi urogenitálního systému, stále častěji se objevují zprávy o extragenitálně lokalizovaných infekcích. Ve většině případů tyto infekce postihují pacienty se sníženou funkcí imunitního systému. Přítomnost M. hominis v těle pacienta může ovlivňovat rozvoj či průběh revmatoidní artritidy, fibromyalgie a chronického únavového syndromu. Nicolson a kol. (1999) zjistili, že kvalitativní i kvantitativní zastoupení mykoplazmat ve vzorcích od pacientů s některým z výše uvedených onemocnění (45-63 %) se prokazatelně liší od asymptomatických pacientů (9 %). U všech pacientů však bylo prokázáno současně více druhů mykoplazmat. Stejnou problematikou se zabývali i Nasralla a kol. (1999). Autoři prokázali M. hominis v krevních vzorcích 28 (31 %) pacientů z 91 vyšetřených. U většiny pacientů se vyskytovaly také další druhy mykoplazmat Citlivost Mycoplasma hominis na antibiotika Používanými antibiotiky k léčbě mykoplazmových infekcí byly ve 2. polovině minulého století tetracyklin a linkomycin. Méně účinné byly chloramfenikol, streptomycin a kanamycin. Penicilinová antibiotika byla označena jako neúčinná (Harwick a Fekety, 1969)

14 Mykoplazmata jsou přirozeně rezistentní k beta-laktamovým antibiotikům, což je dáno strukturou jejich buněk, postrádají pevnou buněčnou stěnu - hlavní cíl antibakteriálního účinku penicilinových antibiotik. Skupinou antibiotik označených za nevhodné k léčbě infekcí způsobených M. hominis, jsou, mimo beta-laktamová antibiotika, také makrolidy. Důvodem je narůstající odolnost na tuto skupinu léčiv. Jsou známi dva mechanismy rezistence M. hominis k makrolidům, a to mutace v genomu vedoucí k rezistenci a aktivní vypuzování antibiotika z buňky, tzv. efflux (Pereyre a kol., 2002). M. hominis je rezistentní k makrolidům s 14 a 15 členným laktonovým kruhem. Do této skupiny řadíme erythromycin a jeho deriváty roxithromycin, clarithromycin a azalid azithromycin (Bébéar, 2005). Dále je rezistentní ke ketolidu telitromycinu. Z makrolidových antibiotik se k léčbě urogenitálních infekcí u těhotných žen používá nejčastěji erythromycin (Taylor-Robinson a Bébéar, 1997). Domingues a kol. (2003) však zaznamenali u 91 % kmenů M. hominis rezistenci k erythromycinu. Nižší procento rezistentních kmenů (50 %) uvádějí Kilic a kol. (2004). Výjimkou mezi makrolidovými antibiotiky je josamycin. Toto makrolidové antibiotikum bylo dlouhou dobu považováno za účinné v léčbě infekcí způsobených M. hominis (Bébéar, 2005). V roce 2002 však Pereyre a kol. (2002) izolovali od pacienta josamycin rezistentní kmen M. hominis. Rezistence byla prokázána také u fluorochinolonů považovaných za velmi perspektivní při léčbě mykoplazmových infekcí. Příčinou odolnosti je mutace podjednotky gyra, enzymu DNA-gyrasy nebo získání schopnosti effluxu (Bébéar a kol., 1997). Výskyt rezistentních kmenů M. hominis je poměrně vzácný (Waites a kol., 2008). Proto jsou fluorochinolony používány k léčbě mykoplazmových infekcí. Inhibují jak M. hominis, tak U. urealyticum, a navíc rychle dosahují účinné koncentrace ve tkáních (Kenny a kol., 1989; Hooper a Wolfson, 1985). Domingues a kol. (2003) neprokázali u žádného z jimi testovaných kmenů M. hominis rezistenci k ofloxacinu. Kilic a kol. (2004) však uvádějí 12,5 % kmenů rezistentních k ofloxacinu. V posledních letech se objevují kmeny M. hominis rezistentní na tetracyklinová antibiotika. Vznik rezistence spočívá v získání tetm genu, který, jak bylo zjištěno, je přenášen mezi bakteriemi v urogenitálním traktu (Roberts a kol., 1985). Výskyt rezistentních kmenů dosahuje již % (Taraskina a kol., 2002; Domingues a kol., 2003). Naopak Kechagia a kolektiv (2008) uvádí 100% citlivost M. hominis na tetracyklin a doxycyklin. K antibiotikům používaným, k léčbě mykoplazmových infekcí, patří také linkomycin a klindamycin, které inhibují proteosyntézu (Cummings a McCormack, 1990). Citlivost M. hominis k této skupině antibiotik potvrzuje ve své práci také Bébéar (2005)

15 O hodnotách účinných koncentrací antibiotik, na M. hominis zjištěných různými autory, informuje tabulka č. 1. Většina antibiotik užívaných k léčbě mykoplazmových infekcí má pouze bakteriostatický účinek, což vysvětluje pomalou eradikaci mykoplazmat z organismu pacienta a časté relapsy (Tully a Razin, 1996; Taylor-Robinson, 1999). Tab. 1 Minimální inhibiční koncentrace inhibující 90 % kmenů Mycoplasma hominis publikované různými autory (mg/l) Antibiotikum Tetracyklin 32 0, Doxycyklin 0, , Ciprofloxacin 1 0,5 0, ,5 >1 1 Ofloxacin 1 0,5 2 Linkomycin >1 Klindamycin 0,016 0,064 >1 0,016 0,032 Erythromycin > >64 >32 >16 Josamycin 0,25 0,25 Legenda: 1 Bébéar a kol., 2000b (použitá metoda agarová diluční metoda) 2 Duffy a kol., 2000 (použitá metoda bujónová mikrodiluční metoda) 3 Hannan a kol., 2000 (použitá metoda bujónová mikrodiluční metoda) 4 Bébéar a kol., 2000a (použitá metoda agarová diluční metoda) 5 Samra a kol., 2002 (použitá metoda Etest) 6 Kenny a Cartwright, 2001 (použitá metoda agarová diluční metoda) 7 Ullmann a kol., 1999 (použitá metoda agarová diluční metoda) 8 Ngan a kol., 2004 (použitá metoda Etest) 9 Taylor-Robinson a Bébéar, Waites a kol., 2009 (použitá metoda bujónová mikrodiluční metoda) 11 Waites a kol., 2008 (použitá metoda bujónová mikrodiluční metoda)

16 1.1.7 Kultivace a růstové vlastnosti Mycoplasma hominis Mykoplazmata jsou vzhledem ke svému malému genomu vysoce nutričně náročná a vyžadují komplexní média obohacená o složky nezbytné pro metabolismus, růst a množení buněk (Taylor-Robinson, 1993). Tyto půdy jsou označovány názvem PPLO agar a PPLO bujón. Jejich základem je infuze z hovězích srdcí, extrakt z kvasnic a koňské sérum. Kvasnicový extrakt je zdrojem vitamínů. Koňské sérum je zdrojem cholesterolu a nasycených a nenasycených mastných kyselin (Taylor-Robinson, 1993). Toto nutričně bohaté médium je vhodné nejen pro mykoplazmata, ale také jiné bakterie. Proto jsou do půdy určené pro kultivaci mykoplazmat přidávány inhibiční látky potlačující růst nežádoucí mikroflóry. Z antibiotik jsou to penicilin nebo ampicilin. Vzhledem k tomu, že mykoplazmata postrádají buněčnou stěnu, jsou k účinku penicilinových antibiotik přirozeně rezistentní. Působení penicilinů je namířeno především proti grampozitivním bakteriím. Růst gramnegativních bakterií inhibuje octan thallný (Quinn a kol., 2002). Kultivační média lze dále obohatit o aminokyselinu arginin, kterou M. hominis využívá jako zdroj energie (Shimke a kol., 1966). Výsledkem utilizace argininu je zvýšení ph kultivačního média, což se projeví změnou zabarvení acidobazického indikátoru (fenolová červeň) z oranžové na růžovou (Schimke a kol., 1966). Z dalších růstových faktorů je možné použít DNA (Quinn a kol., 2002). Optimální ph růstového média pro M. hominis je 7,0 (Taylor-Robinson, 1993). Na agarových půdách vytváří M. hominis kolonie charakteristického vzhledu připomínajícího sázené vejce (fried egg) o velikosti pohybující se do 0,5 mm (Quinn a kol., 2002).. Inkubační podmínky M. hominis je fakultativně anaerobní mikroorganismus. Vhodné prostředí pro jeho růst je atmosféra s obsahem 95 % N 2 a 5 % CO 2 (Taylor-Robinson, 1993). Tekutá média lze inkubovat i v běžných atmosférických podmínkách (Taylor-Robinson a McCormack, 1980). Inkubační teplota se pohybuje v rozmezí C a inkubační doba hodin (Quinn a kol., 2002) Metody průkazu Mycoplasma hominis M. hominis v klinickém materiálu lze prokázat různými metodami. Nejvýznamnější je kultivační vyšetření v PPLO bujónu a agaru. Identifikace M. hominis je založena na schopnosti utilizovat arginin. Toto vyšetření však vyžaduje značnou zručnost laboratorního

