Nesilikagelové materiály v analýze léčiv III. Diplomová práce

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Nesilikagelové materiály v analýze léčiv III. Diplomová práce Nina Brejchová Vedoucí diplomové práce: doc. PharmDr. Radim Kučera Ph.D. Konzultant: Mgr. Michal Klivický HRADEC KRÁLOVÉ, 2017

2 Prohlašuji, že tato diplomová práce je mým původním autorským dílem. Literatura a ostatní zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové dne Nina Brejchová

3 Na tomto místě bych ráda poděkovala doc. PharmDr. Radimovi Kučerovi a Mgr. Michalovi Klivickému za odborné vedení, cenné rady a přínosné připomínky při vypracovávání diplomové práce. Děkuji za jejich vstřícnost a čas, který mi věnovali. Za pomoc s grafickými úpravami moc děkuji Ing. Martinovi Jiřičkovi. Diplomová práce byla vypracována za podpory grantu SVV

4 Abstrakt Nesilikagelové materiály v analýze léčiv III. Nina Brejchová Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Jednou z nejdůležitějších rolí v analýze léčiv hraje úprava vzorku před jeho vlastní analýzou. Velmi rozšířenou a používanou metodou je extrakce na pevné fázi. Tato metoda se vyznačuje vysokou selektivitou, která je dána především použitým sorbentem. Tato práce je zaměřena na studium využití modifikovaného oxidu zirkoničitého grafenem při extrakci na pevné fázi. Grafen je alotropickou modifikací uhlíku, která má specifické adsorpční vlastnosti, proto ji lze využít mimo jiné v chemické analýze. Tato práce studuje adsorpční schopnosti tohoto sorbentu s využitím směsi modelových bazických léčiv. Pozornost byla věnována zejména ph prostředí při extrakci a typu elučních činidel. Vzorky po extrakci byly následně analyzovány pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie, s využitím gradientové eluce. Nejvhodnějším prostředím extrakce bylo vodné prostředí. Extrakční výtěžnosti nového sorbentu byly porovnány s extrakčními výtěžnostmi při použití silikagelového sorbentu. Nejlepších výsledků bylo dosaženo při extrakci diazepamu za použití směsi sorbentů. Klíčová slova: extrakce na pevné fázi, grafen, oxid zirkoničitý

5 Abstract Non-silica based materials in the drug analysis III. Diploma thesis Nina Brejchová Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Chemistry and Drug Analysis Sample preparation prior to an essay plays a key role in the drug analysis. Example of a widely used sample preparation technique is a Solid Phase Extraction. This method is characterised by high selectivity, which is given by the type of used sorbent. The aim of this thesis is to study the application of a new sorbent in Solid phase extraction which is zirconium oxide modified by graphene. Graphene is an allotropic modification of carbon possessing a specific adsorptive properties. Therefore it can be used besides other areas in chemical analysis. This thesis focuses on the testing on adsorptive capability of this sorbent using a mixture of model basic drugs. The attention was also paid to ph of solution used for conditioning of the sorbent and type of eluents. After the extraction, the samples were analysed by highperformance liquid chromatography, using a gradient elution. The most appropriate extraction environment was aqueous environment. Extraction recoveries obtained with the prepared sorbent were compared to those obtained with silica gel. The highest recoveries were obtained by extraction of diazepam when using a mixture of both sorbents. Keywords: solid phase extraction, graphene, zirkonium oxide

6 Seznam zkratek ACN ATE CAR DIA GO acetonitril atenolol karvedilol diazepam grafen-oxid Gr-ZrAX anex na bázi oxidu zirkoničitého modifikovaný grafenem HPLC LID vysokoúčinná kapalinová chromatografie lidokain MeOH methanol MES phpzc rgo SAX SCX SPE TAM THF TRIS WAX WCX kyselina 2-(N-morfolino)ethansulfonová hodnota ph, při které je náboj nulový redukovaný grafen-oxid silný anex silný katex extrakce na pevné fázi tamsulosin tetrahydrofuran tris(hydroxymethyl)aminomethan slabý anex slabý katex

7 Obsah 1 Úvod Teoretická část Extrakce na pevné fázi - SPE Charakteristika Provedení SPE Způsoby extrakce a sorbenty používané v SPE Grafen Vlastnosti Syntéza grafenu Exfoliace grafenu Epitaxiální růst Syntéza grafenu s využitím grafen-oxidu Mechanismus adsorpce a ovlivňující parametry Adsorpce organických látek Adsorpce kovových iontů Adsorpce plynů Použití grafenu v SPE Cíl práce Experimentální část Přístrojové vybavení Vybavení pro SPE Vybavení pro analýzu HPLC Ostatní laboratorní zar ízení Chemikálie a materiál Příprava zásobních roztoků... 39

8 4.4 Příprava sorbentu Provedení SPE metody Podmínky HPLC Výsledky a diskuze Porovnání stejných SPE kolonek Vliv ph a opakovatelnost přípravy grafenu Sorbent Gr3-ZrAX Sorbent Gr5-ZrAX Délka sonifikace grafenu Opakovaná použitelnost kolon Porovnání Gr-ZrAX a silikagelu Závěr Seznam obrázků Seznam tabulek Seznam schémat... 58

