DIPLOMOVÁ PRÁCE Hodnocení vybrané účinné látky v přípravku pomocí UHPLC II.

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ CHEMIE A KONTROLY LÉČIV DIPLOMOVÁ PRÁCE Hodnocení vybrané účinné látky v přípravku pomocí UHPLC II. Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Petr Kastner, Ph.D. Hradec Králové, 2015 Šárka Husáková

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorských dílem, kterou jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci jsou řádně citovány. Práce nebyla použita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové Šárka Husáková

3 Ráda bych poděkovala svému vedoucímu práce PharmDr. Petru Kastnerovi Ph.D. za odborné vedení mé práce a cenné rady. Stejně tak děkuji i ostatním pracovníkům katedry Farmaceutické chemie a kontroly léčiv za pomoc, ochotu a příjemné pracovní prostředí.

4 OBSAH Abstrakt... 7 Abstract... 8 Úvod... 9 Cíl práce TEORETICKÁ ČÁST Chromatografie Rozdělení chromatografických metod Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Ultravysokotlaká kapalinová chromatografie (UHPLC) Stacionární fáze pro UHPLC Využití metody UHPLC Součásti chromatografu Vysokotlaké čerpadlo Dávkovací zařízení (autosamplery) Chromatografické kolony Stacionární fáze Předkolony Detektory Hodnocení chromatogramu Kvalitativní analýza Kvantitativní analýza Metoda vnějšího standardu Metoda vnitřního standardu Metoda normalizace Metoda kalibrační křivky Souhrn informací o analyzovaném léčivém přípravku Guttalax kapky Charakteristika analyzovaných látek Natrium-pikosulfát Natrium-benzoát Validace metody Test způsobilosti systému (system suitability test) Správnost (accuracy) Přesnost (precision) Linearita (linearity) Detekční limit (limit of detection, LOD)... 34

5 5.6 Kvantitativní limit (limit of quantitation, LOQ) Selektivita (specifity) Robustnost (robustness) Úplný faktorový plán Neúplný faktorový plán Rozsah (Range) UHPLC parametry Převod metody HPLC na UHPLC PRAKTICKÁ ČÁST Materiály a pomůcky Chemikálie Pomůcky UHPLC sestava Přístroje Přenos HPLC metody do podmínek UHPLC Obecný postup Příprava mobilní fáze Příprava roztoků Příprava zkoušeného roztoku Příprava porovnávacích roztoků Experimenty s kolonou Stanovení natrium-picosulfátu a natrium-benzoátu Stanovení příbuzných látek Validace analytické metody Test způsobilosti analytického systému Limit detekce a limit kvantifikace Linearita Ověření linearity stanovení natrium-pikosulfátu a natrium-benzoátu Správnost Selektivita Přesnost Opakovatelnost Intermediární přesnost Robustnost VÝSLEDKY A DISKUZE Výsledky validace analytických podmínek... 57

6 14.1. Test způsobilosti chromatografického systému Limit detekce a limit kvantifikace Linearita Ověření linearity stanovení natrium-pikosulfátu a natrium-benzoátu Ověření linearity stanovení příbuzných látek Správnost Selektivita Přesnost Opakovatelnost Intermediární přesnost Robustnost Separace natrium-benzoátu a nečistoty B Retenční čas nečistoty B Retenční čas natrium-pikosulfátu Počet teoretických pater píku natrium-pikosulfátu Faktor symetrie píku natrium-pikosulfátu Rozlišení mezi píky nečistoty A a natrium-pikosulfátu Hmotnostní distribuční poměr (kapacitní poměr) pro pík natrium-pikosulfátu Závěr Seznam zkratek Použitá literatura... 83

7 Abstrakt Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Kandidát: Šárka Husáková Školitel: PharmDr. Petr Kastner, Ph.D. Název diplomové práce: Hodnocení vybrané účinné látky v přípravku pomocí UHPLC II. Byla validována metoda pro stanovení natrium-pikosulfátu monohydrátu, jeho příbuzných látek a natrium-benzoátu s využitím ultravysokotlaké kapalinové chromatografie (UHPLC). Tato metoda byla přenesena z podmínek již validované a optimalizované metody vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC). Separace bylo dosaženo za využití kolony Kinetex 2,6 μm C18, 100A, 150 x 3,00 mm, 2,6 µm pomocí UV detekce při vlnové délce 263 nm. Mobilní fáze byla složena z pufru, acetonitrilu a propan-2-olu v poměru 55:43:2 (v/v/v). V pufru byl obsažen hydrogenfosforečnan sodný dihydrát, cetyltrimethylamonium bromid a voda. Hodnoty ph 7,0 pufru bylo dosaženo pomocí kyseliny fosforečné. Teplota kolony byla 40 C, nástřik 3 μl, průtok byl nastaven na 0,5 ml/min. Metoda byla vyhodnocena jako dostatečně selektivní, správná, přesná, lineární a citlivá. Dále byla testována robustnost dle Plackett-Burmanova plánu a bylo zjištěno, že nejvýznamnější vliv na provedení separace má obsah acetonitrilu v mobilní fázi. Méně byla separace ovlivněna ph, průtokem a množstvím cetyltrimethylamonium bromidu. 7

8 Abstract Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Chemistry and Drug Control Candidate: Šárka Husáková Supervisor: PharmDr. Petr Kastner, Ph.D. Title of thesis: Evaluation of the chosen active substance in the preparation by UHPLC II. Method for the determination of sodium picosulfate monohydrate, its related substances and sodium benzoate using ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) was validated. This method has been transmitted from the conditions of previously validated and optimized high performance liquid chromatography (HPLC) method. Separation of the substance was achieved with Kinetex 2.6 micron C18, 100A, 150 x 3.00 mm, 2.6 microns column using UV detection at a wavelength of 263 nm. The mobile phase consisted of buffer, acetonitrile and propan-2-ol in a ratio of 55: 43: 2 (v/ v/v). The buffer contained sodium dihydrogen phosphate, cetyltrimethylammonium bromide and water. The ph 7.0 of the buffer was achieved by phosphoric acid. The column temperature was 40 C, injection volume 3 μl, the flow rate was set at 0.5 ml/min. The method was evaluated as sufficiently selective, precise, exact, linear and sensitive. Furthermore robustness was tested according to the Plackett-Burman design. It was found, that the acetonitrile volume in the mobile phase has the most significant infuence on the performance of separation. The separation was less affected by ph, flow and quantity of cetyltrimethylammonium bromide. 8

