M I K R O S K O P I E

Transkript

1 Inovace předmětu KBB/MIK SVĚTELNÁ A ELEKTRONOVÁ M I K R O S K O P I E Rozvoj a internacionalizace chemických a biologických studijních programů na Univerzitě Palackého v Olomouci CZ.1.07/2.2.00/

2 Přednáška 5 Typy mikroskopů Mikroskop jako mikromanipulátor Superrozlišovací Mikroskopie Pavla Válová, 2014

3 L u p a x m i k r o s k o p L u p a - z jedné nebo více čoček o krátké ohniskové vzdálenosti ( f ) - pozorovaný předmět vkládáme mezi čočku a její přední ohnisko (F) - vzniklý obraz je přímý, neskutečný a zvětšený Lineární zvětšení lupy: M = 250 / f 250 = normální zraková délka (250 mm) f = ohnisková vzdálenost čočky Maximální zvětšení lupy 30x f Pozn.: Oko přibližujeme k lupě co nejblíže (zadní ohnisko čočky leží ve středu oka)

4 Preparační mikroskop Porrova prizmata Olympus SZX7 Velká pracovní vzdálenost; nepřevrácený obraz Důležitá součást: Porrova prizmata

5 Preparační mikroskroskop (stereomikroskop) - dvě čočkové soustavy (dva objektivy, dva okuláry) - velká pracovní vzdálenost (cca 10 cm) - skleněné hranoly Porrova prismata (pod okulárem, obracejí převrácený obraz z objektivů) Zvětšení: u jednoduchého stereomikroskopu 6,7-40x; kvalitnější x Další zvětšení stereomikroskopu pomocí tzv. zoomu Celkové zvětšení = Z objektivu x Z okuláru x Z zoomu Příklady: Olympus SZ30, SZ40, SZX7 ve cvičení

6 Tužkový mikroskop PEAK Kapesní mikroskop pro práci v terénu Jasný obraz, široké zorné pole, nízká hmotnost. Pro zaostření mikroskopu se opře jeho průhledná špička (výřezem k sobě) o pozorovaný předmět a nahýbáním mikroskopu dopředu a dozadu se najde vhodná poloha s nejostřejším obrazem. Možnosti zvětšení: buď 15x; nebo 25x; 50x; 75x; 100x Cena: ,- Kč

7 Typy mikroskopů Inverzní mikroskop (IMT-2 Olympus) Pozorování buněk zespodu - objektivy pod stolkem - kondenzor nad objektem Využití: Pozorování buněčných kultur na dně kultivačních nádob in vivo

8 Inverzní mikroskop Olympus CKX41 Olympus CK40

9 Mikroskopy průmyslové - pro kontrolu polovodičů Mikroskop MX50

10 Leica Mikromanipulátor

11 Mikroskop jako mikromanipulační nástroj Optická pinzeta umožňuje měřit síly a energie potřebné k vytvoření makromolekulárních komplexů nebo k přeskupení struktur, jejichž součástí jsou bílkoviny Artur Ashkin patent konec 70. let 20. stol.

12 Optická pinzeta - schéma vzorek: vlákno DNA mikropipeta laserový paprsek objektiv osvětlovací systém mikroskopu průhledný mikroobjekt v optické pasti bod zborcení nukleozomu dichroické zrcadlo detektor polohy kuličky Vesmír 83

13 Princip optické pinzety: - vytvoření optické pasti pomocí zaostření intenzivního laserového paprsku objektivem světelného mikroskopu, do které je vtahován průhledný mikroobjekt (velikost několik µm) - možnost měřit velikost vychýlení tohoto objektu působením vnější síly (F) F = k. x k = konstanta (kalibrace) x = velikost vychýlení (až 1 nm) - měříme síly řádu pikonewtonů (10-12 N)

14 Příklady využití optické pinzety: - měření elastických vlastností proteinových komplexů s DNA - měření síly, kterou musí vyvinout RNApolymeráza pro přepis DNA do RNA - měření sil spjatých s kráčením kinezinu (typ molekulárního motoru)