9 1 Úvod Úprava vzorku před jeho analýzou je jedním z nejdůležitějších a časově nejnáročnějších kroků celého analytického stanovení. Je proto nutné mu věnovat patřičnou pozornost. Metody pro úpravu vzorku umožňují zbavit vzorek balastů ovlivňujících následnou analytickou metodou, případně i vyměnit rozpouštědlo, v kterém se vzorek nachází. Extrakce na pevné fázi (SPE) je jednou ze základních metod pro úpravu vzorku. Tato metoda zaručuje jak kompatibilitu vzorku s následnou analytickou metodou, tak umožňuje zakoncentrování vzorku, čímž se zvyšuje citlivost stanovení. SPE je vysoce selektivní a účinnou metodou, což přispívá k jejímu širokému využití. Grafen je alotropickou modifikací uhlíku. Je podobný grafitu, ale je tvořen jednoatomárním plátem. Má specifické vlastnosti mezi něž patří např. chemická odolnost, tepelná vodivost a především velký povrch. Všechny tyto vlastnosti z něj dělají jedinečnou látku využitelnou v mnoha oblastech, mezi něž patří i analytická chemie. V teoretické části této práce je nejprve popsána metoda SPE a následně charakterizován grafen. Je popsána příprava grafenu, jeho adsorpční vlastnosti a mechanismus adsorpce látek. V experimentální části jsou zkoumány adsorpční schopnosti zirkoniového sorbentu modifikovaného grafenem a eluční schopnosti vybraných rozpouštědel. Vzorky byly po extrakci analyzovány pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). 9

10 2 Teoretická část 2.1 Extrakce na pevné fázi - SPE Charakteristika Extrakce na pevné fázi je jednou z několika metod, kterou lze použít pro úpravu vzorku před chromatografickou analýzou. Uvádí se, že příprava vzorku je dokonce časově náročnější než samotná analýza, což vypovídá o její důležitosti [1, 2]. Upravit vzorek před analýzou je nezbytné k minimalizování matricových interferencí, snížení detekčních limitů nebo ke stabilizaci analytu. Zkrátka před vlastní analýzou je nutno upravit vzorek do takového stavu, aby byl kompatibilní s použitou analytickou metodou a analyt mohl být stanoven v příslušné koncentraci. Princip SPE je stejný jako kterékoliv jiné extrakce. Jedná se o separační proces, během něhož se analyt rozděluje mezi dvě nemísitelné fáze. V tomto případě se analyt dostává z rozpouštědla na pevnou fázi (adsorbent). Jsou 3 základní cíle extrakce: čištění vzorku: oddělení analytu od ostatních složek nebo oddělení rušících látek od analytu, výměna rozpouštědla, ve kterém se analyt nachází: v případech, kdy je rozpouštědlo nekompatibilní s následnou analytickou metodou, zakoncentrování vzorku: tím se zvyšuje citlivost stanovení [2, 3, 4, 5]. Při SPE se nanáší objemově velké množství vzorku na kolonku obsahující adsorbent, na který se analyzovaná látka naváže. Pak se analyzovaná látka eluuje objemově menším množstvím rozpouštědla, ve kterém se látka analyzuje. Tímto se získá malé množství vzorku, ale o vysoké koncentraci a vyšší čistotě. Tím se snižuje spotřeba organických rozpouštědel a zjednodušuje následná analýza [6]. Zároveň se jedná o metodu časově nenáročnou. Dnes jsou totiž standardně vyráběné aparatury, pomocí nichž lze provést extrakci na několika kolonkách současně. Komerčně dostupná je i aparatura v 96 jamkovém formátu. V roce 2010 Altun et al. na této aparatuře upravili 96 vzorků během 2 4 min. Metoda je to velmi 10

11 selektivní, protože existuje mnoho různých sorbentů. Nejrozšířenější jsou různé modifikace silikagelu. SPE lze i automatizovat nebo online propojit s HPLC. Práce se vzorky je tedy jednodušší, rychlejší a také levnější. Adsorbované látky na sorbent je možné i snadno transportovat [1, 3, 5, 7] Provedení SPE SPE se provádí na sorbentu, který má zachytit analyzovanou látku nebo balasty. Sorbent je umístěn v kolonce (z polypropylenu nebo skla) mezi fritami (např. z polyethylenu, teflonu), nebo slisován se skleněnými vlákny do disků. Průchod kapalného vzorku skrz kolonku, respektive sorbent je nutné mírně stimulovat, aby extrakce správně proběhla a netrvala příliš dlouho. Tato stimulace je umožněna přetlakem (např. působením pístu), nebo podtlakem. Podtlak může být vytvořen např. pomocí vodní vývěvy. Podtlak i přetlak by měl být kontrolovatelný. Když je vyvíjený tlak na kolonku příliš vysoký nebo nízký, mohlo by dojít k porušení sorbentu, nebo nežádoucímu vyschnutí během kondicionace. Proto by měl být součástí aparatury i tlakoměr. Poměrně běžná je aparatura na Obrázku 1. U jednotlivých kolonek lze zvlášť otvírat a zavírat napojení na podtlakovou komoru, dle potřeby. Lze tak korigovat průtokovou rychlost. Pod kolonkami v aparatuře jsou umístěné zkumavky, které jímají buď původní rozpouštědlo bez analytu, původní rozpouštědlo s analytem, ale bez balastů, anebo už zakoncentrovaný vzorek (po jeho eluci) [8]. Obrázek 1 Aparatura pro SPE převzato z [8] 11