9 Úvod Stanovení složení léčivých přípravků je nepostradatelnou součástí vývoje nových léčiv, aby byla zajištěna jejich kvalita, bezpečnost a účinnost. Takovéto hodnocení je možné provádět pomocí různých metod. Ty se výrazně liší svojí citlivostí, rychlostí provedení a v neposlední řadě také jejich cenou. Vzhledem ke stále se zvyšujícímu počtu nově vyvíjených léčivých přípravků, jejichž vývoj je finančně vysoce nákladný je trendem vyvíjet takové metody, které šetří čas a tím pádem i peníze při zachování dostatečné citlivosti. Ultravysotkotlaká kapalinová chromatografie (UHPLC) je poměrně novou analytickou metodou, která vychází z hojně využívané vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC). Její hlavní výhodou by mělo být zkrácení doby analýzy a současně úspora analyzovaného vzorku a mobilní fáze. Pro ověření této hypotézy jsem se ve své práci převedla již optimalizovanou a validovanou metodu stanovení natrium-pikosulfátu pomocí HPLC do podmínek UHPLC. 9

10 Cíl práce Cílem této práce byl přenos a validace chromatografické metody stanovení účinné látky přípravku Guttalax natrium-pikosulfátu, jeho dvou rozkladných produktů, značených dle Evropského lékopisu jako Impurity A (ImpA) a Impurity B (ImpB), a konzervační přísady natrium-benzoátu z již optimalizované a validované metody HPLC do metody UHPLC. 10

11 TEORETICKÁ ČÁST 1. Chromatografie Chromatografie je analytická separační metoda, pomocí níž lze analyzoval látky od nejlehčích plynů až po homologické polymery, biomolekuly, buňky, viry či částice. Principem chromatografie je separační proces, který je založen na rozdělení látky mezi dvě navzájem nemísitelné fáze a to mezi fázi stacionární (nepohyblivou) a mobilní (pohyblivou), na základě fyzikálně-chemických interakcí. Její objevení se datuje na přelomu 19. a 20. století, kdy ruský botanik Michail S. Cvět, začal dělit rostlinné pigmenty na barevná spektra. Významněji se začala chromatografie využívat díky objevu principu rozdělovací chromatografie A.J.P. Martinem a R.L.M. Syngem, kteří byli za svou práci v roce 1952 oceněni Nobelovou cenou za chemii. Jejich myšlenka o využití tlaku a malých částic sorbentu se později stala základem pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii. V současnosti se chromatografie využívá v mnoha odvětvích, například ve farmaceutickém, chemickém, či petrochemickém průmyslu. Nicméně ji lze využít například i k monitorování znečištění životního prostředí (detekce pesticidů). [1, 2] 11

12 1.1 Rozdělení chromatografických metod Chromatografických metod je velké množství, proto je účelné jejich rozdělení do jednotlivých skupin. a) Podle skupenství mobilní a stacionární fáze hlavní typ chromatografie mobilní fáze stacionární fáze Název zkratka plynová chromatografie (GC gas chromatography) plyn kapalina pevná látka plynová rozdělovací chromatografie plynová adsorpční chromatografie GLC GSC kapalinová rozdělovací chromatografie LLC kapalinová chromatografie (LC liquid chromatography) kapalina kapalina gelová permeační chromatografie papírová chromatografie tenkovrstvá chromatografie kapalinová adsorpční chromatografie GPC PC TLC LSC pevná látka iontově výměnná chromatografie IEC tenkovrstvá chromatografie TLC Tabulka č. 1: Rozdělení chromatografických metod ve vztahu k mobilní a stacionární fázi. Převzato a upraveno z: old.lf3.cuni.cz/chemie/cesky/materialy_b/chromatografie.doc b) Podle uspořádání stacionární fáze Uspořádání stacionární fáze můžeme rozdělit na plošné a kolonové. V případě kolonové chromatografie je sorbent umístěn v trubici, u plošné chromatografie je umístěn na pevném plochém podkladě, kterým je skleněná nebo hliníková destička. 12

13 Další variantou u plošného uspořádání může být forma papírové chromatografie, kde je stacionární fází papír. Tato metoda je však v dnešní době překonána. [3] c) Dle podstaty separačního děje Adsorpční chromatografie - její účinek je založen na rozdílné adsorbovatelnosti dělených látek na aktivní povrch sorbentu. Rozdělovací chromatografie - podstatou separace je rozdílná rozpustnost dělených látek ve dvou vzájemně nemísitelných kapalinách. Stacionární fází je kapalina zakotvená na vhodném nosiči. Iontově výměnná chromatografie - je využívaná k separaci iontů a snadno ionizovatelných látek. Principem iontově výměnné chromatografie jsou silné elektrostatické interakce mezi ionty, mobilní fází a ionizovatelnými funkčními skupinami iontoměniče. Iontoměničem je makromolekulární matrice nesoucí vhodné funkční skupiny kyselé nebo zásadité povahy. Nejčastěji je tato chromatografie využívána k analýze aminokyselin, nebo při čištění proteinů a peptidů. Gelová chromatografie - analyzované látky jsou při této metodě separovány na základě velikosti a tvaru molekul. Tato separace je založena na principu difúze. Afinitní chromatografie - je určena k separaci biologických makromolekul, které lze jinak velmi složitě separovat a to důvodu velmi malých rozdílů v jejich fyzikálně chemických vlastnostech. Afinitní chromatografie je založena na principu, že na nosič je kovalentní vazbou navázán vhodný ligand, jenž je schopen vytvářet specifický komplex s určitou biologickou makromolekulou. [4, 5, 6] d) Podle pracovní techniky Vytěsňovací chromatografie - vzorek je tlačen před mobilní fází, která slouží jako vytěsňovací činidlo. Frontální chromatografie - v tomto případě vzorek slouží jako mobilní fáze. 13

14 Eluční chromatografie - vzorek je unášen mobilní fází, která prostupuje kolonou naplněnou sorbentem. Dělené složky prostupují pomaleji než mobilní fáze a dochází k jejich retenci. Dle složení mobilní fáze v průběhu analýzy rozlišujeme dva druhy eluce. Isokratická eluce, kterou je možné využít u látek, jejichž eluční vlastnosti se v průběhu separace příliš neliší. Při tomto druhu eluce se používá pouze jedna mobilní fáze. Gradientová eluce se využívá u látek, které se v elučních parametrech výrazně liší. V tomto případě se k jedné mobilní fázi přidává rostoucí množství fáze druhé s větším elučním účinkem. Dochází ke vzniku koncentračního gradientu mobilní fáze. Obdobným způsobem je možné využít gradient ph. Podle uspořádání chromatografu může být gradient nízkotlaký a vysokotlaký. Gradientová eluce umožňuje separaci látek s delším retenčním časem. [6] 1.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) je více než 30 let využívanou analytickou laboratorní metodou, kterou lze použít nejenom v oblasti analýzy léčiv. Umožňuje kvantitativní i kvalitativní hodnocení léčiv. Její výhodou je potřeba minimálního množství vzorku pro analýzu a možnost automatizace celého procesu. [4] 14

