Detekce mikroorganismů účastnících se tvorby biogenních aminů ve fermentovaných potravinách

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a technologie potravin Detekce mikroorganismů účastnících se tvorby biogenních aminů ve fermentovaných potravinách Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Radka Burdychová, Phd. Vypracovala: Bc. Jitka Blahová Brno 2008

2 1

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Detekce mikroorganismů účastnících se tvorby biogenních aminů ve fermentovaných potravinách vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. V Brně, dne Podpis diplomanta. 2

4 Poděkování: Touto cestou bych chtěla poděkovat vedoucí diplomové práce Ing. Radce Burdychové, Phd. za odborné vedení, konzultace a připomínky při zpracování diplomové práce. Dále pak děkuji Ing. Pavle Sládkové a Mgr. Vlastimilu Dohnalovi, Phd. a také ostatním pracovníkům Ústavu chemie a technologie potravin za jejich pomoc při mikrobiologických analýzách a poskytnutí potřebných informací a materiálů k této práci. 3

5 ANOTACE Cílem této diplomové práce byla detekce mikroorganismů účastnících se tvorby biogenních aminů ve fermentovaných potravinách. Mikroorganismy pocházely z izolátů polotvrdých sýrů a z čistých bakteriálních kultur používaných jako součást startovacích a probiotických kultur při výrobě potravin živočišného původu. Bakteriální izoláty a kmeny jednotlivých sledovaných rodů byly prověřovány na produkci histaminu a tyraminu. Detekce byla prováděna skríningovou kultivační metodou a vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Izoláty bakterií, které vykazovaly schopnost tvořit histamin nebo tyramin byly dále identifikovány pomocí řady biochemických testů, díky nimž byly zařazeny do rodů Enterococcus a Streptococcus. U startovacích a probiotických kultur bylo zjištěno, že 5 ze 6 rodů tvořilo tyramin. Byly to rody: Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus a Bifidobacterium. Žádný z bakteriálních rodů neprodukoval histamin. Bakteriální kmeny, které netvoří BA jsou vhodné k přípravě fermentovaných potravin. Výrobky vyrobené pomocí kultur produkujících BA by měly být prověřovány na celkový obsah BA. Klíčová slova: biogenní aminy, histamin, tyramin, probiotické a startovací kultury 4

6 ANNOTATION The purposes of this Graduation paper has been a micro-organisms detection entrancing at biogenic amines propduction in ferment foodstuff. Micro-organisms proceed from the symplex of semi-hard cheese and from the clean bacterial culturs used as a part of starter and probiotic culture at the production of livestock origin foodstuff. Bacterial samples and tribes of individual monitored genus have been verified on histamine and tyramine performance. The detection has been provided by a screeaning cultural method and high pressure liquid chromatography. Bacterial samples, which have embodied an ability to create histamine or tyramine were further identified by the help of biochemical tests, and they have been enlisted into stocks Enterococcus and Streptococcus. At the starter and probiotic culture there was an inquest that 5 of 6 genus had created tyramine. There were genera: Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus and Bifidobacterium. None of bacterial genus had produced histamine. The strains at which production of biogenic amines wasn t detected are suitable for fermented food processing. The produce which are made with the help of culture produce BA would be control of concentration of biogenic amines in final product. Key words: biogenic amines, histamine, tyramine, probiotic and starter cultures 5

7 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Vznik a rozdělení biogenních aminů Faktory ovlivňující vznik biogenních aminů Biologické účinky biogenních aminů a polyaminů Odbourávání biogenních aminů v organismu Hygienický význam biogenních aminů Výskyt biogenních aminů Nefermentované potraviny Fermentované potraviny Metody stanovení biogenních aminů Legislativa hygienické limity BA Mikroorganismy podílející se na tvorbě biogenních aminů Startovací kultury Probiotické kultury Význam probiotik Mechanismus účinku probiotik MATERIÁL A METODY Materiál Použité chemikálie Použité přístroje Použité pomůcky Použité testovací soupravy Použitá kultivační média Použité kontrolní kmeny mikroorganismů Metody průkazu mikroorganismů Biochemické testy Izoláty mikroorganismů z polotvrdých sýrů Očkování a kultivace Probiotické a startovací kultury Očkování a kultivace

8 5 VÝSLEDKY Izoláty bakterií z polotvrdých sýrů Probiotické a startovací kultury DISKUZE ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA PŘÍLOHA

9 1 ÚVOD V současné době trh nabízí velký sortiment potravin, ze kterého má spotřebitel možnost výběru podle svých požadavků a kritérií. Chce si být jistý, že výrobky, které kupuje, jsou charakterizovány nejen dobrou kvalitou a nutriční hodnotou, ale především zdravotní nezávadností a bezpečností. Díky tomu vzrostl poslední dobou zájem o problematiku vzniku a výskytu biogenních aminů v potravinách a jejich vliv na lidské zdraví. Biogenní aminy se nacházejí v potravinách buď přirozeně nebo vznikají z aminokyselin působením mikroorganismů. Některé člověk potřebuje k zajištění vybraných fyziologických pochodů, např. působí jako hormony, podílejí se na syntéze nukleových kyselin a bílkovin. Pokud jsou však přijímány v nadměrném množství mohou způsobovat zdravotní problémy, zejména u citlivých osob, které trpí migrénami nebo užívají léčiva ze skupiny psychofarmak. Některé biogenní aminy mohou i podporovat růst nádorů. Biogenní aminy jsou nejčastěji produkovány bakteriemi mléčného kvašení, které se používají při výrobě fermentovaných potravin. Tyto mikroorganismy se do potravin přidávají z technologických důvodů, např. jako startovací kultury do masných výrobků, případně jako zákysové kultury v mlékařství. Jejich vlivem dochází jednak ke změnám fyzikálně-chemickým (textura, ph), ale uplatňují se i senzorické změny výrobků, jako je tvorba chuťových a aromatických látek. Dalším důvodem přidávání mikroorganismů do potravin je jejich probiotický efekt. Probiotické působení mikroorganismů je založeno na tom, že při konzumaci výrobků obsahujících živé bakterie dochází ke zlepšení zdraví spotřebitele, protože probiotické mikroorganismy inhibují růst a přežívání patogenů v lidském střevě. Aby tyto pozitivní účinky bakterií nebyly zastíněny tvorbou nežádoucího množství biogenních aminů je nutné pečlivě vybírat bakteriální kmeny, které se jako startovací a probiotické kultury používají. Současně musíme vědět, které druhy mikroorganismů biogenní aminy produkují, abychom se mohli jejich případného užití vyvarovat. 8

10 2 CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce bylo provést detekci mikroorganismů účastnících se tvorby biogenních aminů (BA) ve fermentovaných potravinách. Byly stanovený tyto dílčí cíle: Zpracovat literární rešerši o rodech a druzích mikroorganismů, která mají schopnost tvořit BA. Naučit se laboratorní mikrobiologickou detekci mikroorganismů s dekarboxylázovou aktivitou. Identifikovat neznámé bakterie produkující BA. Zjistit schopnost tvorby BA jednotlivými bakteriálními druhy používanými jako startovací nebo probiotické kultury. 9

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Vznik a rozdělení biogenních aminů Biogenní aminy (BA) jsou nízkomolekulární dusíkaté baze, které jsou přítomny ve všech živých organismech. Poprvé byly popsány Guggenheimem v r Zdrojem jsou aminokyseliny, jejichž dekarboxylací dochází ke vzniku biogenních aminů. K dekarboxylaci dochází při látkové výměně v lidském organismu, v rostlinách a v mnohých živočišných produktech vlivem určitých skupin enzymaticky aktivních mikrobů (KONEČNÝ, 2005). V potravinách a potravinových surovinách vznikají BA nejčastěji dekarboxylací aminokyselin působením bakteriálních dekarboxylačních enzymů. Na vzniku BA se mohou kromě mikrobiálních dekarboxyláz (exogenních) podílet i endogenní dekarboxylázy tedy enzymy vlastní dané potravině nebo surovině. Dekarboxylázy, které se účastní vzniku BA se označují podle příslušné aminokyseliny, kterou dekarboxylují. Z histidinu vzniká dekarboxylací histidinderboxylázou histamin, z lysinu lysindekarboxylázou kadaverin, atd. Zvlášť významně se endogenní dekarboxylace uplatňuje u potravin rostlinného původu. Biogenní aminy mohou také vznikat z aminokyselin a karbonylových sloučenin působením transaminás. Při jejich transformaci na další biologicky aktivní produkty se uplatňují některé oxigenázy a methyltransferázy (VELÍŠEK, 2002). Podle chemické struktury se alimentárně významné biogenní aminy dělí na: Alifatické: putrescin (PUT), kadaverin (CAD), spermidin (SPD), spermin (SPM) a agmatin (AGM) Aromatické: tyramin (TYR) a 2-fenylethylamin (PEA) Heterocyklické: histamin (HIS) a tryptamin (TRY) Zvláštní postavení zaujímají polyaminy spermidin a spermin, včetně diaminu putrescinu. Putrescin je řazen do skupiny polyaminů (na rozdíl od kadaverinu), protože je přímým meziproduktem syntézy spermidinu a sperminu (KOMPRDA, 2005). 10

12 Dekarboxylací dochází k odštěpení karboxylu z příslušné aminokyseliny. Takto vzniká histamin z histidinu, tyramin z tyrosinu, 2-fenylethylamin z fenylalaninu, tryptamin z tryptofanu a kadaverin z lysinu. Putrescin může vznikat dvěma způsoby: přímo z ornitinu nebo nepřímo z argininu přes amin agmatin (SILLA-SANTOS, 1996; KALAČ a KŘÍŽEK, 2005). Z putrescinu vzniká methylací S-adenosylmethioninem spermidin a dále spermin (VELÍŠEK, 2002). Obr. 1 Vznik biogenních aminů 11

13 3.1.1 Faktory ovlivňující vznik biogenních aminů Na tvorbě BA se podílí řada vlivů, jako je ph, teplota, doba skladování, použití startovacích kultur a další. Ale mezi základní podmínky patří: přítomnost volných (biologicky dostupných) aminokyselin, výskyt mikroorganismů s dekarboxylační aktivitou a vhodné prostředí pro růst a množení těchto mikroorganismů. Důležitá pro tvorbu BA je proteolýza, ať již autolytická nebo bakteriální. Schopnost produkovat dekarboxylační enzymy se u jednotlivých mikroorganismů liší. Nejčastěji jsou produkovány rody Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella, Photobacterium, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Lactobacillus, Pediococcus a Streptococcus. Produkce jednotlivých BA se liší i mezi jednotlivými kmeny daného druhu až o tři řády, proto neexistuje závislost mezi počtem bakterií a množstvím BA (SHALABY, 1996; KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). 1. Voda obsažená v potravinách aktivita vody Vodní aktivita a w se rovná poměru tlaku vodních par nad potravinou k tlaku vodních par nad destilovanou vodou. Optimální hodnota a w je pro většinu mikroorganismů a w > 0,98. Odolnost proti nižší hodnotě je největší u plísní, menší u kvasinek, ještě menší u G + bakterií a nejmenší u G - bakterií. Snížením vodní aktivity dochází nejen k zastavení činností mikroorganismů, ale i ke snížení či úplné inaktivaci enzymů. 2. Koncentrace vodíkových iontů (ph) Jako optimální ph pro dekarboxylaci aminokyselin se uvádí kyselé, v rozmezí 2,5 6,5. Růst bakterií v kyselém prostředí stimuluje tvorbu dekarboxyláz. Podmínky prostředí povzbuzují silněji bakterie k produkci těchto enzymů jako obraného mechanismu proti aciditě. Například laktobacily, enterokoky aj. si adaptivně zvyšují suboptimální ph prostředí dekarboxylací aminokyselin histidinu a tyrozinu na histamin a tyramin. 3. Teplota Teplota prostředí významně ovlivňuje enzymatickou aktivitu mikroorganismů a tím i vznik BA. Jejich produkce je úměrná teplotě a době skladování. Teplota je nejdůležitějším opatřením bránícím vzniku biogenních aminů. Optimální teplota pro tvorbu histaminu má velké rozmezí (5 38 o C), závisí hlavně na druhu přítomné 12

14 mikroflóry. Mezní hodnotou pro tyramin je 10 o C. Nižší teploty nedovolují jeho tvorbu, kvůli inaktivaci enzymu tyrozindekarboxylázy (GREIFOVÁ et al., 2003). Vaření má malý vliv na obsah biogenních aminů, protože jsou termostabilní. Jakmile se biogenní aminy v potravině vytvoří je obtížné je zničit. Přesto ale může docházet k částečnému snížení jejich množství při tepelné úpravě reakcí s redukujícími cukry, respektive s rozkladnými produkty cukrů při Maillardově reakci (VELÍŠEK, 2002). Tepelným zpracováním může docházet také k inaktivaci pyridoxalfosfátu, kofaktoru pro dekarboxylázovou aktivitu, a tím i k nižšímu výskytu BA (DABROVSKI a SIKORSKI, 2005) 4. Fermentovatelné cukry Optimální koncentrace glukózy v substrátu pro tvorbu BA je 0,5 2 %, koncentrace vyšší než 3 % inhibují vznik enzymů. Obecně lze říci, že cukry podporují růst mikroorganismů a tvorbu dekarboxylačních enzymů (SILLA-SANTOS, 1996). 5. Doba skladování potravin Je mnoho studií, které se zabývali dobou zrání u sýrů, fermentovaných salámů a zvyšováním koncentrace BA. Byla prokázána přímá závislost mezi délkou skladování a obsahem BA. Například v trvanlivém fermentovaném salámu Poličan byla zjištěna statistická závislost mezi dobou zrání a množstvím tyraminu a putrescinu (NEZNALOVÁ a STANDARA, 2000). 6. Soli Obecně, přítomnost solí tvorbu BA inhibuje. Bylo ale zjištěno, že histamin a tyramin se vytváří i v přítomnosti NaCl, protože na některé bakterie mohou působit osmoprotektivně a tím dochází i ke zvýšení jejich tvorby (KOMPRDA, 2004). GREIFOVÁ et al. (2003) uvádí, že koncentrace NaCl do 2,2 % příznivě ovlivní nárůst tyraminu produkovaného Enterococcus feacium, avšak v případě Enterococcus faecalis rychlost nárůstu lineárně klesá. Také záleží na složení použité solící směsi. Bylo zjištěno, že přídavek dusitanové soli zpomalí nárůst BA oproti stejnému množství obyčejné soli (KAMENÍK, 2007). 13