12 Kolonky obsahující sorbent jsou často vyráběné komerčně a jsou dostupné v různých velikostech (obvykle 1 6 ml) a s různým množstvím sorbentu. Existuje mnoho typů sorbentů. Použití typu sorbentu, jeho množství a velikost kolonky se odvíjí od typu analytu a jeho objemu. Přehled je uveden v Tabulce 1. Tabulka 1 Výběr kolonky na základě množství vzorku- převzato a upraveno z [8, 9] Hmotnost sorbentu Objem kolonky Minimální eluční objem Kapacita sorbentu Objem vzorku Komerčně dostupné kolonky jsou většinou na jedno použití. Sorbent je možné vyrobit i v laboratoři. Umisťuje se pak do kolonky mezi dvě porózní frity. Sorbent vyrobený komerčně má ale většinou standardizovanější vlastnosti, což může zvýšit validitu metody. Je totiž zaručena její reprodukovatelnost. Při výběru kolonky je nutné brát v potaz tzv. průnikový objem sorbentu. V ideálním případě totiž sorbent zadrží veškerý analyt, nebo balasty (podle toho, co je cílem metody) a rozpouštědlo už vychází z kolonky bez analytu, respektive balastů. Když je ale na sorbent nanesen příliš velký objem vzorku, může dojít k tomu, že sorbent neadsorbuje všechen analyt. Proto se nikdy průnikový objem kolonky nesmí překročit. Průnikový objem závisí na koncentraci analytu ve vzorku, nebo na iontové kapacitě sorbentu. Hmotnost analytu by u normální a reverzní fáze neměla překročit 5 % hmotnosti sorbentu, tím nedojde k překročení průnikového objemu [4, 5, 7, 8, 10]. Jak bylo zmíněno, existuje několik strategií SPE. Vlastní průběh SPE závisí na strategii metody. SPE se skládá ze čtyř základních kroků, přičemž ještě před nimi je nutné vybrat správnou kolonku, respektive sorbent. Jednotlivé kroky jsou znázorněny na Obrázku 2: mg 1 ml µl 2,5-10 mg < 1 ml 500 mg 3 ml 1-3 ml mg 1 ml ml 0,5-1 g 6 ml 2-6 ml mg 1 ml ml 2 g 12 ml ml 0,1-0,2 g 5 g 20 ml ml 1,25-2,5 g 10 ml ml 10 g 60 ml ml 0,5-1 g 12

13 Obrázek 2 Průběh SPE převzato a upraveno z [11] Nejčastěji se provádí SPE s využitím tzv. reverzních fází. Jednotlivé kroky extrakce jsou shrnuty v následujícím textu: Kondicionace Prvním krokem SPE je tzv. kondicionace, při které dochází k solvataci sorbentu. Tím se sorbent smočí a aktivuje pro interakci se vzorkem. Umožní se tak lepší průnik vzorku do sorbentu. K aktivaci sorbentu se nejčastěji používá methanol, který může být následován jiným smáčejícím roztokem (nejčastěji vodou, nebo pufrem o vhodném ph), u kterého je třeba, aby byl dokonale mísitelný a kompatibilní se vzorkem. Aby měla kondicionace patřičný efekt, je třeba dbát na to, aby před nanesením vzorku na kolonku sorbent nevyschl. Nanesení vzorku Po aktivaci sorbentu je možné nanést na kolonku vzorek. Neměl by obsahovat viditelné nečistoty (je možné ho před nanesením přefiltrovat) a měl by být kompatibilní s rozpouštědlem použitým ke kondicionaci (např. ph, iontová síla), aby nedošlo např. k precipitaci solí ve vzorku a sorbent se neponičil. Rychlost průtoku vzorku kolonkou by měla odpovídat množství sorbentu. Obvyklá rychlost průtoku je 13

14 přibližně 1 2 kapky/s. Rychlost průtoku lze ovlivňovat korigováním tlaku (či podtlaku). Promytí pevné fáze Po nanesení vzorku následuje promytí pevné fáze. Během promytí dochází k odstranění látek, které by mohly interferovat s následnou analytickou metodou (např. HPLC). K promytí se používá jedno nebo více různých rozpouštědel, v nichž musí být balasty dostatečně rozpustné, aby se vymyly, ale zároveň nesmí dojít k vymytí analytu. Interakce mezi balasty a promývajícím rozpouštědlem musí být tedy silnější než mezi balasty a pevnou fází. Zároveň je třeba, aby interakce mezi analytem a pevnou fází byly silnější než mezi analytem a promývacím rozpouštědlem. Tyto interakce lze ovlivnit úpravou ph a polaritou rozpouštědla. Charakter promývacího rozpouštědla je dán, jak charakterem analyzované látky, tak charakterem sorbentu. U reverzní fáze se používá např. voda. Eluce analyzovaných látek A posledním - nejdůležitějším krokem metody SPE je eluce analyzované látky. Výběr rozpouštědla (pro eluci analytu) závisí na charakteru analytu a na následné analytické metodě, se kterou by měl být kompatibilní, pokud to lze. Pokud není, je nutno rozpouštědlo následně vyměnit, což prodlužuje úpravu vzorku. Před samotnou elucí analytu se sorbent vysuší. Ideální rozpouštědlo je takové, které selektivně vymyje analyzovanou látku bez dalších nečistot, které na sorbentu zůstaly během promývání pevné fáze. Je také žádoucí, aby objem rozpouštědla byl co nejmenší. K eluci je možné použít více různých elučních činidel. Jako eluční činidla se u normální a reverzní fáze používají např. methanol (MeOH), acetonitril (ACN) nebo tetrahydrofuran (THF) [2, 3, 5, 7, 8, 12, 13, 14] Způsoby extrakce a sorbenty používané v SPE Pro správné provedení SPE je vždy důležitý výběr vhodného sorbentu. Základními vlastnostmi, podílejícími se na adsorpčních schopnostech sorbentu, je jeho povrchová struktura (pórovitost, měrný povrch) a chemické složení. Funkční skupiny 14