17 pracovníka. Je poměrně časově a finančně náročné. Proto kultivační průkaz M. hominis je v mikrobiologických laboratořích nahrazen komerčně dodávanými sety Mycoplasma IST (BioMerieux) a Mycoplasma DUO (Bio-Rad). Sérologická typizace M. hominis je založena na použití specifických protilátek. Mezi tyto metody řadíme růstově inhibiční test, založený na inhibici růstu mykoplazmat specifickým antisérem. Test je jednoduchý a specifický (Lin a Kass, 1974). Imunofluorescenční test využívá k průkazu M. hominis fluorochromem značených protilátek (Giudice a kol., 1967). Dále je možné mykoplazmata prokazovat metodou ELISA (Brown a kol., 1987). V neposlední řadě lze k průkazu M. hominis použít dnes velmi propagované metody molekulárně biologické. Výhodou těchto metod je možnost prokázat i velmi malý počet bakteriálních buněk. Primery k detekci M. hominis navrhli Blanchard a kol. (1993) a citlivost reakce stanovili mezi 10 a 15 fg DNA. Velmi významnou molekulárně biologickou metodou je polymerasová řetězová reakce v reálném čase. Poprvé tuto metodu v diagnostice M. hominis použil Zariffard a kol. (2002). Baczynska a kol. (2004) metodu zdokonalili a optimalizovali k detekci 10 kopií DNA M. hominis. Nepřímá diagnostika mykoplazmových infekcí je založena na průkazu specifických protilátek proti mykoplazmatům. Metabolismus inhibiční test je založen na průkazu protilátek ve vyšetřovaném séru, které inhibují metabolismus mykoplazmat (Lin a Kass, 1974). Z dalších můžeme zmínit komplement fixační test (Jones a Sequeira, 1966) a nepřímý hemaglutinační test (Krogsgaard-Jensen, 1971). 1.2 Přírodní látky Význam přírodních látek Přírodní látky jsou sekundární rostlinné metabolity. Mohou být získány z různých rostlinných částí (květů, pupenů, semen, listů, větví, kůry, dřeva, plodů a kořenů) (Wong a kol. 2008). Rostliny je syntetizují pro svou ochranu před napadením mikroorganismy, hmyzem a býložravci. Řada z těchto látek dává rostlině typické zabarvení, vůni a chuť (Cowan, 1999). Léčivého účinku přírodních látek se snaží lidé využívat již po staletí. Důvodem je jejich schopnost působit antibakteriálně, antivirově, antimykoticky a antioxidačně. Rostlinné látky mohou být využity také jako anestetika, analgetika a spasmolytika

18 Přírodní látky je možné získávat různými postupy. Nejznámější je destilace s vodní parou. Dále mohou být extrahovány organickými rozpouštědly. Nejčastěji užívanými činidly jsou ethanol, aceton a methanol (Prabuseenivasan a kol., 2006). Rostlinné oleje jsou analyzovány chromatografickými metodami. Z nich můžeme jmenovat plynovou chromatografii (Bendahou a kol., 2008), plynovou chromatografii s hmotnostní detekcí (Prabuseenivasan a kol., 2006), vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s UV detekcí, kapalinovou chromatografii s hmotnostní detekcí (Burt a kol., 2005) a tenkovrstvou chromatografii. Dále je možné použít metody elektromigrační (kapilární zónová elektroforéza, micelární elektrokinetická chromatografie) (Kočevar a kol., 2008). Z dalších metod lze využít UV-VIS spektrometrii, infračervenou spektrometrii, nukleární magnetickou rezonanci a rentgenovou krystalografii (Borris, 1996; Cowan, 1999) Mechanismus účinku přírodních látek na mikroorganismy Mechanismus účinku přírodních látek na mikroorganismy je složitý proces, který nebyl dosud zcela objasněn. Působení přírodních látek se liší u grampozitivních a gramnegativních bakterií. Je to dáno odlišnou stavbou a složením bakteriální stěny. Grampozitivní bakterie mají stěnu tvořenou silnou vrstvou peptidoglykanu. Naopak gramnegativní bakterie mají peptidoglykanovou vrstvu tenkou a navíc mají zevní membránu složenou z fosfolipidů a lipopolysacharidů. Gramnegativní bakterie jsou méně citlivé k účinku přírodních látek než bakterie grampozitivní (Burt, 2004, Chung a kol., 2007). Esenciální oleje mohou působit na lipofilní složky buněčné stěny a cytoplazmatické membrány mikroorganismů. Zvýší tak propustnost těchto struktur, což vede k lýze buňky (Bakkali a kol., 2008). Některé přírodní látky např. berberin mají schopnost se vmezeřit do DNA bakterií (Cowan, 1999). Eugenol, thymol a karvakrol poškozují transport iontů přes cytoplazmatickou membránu (Helander a kol., 1998). Specifické terpeny ovlivňují produkci enzymů a tím usmrcují bakteriální buňku ( Kalemba a Kunicka, 2003) Vybrané skupiny přírodních látek Fenoly a polyfenoly Jednoduché fenoly a fenolové kyseliny Hlavními představiteli této skupiny jsou kyselina skořicová a kávová. Kyselina kávová se nachází v estragonu a tymiánu. Je účinná proti bakteriím, virům a houbám. Cytotoxické působení fenolických látek souvisí s počtem a umístěním hydroxylových skupin. S rostoucím

19 počtem hydroxylových skupin roste toxicita. Mechanismus účinku je založen na inhibici enzymové aktivity (Cowan, 1999). Chinony Chinony jsou aromatické sloučeniny se dvěma substituovanými karbonylovými skupinami. Vyskytují se ubikvitárně. Jsou zodpovědné za hnědnutí ovoce a zeleniny při jejich zpracování. Případný toxický účinek chinonů na mikroorganismy je stále zkoumán (Cowan, 1999). Kazmi a kol. (1994) popsal bakteriostatický účinek antrachinonu na Bacillus (B.) anthracis, Corynebacterium pseudodiphtherie a Pseudomonas (P.) aeruginosa. Flavonoidy Flavonoidy jsou hojně přítomny v rostlinách, kde plní mnoho funkcí. Jsou to rostlinná barviva, která se podílí na energetickém metabolismu a fotosyntetických procesech (Cowan, 1999). Flavony a flavonoidy se řadí mezi polyfenolické sloučeniny, jejichž základní skelet je odvozen od flavanového cyklu, tvořeného dvojicí substituovaných benzenových jader a heterocyklického pyranového cyklu (Vodrážka, 2002). Flavonoidy se vyznačují antimikrobiální aktivitou. Mechanismus účinku je pravděpodobně založen na reakci s extracelulárními proteiny, působí na bakteriální stěnu a cytoplazmatickou membránu (Cowan, 1999). Alkaloidy Alkaloidy jsou heterocyklické dusíkaté sloučeniny. V přírodě se vyskytují ve formě solí s organickými kyselinami. Většina alkaloidů je rostlinného původu. Vzácně se můžeme setkat s alkaloidy hub, bakterií a živočichů. Alkaloidy jsou tuhé, krystalické a opticky aktivní látky. Většinou špatně rozpustné ve vodě (Vodrážka, 2002). První alkaloid, který byl použitý v lékařství byl morfin, izolovaný v roce 1805 z máku setého (Papaver somniferum) (Cowan, 1999). Mezi alkaloidy známé pro své antimikrobiální účinky řadíme chinin a berberin. Chinin byl dříve užívaný jako lék proti malárii (Scott, 1918). Berberin působí proti trypanosomám a plasmodiím. Získává se z dřišťálu obecného (Berberis vulgaris). Mechanismus účinku berberinu je založen na schopnosti se vázat na DNA a deregulovat aktivitu enzymu topoisomerasy (Cowan, 1999)

20 Terpeny a terpenoidy Terpeny jsou organické sloučeniny patřící mezi isoprenoidy. Podle počtu isoprenových jednotek se dělí na monoterpeny (C10), diterpeny (C20), triterpeny (C30), tetraterpeny (C40), hemiterpeny (C5) a seskviterpeny (C15). Jsou součástí rostlinných silic a pryskyřic. Terpeny obsahující kyslík se nazývají terpenoidy. Terpeny a terpenoidy jsou účinné proti bakteriím, virům, houbám a prvokům. Jejich mechanismus účinku je založen na porušení membránových struktur mikroorganismů (Cowan, 1999). Glykosidy Glykosidy jsou deriváty sacharidů. Vznikají náhradou vodíkového atomu hydroxylové (poloacetalové) skupiny za cukerný, popřípadě necukerný zbytek. Glykosidy vznikají z cyklických forem sacharidů, tvořících obvykle buď šestičlennou heterocyklickou formu (pyranosa) nebo pětičlennou cyklickou formu (furanosa). Podle toho se vznikající glykosidy nazývají pyranosidy, resp. furanosidy. Konkrétní glykosidy se pak pojmenovávají podle jména příslušného sacharidu, např. glykosidy vzniklé spojením glukosy s jiným radikálem se nazývají glukosidy (resp. glukopyranosidy), z ribosy, ribosidy (resp. ribofuranosidy). Necukernou složkou označovanou jako aglykon mohou být steroidy, flavony a podobně. Dle typu aglykonu se glykosidy dále dělí do skupin na saponiny, glykoalkaloidy, flavonové glykosidy a další (Vodrážka, 2002). Glykosidy se vyskytují hojně v rostlinné říši, ale některé z nich mohou být syntetizovány i živočichy a mikroorganismy. Hrají důležitou roli při detoxikaci ve vodě nerozpustných látek. Jinak mohou sloužit jako toxiny, odstrašující případné predátory. Hojně jsou užívány ve farmakologii (kardiotonika digoxin)

21 1.2.4 Testované přírodní látky a jejich charakteristika Karvakrol Systematický název: 5-isopropyl-2-methylfenol Sumární vzorec: C 10 H 14 O Molární hmotnost: 150,22 g/mol Obr. 2 Strukturní vzorec karvakrolu ( Karvakrol je řazen mezi monoterpenové fenoly. Je součástí esenciálního oleje dobromysli obecné (Origanum vulgare), oleje tymiánu (Thymus vulgaris), oleje získávaného z řeřichy (Lepidium sativum) a z bergamotu (Citrus bergamia). Esenciální olej poddruhů tymiánu obsahuje mezi 5 a 75 % karvakrolu. Karvakrol je bezbarvá až žlutá, čirá, viskózní kapalina s charakteristickou štiplavou vůní (De Vincenzi a kol., 2004). Mechanismus účinku karvakrolu je založen na principu narušení bakteriální membrány (Di Pasqua a kol., 2007). Ultee a Smid (2001) zjistili, že karvakrol způsobuje zvýšenou propustnost cytoplazmatické membrány pro K + a H + ionty. Inhibuje růst širokého spektra mikroorganismů (Ben Arfa a kol., 2006) například Escherichia (E.) coli (Du a kol., 2008) a B. cereus (Ultee a Smid, 2001). Palaniappan a Holley (2010) testovali účinek karvakrolu na rezistentní kmeny bakterií. Zjistili, že karvakrol potlačoval růst kmene Salmonella (Sal.) Typhimurium rezistentního k ampicilinu, tetracyklinu, penicilinu, bacitracinu, erythromycinu a novobiocinu. Dále inhiboval kmen Streptococcus (Str.) pyogenes rezistentní k erythromycinu a kmen Staphylococcus (S.) aureus rezistentní k ampicilinu, penicilinu a bacitracinu. Helander a kol. (1998) stanovili inhibiční koncentraci karvakrolu na E. coli (450,6 mg/l) a na Sal. Typhimurium (150,2 mg/l). Wong a kol. (2008) uvádějí 72,2 mg/l karvakrolu jako účinnou inhibiční koncentraci na Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. Lambert a kol. (2001) zjišťovali citlivost P. aeruginosa a S. aureus na směs karvakrolu a thymolu. P. aeruginosa byl inhibován karvakrolem v koncentraci 278 mg/l a thymolem v koncentraci 255,3 mg/l. S. aureus byl inhibován karvakrolem v koncentraci 105,3 mg/l a thymolem