15 7. Startovací kultury Výběr startovacích kultur u fermentovaných potravin je z hlediska obsahu BA velice důležitý, neboť tímto krokem se jejich množství může snížit, ale i zvýšit. Mikroorganismy obsažené ve startovací kultuře mohou potlačovat růst ostatních mikroorganismů tvořících BA a tím jejich obsah snižovat nebo naopak sami, vytvářet dekarboxylázy podílející se na vzniku BA (KOMPRDA, 2004). Některé studie ukazují, že množství startovací kultury ovlivní ph sýru a tím i produkci BA. Například sýr Manchego, který byl vyroben za použití 1 % a 0,1 % mezofilní startovací kultury. Sýr obsahující 1 % startovací kultury měl ph 5,15 a obsahoval o 15 % více tyraminu a o 28 % více histaminu než sýry vyrobené za použití 0,1 % startovací kultury, a které měly ph 5,08 po 90 dnech zrání. Naproti tomu FERNANDEZ-GARCIA et al., (2000) uvedl, že 1 % startovací kultury sníží ph více než 0,1 % (DABROVSKI a SIKORSKI, 2005). 8. Přístup kyslíku Tento faktor je neurčitý, protože na tvorbě BA se mohou podílet mikroorganismy s aerobním, fakultativně anaerobním i anaerobním metabolismem (KOMPRDA, 2005). Existuje ještě celá řada faktorů podílejících se na obsahu BA v potravinách, například hygienické podmínky při výrobě, průměr salámů, složení a použité kořenící směsi. U sýrů jsou rozdíly způsobené také velikostí, tvarem, podmínkami zrání (pod mazem, pod fólií, pod kůrou) atd. 3.2 Biologické účinky biogenních aminů a polyaminů Biogenní aminy jsou pro organismus nepostradatelné. Slouží jako zdroj uhlíku, prekurzory hormonů (2-fenylethylamin) nebo samy působí jako hormony (histamin), podílejí se na syntéze nukleových kyselin a proteinů (KOMPRDA, 2005). Nadměrné koncentrace mohou však mít negativní účinky, například působit psycho- a vaso-aktivně. Nejvážnější problémy způsobují histamin, tyramin a fenylethylamin. Histamin je v lidském organismu uložen v žirných buňkách a leukocytech, odkud se při alergické reakci uvolňuje do krevního oběhu. V těle se vytváří z histidinu 14

16 prostřednictvím dekarboxylázy spřažené s pyridoxal-fosfátem a jeho koncentrace v krvi je striktně regulována (ČERNÝ et al., 2005). Druhým významným zdrojem histaminu je potrava. Příjem může vést ke stejným potížím, jako jeho uvolňování z tělních depozit. Část histaminu se vstřebává již v ústní dutině, čemuž nasvědčuje rychlost působení. Inkubační doba se pohybuje kolem třiceti minut po požití potravy a projevy příjmu přetrvávají několik hodin až dnů (KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). Histamin působí vasodilatačně, dostavuje se zvracení, průjem, křeče, pálení v ústech, dýchací potíže, pocení, kopřivka, vyrážka, edémy, lokální záněty, zarudnutí obličeje. Otrava má podobné projevy jako alergie na některé potraviny (KALAČ a KŘÍŽEK, 2005; KAMENÍK, 2007). Pro otravu histaminem se také používá označení skombrotoxikóza, neboť tyto otravy se často objevovaly po požití tzv. skombroidních ryb čeledi makrelovité (Scombridae) a sleďovité (Clupeidae). Tyramin vyvolává zvýšení srdeční činnosti a krevního tlaku, zúžení periferních cév, migrény a dokonce může být příčinnou krvácení do mozku. Intoxikace tyraminem se může označovat jako reakce na sýry (SHALABY, 1996). Putrescin a kadaverin způsobí hypotenzi, zpomalení srdeční činnosti a křeče žvýkacích svalů naopak tryptamin a 2-fenylethylamin podporují zvyšování krevního tlaku. Negativní účinky histaminu a tyraminu mohou být podpořeny příjmem ostatních BA, zejména putrescinu a kadaverinu a přítomností látek, které vznikají při bakteriální degradaci bílkovin. Tyto látky působí na uvolnění histaminu z žirných buněk a jiných tělních zásobáren a tím dojde k podpoření jeho účinku (KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). Biogenní aminy mohou být také prekurzory karcinogenních N-nitroso sloučenin. Velmi nebezpečné jsou sekundární aminy (R1-NH-R2), jelikož tvoří stabilní produkty, na rozdíl od těkavých produktů reakcí, kterých se účastní primární aminy (NH 2 -R) (KOMPRDA, 2005). Spermidin a spermin mají význam při diferenciaci a růstu buněk střeva, také na jeho imunologických vlastnostech a účastní se i vychytávání volných radikálů v trávicím traktu. Negativním účinkem polyaminů je jejich podíl na karcinogenezi. Bylo prokázáno, že významně zvyšují růst v aberativních ložiscích krypt kolonu. Samy o sobě nevyvolávají vznik nádorů, ale jejich růst podporují. Toxicita polyaminů se zvyšuje s rostoucí molekulovou hmotností a nábojem. Organismus si polyaminy sám vytváří a klíčovým enzymem syntézy polyaminů putrescinu, spermidinu a sperminu v buňce je ornityndekarboxyláza (KOMPRDA, 2005). Dále jsou polyaminy 15

17 produkovány střevními bakteriemi a v neposlední řadě přijímány potravou (KALAČ a KŘÍŽEK, 2005). Tab. 1 Biogenní aminy a jejich význam (VELÍŠEK, 2002). Biogenní amin Původní Biologický význam aminokyselina Histamin histidin lokální tkáňový hormon, vliv na krevní tlak, sekreci žaludeční šťávy, účast při anafylaktickém šoku a alergických reakcích Tyramin tyrosin prekurzor dopaminu, lokální tkáňový hormon, vliv na krevní tlak a kontrakce hladkého svalstva Putrescin arginin via ornithin, stabilizace makromolekul, citrulin subcelulárních struktur, stimulace diferenciace buněk, rostlinný hormon Kadaverin lysin stabilizace makromolekul, subcelulárních struktur, stimulace diferenciace buněk, rostlinný hormon Tryptamin tryptofan lokální tkáňové a rostlinné hormony (katecholaminy), vliv na krevní tlak, peristaltiku střev, psychické funkce Fenylethylamin fenylalanin prekururzor tyraminu Agmatin arginin stabilizace makromolekul, subcelulárních struktur, stimulace diferenciace buněk, rostlinný hormon 16

18 3.2.1 Odbourávání biogenních aminů v organismu Zdravý člověk se vyrovnává s příjmem BA pomoci účinného detoxikačního systému, který je tvořen enzymy aminooxidáz s prostetickou FAD (flavinadenindinukleotid) skupinou. Mají funkci katalyzátorů při aerobní deaminaci, přičemž dochází ke změně aminů na aldehydy nebo kyseliny a uvolnění peroxidu vodíku a amoniaku (GREIFOVÁ et al., 2003). Tyto enzymy se rozdělují na monoaminooxidázy (MAO), diaminooxidázy (DAO) a polyaminooxidázy (PAO). MAO odbourávají především aromatické monoaminy, a to oxidační deaminací na příslušný aldehyd, amoniak a peroxid vodíku. MAO jsou přítomny v mitochondriích enterocytů, ale i buněk sleziny, ledvin, mozku a plících. DAO oxidativně deaminují diaminy. Nejvyšší aktivitu vykazují v tenkém střevě, ledvinách a placentě. PAO odbourávají polyaminy (SPD, SPM), mohou odbourávat i monoaminy a diaminy (KOMPRDA, 2005). Účinek detoxikačních enzymů v zažívacím traktu je tak veliký, že při orálním příjmu 1 mmol (cca 100 mg) histaminu nedojde u zdravého jedince k příznakům otravy. Naproti tomu 0,07 µmol histaminu podaného intravenózně příznaky otravy již vyvolá (ČERNÝ et al., 2005). Detoxikační aktivita je značně individuální. Omezena je u dětí a starých lidí. Negativně ji ovlivňuje alkohol a některá léčiva ze skupiny psychofarmak, která inhibují účinek monoaminooxidáz. Lidé, kteří jsou těmito léky léčeni jsou ohroženi především tyraminem v důsledku velkého zvýšení krevního tlaku (KALAČ a KŘÍŽEK, 2005). Schopnost vyrovnávat se s příjmem BA je u každého člověka jiná, závisí hlavně na detoxikační schopnosti organismu. V závislosti na množství přijatého histaminu v potravině, se rozlišují tři typy otrav mírné, střední a těžké (8 40 mg kg -1 potraviny, mg kg -1 a více jak 100 mg kg -1. Příjem tyramin přesahující 100 mg kg -1 může vést k migrénám (MAIJALA a EEROLA, 1993). Důležitý je ale součet obsahu histaminu, tyraminu, putrescinu a kadaverinu, který by neměl překročit 900 mg kg -1. To ovšem neplatí pro pacienty, kteří užívají inhibitory monoaminooxidázy. U nich je již dávka 6 mg kg -1 považována za toxickou (KOMPRDA, 2005). 17

19 3.3 Hygienický význam biogenních aminů Z hygienického hlediska slouží BA jako indikátory stupně kažení potravin. Proto byl zaveden tzv. index biogenních aminů (BAI). Tento index vychází z toho, že obsah histaminu, putrescinu a kadaverinu se v průběhu skladování potravin zvyšuje, naproti tomu množství polyaminů zůstává stejné nebo stagnuje. Spermidin a spermin primárně nevznikají činností mikrobiálních dekarboxyláz v potravině, ale vstupují do ní jako preformované látky již z dané suroviny (KOMPRDA, 2005). Index biogenních aminů se vypočte: HIS + PUT + KAD BAI = / 1 + SPD + SPM [ mg kg] Hodnota BAI < 1 ukazuje na výbornou kvalitu potraviny, naopak u BAI < 10 na velmi špatnou (KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). 4.4 Výskyt biogenních aminů BA se vyskytují prakticky ve všech potravinách jako běžné produkty metabolismu. Více BA se nachází ve fermentovaných výrobcích, kde vznikají mikrobiální činností záměrně přidávaných organismů. U nefermentovaných potravin se na jejich vzniku podílí hlavně kontaminující mikroflóra, vysoké koncentrace se proto vyskytují u zkažených potravin Nefermentované potraviny V této skupině jsou BA nejvíce rozšířeny v rybím mase, zvláště u skombroidních ryb. U čerstvě ulovených ryb se obsah histaminu pohybuje do 10 mg kg -1 (tyramin do 2 mg kg -1 ), ve výrobcích do 50 mg kg -1. Při špatné úpravě, se ale jeho obsah může zvýšit až na tisíce mg kg -1 (KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). Na vzniku BA se zde nejvíce podílí kontaminující mikroflóra, proto je důležité dodržení chladírenského řetězce. Nejčastěji se BA tvoří ihned po vylovení ryb, které nejsou patřičně zchlazeny na teplotu 18

20 kolem +1 o C. Další rizikovou operací je tepelné opracování, hlavně uzení makrelovitých ryb. Důležitá je zde délka časové prodlevy mezí přípravou na uzení a vlastním uzením. Pokud je tato doba dlouhá a ryby ponechány při vyšší teplotě, dochází k pomnožení mikroorganismů tvořících hlavně histamin (STEINHAUSEROVÁ, 2004). Makrely pak mohou obsahovat až 3000 mg kg -1 histaminu. Také ostatní BA jako je tyramin, kadaverin, putrescin a další vznikají v relativně vysokém množství. Nejméně zastoupeným BA v rybím mase je agmatin (1-3 mg kg -1 ), ve vyšších koncentracích se ale nachází u korýšů a sušených ryb (VELÍŠEK, 2002). Pečením ryb část BA vytěká, ale sterilací v konzervách se obsah BA nemění (KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). Čerstvé vepřové maso obsahuje do 7 mg kg -1 kadaverinu a putrescinu, zatímco zkažené 60 mg kg -1 a více. Je to způsobeno činností přítomné mikroflóry, a proto lze podle obsahu BA posuzovat čerstvost masa. Obsah BA v mase se dá mírně snížit vařením, kdy dochází k jejich částečnému rozkladu. Úbytek je vyšší u masa vepřového než hovězího (VELÍŠEK, 2002). Koncentrace BA v čerstvém mléce je nepatrná. Nachází se zde histamin, tyramin, ale i putrescin, kadaverin, spermidin a spermin. Jejich obsah nejvíce záleží na množství mikroorganismů v mléce. V ovoci a zelenině bývá hlavním BA tyramin, např. obsah v pomerančích se pohybuje do 10 mg kg -1. Často se vyskytují i konjugáty BA se skořicovými kyselinami či mastnými kyselinami. V některých rostlinách se nachází ve významném množství různé deriváty BA, které se běžně řadí mezi protoalkaloidy (VELÍŠEK, 2002). Množství BA se může zvýšit během mechanického zpracování díky bakteriální kontaminaci. Vyšší obsah tyraminu byl zjištěn v rajčatech, banánech a švestkách (KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). Endogenní BA přirozeně se vyskytující v rostlinných surovinách nepředstavují velké toxikologické nebezpečí Fermentované potraviny Mezi fermentované potraviny se řadí různé druhy trvanlivých salámů, sýrů, dále pivo, víno, kysané zelí atd. Na vzniku BA v trvanlivých salámech se mohou podílet mikroorganismy ze startovacích kultur (laktobacily, pediokoky), ale i mikroorganismy zpracovávané suroviny. Obsah běžných BA se pohybuje v rozmezí jednotek až stovek mg kg -1, ale za špatných hygienických podmínek může dosáhnout mg histaminu na kg potraviny (VELÍŠEK, 2002). 19

21 Nejvíce zastoupeným BA ve fermentovaných salámech bývá tyramin. Obsah polyaminů se pohybuje od 4 do 416 mg kg -1. Největší vliv na množství BA má u těchto výrobků hygienické zacházení s výchozí surovinou, startovací kultury a technologie zpracování. Menší význam má i velikost výrobku, kde byla zjištěna korelace mezi průměrem výrobku, ph, rozsahem proteolýzy a obsahem BA. Také na okraji výrobku byl obsah BA nižší něž v centrální části. Naopak vyšší množství bylo zjištěno u výrobků spontánně fermentovaných bez přídavku cukru ve srovnání s výrobky fermentovanými s jeho přídavkem (KOMPRDA, 2005). GONZALES a FERNANDEZ et al. (2003) zjistili v rámci prováděného testu salámu typu chorizo nejvyšší obsah BA u vzorku vyrobeného bez startovací kultury a to nezávisle na výši přídavku sacharidů. Nejnižší hodnoty byly dosaženy při použití startovacích kultur a aplikaci sacharidů 0,5-1,0 %. Jestliže se však použily startovací kultury, ale dávka sacharidů byla pouze 0,1 %, ve výrobcích se stále vyskytovala vysoká koncentrace putrescinu a tyraminu (KAMENÍK, 2007). Obsah kadaverinu lze snížit přídavkem Na 2 SO 3 do díla, ale to naopak vede ke zvýšené tvorbě histaminu a putrescinu (KOMPRDA, 2005). KALAČ s KŘÍŽKEM (2005) uvádějí, že existují kmeny bakterií, které jsou součástí charakteristické mikroflóry masa a masných výrobků a ty dokáží odbourávat část vytvořeného tyraminu. Velké množství BA se nachází v sýrech. V 1 kg mohou být desítky až stovky mg histaminu, tyraminu, putrescinu a kadaverinu, jednotky až desítky mg fenylethylaminu, nejméně tryptaminu. Obsah záleží na způsobu ošetření mléka a dalším zpracování, jako je teplota sýřeniny, doba zrání, použití startovacích a plísňových kultur. Nižší obsah BA je u sýrů holandského typu, vyšší obsah je u plísňových sýrů a sýrů švýcarského typu, nejvyšší množství se nachází u sýrů vyrobených z nepasterovaného mléka (KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). Podmínkou vzniku toxického množství BA v sýrech je proteolýza, která je při zrání sýrů považována za jeden z nejdůležitějších pochodů ovlivňujících kvalitu sýra. Na proteolýze mléčných bílkovin se podílejí nativní proteázy zákysových kultur, syřidlové enzymy, proteiny kontaminující mikroflóry, ale hlavně bakterie startovacích kultur (Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii subs. bulgaricus, Enterococus faecalis a Enterococcus faecium) (GREIFOVÁ et al., 2003). Nejvíce zastoupenými BA v sýrech jsou tyramin, putrescin, kadaverin a histamin (KOMPRDA, 2005). Koncentrace BA v sýrech může převýšit i hodnotu 1 g kg -1. Biogenní aminy jsou v sýrech rozloženy nestejnoměrně, například KOMPRDA et al. (2007) uvádí vyšší obsah tyraminu v povrchové vrstvě než v jádře u sýru zrajícího pod fólií. Také zjistil, závislost mezi množstvím BA a tučností sýra. Celkový obsah BA byl po 18 týdnech 20