15 na povrchu sorbentu rozhodují o afinitě sorbentu k různým analytům. Velikost a tvar částic souvisí s povrchem sorbentu, a tedy s vyšším počtem aktivních (adsorpčních) míst. Z toho vyplývá i vyšší účinnost extrakce. Chemická odolnost sorbentu ovlivňuje jeho možné opakované použití. Sorbent se vybírá podle charakteru analyzované látky. SPE lze provést na normální fázi, reverzní fázi s využitím iontoměniče a s využitím adsorbentu [4, 7, 8]. V následující části jsou všechny tyto způsoby extrakce detailněji popsány a k nim uvedeny příklady používaných sorbentů. SPE s využitím normálních fází Náplň kolonky je tvořena polárním sorbentem, který adsorbuje polární analyt z nepolárního rozpouštědla. Tato adsorpce je založena na interakcích mezi polárními funkčními skupinami analytu a sorbentu. Jedná se o vodíkovou vazbu, π-π interakce, interakce dipól-dipól nebo dipól-indukovaný dipól vazba. Zmíněné vazby jsou následně přerušeny elučním činidlem, které je polárnější než rozpouštědlo, v němž se analyt nacházel původně. Používá se například ACN nebo MeOH. Mezi nejpoužívanější sorbenty normální fáze patří silikagel a jeho modifikace polárními funkčními skupinami (-OH, -NH2, -CN a Diol). Různé typy a charakteristiky modifikací jsou uvedeny v Tabulce 2. Dalšími polárními sorbenty jsou oxid hlinitý a florisil [2, 4, 8, 9]. 15

16 Silikagel a jeho modifikace Tabulka 2 Silikagel a jeho modifikace pro normální fázi SPE- převzato a upraveno z [8, 9] Florisil Florisil je směs SiO2 (84 %), MgO2 (15,5 %) a Na2SO4 (0,5 %). Jedná se o vysoce selektivní sorbent s nižší polaritou než má silikagel. Používá se pro extrakci silně polárních látek. Je možné ho použít i jako dvojvrstvý sorbent, kdy se Florisil použije jako spodní vrstva a čistý Na2SO4 jako svrchní vrstva. Na2SO4 potom zachytává ze vzorku rezidua, která by mohla narušovat retenci žádaných analytů na samotném Florisilu [8, 9, 15]. 16

17 Oxid hlinitý Oxid hlinitý je jako sorbent pro SPE dostupný ve třech variantách lišících se svým ph: kyselé (cca 5), bazické (cca 8,5) a neutrální (cca 6,5), u kterého lze ph měnit pomocí rozpouštědla naneseného během kondicionace. U všech těchto sorbentů může dojít i k extrakci adsorpcí nebo k iontově výměnné adsorpci, v závislosti na analytu a prostředí. [8, 9] SPE s využitím reverzní fáze Extrakce s využitím reverzní fáze probíhá za účasti středně polárního až nepolárního sorbentu a nepolárního analytu (může se jednat o různé organické látky s alkylovými, aromatickými, alicyklickými funkčními skupinami). Analyt se váže na pevnou fázi z vodného rozpouštědla pomocí Van der Waalsových a disperzních sil. Pevná fáze je většinou tvořena silikagelem, na němž jsou vázány hydrofobní funkční skupiny, jako jsou dlouhé alkyly nebo aryly. SPE s využitím reverzní fáze je považována za způsob extrakce s nejnižší selektivitou v porovnání s normální a iontově-výměnnou fází. Touto metodou je obtížné rozdělit látky s podobnou strukturou. Na sorbentu dochází k retenci všech těchto podobných látek, což na druhou stranu může být někdy výhoda, když je potřeba extrahovat směs různých látek v rámci jednoho vzorku, např. při jeho čištění [2, 4, 8, 9]. Alkyly, které se váží na silikagel pro vytvoření reverzní fáze SPE, jsou: Oktyl (C8) Obrázek 3 Struktura oktylu na silikagelovém sorbentu [16] Oktyl (Obrázek 3) může být na silikagel vázán monomerně, nebo polymerně. Přičemž sorbent s polymerní vazbou obsahuje 2x tolik uhlíku než ten s monomerní a má za následek vyšší vazebnou kapacitu pro analyty. Zajišťuje také vyšší odolnost vůči extrémním ph prostředí a zároveň umožňuje vyšší extrakční výtěžnost [8, 9]. 17

18 Oktadecyl (C18) Obrázek 4 Struktura oktadecylu na silikagelovém sorbentu [16] Oktadecyl (Obrázek 4) se na silikagel může vázat také monomerně, nebo polymerně s tím, že pro polymerní vazbu platí totéž, co pro vázaný oktyl. Tento sorbent má vysokou afinitu k širokému množství sloučenin, což může mít za následek i ko-retenci interferenčních balastů. Jedná se o sorbent natolik odolný, že je možné na něj nanášet i velmi silná eluční činidla. Díky své odolnosti a extrakční výtěžnosti, je vhodné sorbenty s polymerní vazbou použít při extrakci vodných vzorků získaných v životním prostředí [8, 9]. Styren/Divinylbenzen Tento kopolymer se používá při extrakci hydrofobních látek, které obsahují i polární funkční skupiny. Jedná se hlavně o aromáty, např fenoly, které je někdy těžké zachytit na C18 sorbentech, díky jejich rozpustnosti ve vodě. Jedná se o homogenní velmi stabilní sorbent, který je odolný vůči extrémním ph podmínkám [8, 9]. SPE s využitím iontové výměny Iontově výměnná extrakce se využívá při analýze látek, které mají v roztoku náboj. Lze extrahovat látky nabité jak kladně (kationtově výměnná SPE), tak záporně (aniontově výměnná SPE). Adsorpce nabitých částic je umožněna pomocí elektrostatických interakcí mezi opačně nabitými funkčními skupinami analytu a funkčními skupinami (často vázanými na silikagel) pevné fáze. Aby byly analyt i pevná fáze ve formě iontu, je nutné, aby se nacházely v prostředí takového ph, ve kterém dochází k jejich disociaci. Což znamená, že hodnota ph rozpouštědla bazického analytu by měla být minimálně o 2 jednotky nižší, než je pka analytu. U kyselých analytů by měla být tato hodnota o 2 jednotky vyšší. V případě elučního činidla musí být ph nastaveno tak, aby nedošlo k neutralizaci náboje a byla přerušena 18