22 v koncentraci 91,5 mg/l. Botelho a kol. (2007) testovali účinek karvakrolu na Str. mutans, Str. sanguis, Str. salivarius a Str. mitis. Stanovili minimální inhibiční koncentraci mg/l. Karvakrol má nízkou toxicitu, příjemnou chuť a vůní a proto ho lze využít jako potravinové aditivum pro ochranu před bakteriální kontaminací (Ultee a Smid, 2001). Olej z kůry skořicovníku cejlonského Systematický název: 3-fenylprop-2-enal Sumární vzorec: C 9 H 8 O Molární hmotnost: 132,16 g/mol Obr. 3 Strukturní vzorec cinnamaldehydu (hlavní složka skořicového oleje) ( C/Cinnamaldehyde.htm) Skořicový olej se získává z kůry a listů stálezelených tropických stromů skořicovníků. Tyto stromy patří do čeledi vavřínovitých (Lauraceae). Z produkčního hlediska jsou nejdůležitější skořicovník cejlonský (Cinnamomum zeylanicum) a čínský (Cinnamomum cassia). Z těchto stromů se olej získává nejčastěji destilací s vodní parou. Skořicový olej je světle žlutá viskózní kapalina s výraznými aromatickými vlastnostmi a nasládlou chutí. Olej je špatně rozpustný ve vodě a snadno v ethanolu (Wang a kol., 2009). Olej získaný z kůry skořicovníku je z 90 % tvořen cinnamaldehydem. Naopak olej z listů skořicovníku obsahuje převážně eugenol (Chang a kol., 2001). Složením skořicového oleje se zabývali Singh a kol. (2007). Cinnamaldehyd v oleji z kůry tvořil 97,7 % a eugenol v oleji z listů 87,3 %. Skořicový olej má široké využití. Používá se jako ochucovadlo řady pokrmů, déle se využívá jako fungicid a insekticid. Neopomenutelný je jeho účinek na lidský organismus. Snižuje krevní tlak, zlepšuje trávení, podporuje chuť k jídlu, má desinfekční účinky a používá se jako prostředek proti nachlazení, kašli a chřipce. Skořicový olej má antimikrobiální účinky, které zajišťují cinnamaldehyd a eugenol. Mechanismus účinku cinnamaldehydu je založen na vazbě aldehydické skupiny na bakteriální proteiny a tím dochází k potlačení činnosti enzymů (Burt, 2004)

23 Helander a kol. (1998) zjišťovali minimální inhibiční koncentraci cynnamaldehydu na E. coli a Sal. Typhimurium. V obou případech naměřili hodnotu MIC 396 mg/l. Nižší koncentrace cynnamaldehydu a eugenolu, zjistili Ali a kol. (2005). K potlačení růstu kmenů Helicobacter (H.) pylori bylo zapotřebí 2 mg/l cynnamaldehydu a eugenolu. Eugenol Systematický název: 4-allyl-2-methoxyfenol Sumární vzorec: C 10 H 12 O 2 Molární hmotnost: 164,2 g/mol Obr. 4 Strukturní vzorec eugenolu (Cowan, 1999) Eugenol je přírodní aromatická látka náležící svou strukturou mezi fenylpropanoidy. Je součástí esenciálních olejů získaných z hřebíčku, muškátového oříšku, skořice a bobkového listu. Nejvyšší procento eugenolu (85 %) je obsaženo v oleji získaného z poupat hřebíčkovce vonného (Eugenia caryophyllata). Eugenol je bezbarvá až světle žlutá viskózní kapalina a z rostlinného zdroje se získává destilací s vodní parou. Je částečně rozpustný ve vodě a dobře rozpustný v organických rozpouštědlech. Přidává se jako ingredience do řady jídel. Může být součástí parfémů. V Číně je používán v lidovém léčitelství k léčbě průjmových onemocnění a jiných střevní potíží (Pasay a kol., 2010). Eugenol má antibakteriální, insekticidní, protinádorové, antioxidační a anestetitické účinky (Chaieb a kol., 2007). Pro své léčebné účinky bývá přidáván do přípravků určených k ústní hygieně (Santos a Chierice, 2009). Mechanismus účinku eugenolu je založen na inhibici funkce cytoplazmatické membrány. Působením augenolu dochází k inhibici ATPasové aktivity v cytoplazmatické membráně (Gill a Holley, 2006). Shokeen a kolektiv (2008) zjišťovali inhibiční účinek eugenolu na Neisseria (N.) gonorrhoeae. Minimální inhibiční koncentrace eugenolu bránící růstu neiseriím stanovili v rozmezí mg/l. He a kolektiv (2007) využili antimikrobiálních vlastností eugenolu k působení na biofilm Candida (C.) albicans. MIC potlačující růst C. albicans byla 500 mg/l

24 Skupinu sedmi bakteriálních druhů vystavili účinku eugenolu ve své studii Mohammed a Al-Bayati (2009). Hodnota MIC pro B. cereus, Listeria (L.) monocytogenes a Klebsiella (K.) pneumoniae byla 15,6 mg/l, pro S. aureus, Proteus (Pro.) mirabilis a E. coli to bylo 31,2 mg/l. Posledním testovaným kmenem byl P. aeruginosa, který vykazoval rezistenci k celému rozmezí koncentrací. Eugenol mimo své antibakteriální vlastnosti může brzdit i produkci některých látek. Příkladem je zástava produkce listeriolysinu O, produkovaném L. monocytogenes, koncentrací 500 mg/l. Koncentrace 800 mg/l, již působila baktericidně (Filgueiras a Vanetti, 2006). Anethol Systematický název: 1-methoxy-4-(1-propenyl)benzen Sumární vzorec: C 10 H 12 O Molární hmotnost: 148,2 g/mol Obr. 5 Strukturní vzorec anetholu ( Structures---A/Anethole.htm) Anethol je přírodní aromatická látka, která se vyskytuje jako součást řady přírodních esenciálních olejů. Tvoří hlavní složku v oleji z bedrníku anýzu (Pimpinella anisum) a fenyklu obecného (Foeniculum vulgare) z čeledi miříkovitých (Apiaceae) (Koeduka a kol., 2009). Dále se vyskytuje v badyáníku pravém (Illicium verum) z čeledi badyáníkovitých (Illiciacae). Olej se nejčastěji získává destilací s vodní parou. Dominantní složkou oleje z jader fenyklu obecného je trans-anethol (Gulfraz a kol., 2008). Anethol se vyskytuje ve dvou izomerních formách cis a trans. Rozšířenější formou je trans-anethol (Grillo, 2003). Je to bezbarvá látka, která způsobuje charakteristickou lékořicovou chuť a vůni anýzu, fenyklu a badyánu. Další vlastností anetholu je výrazně sladká chuť. Při smíchání alkoholického roztoku anetholu s vodou vzniká tzv. ouzo efekt. Tato mikroemulze způsobí zakalení roztoku (Carteau a kol., 2007)

25 Anethol se vyznačuje antimikrobiálním účinkem na bakterie, kvasinky a houby. De a kolektiv (2002) stanovili MIC anetholu agarovou diluční metodou pro bakterie B. subtilis (3 mg/l), E. aerogenes (20 mg/l), Trichophyton rubrum (18 mg/l), Aspergillus flavus (27 mg/l) a Saccharomyces cerevisiae (5 mg/l). Mikrodiluční metodou zjistil Mohammed (2009) MIC anetholu u E. coli, S. aureus a B. cereus která byla 31,2 mg/l. Koncentrace 62,4 mg/l inhibovala P. mirabilis a K. pneumoniae. Fujita a kol. (2007) uvádějí MIC anetholu a eugenolu (tab. 2) na skupinu různých druhů mikroorganismů. K testování použili bujónovou diluční metodu. Tab. 2 Minimální inhibiční koncentrace anetholu a eugenolu na různé druhy mikroorganismů stanovena zkumavkovou diluční metodou MIC (MBC nebo MFC) Testovaný mikroorganismus mg/l anethol eugenol Bacillus subtilis 400 (400) 800 (800) Brevibacterium ammoniagenes 100 (100) 800 (800) Micrococcus luteus > 1600 (-) 800 (800) Propionibacterium acnes 100 (100) 50 (50 Staphylococcus aureus > 1600 (-) > 1600 (-) S. aureus (MRSA) > 1600 (-) (>1600) Streptococcus mutans 200 (400) 400 (800) Escherichia coli > 1600 (-) 800 (800) Enterobacter aerogenes > 1600 (-) > 800 (-) Pseudomonas aeruginosa > 1600 (-) 1600 (>1600) Proteus vulgaris 100 (100) 400 (800) Salmonella choleraesuis 200 (200) 400 (400) Candida albicans 200 (400) 800 (800) Saccharomyces cerevisiae 100 (200) 400 (800) Zygosaccharomyces bailii 100 (200) 400 (800) Pityrosporum ovale 100 (200) 100 (200) Penicillium chrysogenum > 800 (-) 200 (400) Trichophyton mentagrophytes 800 (-) 400 (-) Legenda: MIC minimální inhibiční koncentrace MBC minimální baktericidní koncentrace MFC minimální fungicidní koncentrace (-) netestováno 1.3 Metody stanovení citlivosti bakterií na antibiotika Metody zjišťování citlivosti na antibiotika se dělí na kvalitativní průkaz citlivosti a kvantitativní stanovení citlivosti. Ke kvalitativnímu průkazu se nejběžněji užívá diskový