22 zrání vyšší u sýrů s tučností 45 % oproti sýrům s 30 % tuku v sušině. Během zrání sýrů dochází k nárůstu tyraminu, putrescinu a histidinu do 120 dne skladování, od tohoto dne dochází k poklesu a po 220 dnech se nacházejí jen ve stopových koncentracích. Výjimku tvoří kadaverin, který dosáhl maxima 40 den a poté následovala fáze poklesu až do vymizení v 220 dni skladování (GREIF a GREIFOVÁ, 2006). KOMPRDA et al. (2005) zjistili, že kvantitativně nejvýznamnějším BA v taveném sýru byl tyramin (1,3 29,3 mg kg -1 ). Koncentrace tyraminu byla prokazatelně vyšší u sýru pasterovaného než u sýru sterilovaného a skladovaného za stejných podmínek. Rozdíl v koncentraci je připisován různému složení obou sýrů. Způsob tepelné úpravy sýra, doba, ani teplota skladování výrazně neovlivnily množství BA. Celkový obsah BA i tyraminu byl ve srovnání se zrajícími sýry nižší. Fyziologické inaktivace BA je možné dosáhnout použitím mikroorganismů, které mají aminoxidázovou aktivitu, mezi které patří například Brevibacterium linens, které snižuje množství tyraminu a histaminu po dobu zrání sýrů. Záhřev na 75 až 80 o C inaktivuje proteolytické bakterie a to má za následek snížení obsahu volných aminokyselin a tím i koncentrace BA (GREIF a GREIFOVÁ, 2006). Tab. 2 Koncentrace biogenních aminů v mléčných výrobcích (GREIFOVÁ et al., 2003) Koncentrace [mg kg -1 ] Vzorky Počet Tyramin Histamin Kadaverin Putrescin vzorků Sýr Niva Sýr Primátor Sýr Ementál Brynza-zimní Sýr Balkánslaný ND-35 ND-25 Tavené sýry ND-105 ND Jogurt 10 ND-34 ND-5 ND ND Obsah biogenních aminů je jedním z kvalitativních znaků v technologii výroby kysaného zelí. Množství BA kolísá v závislosti na technologických podmínkách a přítomné mikroflóře. Vysoký obsah BA je charakteristický pro spontánně kvašené zelí. KŘÍŽEK a KALAČ (2005) uvádějí jako nejvýznamnější BA tyramin, jehož množství 21

23 vzrůstá s délkou skladování. Obsah všech BA lze výrazně snížit přídavkem vhodných startovacích kultur mléčných bakterií při nakládání zelí. Biogenní aminy se mohou tvořit i v alkoholických nápojích jako je pivo a víno. Obsah je sice nízký, ale vzhledem ke konzumovanému množství může vzniknout alergická reakce. Navíc vstřebávání zřejmě probíhá rychleji než z pevných potravin a alkohol potlačuje účinnost detoxikačních střevních enzymů. V pivech plzeňského typu (spodně kvašených) se obsah histaminu pohybuje kolem 1 mg a tyraminu 5-8 mg l -1. To platí i pro nealkoholická piva. Ke zvýšení obsahu BA, zejména tyraminu, může dojít i během skladování piva, pokud nebylo dostatečně pasterováno. Vyšší množství BA jsou typická pro speciální belgická piva se svrchním kvašením. Původcem jsou kontaminující mléčné bakterie. Ve víně vznikají BA v období po hlavním kvašení, kdy probíhá jablečno-mléčná fermentace (KŘÍŽEK a HLAVATÁ, 1995). 3.5 Metody stanovení biogenních aminů Stanovení BA je poměrně náročné. Požadavky jsou kladeny hlavně na citlivost, přesnost stanovení a výběr vhodné předseparační metody. Obsah BA je v potravinách zpravidla malý a srovnatelný s koncentrací chemicky podobných látek, které mohou působit rušivě. U potravin je důležité stanovení celkového obsahu BA ve vzorku, ale i množství jednotlivých zástupců BA. Ke stanovení aminů se nejčastěji používá tenkovrstvá chromatografie (TLC), plynová chromatografie (GC) a vysokoúčelová kapalinová chromatografie (HPLC). Dále se může provádět separace BA kapilární elektroforézou (CE). Vybrané aminy lze stanovit pomoci enzymové imunoanalýzy. Také u HPLC mimo reverzní fázi je vhodné pracovat v režimu ionexové chromatografie (IEC). Využívá se i stanovení pomocí kapilární zónové elektroforézy (CZE) (KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). TLC je rychlá a cenově dostupná, je zde ale nutná předseparace a derivatizace aminů. Derivatizace je nutná u nearomatických aminů, protože neabsorbují záření v UV/VIS oblasti. Ostatní chemické složky musí být odstraněny v předseparaci, jejíž součástí je extrakce. K extrakci se používá kyselina chloristá a trichloroctová, metanol (teplota 60 o C), citran sodný. Nejrozšířenějším derivatizačním činidlem je tzv. dansylchlorid (5-dimethylaminonaftalen-1-sulchonylchlorid). Vzniklé dansylderiváty se 22

24 detekují UV/VIS detektorem při vlnové délce 254 nm. K citlivějšímu stanovení se může využít flourimetrický detektor. K derivatizaci lze použít i jiná činidla, jako je benzoylchlorid nebo p-toluensulfonylchlorid ((KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). Při použití derivatizačního činidla o-phtaldialdehydu lze provádět souběžné stanovení volných aminů a aminokyselin. Nevýhodou je použití spektrofluorometrického detektoru a dlouhá doba průchodu vzorku kolonou (INNOCENTE et al., 2007). Také se může provádět stanovení nederivatizovaných aminů ve formě iontových párů, kdy po separaci následuje tzv. post-column derivatizace. Nevýhodou tohoto stanovení je, že zde dochází k častému chvostování píků (KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). Plynová chromatografie se uplatňuje při separaci aminů na kapilárních kolonách ve spojení s hmotnostním detektorem (GC-MS). Tato metoda dosáhla vysokého stupně citlivosti a selektivity, ale nevýhodou je vysoká cena zařízení (GREIF et al., 1997). Vysokou citlivostí se vyznačuje detekce založená na snímání intenzity laserem indukované fluorescence (LIF) aminových derivátů (KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). Na detekci dekarboxyláza pozitivních mikroorganismů se využívá skríningová zkumavková metoda. Stanovení se provádí pomocí média, které kromě základních složek jako je trypton, kvasničný extrakt, masový extrakt atd. obsahuje i acidobazický indikátor (bromkresolová červeň) a příslušnou aminokyselinu, ze které je tvořen biogenní amin. Po naočkování a kultivaci bakterií se sleduje změna zabarvení média způsobená zvýšením ph v důsledku vzniku BA. Tato metoda byla vylepšena snížením obsahu glukózy a chloridu sodného, pufrační efekt byl zvýšen uhličitanem vápenatým a fosforečnanem draselným a dekarboxylační aktivita byla podpořena pyridoxal-5- fosfátem. Srovnáním s chromatografickou analýzou bylo zjištěno, že dané médium je vhodné pro předběžné stanovení mikroorganismů s dekarboxylační aktivitou (BOVER- CID a HOLZAPFEL, 1999). Toto médium bylo použito v této diplomové práci, a to pro skríning biogenních aminů histaminu a tyramin. 23

25 3.6 Legislativa hygienické limity BA Česká legislativa byla harmonizována s legislativou EU a tak vyhláška MZd. č. 53/2002 Sb. O chemických požadavcích na zdravotní nezávadnost potravin byla nahrazena novou vyhláškou MZd. č. 306/2004 Sb. Zároveň vstoupilo v platnost Nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 O mikrobiologických kritériích pro potraviny. Zde jsou uvedeny požadavky na odběr vzorků, referenční metody a limity pro jednotlivé mikroorganismy, jejich toxiny a metabolity. BA jsou zastoupeny pouze histaminem jehož množství se sleduje u produktů rybolovu z druhů ryb spojených s vysokým množstvím histidinu (ryby čeledi Scombridae, Clupeidae, Engraulidae, Coryfenidae, Pomatomidae a Scombresosidae). Přípustné množství histaminu je 100 mg kg -1 a nejvyšší povolené množství je 200 mg kg -1 potraviny. U produktů rybolovu, které byly ošetřeny enzymatickým zráním v láku, vyrobené z druhů ryb spojených s vysokým množstvím histidinu je přípustné množství histaminu 200 mg kg -1 a nejvyšší povolené množství 400 mg kg -1. Uvedený obsah může být překročen u dvou z devíti vzorků odebraných z jedné šarže a to do hodnoty nejvyššího povoleného množství, tj. u první skupiny produktů do 200 mg kg -1 a u druhé do 400 mg kg -1. Jako referenční metoda je určena vysokotlaká kapalinová chromatografie. Z výsledků získaných při měření skombrotoxikos bylo navrženo, že obsah histaminu v rybách do 50 mg kg -1 bude považován za bezpečný, mg kg -1 za potenciálně toxický, mg kg -1 za pravděpodobně toxický a nad 1000 mg kg -1 za toxický a nebezpečný pro spotřebu. Dříve byl v ČR stanoven limit i na obsah tyraminu, který u sýrů činil 200 mg kg - 1, u červeného vína 50 mg kg -1 a pro ostatní potraviny 100 mg kg -1 (KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). 24

26 3.7 Mikroorganismy podílející se na tvorbě biogenních aminů Hlavní podmínkou pro produkci BA mikroorganismy je schopnost tvorby dekarboxylačních enzymů, které jsou kódovány specifickými DNA sekvencemi. Tyto sekvence se vyskytují zejména u rodů Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella, Photobacterium, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Lactobacillus, Pediococcus a Streptococcus (SHALABY, 1996; KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). Bacillus čeleď Bacillaceae Rod Bacillus patří mezi G - aerobní nebo fakultativně anaerobní peritrichní tyčinky. Tvoří řadu enzymů (proteolytických, pektinolytických, amylolytických). Některé druhy produkují antibiotika polypeptidové povahy např. bacitracin, který se vyrábí průmyslově. Jiné druhy tvoří slizová pouzdra nebo toxiny. V konzervárenském průmyslu mají význam termorezistentní spóry, které přežívají sterilační režim. Zástupci B. insolitus, B. cereus, B. megaterium, B. thuringiensis, B. stearotermophilus, B. coagulans, B. subtilis, B. macerans, B. antracis, B. polymyxa (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). V potravinářství patří k nejdůležitějším Bacillus cereus, který tvoří v tenkém střevě diaroický enterotoxin a vyvolává průjem. Přímo v potravině vytváří emetický toxin, který způsobuje zvracení. Dalším faktorem virulence je fosfolipáza C, která se podílí na hemolýze erytrocytů. Rizikovými potravinami jsou maso a masné výrobky, škrobnaté potraviny, mléko a sušené potraviny (KOMPRDA, 2004). Citrobacter Patří mezi G - tyčinky, jako zdroj uhlíku a energie využívá citrát a tím se odlišuje od rodu Escherichia. Vyskytuje se ve střevním traktu lidí, ale ve vyšších koncentracích může způsobit onemocnění, je tedy podmíněně patogenní. Zástupcem je C. freundii (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Clostridium čeleď Bacillaceae Tvoří G + sporotvorné tyčinky. Je anaerobní a má schopnost tvořit proteolytické a sacharolytické enzymy. Při anaerobní oxidaci tvoří velké množství plynu, který negativně ovlivňuje kvalitu sýrů, způsobuje tzv. pozdní duření sýrů. Některé druhy jsou 25

27 patogenní. Cl. botulinum produkuje tzv. botulotoxin, který je velmi jedovatý a tvoří se hlavně v nedostatečně sterilovaných a okyselených konzervách. Cl. perfringens vytváří toxin až ve střevním traktu lidí, v hlubokých ranách způsobuje sněť plynatou. Cl. tetani produkuje neurotoxin, který blokuje vychytávání acetylcholinu na nervosvalové ploténce a dochází ke křečím. Další zástupci Cl. acetobutylicum, Cl. butyricum, Cl. thermosacharolyticum (GÖRNER a VALÍK, 2004). Escherichia čeleď Enterobacteriaceae Řadí se mezi G - fakultativně anaerobní tyčinky, nesporolující. nachází se ve střevech lidí a zvířat indikuje fekální znečištění a špatnou hygienu. Escherichia coli, která je hlavním zástupcem, roste při teplotách 10 až 45 o C. Výjimku tvoří verotoxigenní E. coli O157:H7, která roste špatně při teplotách nad 43 o C, nefermentuje sorbitol a β-glukuronidázu. Bakterie snáší kyselé i zásadité ph a je schopná růst i při 5 % koncentraci NaCl. E. coli, které způsobují onemocnění, dělíme do čtyř skupin. Do první skupiny patří enteropatogenní E. coli, které způsobují průjmová onemocnění kojenců. Ve druhé skupině jsou enteroinvazivní kmeny, které poškozují sliznici tlustého střeva. Třetí skupinu tvoří enterotoxické kmeny vyskytující se hlavně v tropických a rozvojových oblastech. Čtvrtá skupina zahrnuje verotoxinogenní E. coli, produkující verotoxin, který způsobuje závažná střevní onemocnění hlavně u malých dětí (BURYCHOVÁ a SLÁDKOVÁ, 2007). E. coli O158 může vyvolat hemolytickouretický syndrom, který způsobí hemolýzu erytrocytů a tím dojde k selhání ledvin. Proteus čeleď Enterobacteriaceae Má proměnlivý tvar, je G - a na živných půdách je charakteristický svým plazivým růstem, tzv. Rausův fenomén. Způsobují kažení bílkovinných potravin, vytváří indol a sirovodík. Výskyt ve střevním traktu, vodě a půdě. Některé druhy mohou být patogenní. Zástupci P. vulgaris, P. mireabilis. Pseudomonas čeleď Psedomonadaceae G - tyčinky, bez kvasných schopností. Mají lipolytické a proteolytické enzymy, způsobující kažení potravin. Vyskytují se ubikvitárně a dobře snáší i nízké teploty. Mohou tvořit fenazinová barviva a tím způsobovat nežádoucí zbarvení potravin např. mléka. Zástupci P. aeuruginosa, P. flourescens, P. trati, P. alkaligenes. 26