15 2. Ultravysokotlaká kapalinová chromatografie (UHPLC) Ultravysokotlaká kapalinová chromatografie (Ultra-High Pressure Liquid Chromatography UHPLC) je moderní analytickou separační metodou, zdokonalující principy vysokotlaké kapalinové chromatografie. Je prováděna za vyšších tlaků než HPLC, s menší velikostí částic sorbentu stacionární fáze kolem 1,7 µm. Hlavní výhodou UHPLC oproti doposud používaným metodám je zvýšení rychlosti, citlivosti i rozlišení. Oproti HPLC technice je výhodou snížení nákladů, díky menší spotřebě rozpouštědel. Současně UHPLC umožňuje kratší dobu analýzy, zvýšení separační účinnosti a zvýšení citlivosti díky snížené mezi detekce. Tím získáváme vetší množství kvalitativních informací o analyzovaném vzorku. [7, 8] 2.1 Stacionární fáze pro UHPLC V počátcích využití UHPLC na začátku nového tisíciletí bylo k dispozici jen omezené množství stacionárních fází, které využívaly C18, C8 a fenyl modifikované stacionární fáze. Postupně však byl rozšiřován rozsah používaných stacionárních fází. V roce 2010 byly zavedeny nové stacionární fáze pro UHPLC založené na nové technologii hybrid particle technology, která vznikla využitím výhodných vlastností doposud používaných sorbentů. Bylo využito mechanické odolnosti anorganického silikagelu a chemické stability organických polymerů. Tato technologie využívá výhod silikagelu, kterému pomocí methylenových můstků rozšiřuje stabilitu v širokém rozsahu ph bez ztráty účinnosti. Zvýšení stability ph vede ke zlepšení odolnosti kolony za běžných provozních podmínek. Povrch hybridních částic je však chemicky identický s běžně používanými silikagely. [9, 10, 11] 2.2 Využití metody UHPLC UHPLC díky své rychlosti a vyššímu rozlišení umožňuje získání více informací o zkoumaném vzorku za kratší čas a tím umožnuje zrychlit celý výzkumný proces a uvedení nového léku na trh. Farmaceutické firmy vyvíjejí velké množství molekul, jejichž další testování je finančně i časově náročné, proto nám tato metoda umožňuje 15

16 rychlou selekci látek nadějných od nevyužitelných. Díky většímu množství dat a vyššímu rozlišení je možno i rychleji identifikovat potenciálně nebezpečné metabolity. 2.3 Součásti chromatografu Obrázek č. 1: Schéma kapalinového chromatografu Převzato a upraveno z: Zásobníky mobilní fáze Zásobníkem mobilní fáze je uzavíratelná nádoba, která musí být odolná proti používaným chemickým látkám. Mobilní fáze je ze zásobníku čerpána přes filtr, který zabraňuje průniku pevných nečistot do dalších částí systému. Míchání rozpouštědel může vést k tvorbě bublin, což může ovlivnit analýzu. Například tím, že vzduchové bubliny, které procházejí detektorem, mohou vést ke změně píků. Abychom tomuto jevu zabránili, je nutné odplynění mobilní fáze, které může být provedeno několika způsoby: I. Přivedením mobilní fáze k bodu varu, nicméně tato technika může vést ke ztrátě těkavých složek spolu s plyny ze směsi. Následné ustálení mobilní fáze do požadovaných podmínek je časově velice náročné. Z těchto důvodů se tato metoda již nevyužívá. II. Probublávání héliem, nebo jiným inertním plynem, který odstraní až 80% rozpuštěného vzduchu. Kvůli finanční náročnosti se využívá jen zřídka. III. Ultrazvukem, za využití ultrazvukové lázně, pomocí které lze odstranit pouze 30% rozpuštěného vzduchu, proto samostatné užití této metody není vhodné. 16

17 IV. Vakuovým odplyněním pomocí aplikace vakua například při filtraci mobilní fáze přes membránový filtr. Na většině komerčně dostupných systémů je k dispozici online vakuové odplynění. V tomto případě mobilní fáze prochází přes porézní polymerní hadičky, které jsou umístěné ve vakuové komoře uvnitř systému. Přes póry polymerních hadiček je vypuzován plyn, ale kapalina zůstává v potrubí. K dosažení co nejlepšího odplynění je vhodné využít kombinaci výše uvedených metod. [12] Vysokotlaké čerpadlo Vysokotlaké čerpadlo umožňuje generovat a měřit žádaný průtok mobilní fáze. Na rozdíl od běžné HPLC, kdy je průtok ml/min využívá UHPLC průtoky v µl/min. Tato pumpa musí být vysoce výkonná, neboť průchod mobilní fáze přes kolonu je možný pouze pod vysokým tlakem. Toto je navíc ztíženo tím, že kolony pro UHPLC jsou plněny mikročásticemi, které při průchodu mobilní fáze kladou vysoký odpor. Mohou být použity dva typy gradientových systémů a to vysokotlaký, kde se složky smíchávají až po průchodu čerpadlem před nástřikem. Typické pro tento systém je nízké zpoždění gradientu. Nízkotlaký gradientový systém provádí smíšení složek mobilní fáze již před čerpadlem, tento systém umožňuje flexibilnější výběr rozpouštědla s možností využití kvartérního gradientu s jedním čerpadlem a má i další výhody. Nicméně vykazuje větší zpoždění. [13] Dávkovací zařízení (autosamplery) Dávkovací zařízení mohou velice výrazně ovlivnit účinnost separace. U UHPLC jsou podmínky ještě ztíženy tím, že je nutné pracovat s nízkými objemy nástřiků a vysokými tlaky. 17

18 Rozeznáváme dva základní druhy dávkovacích zařízení a to: I. Dávkovací zařízení s fixní smyčkou První UHPLC systém obsahoval toto dávkovací zařízení, jehož podstatou je, že se jehla se vzorkem neúčastní nástřiku. V tomto případě se vzorek aplikuje do toku mobilní fáze. II. Dávkovací zařízení s variabilní smyčkou V tomto dávkovacím zařízení je jehla součástí dráhy mobilní fáze. Kdy je jehla a smyčka omývána proudem mobilní fáze. Nynější UHPLC soustavy nejčastěji využívají kombinaci obou zařízení k zisku optimálních výsledků. [8] Chromatografické kolony Obrázek č. 2: Schéma chromatografické kolony. Převzato z: Kolona je tvořená: 1 - kovovým pláštěm 2 - fritou, což je nerezový kruhový disk, kterým je jeden konec uzavřen 3 - tělem kolony 4 - ochranným kovovým kroužkem, který je umístěn na obou koncích kolony 5 - koncovou hlavicí, která se nachází na obou koncích upevněná na ochranném kroužku 6 - vstupem na upevnění kapiláry 18