26 difúzní test. Ke kvantitativnímu stanovení citlivosti slouží většinou diluční metody, jimiž se dá stanovit minimální inhibiční koncentrace (MIC) dané látky pro vyšetřovaný kmen mikroba (Votava, 2005) Kvalitativní metody Disková difúzní metoda Je to nejčastěji používaná orientační metoda pro stanovení citlivosti mikroorganismů na antibakteriální léčiva. Principem metody je inhibice růstu mikroba antibakteriálním léčivem, které se uvolňuje z papírového disku do agarové půdy. Kolem disku se vytváří koncentrační gradient účinné látky. Disk se pokládá na agar, který je naočkován stanovenou koncentrací testovaného mikroorganismu. Mikroorganismy citlivé na antibiotikum vytvářejí kolem disku tzv. zónu inhibice, jejíž průměr a naměřená hodnota se srovnává s hodnotou inhibiční zóny pro citlivé kmeny (Urbášková a kol., 1985). Rasooli a Mirmostafa (2003) použili diskovou difúzní metodu ke studiu citlivosti E. coli, S. aureus, B. subtilis, K. pneumoniae a P. aeroginosa na esenciální olej z tymiánu. Iwasa a kol. (1996) studovali diskovou difúzní metodou inhibiční účinek berberinu na S. aureus a E. coli. Agarová difúzní metoda Agarová difúzní metoda je založena na stejném principu jako metoda disková. Rozdíl spočívá v aplikaci testované látky. Místo přikládání papírových disků se antimikrobiální látka pipetuje přímo do jamek v agarovém médiu. Agarovou difúzní metodu využili Wang a kol. (2006) k testování baktericidních a fungicidních účinků esenciálního oleje z ambrózie trojklanné (Ambrosia trifida) Kvantitativní metody Mezi kvantitativní techniky stanovení citlivosti řadíme bujónové a agarové diluční metody. Cílem těchto metod je stanovení minimální inhibiční koncentrace, což je nejnižší koncentrace testované antimikrobiální látky, která potlačuje růst mikroorganismů. V některých případech lze stanovit minimální baktericidní koncentraci (MBC), což je nejnižší koncentrace antibiotika, která je potřebná k usmrcení mikroorganismu. Hodnoty MIC a MBC se udávají v mg/l

27 Bujónová diluční metoda Do řady zkumavek s kultivačním médiem a odstupňovanou koncentrací (dvojková ředící řada) antimikrobiální látky se inokuluje testovaný mikroorganismus. Po proběhlé inkubaci se zjišťuje nejnižší koncentrace antibakteriální látky, která zabránila růstu testovaného mikroorganismu v kultivačním médiu. Tato metoda se v praxi nejčastěji využívá v mikrodilučním provedení (Urbášková, 1998) Agarová diluční metoda Agarová diluční metoda je přesnější než bujónové diluční metody. Proto se užívá jako referenční a složí k hodnocení nových antimikrobiálních látek. Nevýhodou této metody je pracnost a finanční náročnost. Antibiotikum se v odstupňované koncentraci přidává do agarové půdy, která se následně nalije do Petriho misek. Inokula vyšetřovaných mikroorganismů jsou nanášeny na povrch agarových médií s antibiotiky. Po proběhlé inkubaci sledujeme růst mikroorganismů na jednotlivých agarových médiích. Miska s nejnižší koncentrací antimikrobiální látky, která zabránila růstu, odpovídá MIC. Tuto metodu použili Nostro a kol. (2004). Testovali citlivost methicilin rezistentních stafylokoků na karvakrol, thymol a esenciální olej z oregána

28 2 Experimentální část 2.1 Materiál Kmeny Mycoplasma hominis Testované kmeny M. hominis byly izolovány z tampónových stěrů odebraných z krčku děložního žen. Pomnožené kmeny byly uchovávány při teplotě -20 C (Vydržalová, 2006) Antibakteriální léčiva Antibiotika používané při testování citlivosti M. hominis jsme zakoupili od firmy Sigma- Aldrich. Přehled a zvolené koncentrační rozmezí je uvedeno v tabulce 3. Tab. 3 Přehled testovaných antibiotik a zvolené koncentrační rozmezí Antibiotikum Koncentrační rozmezí (mg/l) Doxycyklin 0,06-8 Ciprofloxacin 0,06-8 Ofloxacin 0,06-8 Linkomycin 0,06-8 Erythromycin 62, Přírodní látky Přírodní látky určené k testovaní citlivosti M. hominis jsme zakoupili od firmy Sigma- Aldrich ve formě čistých extraktů. Přehled a zvolené koncentrační rozmezí je uvedeno v tabulce 4. Tab. 4 Přehled zkoumaných přírodních látek a zvolené koncentrační rozmezí Přírodní látka Koncentrační rozmezí (mg/l) Karvakrol ,8 Olej z kůry skořicovníku cejlonského ,5 Eugenol ,5 Anethol ,5 2.2 Kultivační média Ke kultivaci i subkultivaci jsme používali tekuté a pevné půdy připravené následovně:

29 PPLO bujón s argininem 2,1 g PPLO Broth without Crystal Violet (Difco) jsme rozpustili v 70 ml redestilované vody a sterilizovali 15 minut v autoklávu při 121 C. Po ochlazení na teplotu C jsme přidali další složky: 20 ml neinaktivovaného koňského séra 10 ml kvasnicového extraktu 0,8 ml 10% roztoku octanu thallného 0,5 ml ampicilinu (200 mg/l) 0,5 g L-argininu 0,2 ml 1% roztoku fenolové červeně ph média jsme upravili 10% roztokem HCl na hodnotu 6,5. Bujónové médium jsme skladovali v lednici při 4-5 C nejdéle 3 týdny. PPLO agar 3,5 g PPLO Agar (Difco) jsme rozpustili v 70 ml redestilované vody a sterilizovali 15 minut v autoklávu při 121 C. Po ochlazení na teplotu C jsme přidali další složky: 20 ml neinaktivovaného koňského séra 10 ml kvasnicového extraktu 0,8 ml 10% roztoku octanu thallného 0,5 ml ampicilinu (200 mg/l) Podle potřeby jsme ph média upravili 10% roztokem HCl na hodnotu 7. Takto připravenou půdu jsme rozlévali do polystyrénových Petriho misek o průměru 60 mm do výšky 4 mm a dále skladovali v lednici při 4-5 C nejdéle 3 týdny Složky pro přípravu kultivačních médií Kvasnicový extrakt 1 kg čerstvých pekařských kvasnic jsme důkladně homogenizovali v 500 ml horké redestilované vody a následně doplnili do 1000 ml redestilovanou vodou. Suspenzi jsme za stálého míchání zahřívali na 80 C po dobu 45 minut. Po ochlazení jsme směs centrifugovali 30 minut při 3000 ot./min. Supernatant jsme opakovaně (3x) sterilizovali v autoklávu při teplotě 80 C. Sterilní extrakt jsme skladovali v lahvičkách (80 ml) při -20 C nejdéle jeden rok

30 Koňské sérum Koňské sérum bylo dodáváno firmou LabMediaServis s.r.o. Neinaktivované koňské sérum jsme uchovávali v 80 ml sterilních lahvičkách při -20 C nejdéle jeden rok. Roztok octanu thallného (10%) V 50 ml sterilní redestilované vody jsme rozpustili 5 g octanu thallného (Sigma-Aldrich). Roztok jsme skladovali v chladničce při 4 C. Roztok ampicilinu Do lahvičky ampicilinu (BIOTIKA) o obsahu 1,0 mg účinné látky jsme přidali 5 ml sterilní redestilované vody. Po důkladném rozpuštění jsme roztok skladovali při -20 C. L-arginin Navážené množství L-argininu (HIMEDIA) jsme přidali do PPLO bujónu. Roztok fenolové červeně - 1% 1 g fenolové červeně (Pliva LACHEMA) jsme rozpustili ve 25 ml 0,1 mol/l NaOH, v odměrné baňce jsme doplnili do objemu 100 ml sterilní redestilovanou vodou a mírně zahřívali do úplného rozpuštění. Roztok jsme sterilizovali v autoklávu 10 min při teplotě 115 C. Dále skladovali při laboratorní teplotě. Roztok NaOH 10% Navážku 5 g NaOH jsme rozpustili v 50ml sterilní redestilované vody. Připravený roztok jsme skladovali při 4 C. Roztok HCL 10% Odměrnou baňku o objemu 50 ml jsme naplnili z jedné třetiny sterilní redestilovanou vodou, do které jsme napipetovali 14 ml 35% HCL. Roztok jsme poté doplnili po risku redestilovanou vodou a po promíchání jsme jej skladovali v chladničce při teplotě 4 C

31 2.3 Přístroje a pomůcky Přístroje Autokláv (BMT, Sterilab), horkovzdušný sterilizátor (BMT, Sterimat), sušárna (Memmert,UNB500), laminární box MSC 12 (Jouan, MSC12), mrazící box (Sanyo, MDF-U3086S), lednice (AEG, S70402KG), termostat s 5 % CO 2 (SalvisLab, BC170), vodní lázeň (Memmert, WB14), digitální váhy (Kern, ABT), ph metr (Hanna, ph210), světelný mikroskop (Nikon, YS100), plynový kahan, aparatury na výrobu redestilované a destilované vody (Millipore, RO-plus, Q-plus), centrifuga (HETTICH, typ MIKRO 20). Pomůcky Polystyrénové Petriho misky (Ø 60 mm), skleněné Petriho misky, mikropipety, sterilní špičky, silikonové zátky, zkumavky, mikrozkumavky, odměrné válce, kádinky, Erlenmayerovy odměrné baňky, pinzety, kopíčka, očkovací kličky, buničitá vata, mikrotenové sáčky, rukavice, stojánky. Skleněné pomůcky jsme myli a sterilizovali postupem používaným ve virologických laboratořích. 2.4 Pracovní postup Pomnožení kmenů Mycoplasma hominis Kmeny M. hominis byly uchovávány při teplotě -20 C. Po jejich rozpuštění jsme 0,2 ml kmene naočkovali do 2 ml PPLO bujónu. Následně jsme vzorek inkubovali hodin v inkubátoru při teplotě 37 C v prostředí s 5 % CO 2. Pomnožení kmene bylo provázeno změnou zabarvení acidobazického indikátoru (fenolová červeň) z původně oranžové na růžovou (příloha 2). Tento postup jsme ještě jednou zopakovali za účelem dokonalého pomnožení kmenů. Životaschopnost jednotlivých kmenů jsme ověřovali kultivací na PPLO agaru, jejichž inkubace probíhá ve stejném prostředí jako PPLO bujónu. Po skončení inkubační doby jsme zhodnotili nárůst charakteristických kolonii (sázené vejce) M. hominis ve světelném mikroskopu při zvětšení 150x (příloha 1)