28 Salmonella čeleď Enterobacteriaceae Patři mezi G - fakultativně anaerobní tyčinky. Jako zdroj uhlíku mohou využívat citrát, ale mají jen nízkou schopnost zkvašovat laktózu. Vyskytuje se v zažívacím traktu lidí a zvířat, v půdě, vodě, stájových produktech. Salmonely jsou odolné vůči nízkým teplotám. Rostou v rozsahu teplot 5 až 47 o C a ph 4 až 8. Přenos na člověka je kontaminovanými potravinami. Způsobuje kolitidy, enteritidy, břišní tyfus a paratyfus. Primárně patogenní pro člověka je S. typhi, S. paratyphi. Primárně adaptované na hospodářských zvířatech jsou S. choleraesuis a S. gallimarium. Patogenní pro člověka i pro zvířata jsou S. enteritidis, S.typhimurium (GÖRNER a VALÍK, 2004). Shigella čeleď Enterobacteriaceae Vytváří G - tyčinky. Vyskytuje se v půdě, vodě a výkalech. Patří sem čtyři druhy, které produkují toxiny způsobující prudké střevní onemocnění shigelózu a bacilární úplavici. Zástupci S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonei. Lactobacillus čeleď Lactobacillaceae Tento rod se řadí mezi G + fakultativně anaerobní nebo mikroaerofilní nesporulující tyčinky, nerozkládající peroxid vodíku. Cukry rozkládá na kyselinu mléčnou, octovou, ethanol a CO 2, čímž způsobují snížení ph až pod 4,0. Jsou součástí čistých mlékařských kultur. Některé kmeny mohou produkovat bakteriociny. Podle produktů vzniklých při metabolickém rozkladu cukrů se mohou rozdělit do 3. skupin: 1. obligátně homofermentativní, jejichž produktem je pouze kyselina mléčná. Pentózy a glukonáty nefermentují (L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii ssp. lactis, L. helveticus, L. acidophilus, L. farciminis, L. salivarius) 2. fakultativně heterofermentativní, hexózy fermentují skoro výlučně na kyselinu mléčnou, při nedostatku glukózy produkují některé druhy kyselinu octovou, mravenčí a ethanol (L. alimentarius, L. sake, L. casei ssp. casei, L. casei ssp. rhamnosus, L. casei ssp. tolerans, L. curvatus, L. plantarum, L. pseudoplantarum) 3. obligátně heterofermentativní, hexózy fermentují na kyselinu mléčnou, octovou, ethanol a CO 2. Pentózy také fermentují na kyselinu mléčnou a octovou (L. brevis, L. buchneri, L. bifermentas, L. halotolerans, L. fermentum, L. kefír, L. euteri, L. viridescens) (GÖRNER a VALÍK, 2004). 27

29 Pediococcus čeleď Streptococcaceae Jsou to G + koky tvořící páry, tetrády, kataláza negativní a dusičnan neredukují. Fermentují homofermentativně pentózany. Rostou při 30 o C, náročné na růstové faktory (vitamíny, aminokyseliny). Vyskytují se společně s laktokoky, leukonostoky a laktobacily v mase a masných výrobcích a mohou zde produkovat histamin. V mlékařství se využívají jako fermentační kultury. Patří sem P. damnousus, P. acidilactis, P. pardus, P. pentosaceus, P. halophilus. Streptococcus čeleď Streptococcaceae Řadí se nezi G + koky, seskupující se do dvojic nebo řetízků, netvoří spóry a jsou nepohyblivé. Podle nároků na kyslík jsou řazeny mezi fakultativně anaerobní, mikroaerofilní až anaerobní. Fermentují sacharidy hlavně na kyselinu mléčnou, ale netvoří významné množství plynu, některé druhy fermentují i organické kyseliny a aminokyseliny. Neredukují dusičnan a jsou kataláza negativní. Dělí se na pyogenní, orální a jiné streptokoky. Pyogenní streptokoky se mohou označovat jako β-hemolytické podle tvorby hemolýzy na krevním agaru. Do této skupiny patří S. pyogenes, S. egui ssp. egui, S. dysgalactiae, S. canis. Orální streptokoky se vyskytují především v ústní dutině a horních cestách dýchacích, na krevním agaru vytváří α-hemolýzu. Patří sem S. salivarius, S. sanguis, S. oralis, S. mutans, S. pneumoniae. V potravinářství mají malý význam. Do skupiny jiných streptokoků se řadí S. thermophilus, který fermentuje glukózu, laktózu, manózu a fruktózu, některé kmeny i sacharózu. Na krevním agaru netvoří hemolýzu ani viridaci. Je součástí zákysových kultur v mlékařství. Dále sem patří S. bovis, který se nachází v lidských výkalech (GÖRNER a VALÍK, 2004). Enterococcus čeleď Streptococcaceae G + koky ve dvojicích a v krátkých řetízcích, netvoří spóry a jsou kataláza negativní. Od streptokoků se odlišují rezistencí k poměrně vysokému ph, snáší i hodnoty 8,5. Neredukují dusičnan na dusitan, nerozkládají celulózu, pektiny a tuky. Sacharidy štěpí na L(+) kyselinu mléčnou, zkvašuje sorbitol, nezkvašuje L-arabinosu, zřídka redukuje nitráty, z argininu tvoří amoniak Snáší teplotu o C a přežívají ½ hod. záhřev na 60 o C. Hemolýzu na krevním agaru netvoří, vznikají pouze šedobílé kolonie. Nacházejí se ve střevním traktu lidí a zvířat, mohou být přítomny i v mléce a mléčných výrobcích a potravinách s vyšším obsahem soli. Používají se jako doplňkové 28

30 kultury v sýrařství (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Z BA se podílejí nejvíce na produkci tyraminu (BOVER-CID a HOLZAPFEL, 1999). Enterokoky mohou také stimulovat růst jiných mikroorganismů tím, že rychle rozkládají bílkoviny a tak zpřístupňují dusík pro ostatní mléčné bakterie. Proto mohou ovlivňovat na dočasnou dobu tvorbu ok, i když sami plyn netvoří. Významné jsou Enterococcus faecium, E. faecalis, E. furane a E. avium. Lactococcus čeleď Streptococcaceae Tvoří G + fakultativně anaerobní diplokoky nebo řetízky. Některé druhy jsou součástí mezofilní zákysové kultury, některé mohou syntetizovat antibiotikum nizin, které inhibuje spóry Clostrídií. Významnými jsou L. lactis ssp. lactis, L. lactis ssp. cremoris, L. lactis ssp. diacetylactis. L. lactis ssp. lactis někdy tvoří na krevním agaru α-hemolýzu. Optimální teplota růstu je 30 o C. Od bakterií rodu Enterococcus se liší tím, že rostou pouze při 4 % NaCl, nerostou při ph 9,6. Rostou v mléku s obsahem 0,3 % methylenové modři a v médiu s obsahem 40 % žluči. Fermentují glukózu, laktózu a maltózu na kyselinu mléčnou, ale nefermentují sacharózu. Kyselinu citrónovou neštěpí a netvoří acetoin, diacetyl a CO 2. L. lactis ssp. cremoris roste i při nižších teplotách jak 10 o C. Také roste za přítomnosti 40 % žluči, ale neroste při 4 % NaCl, při ph 9,2 a v mléku s 0,3 % methylénové modři. Fermentuje glukózu a laktózu, zřídkakdy maltózu a sacharózu. Z argininu netvoří amoniak. L. lactis ssp. diacetylactis fermentuje citran na diacetyl a CO 2, tato vlastnost je regulována plazmidem, proto není trvalá. Za přítomnosti fruktózy vytváří CO 2 a kyselinu octovou (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). BOVER-CID a HOLZAPFEL (1999) uvádějí jako hlavní producenty tyraminu bakterie mléčného kysání kam patří enterokoky, Carnobacteria, Laktobacillus curvatus, L. brevis, L. buchneri. Mikroorganismy čeledi Enterobacteriaceae jsou spojovány hlavně s tvorbou kadaverinu a putrescinu, na rozdíl od enterokoků, které tvoří jen malé množství těchto aminů. U leukonostoků a pediokoků se neprokázal jakýkoli potenciál k tvorbě BA 29

31 Tab. 3 Významné bakterie produkující biogenní aminy (KŘÍŽEK a KALAČ, 1998). Potraviny Bakterie Biogenní aminy Ryby Sýry Maso a masné výrobky Fermentovaná zelenina Morganella morganii, Klebsiella pneumonia, Hafni alvei, Proteus mirabilis, Probrus vulgarit, Clostridim perfringens, Enterobacter aerogenes, Bacillus ssp., Staphilococcus Lactobacillus buchneri, L. bulgaricus, L. plantarum, L. casei, L. acidophilus, L. arabinose, Streptococcus faecium, S. mitos, Bacillus macerans, Propionibacterium rody Pediococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Streptococcus, Micrococcus, čeleď Enterobacteriaceae Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus histamin, tyramin, kadaverin, putrescin, agmatim, spermidin a spermin histamin, tyramin, kadaverin, putrescin, fenylethylamin, tryptamin histamin, tyramin, kadaverin, putrescin, fenylethylamin, tryptamin histamin, kadaverin, putrescin, tyramin, tryptamin 3.8 Startovací kultury Startovací kultury jsou vybrané a prověřené bakteriální kmeny nebo směsi kmenů, které v čisté kultuře po aplikaci do suroviny vytvářejí v průběhu výrobního procesu potraviny určité žádoucí změny. Jsou to antagonisté hnilobné mikroflóry a tím zajišťují správný a rychlejší průběh zrání. Odbourávají sacharidy na organické kyseliny, redukují dusičnany na dusitany, snižují ph, štěpí lipidy a bílkoviny a tím dochází ke tvorbě typického aroma a chuti výrobku (INGR, 2003). Využití startovacích kultur je široké, od mlékárenského průmyslu, kde se používají hlavně při výrobě různých druhů kysaných mléčných výrobků až po masný průmysl při přípravě fermentovaných salámů, nebo jiných tepelně neopracovaných výrobků. 30

32 Startovací kultury jsou nejčastěji složeny z bakterií mléčného kysání, které jsou důležité pro tvorbu: kyseliny mléčné ze sacharidů látek s antimikrobiálním účinkem bakteriocinů látek aromatických a chuťových (INGR, 2003). Součástí startovacích kultur mohou být také grampozitivní katalázapozitivní koky (Staphyloccocus carnosus, Staphylococcus xylosus, Microccocus varians), kvasinky (Debaryomyces hansenii) a plísně (Penicillium) (KAMENÍK, 1994). Některé kmeny bakterií, používaných ve startovacích kulturách mohou být producenty BA. Dekarboxylázová aktivita mezi kmeny určitého druhu se může lišit dokonce až o tři řády. Proto je v praxi důležité testovat vždy konkrétní bakteriální kmeny použité ve startovacích kulturách (BURDYCHOVÁ, 2006). 3.9 Probiotické kultury Je známo, že pro zdraví člověka má velký význam mikroflóra, která fyziologicky kolonizuje tlusté střevo. Tlusté střevo je metabolicky nejúčinnějším orgánem v důsledku výkonnosti jeho mikroflóry. U dospělých jedinců je osídleno celkem asi různými druhy mikroorganismů. Vyskytuje se zde cca 97 % striktně anaerobních mikroorganismů (jde především o zástupce rodů Bifidobacterium, Eubacterium, Bacteroides, Peptococcus a Fusobacterium) a 3 % fakultativně anaerobních bakterií (zástupci rodu Lactobacillus, Escherichia, Streptococcus a Enterococcus). Celkový počet mikroorganismů ve střevech se odhaduje až na (TOMÁNKOVÁ et al, 2006). K tomu, aby se kolonizující bakterie v tlustém střevě dlouhodobě udržely, potřebují vhodné živiny, z nichž většina pochází z potravy, která je ale nemusí vždy obsahovat v množství nebo formě pro metabolizmus bakterií nejvhodnější. Z těchto základních skutečností vychází moderní představa o možnostech ovlivňovat složení a aktivitu střevní mikroflóry dietou, přesněji jejím obohacením probiotiky a prebiotiky. 31

33 3.9.1 Význam probiotik Jako probiotika se označují mikroorganismy, které mají pozitivní účinky na zdraví konzumenta. Do těla se dostávají v potravě a mají příznivý vliv na trvale přítomné bakterie. Konzumace probiotik je spojena s řadou zdravotních přínosů, z nichž některé jsou prokázané a jiné se považují jen za pravděpodobné: Ustavení či obnovení vyvážené mikroflóry tlustého střeva. Zvýšení odolnosti proti osídlení tlustého střeva mikroorganismy, které vyvolávají průjmy. Snížení hladiny celkového a LDL cholesterolu. Snížení tvorby takových bakteriálních enzymů v tlustém střevě, které mají mutagenní účinky a mohou vyvolávat růst nádorů. Zmírnění intolerance na laktózu. Posílení imunitního systému. Zvýšení vstřebávání vápníku. Syntéza některých vitamínů (především skupiny B a K) (KALAČ, 2003) Mechanismus účinku probiotik Mikrobiální bariéra probiotických bakterií proti patogenům, potencionálně patogenním mikroorganismům a oportunní mikroflóře je zajišťována vícero mechanismy. Jde o obsazení potencionálních vazebných míst střevního epitelu (tzv. receptorová blokace), brždění růstu nebo usmrcení cizích mikroorganismů (produkce bakteriocinů a volných mastných kyselin s krátkým řetězcem), konkurence při získávání výživových látek a růstových faktorů, snížení střevního ph produkcí kyselin. Volné kyseliny s krátkým řetězcem mají navíc prokazatelné pozitivní fyziologické účinky. Jsou resorbovány pasivní difúzí střevní mukózou a slouží ke krytí až 50 % energetické potřeby střevních buněk, na kterém se podílí zejména butyrát. Současně zvyšují prokrvení mukózy a stimulují motilitu střeva (TOMÁNKOVÁ et al, 2006). Pro dosažení probiotických účinků, se musí probiotické bakterie nacházet v potravině v životaschopné formě. Minimální terapeutická hodnota se pohybuje od živých buněk na den. Tato dávka může být zajištěna konzumací 100 g probiotického výrobku, který obsahuje v 1 g 10 6 až 10 7 živých buněk (CHUMCHALOVÁ et al., 2007). 32

34 Mikroorganismy, které jsou řazeny mezi probiotika, musí splňovat určitá kritéria. Musí mít pozitivní vliv na lidské zdraví, humánní původ, zdravotní nezávadnost, schopnost přisednout na střevní výstelku, odolat technologickému zpracování a negativně neovlivnit senzorické vlastnosti výrobku. Všechny popsané bakterie s brobiotickým účinkem používané při výrobě mléčných výrobků patří do skupiny bakterií mléčného kysání a bifidobakterií, která zahrnuje druhy rodů Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Enterococcus, Pediococcus, Streptococcus a Bifidobacterium. Jako probiotické byly popsányněkteré kmeny druhů Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. casei/paracasei, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. johnsonii, L. plantarum, L. rhamnosus, L. reuteri, L. salivarius, Enterococcus faecium, E. faecalis, Bifidobacterium bifidum, B. longum, B. breve, B. infantis, B. lactis (BURDYCHOVÁ, 2007). Kromě bakterií lze využít i kvasinky (Saccharomyces boulardii) nebo plísně. Probiotické mikroorganismy jsou nejčastěji používány jako doplňky stravy nebo jako součást specifických mléčných výrobků, v posledních letech také jako součást kojenecké a dětské výživy. V případě doplňků stravy jde nejčastěji o lyofilizované kultury, které mohou obsahovat jeden nebo více druhů probiotických bakterií, a které jsou samostatně nebo s dalšími látkami vyráběny ve formě kapslí, tobolek, tablet, nebo dražé. Zakysané mléčné výrobky s obsahem probiotické mikroflóry bývají nejčastěji vyráběny jako speciální nápoje a jogurty a jejich různé formy (jogurtové nápoje, krémy, deserty aj.), mléčná a cereální dětská výživa je dodávána v dehydrovaném stavu. Existují i méně typické případy spojení probiotických bakterií s potravinami. Na trhu se např. vyskytují oplatky s náplní obohacenou o bifidobakterie, nebo trvanlivé masné výrobky, u nichž se však většinou jedná o startovací kultury (ŠMELINA, 2006). Mléčný výrobek, který obsahuje bifidobakterie se musí řídit vyhláškou č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky na mléko a mléčné výrobky. Pokud je na obalu výrobku uvedené, že obsahuje bifidobakterie, jejich množství musí být minimálně 10 6 g výrobku. Obsah Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus a ostatních laktobacilů musí být minimálně 10 7 g jogurtového výrobku a toto množství musí být dodrženo po celou dobu trvanlivosti výrobku. 33