19 elektrostatická interakce mezi analytem a sorbentem. Iontoměničové sorbenty se podle náboje dělí na katexy a anexy. Rozlišuje se u nich i jejich síla. Silné katexy a anexy jsou ionizovány vždy. Slabé iontoměniče jsou ionizovány v závislosti na ph prostředí. Při použití iontově výměnné extrakce je třeba vědět, jaký je (acidobazický) charakter analytu a na základě toho se vybírá pevná a eluční fáze, případně i rozpouštědlo, ve kterém se analyt nachází. Na Schématu 1 jsou uvedeny potřebné hodnoty ph pro ionizaci analytu a pevné fáze. Zároveň je na něm vidět, jak musí být nastaveno ph prostředí pro zachycení, respektive eluci analytu [2, 4, 8, 9]. Typ analytu Slabá KYSELINA pka např. 5 Silná KYSELINA Slabá BAZE pka např. 10 Silná BAZE Náboj částice vs. ph prostředí Bez náboje při ph<3 - anion při ph > 7 - anion nabitý vždy + kation při ph < 8 Bez náboje při ph > 12 + kanion nabitý vždy Částice pevné fáze Silný anex Slabý anex pka např. 10 Silný katex Slabý katex pka např. 5 Náboj částice vs. ph prostředí + nabitý vždy + při ph < 8 Bez náboje při ph > 12 - nabitý vždy Bez náboje při ph<3 - při ph > 7 Rozpětí ph mobilní fáze pro retenci analytu pro eluci analytu ph > 7 ph < 8 ph < 8 ph > 7 ph < 3 ph > 12 ph > 12 ph < 3 Schéma 1 Výběr pevné a mobilní fáze při iontově výměnné extrakci převzato a upraveno z [17] 19

20 Jako iontoměniče se využívají: A) Aninontově výměnná SPE SAX (silný anex) Obrázek 5 Struktura silného anexu [16] Silný anexový sorbent je tvořen alifatickou kvarterní aminovou skupinou navázanou na silikagel (Obrázek 5). Kvarterní amin je silnou bazí a vyskytuje se ve formě protonu, který přitahuje záporně nabité částice z analyzovaného vzorku. Hodnota pka kvarterního aminu je velmi vysoká (> 14), což zaručuje kladný náboj v širokém rozmezí ph hodnot (ve kterých se mohou nacházet analyzované vzorky) [2, 8, 9]. WAX (slabý anex) Obrázek 6 Strukura slabého anexu [16] Jako slabý anex se může chovat polymerně vázaný aminopropyl na silikagelu (Obrázek 6), který je používán i jako normální fáze. Jeho použití je vhodné při extrakci silných aniontů, které SAX váží příliš silně a není pak snadné je eluovat [2, 8, 9]. B) Kationtově výměnná SPE SCX (silný katex) Obrázek 7 Struktura silného katexu [16] 20

21 Slabý katex je tvořen silikagelem modifikovaným polymerně vázanou benzensulfonovou kyselinou (Obrázek 7), která je velmi kyselá (pka<1), což zaručuje záporný náboj v širokém rozmezí ph. Na SCX dochází k retenci silných i slabých bazí. Slabé baze je možné eluovat činidlem o ph o 2 jednotky vyšším, než je pka analytu (analyt se zneutralizuje). Pokud je třeba eluovat silnou bazi ze sorbentu, je vhodnější použít slabý katex, kdy dojde ke slabší interakci a eluce bude jednodušší [2, 8, 9]. WCX (slabý katex) Obrázek 8 Struktura slabého katexu [16] Jako slabý katex se používá polymerně vázaná karboxypropylová skupina na silikagelu (Obrázek 8), jejíž pka je přibližně 4,8. Sorbenty na bázi oxidů kovů Oxidy kovů patří mezi polární anorganické sorbenty a mají velkou chemickou stabilitu. Příkladem těchto sorbentů jsou: oxid hlinitý, oxid zirkoničitý či oxid titaničitý, z čehož se nejvíce používá oxid zirkoničitý. ZrO2 je slabě kyselý oxid. Jedná se hlavně o Lewisovu kyselinu a částečně o Brönstedovu kyselinu. Adsorbuje tedy hlavně pomocí Lewisových interakcí, je i amfoterní měnič. Jedná se o chemicky, mechanicky a tepelně velmi odolný materiál. Částice ZrO2 jsou stabilní v celém ph rozmezí a vydrží i teplotu 200 C. ZrO2 je možné modifikovat a to zejména polymery [18, 19]. 2.2 Grafen Vývoj nových sorbentů pro SPE se orientuje především na materiály disponující vysokou selektivitou, výbornou adsorpční schopností, vystupňovanou tepelnou, chemickou a mechanickou stabilitou a samozřejmě také dostatečnou životností [20]. Při vývoji nových sorbentů se v hledáčku vědců čím dál častěji objevují nejrůznější alotropické modifikace uhlíku v podobě nanomateriálů. Pozornost si zaslouží 21