32 2.4.2 Rozpouštění a ředění antibiotik U kmenů M. hominis jsme zjistili citlivost na doxycyklin, erythromycin, linkomycin, ciprofloxacin a ofloxacin. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) jsme stanovili bujónovou diluční metodou ve zkumavkách. Antibiotika jsme nejprve rozpustili ve sterilní redestilované vodě. Pouze erythromycin bylo nutné nejprve rozpustit v 95% ethanolu a následně jsme jej naředili ve sterilní redestilované vodě. Zásobní roztoky obsahující koncentraci antibiotik mg/l jsme skladovali při -80 C nejdéle 1 rok. Požadované koncentrace antibiotika jsme připravili ze zásobního roztoku naředěním PPLO bujónem Rozpouštění a ředění přírodních látek Navážené množství přírodní látky jsme rozpustili ve 24% ethanolu. Výsledný roztok jsme promíchali a vypočtené množství napipetovali do příslušného objemu PPLO bujónu bez inhibitorů. Vzniklý zásobní roztok jsme dále ředili a získali tak roztok o nejvyšší testované koncentraci. Minimální inhibiční koncentraci přírodních látek jsme zjišťovali bujónovou diluční metodou ve zkumavkách Zkumavková diluční metoda Z první zkumavky s 2 ml nejvyšší koncentrace antibiotika nebo přírodní látky jsme odebrali 1ml. Tento objem jsme přenesli do následující zkumavky s 1 ml PPLO bujónu bez inhibitorů. Roztok jsme promíchali a pokračovali dále dvojkovým ředěním. Po vytvoření koncentrační řady jsme 1 ml roztoku z poslední zkumavky dali do odpadu. Do připravených zkumavek s PPLO bujónem, argininem a příslušnou koncentrací antibiotika nebo přírodní látky jsme inokulovali 0,1 ml bujónové kultury testovaného kmene M. hominis. Jako kontrola byl současně očkován testovaný kmen do média bez inhibitorů. Zkumavky s naočkovanými médii jsme inkubovali při 37 C v prostředí 5 % CO 2. MIC jsme poprvé odečetli v okamžiku, kdy jsme zjistili pomnožení pozitivní kontroly, což se projevilo změnou zabarvení obsahu zkumavky z oranžové na růžovou a následně po 48 hodinách jsme správnost prvního hodnocení potvrdili. Hodnota MIC odpovídala první zkumavce, tj. nejnižší koncentraci antibiotika nebo přírodní látky, ve které nedošlo ke změně barvy acidobazického indikátoru následkem utilizace argininu

33 3 Výsledky 3.1 Testování citlivosti Mycoplasma hominis na antibiotika Zkumavkovou diluční metodou jsme zjistili MIC doxycyklinu, ciprofloxacinu, ofloxacinu, linkomycinu a erythromycinu u 40 kmenů M. hominis. O stanovených účinných koncentracích informuje tabulka 5. Z uvedených údajů vyplývá, že 90 % kmenů M. hominis bylo inhibováno doxycyklinem v koncentraci 0,5 mg/l. Ciprofloxacin, ofloxacin a linkomycin potlačovaly růst 90 % kmenů v koncentrací 2 mg/l. MIC erythromycinu inhibující růst 90 % testovaných kmenů dosahovala hodnoty 2000 mg/l Tab. 5 Minimální inhibiční koncentrace antibiotik na Mycoplasma hominis stanovena zkumavkovou diluční metodou (vyšetřeno 40 kmenů) Antibiotikum MIC (mg/l) Rozmezí koncentrací (mg/l) 50 % 90 % Doxycyklin 0,06-8 0,25 0,5 Ciprofloxacin 0, Ofloxacin 0, Linkomycin 0, Erythromycin 62, Testování citlivosti Mycoplasma hominis na přírodní látky Nejprve jsme zjistili citlivost M. hominis na zvolené rozpouštědlo. Ethanol jsme naředili v PPLO bujónu. Získali jsme koncentrační řadu od 0,094 % do 6 %. Zjistili jsme, že 50 % testovaných kmenů bylo inhibováno 3% roztokem ethanolu. Následné ředění přírodních látek bylo vždy voleno tak, aby výsledné množství ethanolu bylo nižší než 3 %. Testované přírodní látky karvakrol, skořicový olej, eugenol a anethol jsme nejprve rozpustili ve 24% ethanolu a následně naředili v PPLO bujónu do požadované koncentrace. V tabulce 6 je uveden vzhled roztoků přírodních látek po jejich rozpuštění ve 24% ethanolu. Tab. 6 Vzhled roztoků přírodních látek po jejich rozpuštění ve 24% ethanolu Přírodní látka Karvakrol Olej z kůry skořicovníku cejlonského Eugenol Anethol Vzhled Bezbarvý roztok Nažloutlý roztok Jemně zakalený roztok Mléčná mikroemulze

34 Dále jsme ověřili antimikrobiální účinky přírodních látek karvakrolu, eugenolu, anetholu a oleje z kůry skořicovníku cejlonského. Zkumavkovou diluční metodou jsme stanovili hodnoty MIC pro jednotlivé přírodní látky (tab. 7). Karvakrol inhiboval růst 90 % kmenů M. hominis při koncentraci 600 mg/l. Nižší hodnotu MIC 90 jsme zaznamenali pouze u skořicového oleje (500 mg/l). Naopak vyšší hodnoty MIC 90 jsme stanovili pro eugenol 1000 mg/l a anethol 4000 mg/l. Tab. 7 Minimální inhibiční koncentrace přírodních látek na Mycoplasma hominis stanovena zkumavkovou diluční metodou (vyšetřeno 40 kmenů) MIC (mg/l) Přírodní látka Rozmezí koncentrací (mg/l) 50 % 90 % Karvakrol , Olej z kůry skořicovníku cejlonského , Eugenol , Anethol ,

35 4 Diskuse Narůstající rezistence mikroorganismů na antibakteriální léčiva představuje celosvětový problém. Časté a neuvážené užívání antibiotik vede k nárůstu počtu rezistentních kmenů různých druhů bakterií, což komplikuje léčbu infekčních onemocnění. Nově vyvíjené generace antibiotik představují záchranu jen na krátkou dobu. Vědecké týmy celého světa se proto snaží najít alternativní cesty léčby infekčních chorob. Jednou z nich může být i využití přírodních látek s antimikrobiální aktivitou. Tyto skutečnosti byly podkladem pro realizaci studie, jejímž cílem bylo zjistit citlivost kmenů M. hominis na antibakteriální léčiva a látky přírodního charakteru. Je známo, že se M. hominis může vyskytovat na sliznici genitálního ústrojí žen i mužů. Často v souvislosti s klinickými příznaky. U žen se nejčastěji jedná o příznaky charakteristické pro bakteriální vaginózu či bakteriální kolpitidu. Za určitých okolností však může tento druh pronikat i do vnitřních pohlavních orgánů a spolu s ostatními mikroorganismy podporovat vznik hlubokého pánevního zánětu. Závažný je především výskyt M. hominis u těhotných žen. U nichž může mykoplazma vyvolat předčasný porod. Pokud pronikne do amniové tekutiny může negativně ovlivnit porodní váhu novorozence, případně vyvolat poporodní horečku novorozence i matky. Důvodem zjišťování citlivost M. hominis na antibakteriální léčiva a přírodní látky je zvyšující se rezistence na antibiotika. K léčbě infekcí vyvolaných M. hominis jsou používány tetracyklinová antibiotika. Dříve doporučovaný tetracyklin je v současnosti nahrazen doxycyklinem, z důvodu zvyšujícího se výskytu rezistentních kmenů k tetracyklinu. Citlivost na doxycyklin jsme ověřovali u 40 kmenů M. hominis. Naše zjištění potvrdilo, že 90 % kmenů bylo inhibováno doxycyklinem v koncentraci 0,5 mg/l. Podstatně nižší hodnoty MIC zaznamenali Samra a kol. (2002), kteří uvádějí 90 % kmenů M. hominis inhibovaných doxycyklinem v koncentraci 0,064 mg/l. Naopak nejvyšší hodnoty MIC zjistili Bébéar a kol. (2000a) a to 16 mg/l. Waites a kol. (2008) uvádějí MIC 90 doxycyklinu 8 mg/l. Z námi testovaných 40 kmenů byl pouze jeden rezistentní k doxycyklinu. Jeho MIC 90 přesahovala hodnotu 8 mg/l, což byla nejvyšší námi testovaná koncentrace. V posledních letech jsou k léčbě infekcí M. hominis doporučovány fluorochinolony. Minimální inhibiční koncentrace ofloxacinu i ciprofloxacinu inhibující 90 % našich kmenů M. hominis byla 2 mg/l. Pouze jeden kmen byl rezistentní na ofloxacin 8 mg/l. Stejnou hodnotu MIC 90 (2 mg/l) pro ofloxacin uvádějí Ullmann a kol. (1999) pro ciprofloxacin Kenny