35 4 MATERIÁL A METODY 4.1 Materiál Použité chemikálie Agar (Noack, Francie) Aceton (Pliva-Lachema, Česká republika) Bromkrezolový purpur (Pliva-Lachema, Česká republika) Citrát amonný (Sigma-Oldrich, USA) Fosforečnan draselný (Merck, Německo) Fyziologický roztok (Noack, Francie) Glukóza (Penta, Česká republika) Histidin (Merck, Německo) Hydroxid sodný (Pliva-Lachema, Česká republika) Chlorid sodný (Pliva-Lachema, Česká republika) Krystalová violeť (HIMEDIA Laboratories, Mumbie, Indie) Kvasničný extrakt (Noack, Francie) Kyselina chlorovodíková (Pliva-Lachema, Česká republika) Lugolův roztok (Jan Kulich, Česká republika) Masový extrakt (Noack,Francie) Pepton (Noack, Francie) Pyridoxal-5-fosfát (Sigma-Oldrich, USA) Safranin (HIMEDIA Laboratories, Mumbie, Indie) Síran hořečnatý (Pliva-Lachema, Česká republika) Síran manganatý (Lach-Ner, Česká republika) Síran železnatý (Pliva-Lachema, Česká republika) Thiamin (Merck, Německo) Krypton (Noack, Francie) Tween 80 (Lach-Ner, Česká republika) Tyrozin (Sigma-Oldrich, USA) Uhličitan vápenatý (Vitrum, Česká republika) 34

36 4.1.2 Použité přístroje Autokláv (Schoeller Instruments, Česká republika) Biohazard (Schoeller Instruments, Česká republika) Laboratorní váhy (Biotech, Česká republika) Mikroskop (Biotech, Česká republika) Termostat (Biotech, Česká republika) Použité pomůcky Jednorázové očkovací kličky (MERCI, Česká republika) Laboratorní sklo Petriho misky, zkumavky, skleněné tyčinky a pipety, podložní sklíčka (MERCI, Česká republika) Mc Farlendova zákalová stupnice Mikropipety (Biotech, Česká republika) Vyvíječe anaerobního prostředí (Merk, Německo) Použité testovací soupravy PYRAtest (Pliva-Lachema, Česká republika) EN-COCCUStest (Pliva-Lachema, Česká republika) OXItest (Pliva-Lachema, Česká republika) ONPtest (Pliva-Lachema, Česká republika) STREPTOtest 16 (Pliva-Lachema, Česká republika) VPtest (Pliva-Lachema, Česká republika) 35

37 4.1.5 Použitá kultivační média ENDO agar (Noack, Česká republika) Hydrolyzát masa 10,0 g/l laktóza 10,0 g/l fosforečnan draselný 3,5 g/l sulfid sodný 2,5 g/l bazický fuchsin 0,5 g/l bakteriologický agar 15,0 g/l ph při 25 o C 7,5 ± 0,2 41,5 g dehydratované půdy bylo rozpuštěno v 1 l destilované vody. Po sterilizaci, která byla prováděna po dobu 20 minut a při teplotě 121 o C, bylo upraveno ph na požadovanou hodnotu. PCA Plate count agar (Noack, Česká republika) trypton 5,0 g/l kvasničný extrakt 2,5 g/l glukóza 1,0 g/l bakteriologický agar 12,0 g/l ph při 25 o C 7,0 ± 0,2 20,5 g dehydratované půdy bylo rozpuštěno v 1 l destilované vody. Po sterilizaci, která byla prováděna po dobu 20 minut a při teplotě 121 o C, bylo upraveno ph na požadovanou hodnotu. MRS agar, ph = 6,5 (Merck, Německo) polypepton 10,0 g/l masový extrakt 10,0 g/l kvasničný extrakt 5,0 g/l glukóza 20,0 g/l Tween 80 1,08 g/l fosforečnan draselný 2,0 g/l acetát sodný 5,0 g/l citrát amonný 2,0 g/l 36

38 síran hořečnatý 0,2 g/l síran manganatý 0,05 g/l bakteriologický agar 15,0 g/l ph při 25 o C 6,5 ± 0,2 70,3 g dehydratované půdy bylo rozpuštěno v 1 l destilované vody. Po sterilizaci, která byla prováděna po dobu 20 minut a při teplotě 121 o C, bylo upraveno ph na požadovanou hodnotu. MRS agar, ph = 6,2 (Merck, Německo) Příprava MRS půdy byla stejná jako v předchozím případě. Po sterilizaci, bylo ale ph upraveno sterilními roztoky na hodnotu 6,2 poté bylo médium rozlévalo do sterilních Petriho misek. MRS + 0,5 % cysteinu (Merck, Německo) K vysterilizované a zchlazené půdě MRS se za aseptických podmínek, přes bakteriologický filtr přidalo 0,35 g cysteinu. Poté se médium rozlévalo do sterilních Petriho misek. M 17 (Merck, Německo) pepton pepton z masa pepton z kaseinu kvasničný extrakt masový extrakt laktóza D+ kyselina askorbová Na-β-glycerolphosphat síran hořečnatý 5,0 g/l 2,5 g/l 2,5 g/l 2,5 g/l 5,0 g/l 5,0 g/l 0,5 g/l 19,0 g/l 0,25 g/l 42,5 g dehydratované půdy bylo rozpuštěno v 1 l destilované vody. Po sterilizaci, která byla prováděna po dobu 20 minut a při teplotě 121 o C, bylo upraveno ph na požadovanou hodnotu. 37

39 Krevní agar (Merck, Německo) hovězí extrakt 4,5 g/l pepton 10,0 g/l kvasničný autolyzát 1,5 g/l škrob 1,0 g/l chlorid sodný 5,0 g/l agar 12,0 g/l beraní erytrocyty 50,0 g/l ph při 25 o C 7,3 ± 0,2 Živná půda byla již dodána od výrobce v jednotlivých Petriho miskách. Médium pro stanovení dekarboxylační aktivity trypton 5,0 g/l kvasničný extrakt 5,0 g/l masový extrakt 5,0 g/l chlorid sodný 2,5 g/l glukóza 0,5 g/l tween 80 1,0 g/l síran hořečnatý 0,2 g/l síran manganatý 0,05 g/l síran železnatý 0,04 g/l citrát amonný 2,0 g/l thiamin 0,01 g/l fosforečnan draselný 2,0 g/l uhličitan vápenatý 0,1 g/l pyridoxal-5-fosfát 0,05 g/l aminokyselina 10,0 g/l brómkrezolový purpur 0,06 g/l Jednotlivé složky byly smíchány a doplněny na objem 1 l destilovanou vodou, poté byla směs sterilizována v autoklávu. Po ochlazení došlo k upravení ph na hodnotu 5,3 sterilní kyselinou chlorovodíkovou a za aseptických podmínek, přes bakteriologický 38

40 filtr byla přidána vhodná aminokyselina (histidin, tyrozin). Pak bylo médium po 10 ml rozpipetováno do sterilních zkumavek. Médium pro stanovení zkvašování sacharidů pepton 10,0 g/l chlorid sodný 5,0 g/l hovězí extrakt 1,0 g/l agar 4,0 g/l bromkresolová purpur 0,04 g/l ph při 25 o C 7,0 ± 0,2 Půda v dehydratovaném stavu, která neobsahovala agar byla rozpuštěna v 1 l destilované vody, bylo upraveno ph a přidáno vhodné množství agaru. Následovala sterilizace při 121 o C 20 minut a rozlití do sterilních Petriho misek Použité kontrolní kmeny mikroorganismů Enterococcus feacalis CCM 1875 Escherichia coli CCM 5172 Pseudomonas aeruginosa CCM 1960 Staphylococcus aureus CCM 2561 Streptococcus thermophilus CCM 4757 Kontrolní kmeny bakterií pocházely z České sbírky mikroorganismů, Masarykovy univerzity v Brně. 39

41 4.2 Metody průkazu mikroorganismů Gramovo barvení bakteriální kultura byla rozetřena na podložní sklíčko a po zaschnutí fixována plamenem poté byla převrstvena po dobu 1 minuty Gramovým roztokem č. 1 (krystalová violeť) a poté následoval oplach vodou pak byl vzorek převrstven Lugolovým roztokem na dobu 1 minuty a zbytek barviva byl opláchnout pod vodou následovalo odbarvení vzorku acetonem 1 minutu a oplach vodou vzorek byl dobarven safraninem po dobu 1 minuty a pak opláchnut pod tekoucí vodou poté byl vzorek osušen a pozorován pod imerzním objektivem při 100 násobném zvětšení Biochemické testy OXItest na zónu proužku bylo naneseno 10 µl činidla pro OXIDÁZA test bakteriální kultura byla rozetřena po zóně proužku barevná reakce byla odečítána po 30 s až 1 minutě jako pozitivní kontrola byl použit bakteriální kmen Pseudomunas aeruginosa Kataláza test vzorek bakteriální kultury byl dán na podložní sklíčko a zakápnut 3 % roztokem peroxidu vodíku pozorována byla tvorba bublinek, které značily produkci enzymu katalázy jako pozitivní kontrola byl použit kmen Escherichia coli 40

42 Test na zkvašování sacharidů na Petriho misky s médiem pro stanovení zkvašování sacharidů byly naočkovány určované kmeny disky obsahující dané sacharidy (mannóza, maltóza, manitol, glukóza, fruktóza) byly položeny na povrch média po inkubaci v termostatu (37 o C, 24 hod) následovalo hodnocení vytvořených zón kolem disků jako pozitivní kontrola na fermentaci glukózy byl použit bakteriální kmen Escherichia coli McFarlandova zákalová stupnice byl připraven 1 % roztok chloridu barnatého a 1 % roztok kyseliny sírové roztoky byly pipetovány dle tabulky Tab.4 Příprava McFarlandovy zákalové stupnice McFarlandova stupnice 1 % BaCl 2 [ml] 1 % H 2 SO 4 [ml] 1. 0,1 9, ,2 9, ,3 9, ,4 9, ,5 9, ,6 9, ,7 9, ,8 9, ,9 9, ,0 9, Hustota bakterií [10 6 /ml] ONPtest bakteriální kultura byla homogenizována v 0,6 ml sterilního fyziologického roztoku tak, aby suspenze odpovídala 2. stupni Mc Farlandovy zákalové stupnice proužek ONPtestu byl ponořen do suspenze a inkubován při 37 o C 24 hodin výsledné zbarvení suspenze bylo hodnoceno podle dabulky Hodnocení testu na detekci β-galaktosidázy jako negativní kontrola byl použit bakteriální kmen Pseudomunas aeruginosa 41

43 Tvorba hemolýzy testovaná bakteriální kultura byla naočkována na krevní agar kultivace byla provedena v termostatu při 37 o C hodin hodnocení vzniku a typu hemolýzy jako pozitivní kontrola byl použit bakteriální kmen Staphylococcus aureus PYRAtest zóna proužku byla navlhčena 20 µl destilované vody a očkovací kličkou na ni byla přenesena sledovaná bakteriální kultura proužek byl inkubován při pokojové teplotě 10 minut poté byla zóna proužku zakápnuta 10 µl činidla pro tento test po 1 až 2 minutách byla vyhodnocena barva zóny proužku podle tabulky Hodnocení testu PYR jako pozitivní kontrola byl použit bakteriální kmen Enterococcus faecalis EN-COCCUStest z bakteriální kultury a fyziologického roztoku byl připravena suspenze, která odpovídala 2. stupni Mc Farlandovy zákalové stupnice pak do každé z jamek příslušného řádku diagnostické destičky bylo napipetováno 0,1 ml suspenze a k jamkám sloupce H byly přidány dvě kapky sterilního parafínového oleje inkubace byla provedena v termostatu při 37 o C 24 hod. pro hodnocení barevných reakcí byla použita diferenciační tabulka a index jako pozitivní kontrola byl použit bakteriální kmen Enterococcus faecalis VPtest byla připravena suspenze bakteriální kultury s 1 ml fyziologického roztoku proužek testu byl vložen do suspenze a inkubován při 37 o C po inkubaci bylo nadávkováno činidlo VPT I a VPT II odečtení barevných reakcí bylo provedeno po 30 minutové inkubaci podle tabulky Hodnocení testu na detekci acetoinu jako pozitivní kontrola byl použit bakteriální kmen Staphylococcus aureus 42

44 STREPTOtest 16 ve fyziologickém roztoku byla připravena suspenze bakteriální kultúry, která odpovídala 2. stupni Mc Farlandovy zákalové stupnice do každé z jamek příslušného řádku diagnostické destičky bylo napipetováno 0,1 ml suspenze inkubace byla provedena v termostatu při 37 o C 24 hod. pro hodnocení barevných reakcí byla použita tabulka jako pozitivní kontrola byl použit bakteriální kmen Streptococcus thermophilus 4.3 Izoláty mikroorganismů z polotvrdých sýrů Izoláty bakterií pocházely z polotvrdých sýrů. U těchto bakterií byla sledována schopnost tvorby dekarboxylačních enzymů pomoci skríningováho média a metodou HPLC. Dále bylo určováno, ke kterému bakteriálnímu rodu popřípadě druhu mikroorganismy náleží Očkování a kultivace Jednotlivé vzorky mikroorganismů byly rozočkovány pomoci křížového roztěru sterilními kličkami na povrch kultivačních médií PCA a ENDO agaru. Kultivace probíhala při teplotě 37 o C, 72 hodin za aerobních podmínek. Po nárustu bakterií byla zjišťována produkce BA histaminu a tyraminu nejprve pomoci skríningového média podle BOVER-CIDA a HOLZAPFELA (1999). Do tohoto média bylo naočkováno vhodné množství čisté bakteriální kultury a kultivace byla prováděna v termostatu o teplotě 37 o C, po dobu 96 hodin. Tvorba BA se hodnotila podle barevné změny média. Při pozitivní reakci původní barva okrová přecházela na fialovou. Intenzita zabarvení byla hodnocena počtem křížků, od slabě intenzivní (+) až po vysoce intenzivní (+++). Na ověření přítomnosti BA v dekarboxylačním médiu byla použita metoda vysokotlaké kapalinové chromatografie popsaná BURDYCHOVOU a DOHNALEM (2007). U vzorků, které vykazovaly pozitivitu na tvorbu histaminu nebo tyraminu, byly použity různé testy na identifikaci jednotlivých mikroorganismů producentů BA. 43

45 4.4 Probiotické a startovací kultury Druhou skupinou mikroorganismů, u kterých byla sledována produkce BA tvořily bakterie využívané v potravinářském průmyslu jako probiotické nebo startovací kultury. Vzorky čistých bakteriálních kultur dodané v lyofilizovaném stavu pocházely od společnosti SACCO, Itálie. Celkový počet vzorků byl 73, zastoupeny zde byly rody Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus a Bifidobacterium Očkování a kultivace Čisté bakteriální kultury byly rozočkovány jednorázovými mikrobiologickými kličkami na povrch kultivačních půd. Způsob kultivace jednotlivých kmenů je uveden v tabulce č. 5. Tab. 5 Podmínky kultivace Kmen Počet vz. Půda Teplota[ o C] Čas [hod] Kultivace Lactobacillus 38 MRS, ph=6, anaerobní Staphylococcus 17 M aerobní Streptococcus 12 Krevní agar aerobní Enterococcus 2 Krevní agar aerobní Pediococcus 2 MRS, ph=6, aerobní Bifidobacterium 2 MRS +0,5%cysteinu anaerobní Po kultivaci bakteriálních kmenů byla sledována tvorba BA stejným způsobem jako v předcházejícím případě, tedy pomoci dekarboxylačního média a HPLC. 44