22 grafitová nanovlákna, nanodiamanty, fullereny, uhlíkové nanotrubičky a především grafen [3]. Grafen má všechny atributy pro to, aby se stal široce využívaným sorbentem pro SPE. Grafen byl poprvé izolován a pojmenován v roce 2004 Konstantinem Novoselovem a André Geimem, kteří za jeho objev dokonce získali v roce 2010 Nobelovu cenu. Grafen je, jak již bylo zmíněno, alotropická modifikace uhlíku podobná grafitu. Jedná se o dvojrozměrný materiál a stejně jako grafit, je tvořen hexagonální strukturou, kdy je uhlík poskládán do sítě aromatických šestičlenných kruhů. Na rozdíl od grafitu je tvořen jen jednou vrstvou atomů. Uhlík je vázán k ostatním třemi vazbami v sp 2 hybridizaci a poslední valenční elektron je vodivostní. Grafen tedy dobře vede elektrický proud, a právě tyto elektrické a fyzikální vlastnosti zkoumali Novoselov s Geimem. Už v době přebírání Nobelovy ceny bylo však jasné, že grafen má velký potenciál a jeho využití bude daleko širší, než Novoselov a Geim očekávali. Díky jeho specifickým elektrickým, elektrochemickým, optickým a mechanickým vlastnostem vyčnívá nad ostatní materiály a jeho možné využití zahrnuje například solární panely, senzory, tranzistory, zásobníky energie a podobně [21, 22]. Velkému využití dochází také v analytické chemii, což je právě předmětem této práce. V analytické chemii nachází uplatnění hlavně díky svým adsorpčním vlastnostem Vlastnosti Grafen patří do stejné rodiny jako uhlíkové nanotrubičky a fullereny (Obrázek 9). Sdílí s nimi tedy podobné vlastnosti, díky kterým se těší vzrůstající pozornosti. Mezi tyto vlastnosti patří například chemická odolnost, tepelná vodivost, stabilita, odolnost vůči korozi a především obrovský povrch, který zaručuje vysokou adsorpční kapacitu [21, 23]. 22

23 Obrázek 9 Příklady uhlíkatých nanomateriálů - převzato a upraveno z [24] Přestože všechny uhlíkové nanomateriály mají stejnou chemickou strukturu, lze mezi nimi pozorovat určité odlišnosti. Grafen na sebe upíná pozornost hlavně z následujících důvodů: grafen má daleko větší povrch než ostatní uhlíkové materiály. Jeho teoretická hodnota je 2630 m 2 /g. Díky tomu má grafen vyšší adsorpční kapacitu. Takto velký povrch je způsoben jeho jedinečnou strukturou: jednoatomární vrstva. Plát je přístupný pro adsorbující se molekuly z obou stran, na rozdíl od uhlíkových nanotrubiček a fullerenů, kdy vnitřní strany materiálu adsorpční funkci neplní kvůli sterickému bránění. Mimoto struktura grafenu vede k rychlejší adsorpční rovnováze [23], další výhodou grafenu je, že je možné ho syntetizovat jednoduchými chemickými metodami a to přímo z jeho levné suroviny- grafitu. Není nutné k jeho výrobě používat speciální zařízení. Jinými slovy grafen lze získat snadno ve většině chemických laboratoří. To zvyšuje jeho šance na široké využití a umožňuje to jeho produkci ve velkém množství, přitom za nízkou cenu [23], 23

24 oproti uhlíkovým nanotrubičkám se jedná o daleko čistší materiál. Pro získání uhlíkových nanotrubiček je totiž nutné použít kovové katalyzátory. Tyto kovové nečistoty je pak prakticky nemožné odstranit a bohužel se mohou negativně projevit během používání trubiček. Zatímco grafen je možné syntetizovat přímo z grafitu, a to bez použití jakýchkoliv kovových katalyzátorů. Čistotu grafenu tedy nejvíce ovlivňuje čistota a kvalita použité suroviny- grafitu [23, 25], další nespornou výhodou je jeho silná afinita k strukturám obsahujícím benzenový kruh. Tyto struktury jsou velmi často součástí léčiv, biomolekul a polutantů. Tuto afinitu má na svědomí delokalizovaný π- elektronový systém [23], zvýšené adsorpční selektivity lze u grafenu docílit jeho obměnou pomocí různých funkčních skupin. Funkční skupiny lze vázat na grafenový derivát grafen-oxid (GO). Tyto skupiny umožňují adsorpci organických látek s funkčními skupinami kyslíku a dusíku, a to pomocí vodíkových vazeb a elektrostatických interakcí [21, 26], na grafenu můžeme také ocenit jeho relativní jemnost a ohebnost. Může být tedy, v porovnání s fullereny a uhlíkovými nanotrubičkami, snadněji připoután na nosič. Což je velmi užitečné v přípravě kompozitních adsorbentů [23]. 2.3 Syntéza grafenu Jak již bylo zmíněno, grafen je velmi slibným materiálem s možností širokého využití. Problémem zůstává jeho příprava. Je poměrně hodně možností, jak grafen připravit, ale aby mohl být následně široce využíván, je nutné, aby byl připravený grafen dostatečně kvalitní a měl standardní vlastnosti. Tím je myšleno, aby defekty, které mohou během jeho přípravy vzniknout, neovlivňovaly ty vlastnosti, které jsou pro praktickou využitelnost grafenu klíčové (např. adsorpční kapacita, která je klíčová v analytické chemii). Způsob přípravy grafenu hraje tedy velmi důležitou roli v jeho následném uplatnění [27]. 24