36 and Cartwright (2001). Nižší hodnoty 0,5 a 1 mg/l ofloxacinu zjistili Bébéar a kol. (2000a,b), kteří však testovali citlivost agarovou diluční metodou. Obdobné hodnoty pro ciprofloxacin publikovali Ngan a kol. (2004), 0,5 mg/l a Bébéar a kol. (2000b), 1 mg/l a Waites a kol. (2008) 1 mg/l. Kilic a kol. (2004) prokázali 12,5 % kmenů rezistentních k ofloxacinu. Naopak Domingues a kol. (2003) nezaznamenali rezistenci k tomuto antibiotiku u žádného z jimi testovaných kmenů. Při testování citlivosti izolovaných kmenů k linkomycinu jsme zjistili u 90 % kmenů inhibici růstu linkomycinem v koncentraci 2 mg/l. Účinností linkomycinu na M. hominis se zabývali pouze Taylor-Robinson a Bébéar (1997), kteří uvádějí MIC 90 >1 mg/l. Ze 40 testovaných kmenů bylo 90 % inhibováno erythromycinem v koncentraci 2000 mg/l. Podle údajů, které publikovali Bébéar a kol. (2000b) byla MIC 90 erythromycinu >64 mg/l. Hannan a kol. (2000) uvádějí MIC 90 erythromycinu 100 mg/l. Přesto, že je erythromycin téměř neúčinný na M. hominis je stále používán k léčbě infekcí genitálního ústrojí, zvláště u těhotných žen. Ve druhé části studie jsme se zaměřili na stanovení účinnosti látek přírodního charakteru. Testovali jsme karvakrol, eugenol, anethol a skořicový olej. U těchto látek byly zjištěny antimikrobiální účinky. Našim cílem bylo zjistit jak budou účinné na kmeny M. hominis. MIC 90 karvakrolu, která inhibovala růst M. hominis, byla 600 mg/l. Téměř shodnou hodnotu MIC 90 zjistili ve své studii Helander a kol. (1998). Koncentrace karvakrolu, která inhibovala růst E. coli byla 450,6 mg/l. Nižší koncentraci (MIC 90 72,2 mg/l) zjistili Wong a kol. (2008) při testování Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. Lambert a kol. (2001) ověřovali účinnost směsi karvakrolu s thymolem. Autoři prokázali, že P. aeruginosa byl inhibován karvakrolem v koncentraci 278 mg/l a thymolem v koncentraci 255,3 mg/l. S. aureus byl inhibován karvakrolem v koncentraci 105,3 mg/l a thymolem v koncentraci 91,5 mg/l. Nejnižší účinnou koncentraci jsme zaznamenali u oleje z kůry skořicovníku cejlonského. Všech 40 kmenů bylo inhibováno uvedenou sloučeninou v koncentraci 500 mg/l. Helander a kol. (1998) zjišťovali minimální inhibiční koncentraci cynnamaldehydu k potlačení růstu E. coli a Sal. Typhimurium. V obou případech naměřili hodnotu MIC mg/l. Nižší koncentrace cynnamaldehydu naměřili Ali a kol. (2005). K potlačení růstu kmenů H. pylori bylo zapotřebí 2 mg/l cynnamaldehydu. Dále jsme zjišťovali účinnou koncentraci eugenolu. Hodnota jeho MIC 90 činila 1000 mg/l. Podstatně nižší hodnoty MIC 90 byly naměřeny při testování N. gonorrhoeae mg/l (Shokeen a kol., 2008), C. albicans 500 mg/l (He a kol, 2007), B. cereus,

37 L. monocytogenes a K. pneumoniae 15,6 mg/l a S. aureus, Pro. mirabilis a E. coli 31,2 mg/l (Mohammed a Al-Bayati, 2009). Vyšší hodnoty MIC 90 (> 1600 mg/l) u S. aureus a S. aureus MRSA popisují ve své studii Fujita a kol. (2007). Poslední námi testovanou přírodní látkou byl anethol. Pro účinné potlačení růst 90 % kmenů M. hominis činila výsledná koncentrace 4000 mg/l. Fujita a kol. (2007) uvádějí ve své studii druhy jejichž hodnoty MIC anetholu byly vyšší než 1600 mg/l. Jednalo se o S. aureus, S. aureus MRSA, E. coli, E. aerogenes a P. aeruginosa. Výrazně nižší hodnoty MIC uvádějí De a kolektiv (2002). MIC anetholu stanovili agarovou diluční metodou u B. subtilis (3 mg/l), E. aerogenes (20 mg/l), Trichophyton rubrum (18 mg/l), Aspergillus flavus (27 mg/l), Saccharomyces cerevisiae (5 mg/l). Mikrodiluční metodou zjistil Mohammed (2009) MIC anetholu 31,2 mg/l pro E. coli, S. aureus a B. cereus. Koncentrace 62,4 mg/l inhibovala Pro. mirabilis a K. pneumoniae. Problematikou testování antimikrobiální aktivity přírodních látek se zabývá řada vědeckých týmů po celém světě. Žádný se však nezabýval jejich účinností na M. hominis. Z tohoto důvodu jsme nemohli námi zjištěné výsledky MIC porovnat s výsledky jiných autorů. Přesto lze říci, že námi stanovené hodnoty MIC se příliš neliší od hodnot publikovaných jinými autory

38 5 Závěr Vzestup rezistence mikroorganismů k antibiotikům je celosvětovým problémem. Důvodů vzniku této nepříznivé situace je několik. Hlavním je nadužívání těchto léčiv v humánní a veterinární medicíně. Je proto nezbytná snaha o zavedení formy léčby infekčních chorob. Jednou z nich by mohlo být využívání přírodních sloučenin samostatných nebo ve směsi s antibiotiky. Vzhledem k nižší toxicitě přírodních látek a relativně snadné dostupnosti by bylo možné jejich využití i jako preventivních přípravků. Ve studii jsme se zaměřili na testování citlivosti M. hominis k antibiotikům a přírodním látkám. Kmeny M. hominis, které jsme použili, byly vykultivovány z genitálního ústrojí žen. Hodnoty MIC jsme zjišťovali zkumavkovou diluční metodou. Dosáhli jsme následujících výsledků: Ze 40 kmenů M. hominis u nichž jsme zjišťovali citlivost k doxycyklinu, ciprofloxacinu, ofloxacinu, linkomycinu a erythromycinu byl pouze jeden kmen rezistentní k doxycyklinu (MIC 8) a jeden k ofloxacinu (MIC 8). Hodnoty MIC 90 citlivých kmenů k ciprofloxacinu byly 2 mg/l, linkomycinu 2 mg/l, ofloxacinu 2 mg/l a doxycyklinu 0,5 mg/l. K erythromycinu byly všechny testované kmeny vysoce rezistentní. MIC 90 tohoto antibiotika dosahovala hodnoty 2000 mg/l. Dále jsme zjistili citlivost kmenů M. hominis na karvakrol, olej z kůry skořicovníku cejlonského, eugenol a anethol. Hodnota MIC 90 karvakrolu byla 600 mg/l. Nižší hodnotu 500 mg/l jsme zjistili u skořicového oleje. Naopak vyšší MIC 90 jsme prokázali u eugenolu 1000 mg/l a anetholu 4000 mg/l. Na závěr je nutné uvést, že výskyt M. hominis v genitálním ústrojí ještě nemusí vést ke vzniku zánětlivého onemocnění. Antibiotická terapie by proto měla být indikována s individuálním přístupem. Perspektivně by bylo vhodné využívat antibakteriálních účinků přírodních látek, které mají nižší toxicitu než antibiotika a nevzniká na ně rezistence

39 Seznam literatury BACZYNSKA, A., et al. Development of real-time PCR for detection of Mycoplasma hominis. BMC Microbiology, September 2004, vol. 4, no. 35, s ISSN: BAKKALI, F. et al. Biological effects of essential oils. Food and Chemical Toxicology, 2008, vol. 46, s ISSN: BÉBÉAR, C.M. KEMPF, I. Antimicrobial therapy and antimicrobial resistance. In: Blanchard A, Browning GF, eds. Mycoplasmas: Molecular Biology, Pathogenicity and Strategies for Control. Norfolk: Horizon Bioscience, 2005; BÉBÉAR, C.M., et al. 2000a Comparative activities to telithromycin (HMR 3647), levofloxacin and other antimicrobial agents against human mycoplasmas. Antimicrobial agents and chemotherapy, July 2000, vol. 44, no. 7, s ISSN: BÉBÉAR, C.M., et al. 2000b In vitro activity of trovafloxacin compared to those of five antimicrobials against Mycoplasmas including Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum fluoroquinolone resistant isolates that have been genetically characterized. Antimicrobial agent and chemotherapy, September 2000, vol. 44, no. 9, s ISSN: BEN ARFA, A. et al. Antimicrobial activity of carvacrol related to its chemical structure. Applied Microbiology, ISSN: BENDAHOU, M., MUSELLI, A., GRIGNON-DUBOIS, M., BENYOUCEF, M., DESJOBERT, J., BERNARDINI, A., COSTA: Antimicrobial activity and chemical composition of origanum glandulosum Dest. essential oil and extract obtained by microwave extraction:comparison with hydrodistillation, Journal of Food Chemistry 2008, vol. 106, no. 1, s ISSN: BLANCHARD, A., et al. Evaluation of intraspecies genetic variation within the 16S rrna gene of Mycoplasma hominis and detection by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, May 1993, vol. 31, no. 5, s ISSN:

40 BORRIS, R. P.: Natural products research: perspectives from a major pharmaceutical company., J. Ethnopharmacol. 1996; vol. 5, no. 1-3, s ISSN: BOTELHO, M.A., et al. Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol and thymol against oral pathogens. Brazil J Med Biol Res, March 2007, vol. 40, no. 3, s ISSN: BREDT, W. et al. Microcinematographic studies of Mycoplasma hominis cells. Journal of Bacteriology, March 1973, vol. 113, no. 3, s ISBN: BROWN, M.B. et al. Measurement of antibody to Mycoplasma hominis by an enzyme-linked immunoassay and detection of class-specific antibody responses in women with postpartum fever. American journal of obstetrics and gynecology, March 1987, vol. 156, no. 3, s ISSN: BURT, S.: Essential oils: Their antibacterial properties and potential applications in fous, Int. J. Food. Microbiol., 2004, vol. 94, no. 3, s ISSN: CARTEAU, D. - BASSANI, D. PIANET, I. The Ouzo effect : Following the spontaneous emulsification of trans-anethole in water by NMR. Comptes Rendus Chimie, April-May 2008, vol. 11, no. 4-5, s ISSN: CIMOLAI, N. Mycoplasmas. In Laboratory diagnosis of bacterial infections. New York: Marcel Dekker, 2001, s ISBN: COWAN, M.M. Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical Microbiology, October 1999, vol. 12, n. 4, s ISSN: CUMMINGS, M.C. MCCORMACK, W.M. Increase in resistance of Mycoplasma hominis to tetracyclines. Antimicrobial agents and chemotherapy, December 1990, vol. 34, no. 12, s ISSN: DE VINCENZI, M., et al. Constituents of aromatic plants: carvacrol. Fitoterapia, 2004, vol. 75, no. 7-8, s ISSN: X