46 5 VÝSLEDKY V průběhu laboratorní práce byla sledována produkce dvou nejvýznamnějších BA histaminu a tyraminu některými bakteriálními druhy. Schopnost tvořit BA je závislá na přítomnosti daného bakteriálního enzymu, histidindekarboxylázy a tyrozindekarboxylázy. Pokud tento enzym je bakterie schopna vytvářet, je předpoklad, že za příznivých podmínek může docházet i ke tvorbě BA v potravinách. 5.1 Izoláty bakterií z polotvrdých sýrů Z celkového počtu 33 bakteriálních kultur byla pouze u 9 odhalena produkce histaminu nebo tyraminu pomoci skríningové metody kultivace bakterií v dekarboxylázovém médiu. Principem tohoto stanovení je, že vlivem produkce zásaditých aminů dochází ke změně ph, které se přesouvá z oblasti kyselé do oblasti zásadité, načež reaguje acidobazický indikátor, bromkrezolový purpur změnou zabarvení půdy. Schopnost vytvářet tyramin byla odhalena u šesti bakterií, z toho u dvou byla produkce hodnocena třemi křížky, u ostatních na dva. Tvorba histaminu byla detekována u třech mikroorganismů (++). Tab. 6 Tvorba biogenních aminů jednotlivými izoláty Dekarboxylázové médium HPLC [mg l -1 ] Číslo vzorku histamin tyramin histamin tyramin ,05 ± 0, ,60 ± 0, ,85 ± 0, ,65 ± 0, ,40 ± 0, ,25 ± 0, ,70 ± 0, ,35 ± 0, ,05 ± 0, střední intenzita zabarvení +++ vysoká intenzita zabarvení - negativní na tvorbu BA 45

47 Tvorba BA byla sledována i pomoci HPLC. Tato metoda měla ověřit spolehlivost výsledků získaných ze skríningového média. Metodou HPLC podle BURDYCHOVÉ a DOHNALA (2007) bylo zjištěno, že výsledky z vysokotlaké kapalinové chromatografie odpovídají stanovením z dekarboxylázového média. Izobáty devíti bakterií pozitivních na tvorbu BA byly podrobeny několika testům, které měly za cíl zařadit bakterie do jednotlivých bakteriálních druhů, popřípadě rodů. Identifikace mikroorganismů Při identifikaci mikroorganismů, tj. stanovení příslušnosti studovaných kmenů k určité taxonomické skupině byl použit komplex testů. Nejprve byly sledovány morfologické vlastnosti, a to jak makroskopické tak i mikroskopické za použití identifikačního barvení (Gramovo barvení). Morfologické znaky bakterií byly doplněny o biochemické testy pro zjištění některých základních fyziologických vlastností. Gramovo barvení Jako základním rozlišovacím znakem bakterií je barvení podle Grama, které využívá rozdílů ve struktuře buněčné stěny bakterií. Grampozitivní buňky mají buněčnou stěnu tvořenou silnou peptidoglykanovou vrstvou. Gramnegativní buňky mají peptidoglykanovou vrstvu tenkou, obklopenou silnou lipopolysacharidovou vrstvou. Lipidy v této vrstvě jsou rozpouštěny acetonem, který je součástí barvícího postupu. Dochází ke zvětšení pórovitosti buněčné stěny a k vyplavení barevného komplexu, buňky jsou odbarveny. U grampozitivních buněk dochází vlivem ethanolu k narušení peptidoglykanové vrstvy, ale k odstranění barviva nedojde (BURDYCHOVÁ a SLÁDKOVÁ, 2007). Grampozitivní buňky jsou fialově až tmavomodře zbarveny, gramnegativní jsou dobarveny karbolfuchsinem a jejich výsledné zbarvení je červené. U všech devíti izolátů bylo zjištěno, že se jedná o grampozitivní koky (tabulka č. 6, izobáty 1 9). K identifikaci bakterií byl použit i Bergeyho manuál systematické bakteriologie, který popisuje všechny dosud známé bakterie a uvádí tabulky a klíče k určování jednotlivých rodů a druhů. Identifikace izolátů byla prováděna za pomoci schématu pro rozdělení grampozitivních koků. 46

48 G + koky čeleď Micrococcus, Staphylococcus a Streptococcus + - kataláza Micrococcus, Staphylococcus Streptococcus Manitol Žluč. eskulin Staph. aureus Staph. saprophyticus Entero. faecium Str. pneumonie Staph. epidermidis Str. bovis Str. mitis Mic. luteus Str. pyogenes Mic. varians + - 6,5 %NaCl α β Hemolýza + - Pigment E. faecium Str. bovis Str. mitis Str. pyogenes Mic. luteus Staph. saprophyticus Str. pneumonie Mic. varians Staph. epidermidis + - Žluč Glukóza Fruktóza Str. pneumonie Str. mitis Mic. varians Mic. luteus Staph. epidermidis Staph. saprophyticus Obr. 2 Schéma rozdělení G + koků (Bergey s Manual of Determinative Bacteriology) 47

49 Biochemické identifikační testy Biochemické testy zjišťují schopnost buňky syntetizovat určité enzymy. U heterotrofních bakterií patří k nejdůležitějším biochemickým znakům rozdíly ve využití uhlíkatých a dusíkatých sloučenin tj. zkvašování sacharidů, štěpení škrobu, bílkovin a některých jednodušších sloučenin, vznik specifických produktů metabolismu (acetylmethylkarbinolu) a další (ŠILHÁNKOVÁ a DEMELOVÁ, 1993). OXItest Test je určen pro detekci cytochromoxidázy. Oxidázy jsou enzymy, které se podílejí na transportu elektronů během aerobní respirace. Enzym cytochromoxidáza katalyzuje oxidaci redukovaného cytochromu molekulovým kyslíkem za tvorby vody nebo peroxidu vodíku. Je přítomen u všech aerofilních bakterií s respiračním metabolismem. Přítomnost cytochromoxidázy je detekována barevnou reakcí N, N- dimethyl-1,4-feniléndiaminu s α-naftolem za vzniku indofenolové modři. Bylo zjištěno, že všechny bakteriální izoláty mají cytochromoxidázu (tabulka č. 6, izobáty 1 9). Test na tvorbu katalázy Během aerobní respirace mikroorganismy produkují peroxid vodíku, v některých případech i extrémně toxický superoxid. Akumulace těchto metabolitů by mohla vést k poškození buňky. Některé mikroorganismy si vytvořily ochranný systém, který vede k odbourávání těchto látek. Hlavní součástí je enzym kataláza, která rozkládá peroxid vodíku na kyslík a vodu. Tento test umožňuje kvantitativní zjišťování mléčných bakterií v potravinách, které katalázu neprodukují. Zkoumané bakterie tento enzym obsahovaly, což potvrdila produkce bublinek při aplikaci peroxidu vodíku na bakteriální kulturu (tabulka č. 6, izobáty 1 9). Tím bylo zjištěno, že se s největší pravděpodobností nejedná o příslušníky rodu Lactobacillus (ŠILHÁNKOVÁ, 2002) a Streptococcus. Test na zkvašování sacharidů Na médiu určeném pro zjišťování schopnosti zkvašovat sacharidy nebyla kolem jednotlivých disků obsahujících sacharidy nalezena zóna prosvětlení půdy. Zkoumané bakterie tedy tyto sacharidy nezkvašují za tvorby kyselin. Pomoci tohoto testu, kde jedním ze zkvašovaných sacharidů byl manitol bylo zjištěno, že hledané bakterie nepatří do druhu Staphylococcus aureus (tabulka č. 6, izobáty 1 9). 48

50 ONPtest Tímto testem se určuje přítomnost β-galaktosidázy a permeázy. β-galaktosidáza je intracelulární enzym, který katalyzuje štěpení laktózy. Aby mohlo dojít ke štěpení musí být přítomna i permeáza, která umožňuje vstup laktózy do buněk. Enzym β-galaktosidáza hydrolyzuje bezbarvý substrát o-nitrofenyl-β-d-galaktopyranosid, pozitivní reakce je detekována žlutým zbarvením uvolněného o-nitrofenolu. Produkujeli mikroorganismus β-d-galaktosidázu a permeázu nikoli, test vychází negativně. ONPtest byl pozitivní pouze u vzorků č. 1, 5 a 7 (tabulka č. 6, izobáty 1 9). Hemolýza Ke zjištění hemolytické aktivity se používá krevní agar. V okolí kolonie může dojít k α-, β- nebo γ-hemolýze. Při α-hemolýze neboli viridaci dochází k částečnému rozrušení hemoglobinu na zelenohnědý pigment methemoglobin a erytrocyty nejsou lyzovány. Při β-hemolýze dojde k úplnému rozložení hemoglobinu i erytrocytů a kolem kolonií se vytvoří průhledný dvorec. U γ-hemolýzy nedojde k žádné změně. Tvorba hemolyzinu je typická pro řadu patogenních bakterií, ale i některých nepatogenních (některé streptokoky, Str. aureus, hemolytické E. coli, Pseudomonás, některé bacily a podobně). α-hemolýza byla zjištěna pouze u vzorku č. 2 a barva kolonií byla bílá. Izobát č. 5 vytvářel β-hemolýzu a kolonie zde měly mírně žluté zabarvení. Vzorky č. 1, 3, 4, 6, 7, 8 a 9 vykazovaly tvorbu γ-hemolýzy (tabulka č. 6, izobáty 1 9). PYRAtest Tento test se využívá pro rychlou detekci aktivity enzymu pyrrolidonylarylamidázy, která je charakteristická pro rod Enterococcus. Pozitivní výsledek PYRAtestu se také vyskytuje u kmene Streptococcus pyogenes. Test je možné použít jako diferenční test pro zástupce čeledí Enterobacteriaceae. Test je založen na enzymatické hydrolýze β-naftylamidu kyseliny pyroglutamuvé pyrrolidonylarylamidázou, která je detekována reakcí s p-dimethylaminocinamaldehydem za vzniku červeného zbarvení. PYRAtest vyšel pozitivně u vzorků č. 4, 6 a 7. Následně byly tyto vzorky podrobeny identifikaci pomocí EN-COCCUStestu (tabulka č. 6, izobáty 1 9). 49

51 EN-COCCUStest Souprava EN-COCCUStest je určena pro rutinní druhovou identifikaci zástupců rodu Enterococcus. Využívá se zde osmi biochemických testů, které obsahují arginin, sorbózu, arabinósu, mannitol, sorbitol, melibiózu, rafinózu a melecitózu. Po odečtení pomoci diferenciační tabulky a indexu byl vzorek č. 1 identifikován jako Enterococcus faecium, vzorek č. 6 byl zařazen do Enterococcus group III (E. durans) a vzorek č. 7 byl také určen jako Enterococcus faecium (tabulka č. 6, izobáty 1 9). VPtest (Voges Proskauerův test) Fermentace glukózy příslušníky čeledi Enterobacteriaceae i některými jinými bakteriemi vede ke vzniku acetoinu. Acetoin (acetylmethylkarbinol) je neutrální látka vznikající dekarboxylací a kondenzací ze dvou molekul kyseliny pyrohroznové. Oxidací acetoinu vzdušným kyslíkem se tvoří biacetyl, který se prokáže barevnou reakcí s α-naftolem v alkalickém prostředí (VYTRAŠOVÁ a BÍLKOVÁ, 1998). Produkce acetoinu byla ověřena u bakteriálních izolátů č. 2, 3, 5 a 8 (tabulka č. 6, izobáty 1 9). STREPTOtest 16 Pomoci tohoto testu byl izobát č. 2 určen jako Streptococcus vestibularis. Vzorky č. 3, 4, 8 a 9 byly označeny jako Str. equinus, Str. vestibularis, nebo jako Str. salivarius ssp. salivarius. Vzorek č. 5 byl zařazen do skupiny Str. group L (Str. agalactie) (tabulka č. 6, izobáty 1 9). Výsledky identifikace bakteriálních druhů, izolovaných z polotvrdých sýrů, jsou uvedeny v tabulce 7. U těchto druhů byla posléze produkce BA potvrzena pomoci metody HPLC, kterou popsali BURDYCHOVÁ s DOHNALEM (2007). 50

52 Tab. 7 Identifikace mikroorganismů produkujících histamin a tyramin Číslo vz. Gramovo barvení OXI test + pozitivní - negativní Kataláza Zkvašování sacharidů ONP test Tvorba henolýzy 1. G + koky γ-, šedé kolonie 2. G + koky α-, žluté kolonie 3. G + koky γ-, bílé kolonie 4. G + koky γ-, bílé kolonie 5. G + koky β-, žluté kolonie 6. G + koky γ-, šedé kolonie 7. G + koky γ-, šedé kolonie 8. G + koky γ-, bílé kolonie 9. G + koky γ-, bílé kolonie PYRA test EN-COCCUS test + Enterococcus faecium VP test STREPTO test 16 Histamin Tyramin / / + Streptococcus vestibularis / + Str. equinus, Str. vestibularis, Str. salivarius ssp. salivarius - / - Str. equinus, Str. vestibularis, Str. salivarius ssp. salivarius / + Str. group L (Str. agalactie) Enterococcus group III (E. durans) + Enterococcus faecium / - + / / + Str. equinus, Str. vestibularis, Str. salivarius ssp. salivarius - / - Str. equinus, Str. vestibularis, Str. salivarius ssp. salivarius

53 5.2 Probiotické a startovací kultury Dalším úkolem bylo, odhalit produkci BA u mikroorganismů, které jsou cíleně používány při výrobě potravin jako startovací nebo probiotické kultury. Sledované skupiny mikroorganismů poskytla společnost SACCO, Itálie. Jednotlivé vzorky obsahovaly vždy čistou kulturu dané bakterie. Prověřeno bylo 38 kmenů rodu Lactobacillus, 17 kmenů rodu Staphylococcus, 12 kmenů rodu Streptococcus a po 2 kmenech rodů Enterococcus, Pediococcus a rodu Bifidobacterium. Ke stanovení produkce BA byla použita skríningová metoda kultivace v dekarboxylázovém médiu podle BOVER-CIDA a HOLZAPFELA (1999). Jelikož, byla sledována produkce histaminu a tyraminu, v kultivačním médiu byla přítomna aminokyselina histidin a tyrozin. Aby se schopnost tvořit histamin a tyramin u jednotlivých bakterií skutečně prokázala, bylo kultivační médium dále vyhodnoceno pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie podle postupu uveřejněném BURDYCHOVOU a DOHNALEM (2007). Nejprve byla hodnocena produkce tyraminu pomocí skríningové metody. Při tomto způsobu stanovení bylo nalezeno 13 kmenů rodu Lactobacillus pozitivních na tvorbu tohoto BA, 14 kmenů rodu Staphylococcus, 1 kmen rodu Streptococcus a 2 kmeny rodu Enterococcus. Pozitivní reakci vykazovaly i oba dva kmeny rodu Bifidobacterium. Naopak u kmenů pocházejících z rodu Pediococcus nebyla produkce tyraminu zjištěna. Průkaznost stanovení BA skríningovou metodou na dekarboxylačním médiu byla ověřena pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie. Výsledky dosažené touto metodou byly shodné s výsledky získanými na dekarboxylačním médiu. Produkce histaminu nebyla zjištěna ani u jednoho ze 73 sledovaných bakteriálních kmenů. Tab. 8 Zastoupení bakterií startovacích a probiotických kultur v produkci BA Bakteriální tyramin histamin kmen Počet vz. Absolutní četnost Relativní četnost Absolutní četnost Lactobacillus ,21 % 0 Staphylococcus ,35% 0 Streptococcus ,08 % 0 Enterococcus % 0 Pediococcus % 0 Bifidobacterium % 0 52