15 Laserová mikrodisekce = nástroj pro manipulaci s mikroskopickými vzorky (buněčné organely nebo jednotlivé chromozómy) - umožňuje cílené vyseknutí definovaných buněk z histologického preparátu pomocí laserového paprsku Příklad: Laserová mikrodisekce CellCut - vzorek je po vyřezání vybraného objektu pomocí laserového svazku (UV-A laser) nalepen na sběrné víčko eppendorfky

16 Sestava systému MicroBeam

17 OLYMPUS MicroBeam Hep3B buňky pro následnou p53 genomovou analýzu H+E barvené buňky na membráně Vyříznutí memrány Katapultace metodou LPC Buňka ve sběrném víčku Izolace chromozómu po vyříznutí

18 CellSurgeon by ROWIAK Multiphoton Imaging and Dissection Instrument

19 CellSurgeon Dissection and extraction of chromosomes CellSurgeon Precise dissection of actin filaments in live cell

20 Využití laserové mikrodisekce v biologii: Mikrochirurgie mikroskopicky malých vzorků (buněk a buněčných organel) Selektivní destrukce buněk, buněčných organel nebo subbuněčných částic uvnitř živého organismu pro studium chování buněk Bezkontaktní laserová mikroinjektáž léčiv nebo genetického materiálu bez mechanických nástrojů a nosičů Fúze jednotlivých buněk nebo buněčných kompartmentů Selektivní fúze buněk, vesikul nebo buněčných částí Selekce a separace buněk, kvasinek, bakterií nebo subbuněčných struktur

21 Typy mikroskopů Digitální mikroskopy

22 Digitální mikroskopy Carson MM-480 zelený 35x zvětšení s kamerou Cena s DPH 1749,- Kč mofe67scfyzz3godu30a_w Různé typy malých mikroskopů

23 Programy pro záznam upravování a přenos obrazu

24 Digitální kamera - Model DP30BW Olympus - vysoce citlivá a rychlá černobílá kamera - CCD - chip chlazený Peltierovým článkem na teplotu 5 C - redukce šumu na pozadí mimořádně jasný fluorescenční obraz - vysoká přenosová rychlost: 15 snímků/s při max. rozlišení 1360 x 1024

25 Digitální kamera Model DP71 Olympus - rozlišení 12,5 megapixelů (4080 x 3072) - pro barevnou mikrofotografii na světelném mikroskopu včetně fluorescence s nízkou úrovní signálu - CCD - chip chlazený Peltierovým článkem na teplotu 10 C pod teplotu okolí - vysoká přenosová rychlost pro živý obraz: 15 snímků/s (rozlišení 1360 x 1024)

26 Program M.I.S. QuickPHOTO - určen k ovládání digitálních fotoaparátů CAMEDIA a přímému fotografování do počítače - využití především v mikrofotografii (výrazné urychlení celého procesu pořízení snímku) Program QuickPHOTO Pro umožňuje navíc - měření velikosti objektů - vkládání kalibrovaného měřítka do snímku

27 MISTIC (M.I.S. Tele-image consulting) 1.2 Telemikroskopický systém pro dálkové online konzultace digitálních snímků Audiovizuální konzultace digitálních snímků v reálném čase prostřednictvím Internetu Využití: - především v lékařských oborech (patologii, rentgenologii, radiologii) - v materiálovém výzkumu a řízení jakosti Systém pracuje se snímky pořízenými libovolným digitálním fotoaparátem, digitálním mikrofotozařízením nebo scannerem

28 Aplikace kombinující výpočetní techniku s moderními CCD kamerami (rozlišení 4096 x 4096 pixelů) - možnosti kvantitativního zpracování digitálních mikroskopických snímků (identifikace a počítání objektů v zorném poli, měření jejich velikosti nebo zařazování do vybraných tříd) - kvantitativní rozdílové nebo poměrové porovnání dvou mikroskopických snímků - doostřování snímků digitálními filtracemi pomocí speciálních matematických postupů - zvýšení rozlišení pomocí metod speciální numerické filtrace digitálních mikroskopických obrazů (překračující Abbeovu mez rozlišovací schopnosti)