19 Správný výběr a volba chromatografické kolony má pro separaci rozhodující význam. Chromatografická kolona obsahuje sorbent, tedy stacionární fázi potřebnou k provedení separace. Sorbenty mohou být charakteru organického (silikagel) tak i anorganického (polymer, uhlík). O účinnosti kolon rozhoduje nejen kvalita použitého sorbentu, ale i délka a materiál, ze kterého jsou kolony vyrobeny. Náplně v kolonách musí být naprosto homogenní a rovnoměrně rozložené, proto se dnešní době převážně využívají kolony vyráběné komerčně. [14] Kolony jsou nejčastěji vyrobeny ze skla nebo nerezové oceli. Kolona využívaná pro UHPLC bývá dlouhá 5-10 cm s vnitřním průměrem 1,0 nebo 2,1mm. Toto je další z rozdílů oproti běžné HPLC, kde jsou používány kolony délek 3-25 cm, s průměrem 1-5mm. Pro UHPLC byly vyvinuty kratší kolony, neboť s rostoucí délkou kolony se úměrně prodlužuje i délka analýzy. Ke zvýšení separační účinnosti jsou kolony plněny za vysokého tlaku až 1034 barů. Vysoký tlak zajišťuje optimální rozložení sorbentu uvnitř kolony, proto musí být i koncové spoje kolon uzpůsobeny používaným tlakům. [12] Během analýzy je důležité udržovat nejen konstantní teplotu mobilní fáze, ale i teplotu na koloně, která se může pohybovat od pokojové teploty až po 60 C. S vyššími teplotami hrozí nebezpečí změny vlastností mobilní fáze a rozkládání stacionární fáze. [15] Stacionární fáze Stacionární fází může být tuhá látka nebo film kapaliny, který je chemicky navázaný na pevnou matrici neboli nosič. Jedná se tedy o nepohyblivou fázi chromatografického systému. Typ kolony a použitého sorbentu volíme dle požadavků analýzy a použité techniky. Typy nejčastěji využívaných stacionárních fází jsou: a) Silikagel Silikagel patří mezi nejrozšířenější polární anorganické sorbenty. Jeho výhodou je vysoká odolnost vůči vysokým tlakům, což z něho činí takřka ideální nosič. Jeho komerční využití je proto široké. [16] b) Stacionární fáze na bázi oxidu zirkoničitého Oxid zirkoničitý je možné připravit ve formě monodisperzních porézních kulovitých částic. Kolony naplněné takto upraveným oxidem zirkoničitým vykazují 19

20 srovnatelnou separační účinnost jako kolony plněné silikagelem. Největší jejich výhodou je chemická a tepelná odolnost do teplot pohybujících se až ke 200 C. Z toho vyplývá jejich široké využití za extrémních podmínek. Jejich další výhodou je nízká cena. [17] c) Polymerní stacionární fáze Impulzem ke studiu polymerních stacionárních fází byla nízká chemická stabilita silikagelu. Většina polymerních stacionárních fází je tvořena polystyren-divinylbenzen kopolymerem, mnohem méně jsou užívány např. substituované metakryláty a polyvinylalkoholy. Porézní struktura polymerů vykazuje velký adsorpční povrch. Jejich hlavní výhodou je stabilita v celém rozmezí ph a též stabilita termální. Mezi nevýhody patří značná omezenost využití v oblasti pracovního tlaku kolem 20 MPa. Další nevýhodou je závislost jejich účinnosti na organické složce mobilní fáze. [17] d) Hybridní stacionární fáze Hybridní stacionární fáze je sorbent, který je tvořen kombinací silikagelu a polymeru za vzniku stabilnějších stacionárních fází, které spojují výhodné vlastnosti silikagelu a polymeru které jsou shrnuty v následující tabulce. Typ částice Výhody Nevýhody Silikagel Polymer mechanická odolnost reprodukovatelnost výsledků vysoká účinnost dělení širší rozsah pracovního ph chemická stabilita omezený rozsah ph (2-7) chemická aktivita nižší účinnost dělení nižší mechanická odolnost menší reprodukovatelnost výsledků Hybrid široký rozsah pracovního ph (1-12) vyšší účinnost dělení než polymer vyšší mechanická odolnost než polymer Nižší účinnost dělení Nižší výkon dělení než silikagel Nižší kapacita než silikagel Tabulka č. 2: Převzato z 20

21 e) Stacionární fáze na bázi porézního grafitického karbonu Porézní grafitický uhlík je syntetický materiál, který je připravován pro HPLC ve tvaru částic kulovitého tvaru o různé velikosti. Tento materiál je vhodný pro separaci silně hydrofilních látek, které nejsou dostatečně zadržovány na jiných fázích. K výhodám patří vysoká teplotní odolnost a stabilita v širokém rozsahu ph Nevýhodou je pak jeho značná křehkost a nižší efektivita. Práce s tímto typem sorbentu vyžaduje vysoký stupeň čistoty jak vzorku, tak mobilní fáze, protože nečistoty se mohou vázat na sorbent a způsobit vznik šumu. V krajním případě mohou vést až k nevratnému poškození kolony. Využívá se pro separaci strukturálních izomerů a chirálních analytů. [17] f) Technologie s pevným jádrem a porézním povrchem Technologie s pevným jádrem a porézním povrchem se nachází v kolonách Kinetex a tato kolona byla využita i v této práci. Částice s pevným jádrem není plně porézní. Jejich příprava probíhá pomocí techniky koloidních roztoků a technologie uspořádání nanočástic. Dochází k tvorbě homogenního porézního obalu, který se nachází na pevném jádře silikagelu. Výsledem tohoto optimalizovaného procesu v kombinaci s rovnoměrnou distribucí částic je kolona s extrémně vysokým počtem teoretických pater. Mezi výhody těchto stacionárních fází patří zlepšení rozlišení, kapacity a citlivosti při současném snížení spotřeby použitých rozpouštědel. [18, 19] Obrázek č. 3: Schéma technologie s pevným jádrem a porézním povrchem. Převzato a upraveno z g) Monolitické stacionární fáze Monolit je separační médium, které je tvořené jedním kusem porézního materiálu, který zcela zaplňuje vnitřní prostor kolony. Charakteristické pro tyto kolony je vysoká 21