54 V tabulkách 9 až 14 jsou uvedeny konkrétní kmeny bakterií, jednotlivých rodů, u kterých byla sledována schopnost produkce BA tyraminu a histaminu. Tab. 9 Produkce BA rodem Lactobacillus Tyramin Bakteriální kmen Dekarb. HPLC Histamin médium [mg l -1 ] Lactobacillus acidophilus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus casei Lactobacillus curvatus ,50 ± 0,01 - Lactobacillus helveticus Lactobacillus helveticus Lactobacillus helveticus Lactobacillus helveticus Lactobacillus helveticus Lactobacillus lactis Lactobacillus pentosaceus Lactobacillus pentosaceus Lactobacillus pentosaceus Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum ,50 ± 0,01 - Lactobacillus plantarum ,55 ± 0,01 - Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum ,45 ± 0,01 - Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum

55 Lactobacillus pseudoplantarum01 + 0,45 ± 0,01 - Lactobacillus rhamnosus ,55 ± 0,01 - Lactobacillus rhamnosus ,40 ± 0,01 - Lactobacillus rhamnosus ,45 ± 0,01 - Lactobacillus rhamnosus ,40 ± 0,01 - Lactobacillus sakei ,40 ± 0,01 - Lactobacillus sakei ,50 ± 0,01 - Lactobacillus sakei ,40 ± 0,01 - Lactobacillus sakei Lactobacillus salivarius Lactobacillus salivarius ,45 ± 0,01 - Lactobacillus salivarius Lactobacillus salivarius Mezi nejvíce používané bakterie mléčného kysání, které jsou součástí startovacích i probiotických kultur, patří rod Lactobacillus. Při stanovení tvorby BA zástupci tohoto rodu bylo zjištěno, že tyramin byl produkován u 34 % sledovaných bakteriálních kmenů. Mezi tyramin-pozitivní kmeny byly zařazeny L. plantarum, L. rhamnosus, L. sakei, L. curvatus, L. pseudoplantarum a L. salivarius. Naměřené hodnoty se pohybovaly v rozmezí 0,40 až 0,55 ± 0,01 mg l -1 média. Výjimkou tvořil vzorek z kmene Lactobacillus rhamnosus 02, u kterého bylo zjištěné množství vyprodukovaného tyraminu 1,55 ± 0,01 mg l

56 Tab. 10 Produkce BA rodem Staphylococcus Tyramin Bakteriální kmen Dekarb. médium HPLC Histamin [mg l -1 ] Staphylococcus carnosus ,55 ± 0,01 - Staphylococcus carnosus ,45 ± 0,01 - Staphylococcus carnosus ,30 ± 0,01 - Staphylococcus carnosus ,45 ± 0,01 - Staphylococcus carnosus Staphylococcus carnosus Staphylococcus lentus ,35 ± 0,01 - Staphylococcus lentus ,55 ± 0,01 - Staphylococcus lentus ,50 ± 0,01 - Staphylococcus lentus ,45 ± 0,01 - Staphylococcus lentus ,45 ± 0,01 - Staphylococcus lentus ,45 ± 0,01 - Staphylococcus lentus Staphylococcus xylosus ,35 ± 0,01 - Staphylococcus xylosus ,55 ± 0,01 - Staphylococcus xylosus ,45 ± 0,01 - Staphylococcus xylosus ,40 ± 0,01 - Bakterie rodu Staphylococcus jsou také v hojné míře využívány k výrobě fermentovaných potravin jako startovací kultury. Produkce BA tímto rodem byla sledována u kmenů S. carnosus, S. lentus a S. xylosus. Tvorba tyraminu byla zjištěna téměř u všech zástupců jednotlivých kmenů. Průměrná hodnota BA v médiu byla stanovena v množství 0,45 ± 0,01 mg l

57 Tab. 11 Produkce BA rodem Streptococcus Tyramin Bakteriální kmen Dekarb. HPLC Histamin médium [mg l -1 ] Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus ,50 ± 0,01 - Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus Streptococcus thermophilus patří v mlékařství k nejvíce využívaným bakteriím, zvláště na výrobu jogurtů a jogurtových nápojů. Ke zjištění produkce BA bylo použito 12 zástupců tohoto bakteriálního kmene a pouze u jednoho byla nalezena schopnost vytvářet z příslušné aminokyseliny tyramin. Tab. 12 Produkce BA rodem Enterococcus Tyramin Bakteriální kmen Dekarb. médium HPLC Histamin [mg l -1 ] Enterococcus faecium ,50 ± 0,01 - Enterococcus faecium ,45 ± 0,01 - Mezi největší producenty tyraminu patřil rod Enterococcus a jeho zástupce E. faecium. Tvorba tyraminu těmito zástupci byla až o jeden řád větší oproti ostatním sledovaným bakteriím jiných rodů. 56

58 Tab. 13 Produkce BA rodem Pediococcus Tyramin Bakteriální kmen Dekarb. médium HPLC Histamin [mg l -1 ] Pediococcus acidilactici Pediococcus pentosaceus U zkoumaných bakterií rodu Pediococcus, které jsou hlavně součástí startovacích kultur k přípravě tepelně neopracovaných fermentovaných masných výrobků nebyla zjištěna tvorba tyramin ani histaminu. Tab. 14 Produkce BA rodem Bifidobacterium Tyramin Bakteriální kmen Dekarb. médium HPLC Histamin [mg l -1 ] Bifidobacterium lactis ,50 ± 0,01 - Bifidobacterium longum ,40 ± 0,01 - Rod Bifidobacteriu je často spojován s příznivým působením na střevní trakt a trávení, a proto je součástí mnoha výrobků na povzbuzení střevní činnosti. Ze dvou sledovaných kmenů byla u obou zjištěna pozitivita na tvorbu BA tyraminu. 57

59 6 DISKUZE Mezi spotřebiteli jsou velice oblíbené různé druhy fermentovaných potravin, ať již se jedná o výrobky rostlinného či živočišného původu. Charakteristickým znakem pro tyto potraviny je, že vznikají za pomocí mikroorganismů, kteří rozkládají základní složky na různé produkty a tím dochází ke tvorbě typických senzorických vlastností takto vyrobených potravin. Mikroorganismy podílející se na tomto procesu jsou v daných surovinách přirozeně přítomny nebo jsou do nich přidávány v podobě startovacích kultur. V průběhu fermentace a následném zrání může kromě požadovaných vlastností docházet i ke tvorbě BA, které mohou u citlivé skupiny obyvatel vyvolat zdravotní obtíže. BA patří mezi prekurzory N-nitroso sloučenin. Tyto látky způsobují vznik nádorů v oblasti trávicího traktu, z tohoto důvodu jsou BA zařazovány mezi prekarcinogeny. První část této práce měla za úkol identifikovat právě ty bakterie, které jsou schopny za daných podmínek tvorby BA, zejména histaminu a tyraminu. Po kultivaci a zjištění schopnosti produkovat BA pomocí skríningového média a ověření na HPLC byly jednotlivé izoláty z polotvrdých sýrů podrobeny řadě testů, jež měly za cíl zařazení izolátů do bakteriálních druhů či rodů. Izolované kultury bakterií z polotvrdých sýrů, produkující histamin nebo tyramin byly identifikovány jako bakterie rodu Enterococcus a Streptococcus (tab. 7, izobáty 1 9). Pro identifikaci byly použity biochemické testy, které vychází z fenotypových vlastností bakterií. Tyto testy jsou definovány pomocí sbírkových kmenů, a proto se některé výsledky mohou při testování terénních kmenů lišit. Oba zjištěné rody patří do rozsáhlé skupiny bakterií, která se označuje jako bakterie mléčného kvašení. Stejně jako některé skupiny mikroorganismů, např. čeleď Enterobacteriaceae, Pseudomonas ssp. jsou i bakterie mléčného kysání schopny tvořit BA. Při dekarboxylaci aminokyselin jsou sice méně aktivní, ale naproti tomu dosahují ve fermentovaných potravinách vysokých počtů, a proto není jejich podíl na produkci BA zanedbatelný. To se týká zvláště dlouho zrajících sýrů, ve kterých se nejvíce vytváří tyramin (FERNANDEZ-GARCIA et al., 1999). Bakterie rodu Enterococcus mohou přecházet do sýrů přímo z mléka nebo jsou do nich záměrně přidávány v podobě startovacích a doplňkových kultur. Nevýhodou tohoto rodu je, že se může podílet na kažení potravin a také na produkci BA v potravinách. Schopnost tvořit BA byla potvrzena řadou studií. MARTUSCELLI et al., 58

60 (2004) uvádí, že v italském sýru Pecorino Abruzzese z ovčího mléka jsou bakterie rodu Enterococcus schopny produkovat tyramin, 2-fenylethylamin a putrescin, naopak histamin, kadaverin a tryptamin netvoří. Problematikou tvorby BA některými kmeny rodu Enterococcus se zabývala také GREIFOVÁ et al., (2003). Sledovala produkci tyraminu druhem E. faecalis a E. faecium při různých podmínkách růstu. K tvorbě BA v potravinách může přispívat mnoho bakteriálních druhů, přirozeně přítomných i dodaných v podobě startovacích kultur, proto se druhá část práce zabývala odhalením produkce histaminu a tyraminu přímo u bakterií používaných jako součást startovacích a probiotických kultur. Prověřováno bylo 6 bakteriálních rodů dodaných společností Sacco, Itálie (Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus a Bifidobacterium). Nejprve byly vzorky podrobeny skríningovému vyšetření v dekarboxylačním médiu připraveném podle BOVER-CIDA a HOLZAPFELA (1999). Produkce sledovaných BA byla ověřena i pomocí HPLC metodou popsanou BURDYCHOVOU a DOHNALEM (2007). Analyzováno bylo celkem 73 vzorků bakteriálních kultur. Nejvíce zástupců pocházelo z rodu Lactobacillus, jednalo se o 38 kmenů, z kterých bylo 13 kmenů schopno produkovat tyramin. Mezi producenty patřili: Lactobacillus plantarum, L. rhamnosus, L. sakei, L. curvatus, L. pseudoplantarum a L. salivarius. Naopak u L. acidophilus, L. casei, L. bulgaricus, L. helveticus, L. lactis a L. pentosaceus nebyla zjištěna tvorba BA. Neschopnost produkce BA bakteriemi L. casei a L. bulgaricus uvádí MARTUSCELLI et al. (2004), který tyto bakterie použil jako součást startovací kultury při výrobě ovčího sýra. MASSON et al. (1996) uveřejnil, že mezi producenty tyraminu patří kmeny L. curvatus a L. plantarum. Ke stejným závěrům došel i PEREIRA et al. (2001), který sledoval produkci BA ve fermentovaných klobásách a zjistil, že L. curvatus je schopen dekarboxylace tyrozinu na tyramin. Naopak SHALABY (1996) uvádí, že některé kmeny L. plantarum tyramin neprodukují a dokonce mohou jeho obsah ve výrobku snižovat. Dalším zkoumaným rodem z hlediska tvorby BA byl rod Staphylococcus. Jak vyplývá z tabulky č. 10, byl tento rod ve 14 případech ze 17 schopen produkce tyraminu. Mezi kmeny, u nichž byla zjištěna tvorba tyraminu, byl i S. carnosus. Tento bakteriální kmen byl podle RIVASE et al., (2007) izolován ze španělského sušeného masného výrobku chorizo a kromě tyraminu se mohl podílet i na tvorbě 2-fenylethylaminu. Některé studie, např. MARTÍN et al., (2006), ale ukazují, že S. carnosus kromě již 59

61 zmíněného 2-fenylethylaminu neprodukuje žádný jiný BA, tedy ani tyramin. Toto tvrzení ale neodpovídá názorům SIMONOVOVÉ et al., (2006), která zjistila, že S. carnosus přítomný v masném výrobku nazývaném Slovák byl producentem tyraminu. K prověřovaným kmenům stafylokoků patřili také zástupci kmene S. xylosus u nichž byla zjištěna tvorba tyraminu. BOVER-CID et al., (2001), ale zveřejnil, že startovací kultura použitá k výrobě fermentovaného masného výrobku, složená z L. curvatus a S. xylosu, způsobovala snížení množství tyraminu v porovnání s výrobkem vyrobeným bez přidání startovací kultury. Některé mikroorganismy jako např. L. sakei jsou schopny redukovat obsah BA v potravinách. Podle AMMORA a MAYO (2006) by používání startovacích kultur s aminooxidázovou aktivitou mohlo snížit množství vytvořených BA. Tuto vlastnost startovacích kultur popsal i AYHAN et al., (1999), jehož kultura obsahovala L. sakei, Pediococcus pentosaceus, S. carnosus a S. xylosus. Přídavek této startovací kultury zabránil tvorbě putrescinu, ale ne tyraminu Schopnost produkovat tyramin byla sledována také u rodu Streptococcus, jehož zástupcem byl kmen S. thermophilus. Tento kmen se podle mého názoru, z pohledu tvorby BA, jeví jako vhodný pro přípravu fermentovaných výrobků, protože pouze zanedbatelný počet kmenů (0,08 %) byl schopen vytvářet tyramin. To, že S. thermophilus netvoří BA potvrdil i MARTUSCELLI et al. (2004), který jej využil při výrobě italského sýra. BA obsažené v tomto sýru byly vyprodukovány přirozenou nebo kontaminující mikroflórou. K prověřovaným bakteriím patřil i rod Enterococcus, jehož dva zástupci z kmene E. faecium se ukázali jako významní producenti tyraminu. Kmen E. faecium byl kvůli svému hojnému výskytu v mléce a mase dosti prozkoumán a tím i jeho tvorba BA (SILLA-SANTOS, 1996; GREIFOVÁ, 2003). Produkce tyraminu byla pozorována i u kmene E. fecalis izolovaného z masa a sýru typu Čedar (SHALABY, 1996). Sledovaným rodem z pohledu tvorby BA byl také rod Pediococcus u něhož byly prověřovány kmeny P. pentosaceus a P. acidilactici. Žádný z obou kmenů nevykazoval schopnost tvořit tyramin. Tyto výsledky jsou shodné s tvrzením BOVER-CIDA a HOLZAPFELA (1999), kteří u pediokoků nezaznamenali potenciál k produkci BA. V řadě publikací je rod Pediococcus řazen do skupiny bakterií tvořících BA (SILLA- SANTOS, 1996; SHALABY, 1996). Zástupci tohoto rodu jsou velice často součástí startovacích kultur používaných v masném průmyslu. Někteří autoři také uvádí, že při složení startovací kultury z kmenů Micrococcus carnosus, Lactobacillus plantarum 60