29 - potlačení rozostření pomocí výpočtu (dekonvoluce) s využitím funkce bodového rozmazání výhoda: na rozdíl od konfokálního mikroskopu není vázána na fluorescenci nevýhoda: časová náročnost - vyloučení rozostřených rovin pomocí detekce hran (získání obrazu, který předčí fyzicky dosažitelnou hloubku ostrosti) - metoda využívající optiku s kódovanou vlnoplochou (Wavefront Coded Optics) umožňuje zvětšit hloubku ostře zobrazovaného pole více než 10x oproti klasickému optickému mikroskopu princip: cílené rozmazání primárního obrazu vytvářeného objektivem, využívající matematické algoritmy radarových systémů; patent v r. 2000

30 Dekonvoluce - Metoda softwarové rekonstrukce původního nezkresleného vzorku bod Ing. Pavel Krist, Ph.D.; obchodní zástupce Carl Zeiss spol. s.r.o.

31 Superrezoluční (superrozlišovací) mikroskopie STED SIM 3D mikroskop 4Pi mikroskop NSOM STORM PALM FPALM

32 STED (Stimulated Emission Depletion) Fluorescenční mikroskopie umožňující dosáhnout rozlišení vyšší (30 nm), než je klasická mez (0,61. λ/na obj tj. asi 250 nm). Princip metody: - tlumení fluorescence excitovaných molekul v krajních partiích stopy (rozptylové funkce) skenujícího laserového svazku pomocí dvou časově synchronizovaných a prostorově koincidujících (souosých) laserových pulsů první (excitační, budící) - provádí excitaci fluorochromů druhý (STED puls, depleční) - tlumí (ochuzuje) saturací emisi K tlumení emise dochází v okrajových partiích stopy excitačního svazku, její střed však není tlumen podstatné zmenšení fluorescenční stopy, a tím výrazné zvýšení rozlišení (Point Spread Function engineering). Více zde:

33 Leica TCS SP8 STED

34 Princip mikroskopie STED u mikroskopu Leica TCS SP5 STED Profesor Stefan W. Hell 1 paprsek budicího laseru (exitační záření) 2 paprsek deplečního laseru 3 původní excitační kroužek (klasický konfokální) 4 depleční (STED) kroužek 5 výslední excitační bod (menší než 90 nm) 6 konfokální clona 7 detektor 8 dichroické destičky 9 λ/2 fázová destička

35 Porovnání výsledků dosažených pomocí klasické konfokální mikroskopie (vlevo) a pomocí mikroskopie STED (vpravo). (Mikrotubuly v Hela buňkách značené fluorochromem Atto 647 N.) Jochen Sieber, Leica Microsystem.

36 Porovnání výsledků dosažených pomocí klasické konfokální mikroskopie (nahoře) a pomocí mikroskopie STED (dole).

37 SIM (Structured Illumination Microscopy) - využívá osvětlení vzorku světlem s pruhovaným vzorem vzniklým difrakcí na mřížce - interferencí s detaily vzorku vzniká moiré efekt - jeho následným počítačovým zpracováním lze spočítat, jak vypadaly struktury, jenž ho způsobily, a získat tak obrázek obsahující jemnější detaily s rozlišením okolo 100 nm 1 µm Detail jaderné membrány: červeně jaderné póry (anti-npc) zeleně jaderný obal (anti-lamin) modře chromatin (DAPI) Nahoře: rastrovací konfokální mikroskop Dole: 3D-SIM

38 Konvenční konfokální mikroskop x SIM

39 4Pi mikroskop - podobný klasickému konfokálnímu mikroskopu - má 2 stejné objektivy, každý na opačné straně vzorku, zaostřené na stejné místo Obrazy z nich se skládají a ve výsledku tak fungují jako jeden objektiv s dvojnásobkem numerické apertury, což vede ke zlepšení rozlišení. Díky interferenci proti sobě jdoucích paprsků se ještě více zmenšuje objem, do nějž se promítá bod, zejména v axiálním (ve směru osy) směru. Výsledné laterální (boční) rozlišení dosahuje až 100 nm a axiální rozlišení až 190 nm.