22 odolnost vůči změnám ph, mechanická odolnost a pórovitost. Kolony mají dva typy pórů makropóry a mesopóry, díky kterým monolitu poskytují dostatečně velký povrch a separační účinnost. Velké využití nacházejí tyto kolony při analýze biopolymerů právě metodou UHPLC. [20] V dnešní době stále vzrůstají požadavky na nově vyráběné kolony a jejich stacionární fáze. K těmto požadavkům patří: mechanická, termální a chemická stabilita, úspora rozpouštědel, citlivější analýza, možnost využití kolony při 100% vodných fázích, selektivita a v neposlední řadě dlouhá životnost kolony Předkolony Předkolony jsou umístěny před dávkovačem, nebo mezi dávkovačem a chromatografickou kolonou. Nejčastěji se využívají právě u metody UHPLC, kde je jejich úkolem chránit finančně nákladnou kolonu před ucpáváním složkami vzorku nebo mobilní fáze. [21] Obrázek č. 4: Schéma předkolony v chromatografickém systému. Převzato a upraveno z Detektory Detektory mají za úkol zaznamenat rozdíl mezi průchodem čisté mobilní fáze a mobilní fáze obsahující analyzovanou látku. Zpravidla jsou umístěny na konci kolony. Detektor po průchodu mobilní fáze zaznamenává změnu některé vlastnosti eluátu pomocí vhodného snímače. Vzniklý signál se po zesílení přivádí do zapisovače, který nám poskytuje záznam intenzity daného signálu na čase. Jednotlivé detektory se liší citlivostí a selektivitou analýzy. Mezi požadované vlastnosti detektoru patří: - dostatečně velký poměr mezi signálem a šumem 22

23 - citlivost (mez detekce) jaké množství analytu je schopen zaznamenat - linearita odezvy v co nejširším koncentračním rozmezí - možnost využití gradientové eluce Detektory lze rozdělit do dvou skupin, na selektivní, jejichž signál je úměrný pouze koncentraci analyzované látky a univerzální, které poskytují signál úměrný určité vlastnosti eluátu jako celku. Následuje přehled jednotlivých typů detektorů, které jsou využívány v HPLC a stejně tak i v UHPLC. [22] Druhy detektorů I. Spektrofotometrické detektory Tyto detektory jsou nejužívanějšími v oblasti chromatografie. Jedná se o selektivní detektory, které jsou založeny na principu absorpce záření v určitém rozmezí vlnových délek v UV a VIS oblasti, což odpovídá rozmezí od 190 do 800 nm. Koncentrace látky je následně určena dle Lambert-Beerova vztahu: A = c. ε. l A - absorbance c - molární koncentrace ɛ - molární absorpční koeficient l - tloušťka proměřované vrstvy v cm Hlavním benefitem spektrofotometrických detektorů je jejich značná citlivost ( g/ml) a také možnost využití těchto při gradientové eluci. Spektrofotometrické detektory se rozdělují na podskupiny, dle způsobu detekce: a) Detektory, které pracují s fixní vlnovou délkou (nejčastěji 254nm nebo 280nm). Při této vlnové délce absorbuje většina léčiv. Jejich výhodou je konstrukční jednoduchost a finanční dostupnost. b) Detektory s proměnnou vlnovou délkou, kterou je možné měnit dle potřeby. c) Scanning detektory, které mají programovatelnou vlnovou délku, která se v průběhu analýzy mění, tak aby snímaly vždy absorbanci v maximu píku. 23

24 d) Diode array detektory snímají celé absorpční spektrum a hodnotí léčivo současně při několika vlnových délkách. Detektory jsou řízeny počítačem a výsledkem je trojrozměrná projekce. [4, 22] II. Fluorescenční detektory Tyto detektory jsou méně univerzální než UV detektory, ale mnohem citlivější ( g/ml), s výhodou jsou využívány u látek, které vykazují fluorecenci. Látky, jež tuto vlastnost postrádají, lze vhodnými činidly převést na fluoreskující deriváty. Omezením je však požadavek, že ostatní složky mobilní fáze nesmí fluoreskovat, nebo naopak fluorescenci zhášet. [23, 24, 25] III. Elektrochemické detektory Elektrochemické detektory jsou využitelné jen pro látky, které se mohou oxidovat či redukovat. Tedy látky, které vyvolávají elektrochemickou reakci na rozhraní elektrody a eluentu. Mezi jejich výhody patří značná citlivost, která se pohybuje v rozmezí ( g/ml ), naopak nevýhodou je nemožnost využití při gradientové eluci. Rozdělení elektrochemických detektorů: a) Polarografický - měří vznikající proud, jako měrná elektroda se využívá rtuťová kapková elektroda. b) Ampérometrický - který měří proud vyvolaný průchodem látky přes měrnou celu detektoru při stabilním napětí, měrná elektroda je nejčastěji zhotovena z grafitu, platiny, mědi, zlata nebo jiných kovů. c) Voltametrický - měří náboj potřebný nejčastěji k oxidaci látek, měrná elektroda je v tomto případě je grafitová. [8, 26] IV. Refraktometrické detektory Tyto detektory umožňují detekci v podstatě všech látek, na základě porovnání indexu lomu samotné mobilní fáze a mobilní fáze se stanovovanou látkou. Mezi jejich nevýhody patří nízká citlivost (10-6 g/ml) a nemožnost využití při gradientové eluci. [27] 24

25 V. Hmotnostně-spektrofotometrické detektory Tyto typy detektorů detekují ionty, které vznikají ionizací analytů. V první fázi probíhá převod analytů rozpuštěných v mobilní fázi na ionty v plynné fázi. V dalším kroku se ionty separují podlě poměru jejich hmotnosti k náboji. Hmotnostní detektory jsou vysoce citlivé, selektivní a poskytují řadu potřebných údajů pro identifikaci léčiv. Jejich hlavní nevýhodou je cena. [28] VI. Vodivostní detektory Detektory měří elektrickou vodivost mezi elektrodami, na které je vkládáno střídavé napětí, aby se zabránilo polarizaci těchto elektrod. Mobilní fáze u vodivostních detektorů musí být nevodivá, aby se v ni analyzované látky rozpouštěly. Těmto požadavkům na mobilní fázi vyhovuje redestilovaná voda, případně ve směsi s polárními organickými rozpouštědly. Tento typ detektorů se nejčastěji využívá v iontové chromatografii. [8] VII. Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) ELSD slouží k detekci látek, které jsou málo těkavé a ve své molekule neobsahují žádný chromofor nebo fluorofor. Jsou vhodné pro detekci látek, jako jsou aminokyseliny, mastné kyseliny, fosfolipidy nebo makromolekul. V tomto případě jsou kladeny vysoké nároky na mobilní fázi, která musí být těkavější než soluty. Vzorek je přiváděn do cely se zdrojem záření a je detekován rozptyl světla na částicích látky, který je přímo úměrný hmotnosti. Je možné jejich využití při gradientové eluci. [27] VIII. Corona Charged Aerosol Detector (CAD) CAD pracují na principu detekce kladně nabitých částic, které mají rozdílnou pohyblivost a tedy i hmotnost. Získaný signál je závislý pouze na velikosti částic solutu, ale není závislý na jeho fyzikálně - chemických vlastnostech. Detektor je velmi citlivý a má srovnatelný rozsah s UV detekcí. [8] 25