41 DE, M., et al. Antimicrobial properties of star anise (Illicium verum Hook f). Phytotherapy Research, February 2002, vol. 16 (1), s ISSN DI PASQUA, R., ET AL. Membrane toxicity of antimicrobial compounds from essential oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, vol. 55, no. 12, s ISSN: DIENES, L. EDSALL, G. Observations on the L-organism of Klieneberger Proceedings of the Society for Experimantal Biology and Medicine, 1937, vol 36, DOMINGUES, D., et al. Genital mycoplasmas in women attending a family planning clinic in Guiné-Bassau and their susceptibility to antimicrobial agents. Acta Tropica, April 2003, vol. 86, no. 1, s ISSN: X. DU, W.X., et al. Storage Stability and Antibacterial Activity against Escherichia coli O157:H7 of Carvacrol in Edible Apple Films Made by Two Different Casting Methods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, vol. 56, ISSN: DUFFY, L.B., et al. Comparative potency of gemifloxacin, new quinolones, macrolides, tetracycline and clindamycin against Mycoplasma spp. Journal of antimicrobial chemotherapy, April 2000, vol. 45, no. 1, s ISSN: FILGUEIRAS, C.T. VANETTI, M.C.D. Effect of eugenol on growth and listeriolysin O production by Listeria monocytogenes. Brazilian Archives of Biology and Technology, 2006, vol. 29, n. 3, s ISSN: FUJITA, K. FUJITA, T. KUBO, I. Anethole, a Potential Antimicrobial Synergist, Converts a Fungistatic Dodecanol to a Fungicidal Agent. Phytotherapy Research, January 2007, vol. 21, s ISSN: GARLAND, S.M. KELLY, V.N. Role of genital mycoplasmas in bacteremia: should we be routinely culturing for these organisms? Infection Disease Obstet Gynecol, 1996, vol.4, no.6, s ISSN:

42 GILL, A.O. HOLLEY, R.A. Inhibition of membrane bound ATPase of Escherichia coli and Listeria monocytogenes by plant oil aromatics. International Journal of Food Microbiology, 2006, vol. 111, S ISSN: GIUDICE, R.A. ROBILLARD, N.F. CARSKI, T.R. Immunofluorescence identification of Mycoplasma on agar by use of incident illumination. Journal of Bacteriology, April 1967, vol. 93, no. 4, s ISSN: GRILLO, I. Small-angle neutron scattering study of a world-wide known emulsion: Le pastis, Colloids and Surfaces, Physicochem, 2003, vol. 225, s ISSN: GULFRAZ, M. ET AL. Composition and antimicrobial properties of essential oil of Foeniculum vulgare, African Journal of Biotechnology, 2008, vol. Ý, n.24, s ISSN: HANNAN, P.C.T. WOODNUTT, G. In vitro activity of gemifloxacin (SB ; LB20304a) against human mycoplasmas. The journal of antimicrobial chemotherapy, March 2000, vol. 45, no. 3, s ISSN: HARWICK, H.J. FEKETY, R.F. The antibiotic susceptibility of Mycoplasma hominis. Journal of clinical pathology, July 1969, vol. 22, no. 4, s ISSN: HE, M., et al. In vitro activity of eugenol against Candida albicans biofilms. Mycopathologia, March 2007, vol. 163, no. 3, s ISSN: HELANDER, I.M. et al. Characterization of the action of selected essential oil components on gram-negative bacteria, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, vol. 46, s ISSN: HOOPER, D.C. WOLFSON, J.S. The fluoroquinolones: pharmacology, clinical uses, and toxicities in humans. Antimicrobial agents and chemotherapy, November 1985, vol. 28, no. 5, ISSN:

43 CHAIEB, K., et al. The chemical composition and biological activity of clove essential oil, Eugenia caryophyllata (Syzigium aromaticum L. Myrtaceae): a short review. Phytoterapy research, Jun 2007, vol. 21, no. 6, s ISSN: CHANG, C.W. CHEN, P.F. CHANG, S.C. Antibacterial activity of leaf essential oils and their constituents from Cinnamomum osmophloeum. Journal of Ethnopharmacology, 2001, vol. 77, s ISSN: CHUNG, K.H. et al. Antibacterial activity of essential oils on the growth of Staphylococcus aureus and measurement of their binding interaction using optical biosensor, J Microbiol Biotechnol. November 2007, vol. 17, n. 11, s ISSN IWASA, K. et al. Antibacterial activity and structure-activity relationships of berberine analogs, European Journal of Medicinal Chemistry. 1996, vol. 31, s ISSN: JENSEN, L.T., et al. Selection of Mycoplasma hominis PG21 deletion mutants by cultivation in presence of monoclonal antibody 552. Infection and immunity, September 1995, vol. 63, no. 9, s ISSN: KALEMBA, D. KUNICKA, A. Antibacterial and antifungal properties of esentials oils. Current Medicinal Chemistry, 2003, vol. 10, n. 10, s ISSN: KAZMI, M. H. et al. An anthraquinone derivative from Cassia italica. Phytochemistry, 1994, vol. 36, s ISSN: KECHAGIA, N. BERSIMIS, S. CHATZIPANAGIOTOU, S. Incidence and antimicrobial susceptibilities of genital mycoplasmas in outpatient women with clinical vaginitis in Athens, Greece. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. July 2008, vol. 62, no. 1, s ISSN: KENNY, G.E. CARTWRIGHT, F.D. Susceptibilities of Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae and Ureaplasma urealyticum to GAR-936, Dalfopristin, Dirithromycin, Evernimicin, Gatifloxacin, Linezolid, Moxifloxacin, Quinupristin-Dalfopristin and Telitromycin compared to their susceptibilities to reference Macrolides, Tetracyclines and

44 Quinolones. Antimicrobial agents and chemotherapy, September 2001, vol. 45, no. 9, s ISSN: KENNY, G.E., et al. Susceptibilities of genital mycoplasmas to the newer quinolones as determined by the agar dilution method. Antimicrobial agents and chemotherapy, January 1989, vol. 33, no. 1, s ISSN: KILIC, D., et al. Prevalence and treatment of Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, and Mycoplasma hominis in patients with non-gonococcal urethritis. Japanese journal of infectious diseases, February 2004, vol. 57, no. 1, s ISSN: KOČEVAR, N. et al. Comparison of capillary electrophoresis and high performance liquid chromatografy for determination of flavonoids in Achillea millefolium, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2008, vol. 46, s ISSN: KOEDUKA, T., et al. Biosynthesis of t-anethole in Anise: Characterization of t- Anol/Isoeugenol Synthase and an O-Methyltransferase Specific for a C7-C8 Propenyl Side Chain. Plant Physiology, January2009, vol. 149, no. 1, s ISSN: KROGSGAARD-JENSEN, A. Indirect hemagglutination with mycoplasma antigens: Effects of ph on antigen sensitization of tanned fresh and formalinized sheep erythrocytes. Applied Microbiology, November 1971, vol. 22, no. 5, s ISSN: LADEFOGED, S.A. CHRISTIANSEN, G. Physical and genetic mapping of the genomes of five Mycoplasma hominis strains by pulsed-field gel electrophoresis. Journal of Bacteriology, April 1992, vol. 174, n. 7, s ISSN: LADEFOGED, S.A., et al. A 135-kilodalton surface antigen of Mycoplasma hominis PG21 contains multiple directly repeated sequences. Infection and immunity, January 1995, vol. 63, no. 1, s ISSN: LAMBERT, R.J.W. et al. A study of the minimum inhibitory concentration and mode of action oregano essential oil, thymol and carvacrol. Journal of Applied Microbiology, 2001, vol. 91, s ISSN:

45 LIN, J. KASS, E.H. Serological reactions of Mycoplasma hominis: Differences among mycoplasmacidal, metabolic inhibition, and growth agglutination tests. Infection and Immunity, September 1974, vol. 10, no. 3, s ISSN: MADOFF, S. HOOPER, D.C. Nongenitourinary infections caused by Mycoplasma hominis in adults. Reviews of infectious diseases, May 1988, vol. 10, no. 3, s ISSN: MOHAMED, M.J. ALBAYATI, F.A. Isolation and identification of antibacterial compounds from Thymus kotschyanus aerial parts and Dianthus caryophyllus flower buds. Phytomedicine, 2009, vol. 16, s ISSN: MOHAMMED, M.J. Isolation and identification of anethole from Pimpella anisum fruit oil. Journal of Pharmacy Research, 2009, vol. 2,n. 5., s ISSN: NASRALLA, M. HAIER, J. NICOLSON, G.L. Multiple Mycoplasmal infections detected in blood of patients with chronic fatigue syndrome and/or fibromyalgia syndrome. European journal of clinical microbiology & infectious diseases. December 1999, vol. 18, no. 12, ISSN: NGAN, C.C., et al. Susceptibility testing of Singapore strains of Mycoplasma hominis to tetracycline, gatifloxacin, moxifloxacin, ciprofloxacin, clindamycin, and azithromycin by Etest method. Diagnostic microbiology and infectious disease, March 2004, vol. 48, no. 3, s ISSN: NICOLSON, G.L., et al. Mycoplasmal infections in chronic illnesses: Fibromyalgia and chronic fatigue syndromes, gulf war illness, HIV-AIDS and rheumatoid arthritis. [online] [cit ]. Dostupné z: < NOSTRO, A. et al. Susceptibility of methicilin resistant staphylococci to oregano essential oil, carvacrol and thymol. FEMS Microbiology, 2004, vol. 230, n. 2, s ISSN: NYVOLD, C. BIRKELUND, S. CHRISTIANSEN, G. The Mycoplasma hominis P120 membrane protein contains a 216 amino acid hypervariable domain that as recognized by the