40 Schéma 4Pi mikroskopu DM Laser BS Detektor Bod jako Airyho kroužek Objektiv Objektiv BS rozdělovač paprsku laseru DM dichroické zrcadlo

41 Skenovací optická mikroskopie blízkého pole (NSOM) (Near-field Scanning Optical Microscopy) - zobrazuje vzorky pomocí skenování sondou nanometrových rozměrů sloužící jako zdroj světla a/nebo detektor fluorescenčního záření - jako sonda slouží hrot z průhledného materiálu v neprůhledném obalu, který má na konci miniaturní otvor - menší než vlnová délka světla, které tak nemůže projít skrz - v blízkém okolí otvoru se však tvoří evanescentní vlna, která dokáže excitovat blízké fluorofory; intenzita vlny exponenciálně klesá se vzdáleností, takže oblast, v níž se excitují fluorofory, je menší než difrakční limit (asi 100 nm). - Nevýhoda: dokáže zobrazovat jen povrch vzorku

42 Metody STORM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy) PALM (PhotoActivation Localization Microscopy) FPALM (Fluorescence PhotoActivation Localization Microscopy) - Metody byly nezávisle publikovány krátce po sobě a využívají stejný princip. - Fluorofory pro tyto techniky mají dva stavy - jeden schopný fluorescence a druhý fluorescence neschopný, které se dají přepínat světlem různých vlnových délek nebo se přepínají stochasticky (nahodile). - Ve stavu schopném fluorescence se nachází vždy jen velmi malý podíl všech fluoroforů, jejichž fluorescence se snímá, dokud nedojde k jejich vybělení. Poté se převede do stavu schopného fluorescence další malá část fluroforů a snímají se, dokud se nevybělí. Tento postup se opakuje, dokud není nasnímáno dostatečné množství fluoroforů.

43 Fotony nasnímané z jednoho fluoroforu jsou detekovány na širším prostoru podle rozptylové funkce (PSF, point spread function). Poté se matematicky určí střed PSF a danému fluoroforu se přiřadí tato spočítaná souřadnice. Čím více fotonů se detekuje z daného fluoroforu, tím lépe je definovaná PSF a tím přesnější je lokalizace fluoroforu. Lze dosáhnout rozlišení až v jednotkách nm. Jako fluorofory se využívají buď fotoaktivovatelné fluorescenční proteiny (např. PA-GFP), nebo organické fluorescenční barvy (např. Cy5 spojená s Cy3). K aktivaci fluoroforu obvykle dochází osvícením laserem s nízkou intenzitou, využívající jinou barvu, než se poté využívá k vybuzení fluorescence. Nevýhoda: obvykle delší doba snímání celkového obrazu, protože se musí nasnímat velké množství dílčích obrazů

44 Superrezoluční mikroskop v ČR V ÚMG AV ČR v Praze-Krči zapůjčen pro základní výzkum (monitorování fungování procesů ve zdravém a nemocném organismu, vývoj léků) 4. v Evropě v Barceloně, Amsterdamu a Budapešti - stativ, objektiv, okulár, místo pro preparát na mikroskopickém skle - plně automatický - umožňuje vidět detaily v buňce na molekulární úrovni Rozlišení nm (cena + 20 mil. Kč)

45 3D mikroskop v ČR s rozlišením až 25 nm Fyziologický ústav Akademie věd v Praze Optické mikroskopy neumožňují rozlišení vyšší než asi 250 nm, což je tloušťka mitochondrií, buněčných organel dávajících energii, ale i signály při mnoha fyziologických pochodech. Vysoké rozlišení 3D mikroskopem umožní studovat strukturu mitochondrií a jejich sítě, které v buňce vytvářejí, organizaci mitochondriální DNA a děje, které vedou k jejím mutacím. Mikroskop pomůže identifikovat diabetický stav beta buněk a v budoucnu možná i svalových buněk ještě dříve, než je možné zjistit vysokou hladinu cukru v krvi. Studie diabetu probíhají ve spolupráci s Františkem Saudkem z IKEM, světovým odborníkem na transplantaci Langerhansových ostrůvků diabetikům. Zdroj: /veda.aspx?c=a110729_222435_ln_veda_ape