25 Grafen je možné vyrobit několika základními metodami. Jedním z nejstarších způsobů, jak připravit grafen, je jeho příprava z grafitu, do něhož je vmezeřená určitá sloučenina. Při zvýšené teplotě se pak docílí rychlého vypaření vmezeřené látky a grafen se zjednodušeně řečeno roztrhá na malé kousky. Tento roztrhaný materiál se pak dále upravuje (například sonifikací) a získávají se z něj malé destičky grafenu. Příkladem této metody je rychlé vypaření kyseliny sírové vmezeřené do grafitu. Přestože je tato metoda velmi jednoduchá, použitelná ve velkém měřítku a využívající komerčně dostupnou kyselinu sírovou, bohužel během ní nedochází k úplné exfoliaci grafitu na jednotlivé jednoatomární pláty. Destičky jsou velmi nejednotné a jsou obvykle i 100 atomů široké. Navíc u této metody výsledek velmi závisí na typu použitého grafitu a způsobu interkalace vypařované látky. Během této metody může také dojít k uvolnění nezanedbatelného množství plynu, což může ohrozit použití této metody ve velkém měřítku [28]. Proto se tedy výzkumy týkající se přípravy grafenu zaměřují spíše jinými směry. Existují tři základní principy přípravy grafenu: prvním z těchto principů je takzvaná exfoliace ze surového grafitu. To znamená odloupnutí jedné vrstvy (tedy grafenu) z grafitu. Toto odloupnutí lze vykonat např. mechanicky (mikromechanická exfoliace), chemicky (exfoliace v roztocích) nebo elektrochemicky, druhou cestou, jak připravit grafen je tzv. epitaxální růst vrstev. Podstatou této metody je získání grafenu z různých uhlíkatých materiálů za vysoké teploty (to lze buď vyžíháním grafenu z uhlíkaté sloučeniny nebo růstem grafenové vrstvy na určitém povrchu), poslední cesta přípravy grafenu spočívá v exfoliaci oxidací (připraví se GO) a následné redukci. Vzniká redukovaný GO (rgo) [27, 29, 30]. V následující části této práce jsou ukázky a příklady zmíněných principů, nebo jejich variant. Metod, jak připravit grafen, je velmi mnoho. Nelze tedy následující výčet brát jako úplný. 25

26 2.3.1 Exfoliace grafenu První základní metodou přípravy grafenu je mikromechanická exfoliace, kterou představili právě nositelé Nobelovy ceny Novoselov a Geim. Jedná se o velmi jednoduchou metodu. Tato metoda spočívá v postupném naškrábání surového grafitu na tenké pláty a následném odlupování tenoučkých vrstev pomocí lepící pásky [22, 31]. Tento přístup je poměrně spolehlivý a umožňuje vytvořit grafenové pláty o tloušťce až 10 m [22]. Jsou to velmi tenké pláty, které mohou být několik málo atomů široké, ale lze tak připravit i jednoatomární plát. Na těchto plátech lze studovat fyzikální a elektrické vlastnosti [31]. Tato metoda umožňuje především připravit grafen vysoké kvality, přičemž grafenové pláty mají dost velkou plochu [32]. Díky této metodě ale nelze připravit homogenně široké pláty a zatím ji ani není možné aplikovat ve velkém měřítku. Metoda je velmi pracná a časově náročná. Použitelná je spíše ve výzkumných laboratořích, proto je snaha nalézt metody jiné a jednodušší [31, 32]. Grafen lze mechanicky exfoliovat pomocí velmi ostrého klínu. Jayasena et al. představili metodu mechanické exfoliace grafenu za pomoci velmi ostrého diamantového krystalu, jako klínu. Diamant je připevněn na ultrazvukový systém schopný oscilace o 10 khz a naproti němu je připevněn kousek grafitu. Diamant je ve stabilní pozici a grafit je posouván naproti němu za určité rychlosti. Oscilace o vysoké frekvenci umožňují hladké klouzání diamantu po grafitu, což vede ke kvalitnějším vrstvám grafenu. Odloupnuté vrstvy grafenu padají do vodní lázně, kde jsou shromažďovány [33]. Mezi mechanické exfoliace grafenu patří také takzvaná metoda kulového mlýna. Aparatura této metody se skládá z válce, v němž jsou uloženy koule a rozmělňovaný materiál. Válec se točí a pohybující se koule rozmělňují materiál, v tomto případě grafit. Při fragmentaci grafitu se uplatňují dva druhy účinku způsobující exfoliaci grafenu. První z nich vzniká otáčením válce a způsobuje podélné lámání grafitu, vznikají tak grafenové pláty. A druhý z nich vzniká díky pohybu koulí a láme grafit příčně ke grafitovým vrstvám. Zmenšuje tedy grafenové pláty. Pro získání vysoce kvalitního grafenu o velké ploše je důležité druhé působení na fragmentaci, co nejvíce 26