46 human humoral immune response. Microbiology, February 1997, vol. 143, no. 2, s ISSN: PALANIAPPAN, K. HOLLEY, R.A. Use of natural antimicrobials to increase antibiotic susceptibility of drug resistant bacteria. International Journal of Food Microbiology, Jun 2010, vol.15, no.140(2-3), s ISSN: PASAY, C., et al. Acaricidal Activity of Eugenol Based Compounds against Scabies Mites. PloS one, August 2010, vol. 11, no. 5(8):e ISSN: PEREYRE, S., et al. Mutations in 23S rrna account for intrinsic resistance to macrolides in Mycoplasma hominis and Mycoplasma fermentans and for acquired resistance to macrolides in Mycoplasma hominis. Antimicrobial agents and chemotherapy, October 2002, vol. 46, no. 10, ISSN: PETERSON, J.E. RODWELL, A.W. RODWELL, E.S. Occurrence and ultrastructure of a variant (rho) form of Mycoplasma. Journal of Bacteriology, July 1973, vol. 115, no. 1, s ISBN: PRABUSEENIVASAN, S. JAYAKUMAR, M,. IGNACIMUTHU, S. In vitro antibacterial activity of some plant essential oils. BMC complementary and alternative medicine, November 2006, vol. 30, n. 6, s. 39. ISSN: QUINN, P.J., et al. The Mycoplasmas. In Veterinary microbiology and microbial diseases. London: Blackwell Publishing Company, 2002, s ISBN: RASOOLI, I. MIRMOSTAFA, SA.Bacterial susceptibility to and chemical composition of essential oils from Thymus kotschyanus and Thymus persicusjournal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, vol. 9, n. 51, s ISSN: RAZIN, S. Medical microbiology - Mycoplasmas. [online]. [cit ]. Dostupné z: <

47 ROBERTS, M.C., et al. Tetracycline-resistant Mycoplasma hominis strains contain streptococcal tetm sequences. Antimicrobial agents and chemotherapy, July 1985, vol. 28, no. 1, s ISSN: ROTTEM, S. In The mycoplasmas. New York: Academic press, 1979, s SAMRA. Z. ROSENBERG, S. SOFFER, Y. In vitro susceptibility of Mycoplasma hominis clinical isolates to tetracycline, quinolones and macrolides. Diagnostic microbiology and infectious disease, December 2002, vol. 44, no. 4, s ISSN: SCOTT, G.W. Quinine prophylaxis in malaria. British medical journal, October 1918, vol. 26, n. 2, s ISSN: SHOKEEN, P., et al. In vitro activity of eugenol, an active component from Ocimum sanctum, against multiresistant and susceptible strains of Neisseria gonorrhoeae. International Journal of Antimicrobial Agents, August 2008, vol. 32, no. 2, s ISSN SCHIMKE, T.R., et al. The generation of energy by the arginine dihydrolase pathway in Mycoplasma hominis 07. The Journal of biological chemistry. May 1966, vol. 241, no. 10, s ISSN: SINGH, G. et al. A comparison of chemical, antioxidant and antimicrobial studies of cinnamon leaf and bark oils, oleoresins and their constituents. Food and Chemical Toxicology, 2007, vol. 45, s ISSN: SU, C.J. BASEMAN, J.B. Genome size of Mycoplasma genitalium. Journal of Bacteriology, August 1990, vol. 172, no. 7, s ISSN: TARASKINA, A.E. et al. Drift of tetm determinant in urogenital microbiocenosis containing mycoplasmas during treatment with a tetracycline antibiotic. Bulletin of experimental biology and medicine, July 2002, vol. 134, no. 1, s ISBN:

48 TAYLOR-ROBINSON, D. BÉBÉAR, C. Antibiotic susceptibilities of mycoplasmas and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobial agents and chemotherapy, November 1997, vol. 40, no. 5, s ISSN: TAYLOR-ROBINSON, D. FURR, P.M. Further observations on the murine model of Mycoplasma hominis infection. Journal of Medicine Microbiology, August 2010, vol. 59, Pt 8, s ISSN: TAYLOR-ROBINSON, D. FURR, P.M. Genital mycoplasma infections. Wiener klinische Wochenschrift, August 1997, vol. 109, no , s ISSN: TAYLOR-ROBINSON, D. GILROY, G.B. KEANE, F.E. Detection of several Mycoplasma species at various anatomical sites of homosexual men. European journal of clinical microbiology & infectious diseases, May 2003, vol. 22, n. 5, s ISSN: TAYLOR-ROBINSON, D. MCCORMACK, W.M. The genital mycoplasmas (first of two parts). The New England journal of medicine, May 1980, vol. 302, no. 18, s ISSN: TAYLOR-ROBINSON, D. ROSENSTEIN, I.J. Is Mycoplasma hominis a vaginal pathogen? Sexually Transmitted Infections, August 2001, vol. 77, no. 4, s ISSN: TAYLOR-ROBINSON, D. Mykoplazmata. In Lékařská mikrobiologie. 1. vyd. Praha: Grada, Kapitola 42, s ISBN TAYLOR-ROBINSON, D. The Mycoplasmatales. In Systematic bakteriology. Philadelphia, Pennsylvania: B.C. Decker Inc. 1993, s ISBN: TULLY, J.G. RAZIN, S. Molecular and diagnostic procedures in mycoplasmology. San Diego, Californie: Academic Press, 1996, s ISBN: ULLMANN, U. SCHUBERT, S. KRAUSSE, R. Comparative in-vitro of levofloxacin, other fluoroquinolones, doxycycline and erythromycin against Ureaplasma urealyticum and

49 Mycoplasma hominis. Journal of antimicrobial chemotherapy, June 1999, vol. 43, s ISSN: ULTEE, A. SMID, E.J. Influence of carvacrol on growth and toxin production by Bacillus cereus. International Journal of Food Microbiology, 2001, vol. 64, no. 3, s ISSN: URBÁŠKOVÁ, P. Rezistence bakterií k antibiotikům. Vybrané metody. Praha, Trios, VODRÁŽKA, Z. Biochemie, Academia, 2002, s VOTAVA, M. et al. Lékařská mikrobiologie obecná. Neptun, 2005, s VYDRŽALOVÁ, M. Mycoplasma hominis v genitálním ústrojí žen, Disertační práce. Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové, WAITES, K.B. - CRABB, D.M. DUFFY, L.B. Comparative In Vitro Activities of the Investigational Fluoroquinolone DC-159a and Other Antimicrobial Agents against Human Mycoplasmas and Ureaplasmas. Antimicrobial Agents Chemotherapy. October 2008, vol. 52, no. 10, s ISSN: WAITES, K.B. CRABB, D.M. DUFFY, L.B. Comparative in vitro susceptibilities of human mycoplasmas and ureaplasmas to a new investigational ketolide, CEM-101. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, May 2009, vol. 53, n. 5, s ISSN WANG, P. KONG, C.H. ZHANG, C.X. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil from Ambrosia trifida L.. Molecules. 2006, vol. 25, n. 7, s , ISSN: WANG, R. WANG, R. YANG, B. Extraction of essential oils from five cinnamon leaves and identification of their volatile compund compositions. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2009, vol. 10, s ISSN:

50 WONG, S.Y., et al. Antibacterial activities of naturaly occuring compounds against Mzcobacterium avium spp. Paratuberculosis. Applied and environmental microbiology, October 2008, vol. 73, no. 19, s ISSN: ZARIFFARD, M.R. et al. Detection of bacterial vaginosis-related organisms by real-time PCR for Lactobacilli, Gardnerella vaginalis and Mycoplasma hominis. FEMS immunology and medical microbiology, December 2002, vol. 34, no. 4, s ISBN: ZHANG, Q. WISE, K.S. Localized frameshift mutation in an adhesin gene confers a phasevariable adherence phenotype in mycoplasma. Molecular Microbiology, September 1997, vol. 25, no. 5, s ISSN: X. Elektrnické zdroje Rod Mycoplasma [online] [ ] Dostupný z www: ( Karvakrol: [online] [ ] Dostupný z www: ( Cinnamaldehyd: [online] [ ] Dostupný z www: ( C/Cinnamaldehyde.htm) Anethol: [online] [ ] Dostupný z www: (

51 Seznam obrázků Obr. 1 Dělení mykoplazmat...12 Obr. 2 Strukturní vzorec karvakrolu...21 Obr. 3 Strukturní vzorec cinnamaldehydu (hlavní složka skořicového oleje)...22 Obr. 4 Strukturní vzorec eugenolu...23 Obr. 5 Strukturní vzorec anetholu

52 Seznam tabulek Tab. 1 Minimální inhibiční koncentrace inhibující 90 % kmenů Mycoplasma hominis publikované různými autory (mg/l)...15 Tab. 2 Minimální inhibiční koncentrace anetholu a eugenolu na různé druhy mikroorganismů stanovena zkumavkovou diluční metodou...25 Tab. 3 Přehled testovaných antibiotik a zvolené koncentrační rozmezí...28 Tab. 4 Přehled zkoumaných přírodních látek a zvolené koncentrační rozmezí...28 Tab. 5 Minimální inhibiční koncentrace antibiotik na Mycoplasma hominis stanovena zkumavkovou diluční metodou (vyšetřeno 40 kmenů)...33 Tab. 6 Vzhled roztoků přírodních látek po jejich rozpuštění ve 24% ethanolu...33 Tab. 7 Minimální inhibiční koncentrace přírodních látek na Mycoplasma hominis stanovena zkumavkovou diluční metodou (vyšetřeno 40 kmenů)

53 Přílohy Priloha 1 Charakteristický tvar kolonií Mycoplasma hominis na PPLO agaru (150x) Priloha 2 Růst Mycoplasma hominis v PPLO bujónu s argininem a fenolovou červení