26 3. Hodnocení chromatogramu 3.1 Kvalitativní analýza Kvalitativní analýza využívá k identifikaci látky její retenční čas. Tím je myšlen časový interval od nástřiku vzorku po dosažení maxima chromatografického píku. Identifikačním nástrojem je shoda retenčních časů chromatografických píků a to píku standardu vůči píku analyzované látky. Kvantitativní analýza je využívána k identifikaci, či potvrzení identity analyzovaných látek. [4, 29] 3.2 Kvantitativní analýza Nástrojem kvantitativního hodnocení je plocha (případně výška) chromatografických píků. Ke stanovení koncentrace jednotlivých složek směsi se využívají tyto čtyři základní metody Metoda vnějšího standardu Metoda vnějšího standardu spočívá v nástřiku analyzovaného vzorku a roztoku vnějšího standardu. Pomocí vnějšího standardu se vypočítá koncentrace stanovovaných složek směsi a to z poměrů ploch píků jednotlivých stanovovaných látek a plochy píku vnějšího standardu. Jako vnější standard se využívá chemická referenční látka CRL (anglicky - chemical reference substance CRS) nebo jiná látka kvalitou odpovídající požadavkům na standard. U složených lékových přípravků se využije jedna z analyzovaných složek směsi Metoda vnitřního standardu U této metody postupujeme tak, že ke známému objemu roztoku vzorku se přidá definovaný objem roztoku vhodného vnitřního standardu a po promíchání se nastřikuje na kolonu. Pro výpočet koncentrace se využívá poměru ploch píků jednotlivých 26

27 separovaných složek vzorku a plochy píku vnitřního standardu. Výhodou této metody je, že není zatížena chybou dvojího nástřiku a její nespornou výhodou je taktéž nižší časová náročnost. Její využití při lékopisném hodnocení přípravků je spíše marginální, je hlavně využívána v analýze biologických vzorků Metoda normalizace Metoda normalizace nám umožňuje vypočítat procentuální obsah určité složky ze vzorku. Obsah jedné nebo více složek zkoušené látky v procentech se vypočítá z plochy nebo ploch, jako procento celkové plochy všech píků rozpouštědel a ostatních složek, které se nacházejí pod limitem zanedbatelnosti. Výhodou této metody je, že k analýze vzorku nám postačí pouze jeden nástřik Metoda kalibrační křivky Metoda kalibrační křivky je založená na přípravě a proměření vzorku se sadou standardů o stanovených koncentrací. Výsledkem je sestrojení kalibrační křivky, ze které je možné odečíst koncentraci stanovovaného vzorku. [4, 29] 27

28 4. Souhrn informací o analyzovaném léčivém přípravku Guttalax kapky Složení přípravku: Přípravek Guttalax obsahuje účinnou látku natrium-pikosulfát. Mezi pomocné látky patří sorbitol 70% nekrystalizující, dihydrát natrium-citrátu, monohydrát kyseliny citronové, čištěná voda a natrium benzoát, který se uplatňuje jako konzervační látka. Léková forma: Perorální kapky, které jsou čiré, nebo téměř čiré. Terapeutické využití: Guttalax kapky se využívají při akutní funkční zácpě, ale slouží i k občasnému použití u zácpy chronické. Nebo u zácpy vzniklé jako nežádoucí účinek léčiv, dietními chybami, nebo u psychogenní zácpy. Nejsou vhodné k dlouhodobému používání z důvodu možnosti vzniku návyku a toxikého účinku na nervové střevní pleteně. Mechanismus účinku: Je uveden v kapitole Natrium-pikosulfát. Kontraindikace: Guttalax je kontraindikován při střevní obstrukci, střevní neprůchodnosti, při náhlé příhodě břišní, nebo při akutních zánětech střev. Dále při onemocněních a těžkých bolestech břicha doprovázených nauzeou a zvracením, které mohou svědčit pro výše uvedené závažné stavy. Guttalax se dále nesmí užívat pacienty, u kterých byla indikována hypersenzitivita na pikosulfát sodný nebo na kteroukoli pomocnou látku přípravku. Interakce: Podávání přípravku Guttalax společně s diuretiky nebo kortikosteroidy hrozí riziko vzniku elektrolytové nerovnováhy. Porušená elektrolytová nerovnováha může způsobit zvýšenou citlivost působení srdečních glykosidů. 28

29 Nežádoucí účinky: Poruchy imunitního systému Vzácné: hypersenzitivita včetně angioneurotického edému a kožních reakcí. Gastrointestinální poruchy Časté: abdominální křeče, abdominální bolest, průjem, abdominální obtíže. Méně časté: zvracení, nauzea [30] 4.1 Charakteristika analyzovaných látek Natrium-pikosulfát Obrázek č. 5: Strukturní vzorec Natrium-picosulfátu Chemický název natrium-pikosulfátu je: Dinatrium-4,4'-(2-pyridylmethylen) diphenylbis(sulfát). Jedná se o téměř bílý krystalický prášek snadno rozpustný ve vodě a těžce rozpustný v ethanolu. Natrium-pikosulfát patří mezi kontaktní laxativa, který se řadí do skupiny látek obsahujících difenylmethanovou skupin. Nátrium-pikosulfát je bakteriálním štěpením v tlustém střevě přeměněn na bis-(p-hydroxyphenyl)-pyridyl-2-methane (BHPM). Tato laxativní složka působí lokálně na nervová zakončení ve střevní sliznici a podrážděním nervových pletení ve střevě způsobí zrychlení střevní peristaltiky, zvýšením sekrece vody a elektrolytů do lumen střeva. Pikosulfát je nejčastěji využívaným syntetickým laxativem. Jeho účinek nastupuje za 6-12 hodin. [29, 31] 29

30 Rozkladné produkty natrium-pikosulfátu Rozkladné produkty natrium-pikosulfátu jsou uvedeny v Evropském lékopise jako Impurity A nečistota A: 4-[(RS)-(4-hydroxyfenyl)(pyridin-2-yl)metyl]fenylsulfát sodný a Impurity B nečistota B: 4,4 -[(pyridin-2-yl)metylen]difenol. [30, 32] Obrázek č. 6: Struktura nečistoty A Obrázek č. 7: Struktura nečistoty B Natrium-benzoát Obrázek č. 8: Strukturní vzorec Natrium-benzoátu Chemickým názvem sodná sůl kyseliny benzoové. Jedná se o bílý prášek, který je dobře rozpustný ve vodě. V přírodě se vyskytuje především v bobulovitých rostlinách, houbách, ale i ve skořici a hřebíčku. Může vzniknout i při mléčném kvašení. Pro komerční účely se benzoan sodný vyrábí neutralizací kyseliny benzoové, která je připravena oxidací 30