46 Mikroskop s dokonalou čočkou Paprsky světla se v dokonalé čočce pohybují po kružnicích a na rozdíl od běžných čoček se při zobrazení využijí všechny paprsky. - pomocí obyčejného světla bude možno pozorovat mnohem menší objekty než dnes, kdy jsme od určitého rozlišení závislí na elektronových mikroskopech Využití: - v biologii - pozorování např. živých buněk bez jejich narušení - pokrok při výrobě integrovaných obvodů a mikročipů (při nanášení čím dál menších struktur na křemíkové desky)

47 ZAJÍMAVOST : Nejlepší mikroskop na světě Podle článku publikovaného na portále phys.org (odkaz ZDE) v červnu roku 2013 se nejpokročilejší mikroskopovací přístroj na světě nachází na University of Victoria v Britské Kolumbii v Kanadě. Jedná se o 7 tun vážícího a 4,5 metru vysokého obra, kterého vědci zkráceně označují za STEHM (z anglického scanning transmission electron holography microscope volný překlad do češtiny: skenovací prozařovací elektronový holografický mikroskop). Jedná se o vůbec první mikroskop tohoto druhu na světě. Mikroskop STEHM ve skutečnosti (srv. výška židle vs. výška mikroskopu) ZDROJ: 9A0115_small.jpg

48 Optické mikroskopy Firmy: Olympus japonská, sídlo Tokio Evropa: Hamburk v Německu ( Nikon japonská, sídlo Tokio Evropa: Badhoevedorp, Holandsko ( Leica švýcarská Zeiss německá, Jena Arsenal (obchodní organizace) Meopta Přerov (optika pro vojenské účely) ( ( (

49 Mikroskopy atomárních sil Řádkovací tunelová mikroskopie Mikroskopie atomárních sil

50 Řádkovací tunelový mikroskop (STM - Scanning Tunnelling Microscope) 1981 v Curychu (G. Binning, H. Rohrer; Nobelova cena 1986) - rozlišení pod nm (možná identifikace jednotlivých atomů) schéma měření proudu vodivý hrot tunelující elektrony vodivý skenovací povrch

51 Řádkovací tunelový mikroskop (STM) Povrch železa s nečistotami chrómu

52 Řádkovací tunelový mikroskop (STM) Chlapec a jeho atom Hlavním hrdinou filmu je bezejmenný hoch oddávající se radostem života. Divák je vtažen do děje jednoduchými výrazovými prostředky mimikou, tanečními kreacemi, driblováním s míčem a skoky na trampolíně. Režie: Andreas Heinrich a kol. Filmové laboratoře IBM, Kalifornie. Animace: Řádkovací tunelový mikroskop. Filmové efekty: Oxid uhelnatý. Reklamní upoutávka na nejmenší film na světě.

53 Mikroskop atomárních sil (AFM - Atomic Force Microscope) 1986 (G. Binning, C. Quate, Ch. Gerber) - rozlišení pod desítky nanometrů (vlákno DNA, atomy) CCD kamera Držadlo Piezokeramika pro posun v ose X a Y Žárovka Stavění nožiček Šrouby k nastavení laseru Vespod skenující hrot Mikroskop AFM - Centrum výzkumu nanomateriálů na pracovišti Katedry experimentální fyziky UP Olomouc Popis mikroskopu AFM

54 Mikroskop atomárních sil (ASM) - schéma laserový paprsek nevodivý skenovaný povrch elektrostatické a van der Waalsovy síly

55 Mikroskop atomárních sil (AFM) řádek atomů Povrch křemíku AFM (plocha 18 x 18 nm 2 ) Struktury uvnitř atomů wolframu Modifikace AFM mikroskopu: FM-AFM (Frequency Modulated AMF) největší rozlišení 77 pm (77 x m); plocha 500 x 500 pm 2

56 Mikroskop atomárních sil (AFM) Veeco

57 Další informace: Kubínek R., Vůjtek M., Mašláň M.: Mikroskopie skenující sondou. PřF UP Olomouc, Katedra experimentální fyziky. entace/kubinek/spm.pdf