62 nebo P. pentosaceus, došlo ke snížení v tvorbě BA, ale ne k jejímu úplnému zastavení (FERNANDEZ, 1997). Posledním pozorovaným rodem byl rod Bifidobacterium, s prověřovanými kmeny B. lactis a B. longum. Bohužel jsem i u těchto kmenů zjistila tvorbu tyraminu. Tento rod je často využíván u výrobků zlepšujících zažívání, proto je důležité znát i tuto negativní vlastnost. Sledovaný soubor byl ale velmi malý na stanovení konkrétních závěrů. Kromě tyraminu se hodnotila i produkce druhého významného BA, histaminu. Pomoci kultivační metody a HPLC bylo zjištěno, že žádný ze sledovaných bakteriálních rodů nebyl jeho tvorby schopen. Získané výsledky, ale neodpovídají poznatkům SHALABYHO (1996), který jako histamin-pozitivní kmeny označil řadu členů rodu Lactobacillus, konkrétně kmeny L. bulgaricus, L. plantarum, L. helveticus, L. casei, L. acidophilus, L. arabinose a L. buchneri. Také u ostatních rodů literatura uvádí zástupce, kteří jsou schopni přeměny histidinu na histamin, např. Streptococcus mitis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium (DABROWSKI a SIKORSKI, 2005) a Staphylococcus spp. získaný z fermentovaných ryb (SILLA-SANTOS, 1996). Z prováděných testů vyplývá, že výsledky získané skríningovou kultivační metodou jsou shodné s hodnotami získanými HPLC. Nevýhodou skríningové metody ale je, že měření může za určitých okolností vycházet negativně i v přítomnosti BA v médiu. K tomu může docházet např. tehdy, pokud sledované bakterie při svém metabolickém procesu produkují velké množství kyselin. Pak nedojde ke změně ph a tím ani ke změně barvy acidobazického indikátoru v médiu v přítomnosti BA, protože je ph udržováno v kyselé oblasti působením vyprodukovaných kyselin. Na toto riziko, se proto musí brát zřetel při použití této metody stanovení. Jedním z nejspolehlivějších způsobů, jak jistit produkci BA mikroorganismy, je v současné době určení specifických DNA sekvencí kódujících tvorbu dekarboxylačních enzymů, např. tyrozindekarboxylázu u jednotlivých bakterií. Pro toto stanovení je výhodné použít polymerázovou řetězovou reakci (PCR), která umožňuje rychlou, citlivou a spolehlivou detekci cílových genů. Dalším hojně používaným způsobem je stanovení BA pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie, která poskytuje velice přesné výsledky a v této práci byla použita jako referenční metoda. 61

63 7 ZÁVĚR Cílem diplomové práce byla detekce mikroorganismů účastnících se tvorby biogenních aminů ve fermentovaných potravinách. Bakterie, u nichž byla stanovována dekarboxylační aktivita pocházely z izolátů polotvrdých sýrů, dále ze startovacích a probiotických kultur používaných při výrobě fermentovaných potravin živočišného původu. Prověřována byla produkce dvou hlavních BA histaminu a tyraminu pomocí skríningové kultivační metody a vysokotlaké kapalinové chromatografie. Zjištěné výsledky lze shrnout do následujících bodů: Izoláty bakterií z polotvrdých sýrů, které byly schopny produkovat některý z BA tj. histamin nebo tyramin, byly pomocí mikrobiologické analýzy zařazeny do bakteriálních rodů Enterococcus nebo Streptococcus. Některé kmeny patřící do rodu Streptococcus tvořily tyramin i histamin, naopak bakterie z rodu Enterococcus dekarboxylovaly pouze tyrozin na tyramin. Při analýze bakterií startovacích a probiotických kultur, bylo zjištěno, že 5 ze 6 sledovaných rodů bylo schopno tvorby tyraminu. Mezi tyto rody patří Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus a Bifidobacterium, kde byl z předložených zástupců nalezen alespoň jeden tyramin-pozitivní kmen. Pouze u rodu Pediococcus nebyla tato schopnost stanovena, což ale může být dáno nízkým počtem prověřovaných kmenů. Zjišťována byla i produkce histaminu, ale v tomto případě nebyl nalezen žádný zástupce, u kterého by se tato vlastnost projevila. Bakteriální kmeny, které netvoří BA jsou vhodné k přípravě fermentovaných potravin. Výrobky vyrobené pomocí kultur produkujících BA by měly být prověřovány na celkový obsah BA. To je ale velice nákladné. Obě použité metody stanovení tvorby BA bakteriálními kmeny vykazovaly shodné výsledky. Přesnější a průkaznější je HPLC, která patří mezi referenční metody stanovení BA. 62

64 8 POUŽITÁ LITERATURA AMMOR M. S., MAYO B.: Selection kriteria for lactic acid bakteria to be used as functional starter cultures in dry sausage production. Meat Science 2007, roč. 76, č.1, s AYHAN K., KOLSARICI N., ÖZKAN G. A.: The effects of a starter culture on the formation of biogenic amines in Turkish soudjoucks. Meat Science 1999, roč. 53, č. 3, s BOVER-CID S., HOLZAPFEL W. H.: Inproved screening procedur efor biogenic amine production by lactic acid bakteria. International Journal of Food Mikrobiology 1999, roč. 53, s BOVER-CID S., IZQUIERDO-PULIDO M., VIDAL-CAROU M. C.: Effect of the interaction between a low tyramine-producing Lactobacillus and proteolytic staphylococci on biogenic amine production during ripening and storage of dry sausages. International Journal of Food Mikrobiology 2001, roč. 65, str BURDYCHOVÁ R.: Identifikace a charakterizace bakterií rodu Enterococcus určených pro výrobu fukčních potravin. Sborník Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně 2007, roč. 55, č. 2, s BURDYCHOVÁ R.: Skríning vybraných startovacích bakteriálních kultur na přítomnost DNA sekvencí kódujících dakarboxylázu tyrosinu. Sborník Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně 2006, roč. 54, č. 5, s BURDYCHOVÁ R., DOHNAL V.: Využití HPLC ke stanovení produktu exprese genu pro mikrobiální tyrosyndekarboxylásu. Chemické listy 2007, č. 101, s ČERNÝ V., KŘÍŽEK M., KVASVIČKOVÁ E., HAVLÍKOVÁ Š.: Výskyt biogenních aminů v sýrech. Celostátní přehlídka sýrů 2005, výsledky přehlídek a sborník přednášek semináře Mléko a sýry 2005, vydavatel: Česká společnost chemická, s. 214, ISBN DABROVSKI K. M., SIKORSKI Z. E.: Toxins in Food. CRC Press 2005, s. 313, ISBN DUCKOVÁ V., ČANIGOVÁ M., KROČKO M.: Enterokoky v potravinách živočišného pόvodu. Mliekarstvo 2007, roč. 38, č. 4, s FERNÁNDEZ-GARCIA E., TOMILLO J., NÚŇEZ M.: Effect of added proteinases and level of starter culture on the formation of biogenic amines in raw milk 63

65 Manchego cheese. International Journal of Food Microbiology 1999, roč. 52, č. 3, s GIRAFFA G.: Enterococci from foods. FEMS Mikrobiology Reviwes 2002, roč. 26, č. 2, s GÖRNER F., VALÍK L.: Aplikovaná mikrobiológia poživatin. Bratislava: Malé centrum 2004, s. 528, ISBN GREIF G., GREIFOVÁ M.: Štúdium analýzy biogénnych amíniv vo vybraných mliečnych výrobcich. Mliekarstvo 2006, roč. 37, s , ISSN GREIF G., GREIFOVÁ M., DRDÁK M.: Stanoveni biogénnych zmíniv v potravinách živočišného pövodu metodou HPLC. Potravinářské vědy 1997, roč. 15, č. 2, s , ISSN GREIFOVÁ M., GREIF G., NOVOROĹNÍKOVÁ B., KUBOVÁ A.: Biogénne amíny v mliečnych výrobkoch a ich tvorba Enterokokami. Mliekarstvo 2003, roč. 34, č. 4, s , ISSN HERNANDEZ JOVER T., IZQUIERDO PULIDO M., VERCIANA NOGUES M. T., MARINE FONT A., VIDAL CAROU M. C.: Effect of starter cultures on biogenic amine formation dutiny fermented sausage production. Journal of Food Prot. 1997, 60, s CHUMCHALOVÁ J., PLOCKOVÁ M., TŮMA Š., ČURDA L.: Faktory ovlivňující životaschopnost bifidobakterií ve fermentovaných mléčných výrobcích. Mlékařské listy, zpravodaj 2007, č. 104, s , ISSN x. INGR I.: Produkce a zpracování masa. MZLU 2003, s. 202, ISBN INNOCENTE N., BIASUTTI M., PADOVESE M., MORES S.: Determination of biogenic amines in cheese usány HPLC technique and direkt derivatization of acid extrakt. Food chemistry 2007, 101, str KALAČ P., KŘÍŽEK M.: Biogenní aminy a polyaminy v potravinách a jejich vliv na lidské zdraví. Potravinářská revue 2005, č. 2, s KAMENÍK J.: Technologie fermentovaných trvanlivých salámů z pohledu prevence vad finálních produktů. Maso 2007, roč.18, č. 3, Praha, s KAMENÍK J.: Startovací kultury v masném průmyslu. Ústav zemědělských a potravinářských informací Praha, 1994, s. 51, ISBN KONEČNÝ S.: Cizorodé látky v potravinách (IV). Maso 2005, roč. 16, č.5, Praha, s , ISSN KOMPRDA T.: Hygiena potravin. MZLU Brno 2004, s. 145, ISBN x. 64

66 KOMPRDA T., SMĚLÁ D., PECHOVÁ P., KALHOTKA L., ŠTENCL J., KLEJDUS B.: Effect of starter culture, spice mix and storage time and temperature on biogenic amine content of dry fermented sausages. Meat science 2004, roč. 64, č 4, s KOMPRDA T., NOVICKÁ K., KALHOTKA L., SMĚLÁ D.: Biogenic amine kontent in sterilised and pasteurised long-term stored processed cheese. Czech Journal of Food Science 2005, roč. 23, č. 5, s , ISSN KOMPRDA T.: Biogenní aminy a polyamidy ve fermentovaných potravinách živočišného původu. Veterinářství odborný a stavovský měsíčník 2005, roč. 55, č. 10, s , ISSN KŘÍŽEK M., HLAVATÁ V.: Stanovení vybraných biogenních aminů v pivu. Kvasný průmysl 1995, řoč. 41, č. 9, s KŘÍŽEK M., KALAČ P.: Biogenní aminy a polyaminy v potravinách a jejich role ve výživě. Czech Journal of Food Science 1998, roč. 16, č. 4, s , ISSN MAIJALA R., EEROLA S.: Contaminant lactis acid bakteria of dry sausages produce histamine and tyramine. Meat science 1993, roč. 35, č. 3, s MARTÍN M., GARRIGA M., HUGA M., BOVER-CID S., VECIANA-NOGUÉS M. T., AYMERICH T.: Molecular, technological and safety characterization of Gram-positive catalase-positive cocci from slightly fermented sausages. International Journal of Food Microbiology 2006, 107, s MARTUSCELLI M., GARDINI F., TORRIANI S., MASTROCOLA D., SERIO A., CHAVES-LÓPEZ C., SCHIRONE M., SUZZI G.: Production of biogenic amines dutiny the ripening of Pecorino Abruzzese cheese. International Dairy Journal 2005, roč. 15, č. 6-9, s MASSON F., TALON R., MONTEL M. C.: Histamine and tyramine production by bacteria from meat products. International Journal of Food Microbiology 1996, roč. 32, s NEZNALOVÁ J., STANDARA S.: Tvorba biogenních aminů v tepelně neopracovaných masných výrobcích během zrání a různých režimů skladování. XXX. Lenfeldovy a Höklovy dny, zaměřené do oblasti hygieny a technologie zpracování masa. Sborník přednášek VFU Brno, s.63, ISBN PEREIRA C.I., BARRETO CRESPO M.T., SAN ROMAO M.V.: Evidence for proteolytic activity and biogenic amines production in Lactobacillus curvatus and 65

67 L. homohiochii. International Journal of Food Mikrobiology 2001, roč. 68, s DE LAS RIVAS B., RUIZ-CAPILLAS C., CARRASCOSA A. V., CURIEL J. A., JIMÉNEZ-COLMENERO F., MUŇOZ R.: Biogenic amine production by Grampozitive bakteria isolatér from Spanish dry-cured chorizo sausage treated with high pressure and kept in chille storage. Meat Science 2007, roč. 76. SHALABY A. R.: Significance of biogenic amines to food safety and human health. Food Reasarch International 1996, roč. 29, č. 7, s SILLA-SANTOS M. H.: Biogenis amines: thein importace in foods. International Journal of Food Mikrobiology 1996, roč. 29, s SIMONOVÁ M., STROMPFOVÁ V., MARCINÁKOVÁ M., LAUKOVÁ A., VESTERLUND S., LATORRE MORATALLA M., BOVER-CID S., VIDAL- CAROU S.: Characterization of Staphylococcus xylosus and Staphylococcus carnosus isolated from Slovak meat products. Meat Science 2006, roč. 73, s STEINHAUSEROVÁ I.: Otravy biotoxiny ryb a mořských živočichů. Veterinářství odborný a stavovský měsíčník 2004, roč. 54, č. 3, s ŠILHÁNKOVÁ L, DEMNEROVÁ K.: Návody pro laboratoře z mikrobiologie. VŠCHT 1993, s. 183, ISBN ŠILHÁNKOVÁ L.: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia 2002, s. 363, ISBN TOMÁNKOVÁ E., RADA V., KILLER J.: Potravinářská mikrobiologie. ČZU v Praze 2006, s. 168, ISBN VYTRAŠOVÁ J., BÍLKOVÁ Z.: Laboratorní cvičení z obecné mikrobiologie. Univerzita Pardubice, 1998, s. 140, ISBN Nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 O mikrobiologických kritériích pro potraviny Vyhláška č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky na mléko a mléčné výrobky ŠMELINA V.: Informace vědeckého výboru pro potraviny ve věci: probiotika a startovací kultury. [on-line] c2006, [cit ] dostupné z 66

68 Seznam tabulek Tab. 1 Biogenní aminy a jejich význam Tab. 2 Koncentrace biogenních aminů v mléčných výrobcích Tab. 3 Významné bakterie produkující biogenní aminy Tab.4 Příprava McFarlandovy zákalové stupnice Tab. 5 Podmínky kultivace Tab. 6 Tvorba biogenních aminů jednotlivými izoláty Tab. 7 Identifikace mikroorganismů produkujících histamin a tyramin Tab. 8 Zastoupení bakterií startovacích a probiotických kultur v produkci BA Tab. 9 Produkce BA rodem Lactobacillus Tab. 10 Produkce BA rodem Staphylococcus Tab. 11 Produkce BA rodem Streptococcus Tab. 13 Produkce BA rodem Pediococcus Tab. 14 Produkce BA rodem Bifidobacterium Seznam obrázků Obr. 1 Vznik biogenních aminů Obr. 2 Schéma rozdělení G + koků (Bergey s Manual of Determinative Bacteriology) Obr. 3 EN-COCCUStest sloužící ke stanovení zástupců rodu Enterococcus Obr. 4 STREPTOtest sloužící ke stanovení zástupců rodu Streptococcus Obr. 5 Rod Enterococcus Obr. 6 Rod Streptococcus 67

69 9 PŘÍLOHA Ukázka diagnostických testů Pliva Lachema, použitých k identifikaci bakteriálních kmenů. Obr. 3 EN-COCCUStest sloužící ke stanovení zástupců rodu Enterococcus Obr. 4 STREPTOtest sloužící ke stanovení zástupců rodu Streptococcus 68

70 Zobrazení růstu mikroorganismů Obr. 5 Rod Enterococcus Obr. 6 Rod Streptococcus 69