31 toluenu. Je využíván jako konzervační přísada v kyselých přípravcích jako ochrana proti plísním a kvasinkám. V potravinářství je označován zkratkou E221. [33] 5. Validace metody Validace metody je proces, při kterém ověřujeme kvalitu analytické metody za stanovení přesně daných kritérií a měřením hodnot těchto kritérií. Slouží k ověření vhodnosti zvoleného analytického postupu. Je vždy prováděna při vývoji nové metody, ale také při přenosu metody do jiné laboratoře, záměně dat u metody stávající, nebo při porovnávání rovnocennosti dvou metod. Validace metody přesně určuje podmínky, při kterých je zkušební postup použitelný a kdy je zajištěna stejná spolehlivost a reprodukovatelnost. Ke sledovaným parametrům metody patří: test způsobilosti, správnost, přesnost, linearita, detekční limit, kvantitativní limit, robustnost, rozsah a selektivita. Rozeznáváme interní validaci, při které je prováděna validace metody pouze v rámci jedné laboratoře a externí validaci, při níž je kromě interní validace provedeno srovnání výsledků metody z více laboratoří a výpočet reprodukovatelnosti metody. Ve farmaceutickém průmyslu validace a přenos metody probíhá v souladu se zásadami SVP. Pro harmonizaci pravidel uvedených v Evropském lékopisu, Japonském lékopisu a Lékopisu Spojených států amerických byla vytvořena Mezinárodní konference o harmonizaci (ICH). Jejím hlavním účelem je snížit počet duplicitního testování, které se provádí při výzkumu a vývoji nových léků. Tato organizace vydává doporučení, jak dosáhnout lepší harmonizace při interpretaci a aplikaci technických pokynů a požadavků na registraci produktu. Cílem této iniciativy je zamezit zbytečnému plýtvání zdrojů a odstranění průtahů při globálním vývoji a rozšiřování léčiv, při současném zachování bezpečnosti, účinnosti a kvality těchto léčiv. [26, 34] 31

32 5.1 Test způsobilosti systému (system suitability test) System suitability test, tedy test způsobilosti, slouží ke zjištění přiměřené účinnosti chromatografického systému, proto také tvoří nedílnou součást každé chromatografické metody. Při každém novém použití metody tedy není nutné provádět novou validaci systému, nýbrž jsou definovaná určitá kritéria, která musí být splněna, aby se dalo předpokládat, že dříve provedená validace platí. Pomocí porovnávacích roztoků se zjišťují nejčastěji tyto parametry: rozlišení, faktor symetrie píku, opakovatelnost nástřiku, poměr signálu k šumu, kapacitní faktor, účinnost a relativní retence. Jedná se o validační postupy, které je nutné ověřit při opakovaném použití metody. V případě, že některý parametr nebo více parametrů neodpovídá, upraví se chromatografické podmínky v rozsahu tak, aby byla splněna kritéria způsobilosti chromatografického systému. Povolené úpravy chromatografických podmínek: - složení mobilní fáze: jedna složka ± 30%, každá další složka ± 10% - průtoková rychlost: ±50% - teplota kolony: ±10%, max. 60 C - stacionární fáze: délka kolony ±70%, průměr kolony ±25%, velikost částic povolené zmenšení max. o 50% - nástřik: možno zmenšit, je-li vyhovující opakovatelnost a mez detekce - vlnová délka detektoru: není povolena žádná změna - koncentrace soli v tlumivém roztoku: ± 10% - hodnota ph vodné složky: ± 0,2 od určené hodnoty ph V případě využití gradientové eluce jsou malé změny ve složení mobilní fáze a gradientu přijatelné za předpokladu, že: - hlavní pík(y) eluují do 15% uvedené doby retenčního času - konečné složení mobilní fáze není v eluční síle slabší než předepsané složení [29, 32] 32

33 5.2 Správnost (accuracy) Správnost vyjadřuje míru shody mezi výsledkem získaným měřením a skutečnou hodnotou dané veličiny. Tento důležitý validační parametr můžeme získat několika různými způsoby. Jedním z nich je analýza vzorku s přidaným standardem v případě, že není k dispozici placebo. Nebo analýza vzorku s placebem a přidaným standardem, či jinou metodou, jejíž správnost byla již dříve ověřena. 5.3 Přesnost (precision) Přesnost je definována jako shoda mezi výsledky získanými opakovaným měřením jednoho homogenního vzorku. Nejčastěji se vzorek analyzuje šestkrát a to kompletním postupem, který zahrnuje i přípravu vzorku. Následně se přesnost vyjádří jako relativní směrodatná odchylka těchto šesti stanovení. Přesnost může být hodnocena jako: - opakovatelnost: která spočívá v opakování měření jedním pracovníkem, stejnými činidly na tomtéž přístroji v krátkém časovém intervalu - mezilehlá přesnost: rozdíl od opakovatelnosti spočívá v tom, že se metoda se provádí jinými analytiky, přístroji, v jiný den a s různými činidly. Zůstávají tedy stejné vzorky a laboratoř. - reprodukovatelnost: jsou podmínky stejné jako u mezilehlé přesnosti jen s tím rozdílem, se metoda provádí v jiných laboratořích 5.4 Linearita (linearity) Linearita je schopnost metody poskytovat výsledky přímo úměrné koncentraci stanovované látky. Rozsah linearity vyplývá z účelu použití metdy. Obvykle je pro hodnocení obsahu účinné látky v přípravku doporučováno proměřovat pět různých koncentrací v rozmezí %. Pro hodnocení příbuzných látek bývá jako minimální koncentrace vzorku zvolen limit kvantifikace. Pro hodnocení linearity se využívá takzvaný korelační koeficient, jehož hodnota se blíží 1 a jeho limit pro určitou metodu opět závisí na tom, k jakému účelu se bude metoda využívat. 33

34 Hodnota korelačního koeficientu pro stanovení: účinné látky v přípravku je obvykle 0,999 konzervační látky v přípravku 0,995 stanovení příbuzných látek 0, Detekční limit (limit of detection, LOD) Detekční limit vyjadřuje citlivost metody, kterou rozumíme nejnižší detekovatelnou koncentraci látky, která je metodou možná detekovat. Nejedná se však o stanovení kvantitativní. Lze stanovit experimentálně a to u metod neinstrumentálních, naopak u metod instrumentálních je možné ho určit jako koncentraci analyzované látky s poměrem signálu k šumu s hodnotou 3. Nalezený limit detekce se ověří analýzou příslušné koncentrace vzorku. 5.6 Kvantitativní limit (limit of quantitation, LOQ) Kvantitativní limit patří rovněž mezi parametry citlivosti metody. Jde o nejnižší koncentraci látky, která je stanovitelná s přijatelnou přesností a správností. Také se často vyjadřuje jako koncentrace látky poskytující záznam s poměrem signálu k šumu s hodnotou Selektivita (specifity) Selektivita metody je vyjádřením schopnosti změřit správně a specificky danou látku i v přítomnosti jiných možných látek, jako jsou nečistoty, další účinné látky u složených lékových forem, pomocné látky, rozkladné produkty nebo zbytková rozpouštědla. Tento parametr se doloží výsledky analýzy standardu a výsledky vzorků bez analyzované látky obsahující všechny složky přípravku, rozkladné produkty a nečistoty. [4, 29] 34

35 5.8 Robustnost (robustness) Robustnost je schopnost metody dávat reprodukovatelné výsledky při změně podmínek. V průběhu vývoje metody se sbírají poznatky s cílem upozornit na podmínky, které by mohly významně ovlivnit výsledky. Změna podmínek může nastat změnou podmínek v jedné laboratoři (složení mobilní fáze, ph vodné fáze, rychlost průtoku, teplota na koloně, změna gradientu, stabilita analyzovaných vzorků a v neposlední řadě šarže chemikálií a kolon), nebo v případě mezilaboratorních zkoušek (jiná laboratoř, analytik). Cílem ověření robustnosti metody je stanovit, jaké parametry mají na výsledek zásadní dopad a které změny jsou stále ještě vyhovující, abychom získali správné a přesné hodnoty. Pro experimentální testování robustnosti máme dvě možnosti. První je klasický, více časově náročný a méně využívaný, tzv. úplný faktorový plán. Kde výsledek pokusu ovlivňují dvě proměnné veličiny. Druhou metodou je častěji využívané testováni robustnosti podle Plackett-Burmanova plánu, který patří mezi takzvané neúplné vektorové plány. Tento plán zanedbává vzájemné ovlivňování proměnných a to vede k významné časové úspoře. [4, 35] Úplný faktorový plán Touto metodou testujeme na základě plánovaných pokusů robustnost metody vůči malým změnám. Výsledek pokusu ovlivňují dvě proměnné. Podle úplného faktorového plánu určíme pro každou proměnnou dvě hodnoty, kdy vyšší označíme +1 a nižší Proměnná 2. Proměnná Výsledek +1-1 y y y y 4 Tabulka č. 3: Znázornění testování dle úplného faktorového plánu. Při každém provedeném měření si zaznamenáme výsledek pokusu y1 až y4. K odhalení míry ovlivnění výsledku proměnnou využijeme metodu lineární regrese. 35

36 Při ní předpokládáme, že výsledek (proměnná y) závisí na nezávisle proměnné x a citlivost této závislosti udávají hodnoty parametru. [36] Neúplný faktorový plán V případech, kdy je nutné posoudit významnost více proměnných, není možné využít z časových a ekonomických důvodů úplného faktorového plánu, kdy se počet experimentů s každou proměnnou veličinou zdvojnásobí. V těchto složitých případech z praktických důvodů zanedbáváme možnost vzájemné interakce proměnných a využíváme tzv. neúplného faktorového plánu. Pro účely této práce jsem využila Plackettův-Burmanův plán, který je jedním z nejužívanějších. [36] Plackettův-Burmanův plán (Redukovaný faktorový plán) Redukovaný faktorový plán byl navržen za účelem zredukování počtu pokusů, které jsou nutné pro určení významných proměnných v regresi při komparaci s úplným faktorovým plánem. Pro tři proměnné lze využít tuto tabulku: I A B C Tabulka č. 4: Schéma testování robustnosti dle Plackett-Burmanova plánu pro tři proměnné. Jestliže u prvního řádku základní matice Z (tj. sloupce A, B, C) provedeme cyklickou záměnu, kdy první prvek vyjmeme a vložíme za poslední, tím získáme 2. řádek. Další cyklickou záměnou dostaneme řádek 3. Tímto krokem cyklické záměny končí, následující tedy poslední řádek vytvoříme ze samých -1. Toto je podstatou Plackett-Burmanova plánu, kde platí: - Pro n proměnných budeme mít jen n+1=m experimentů 36

37 - Přičemž n+1 musí být dělitelné čtyřmi, jestliže není, přidá se k reálným proměnným potřebný počet fiktivních proměnných. - Provede se m experimentů, při nichž se použijí proměnné dle znamének u jedniček v příslušných řádcích. Po provedených experimentech se odečtou hodnoty závisle proměnných (kterými mohou být rozlišení mezi píky, nebo faktor symetrie u některého z píků). Pro každou závisle proměnnou se naměřená data vyhodnotí pomocí lineární regrese, kdy se vypočítá rovnice s absolutním členem a koeficienty u jednotlivých nezávisle proměnných, které budou naznačovat míru ovlivnění dané závislé proměnné. Ze statistického hodnocení závislosti je možné posoudit proměnné a jejich vliv. Při testování robustnosti metody pomocí Plackett-Burmanova plánu se může projevit jev zvaný confounding, který se dá nejlépe charakterizovat jako vzájemné ovlivňování proměnných, které mohou vést ke zkreslení výsledku. Tomuto jevu lze předejít tak, že se zvolí plán, kde počet experimentů bude odlišných od mocniny 2. V praxi se dá vyhnout confoudingu tak, že vybereme pro daný počet proměnných plán, ve kterém se confounding neprojevuje. Například jestliže máme 7 a méně proměnných, není vhodné používat nejbližší plán tedy 8 experimentů, ale lze doporučit přidat více fiktivních proměnných a pracovat dle plánu pro 12 experimentů, kde se confounding nevyskytuje. [35, 36] 5.9 Rozsah (Range) Rozsahem metody rozumíme koncentrační rozmezí, ve kterém je možné danou metodu využít. Tak abychom získali správné a přesné výsledky. Nejnižší koncentrací může být výše zmiňovaný kvantitativní limit a horním limitem maximální odezva detektoru. [4] 37

38 6. UHPLC parametry Doba analýzy Pro dobu analýzy platí následující vztah: t α = Lπd c 2 ε T 4F m (k max + 1) Ze kterého je patrné, že doba analýzy je přímo úměrná délce kolony L, jejímu vnitřnímu průměru dc a je také nepřímo úměrná objemovému průtoku Fm. Vzhledem k tomu, že všechny tyto parametry jsou u metody UHPLC menší, je i doba analýzy touto metodou podstatně kratší. Účinnost separace Účinnost separace N je vyjádřena poměrem výškového ekvivalentu teoretického patra H a délky kolony L. N = L H Výškový ekvivalent teoretického patra H popisuje van Deemterova rovnice, ze které vyplývá, že účinnost separace je nepřímo úměrná velikosti sorbentu dp. Pro zjednodušení proto můžeme pro účinnost separace využít vztah: N 1 d p Rozlišení Rozdělení látek může být dokonalé či nedokonalé, přičemž jsme schopni kvantitativně tento stupeň vyjádřit. Rozlišení je pak nejpoužívanější vyjádření míry kvality separace dvou sousedních elučních křivek, obecně lze tento vztah vyjádřit: 38