27 potlačit. Tato metoda byla různě upravována a je možné ji provést za sucha i za mokra. Za mokra je vhodné do válce přidat různá exfoliační činidla, která exfoliaci usnadní. Nebo je možné na metodu kulového mlýna navázat sonifikací [32]. Další metodou exfoliace grafenu je exfoliace v roztocích. Jedná se o chemickou exfoliaci. Tato metoda je založena na odtržení jedné nebo více vrstev grafenu z grafitu v rozpouštědle [29]. Je nutné docílit toho, aby přitažlivé van der Waalsovy síly mezi jednotlivými vrstvami grafitu byly slabší než interakce mezi grafenem a rozpouštědlem [34]. Proto je velmi důležitý výběr rozpouštědla nebo exfoliačního činidla. Jestliže je mezipovrchové napětí mezi rozpouštědlem a grafenem vysoké, vločky grafenu mají tendenci k sobě adherovat. Je třeba toto mezipovrchové napětí minimalizovat. To nám umožní buď dobře vybrané rozpouštědlo nebo pomocná látka v něm [35]. Jako exfoliační rozpouštědla nebo činidla jsou vhodná různá aromatická i nearomatická rozpouštědla (např. N,N-dimethylformamid, N,N-dimethylacetamid a o-dichlorbenzen), která jsou schopná koordinační vazby, kdy rozpouštědlo může fungovat jako donor, ale i jako akceptor elektronového páru ve vazbě mezi grafenem a rozpouštědlem. Exfoliovaný grafen dispergovaný v organickém rozpouštědle může mít jak negativní, tak pozitivní náboj. Je to způsobeno přenosem elektronů mezi grafitovými pláty a rozpouštědlem. To, jakým směrem dochází k přenosu elektronů, závisí na použitém rozpouštědle. Přenos elektronů je zodpovědný za účinnou exfoliaci grafenu v organických rozpouštědlech. Odpudivé elektrostatické síly mezi jednotlivými nabitými pláty grafitu zabraňují reagregaci exfoliovaných plátů a stabilizují je. Naproti tomu surfaktanty a polymery (které lze také použít jako exfoliační činidla) zabraňují reagregaci grafenových plátů pomocí sterického působení a elektrostatickými silami mezi zmíněnými činidly a grafenem. Jako surfaktanty se používají pyreny a jejich deriváty. Exfoliační činidla typu polymerů jsou např. polystyren, polybutadien, polyvinylchlorid [35, 36]. Mezi novější metody exfoliace patří také takzvaná elektromechanická exfoliace. Tato exfoliace probíhá ve směsi kapalin, z nichž jedna má nízký elektrochemický potenciál (například voda) a druhá vysoký (je to kapalina obsahující ionty za pokojové teploty). V této metodě jsou grafitové vločky nebo tyčky použity jako anoda. Dojde 27

28 k elektrolýze vody, kdy na elektrodě vzniknou hydroxylové a kyslíkaté radikály. Kyslíkaté radikály začnou rozkládat grafitovou anodu po okrajích, čímž se rozevřou okraje plátů. Anionty ve směsi se mezi pláty vmezeří a zahájí rozpad elektrody. Vznikne tak roztok obsahující grafenové pláty. Nevýhodou této metody je, že je velmi obtížné kontrolovat jednotnost a homogenitu grafenových struktur ve velkém objemu [30] Epitaxiální růst Epitaxální růst vrstev je metoda s odlišným principem, než má exfoliace. Zde se nejedná o oddělení plátu z grafitu, ale přímo o vytvoření nové vrstvy, a to pomocí alternativních zdrojů uhlíku (ne pomocí grafitu). Tato metoda může mít dva přístupy. Je to vlastní epitaxální růst, nebo takzvaná chemická depozice z plynné fáze [37]. Podstatou vlastního epitaxálního růstu vrstev je izolace grafenu ze sloučeniny uhlíku, čemuž většinou předchází syntéza zmíněné sloučeniny [37]. Příkladem této metody je vytvoření krystalu karbidu křemíku, po němž následuje izolace grafenu z krystalu, a to odloučením křemíku ze sloučeniny. Uhlík se v takovém krystalu nachází v potřebné konfiguraci a při sublimaci křemíku ze sloučeniny uhlík zůstává na svém místě. Zbavit se křemíku z povrchu sloučeniny je možné vysokou teplotou (nad 1300 C), které je docíleno za vysokého tlaku, nebo naopak za silného podtlaku. Doba ohřívání musí být přiměřená. Je třeba se zbavit veškerého křemíku, ale zároveň se nesmí poškodit potřebná struktura grafenu. Často lze křemík vysublimovat pouze z povrchu krystalu. Grafen se tedy vytvoří pouze na povrchu krystalu [31, 37]. Chemická depozice z plynné fáze probíhá odlišně. Zahrnuje tepelný rozklad uhlovodíku a následnou depozici atomů uhlíku na určitý povrch. Jako povrch, na kterém grafen roste, se nejčastěji používají kovové pláty, například měděný nebo niklový. Tato metoda, na rozdíl od klasického epitaxálního růstu, probíhá za atmosferického tlaku a nižší teploty (pod 1000 C) [37]. Je použitelná pouze v případě, když chceme grafen z kovového podkladu přenést na jiný podklad. Vytvoření grafenového plátu během této metody je docíleno v zásadě jednoduchou expozicí vhodné kovové folie atomům uhlíku. Lze tak vytvořit grafen o téměř nekonečné délce 28

29 i šířce. Tato metoda vypadá velmi jednoduše. Byla zrealizována za použití plátů různých druhů kovů, ale provází ji řada problémů. Například při použití niklu, dochází ke srážení uhlíkových atomů a vytváří se tak nerovnoměrná vrstva grafenu. Výsledkem je plát grafenu o tloušťce pohybující se od jednoho atomu až do několika desítek atomů [31]. Pořád je to ale metoda, pomocí níž lze připravit grafen velmi tenký, o velké ploše a pouze s malými defekty, což je výhodné především při použití v elektronice (např. dotykové obrazovky). Bohužel i grafen připravený touto metodou může být mírně pokřivený, a proto tato oblast přípravy grafenu stále vyžaduje další výzkum [37] Syntéza grafenu s využitím grafen-oxidu Po mnoha, často neúspěšných, pokusech vytvořit jednovrstevný grafen se jako nejschůdnější metoda, kterou lze navíc provést poměrně levně a ve velkém měřítku, ukázala jeho syntéza přes GO. Základní strategií této metody je vytvoření jednotlivých plátů GO a poté jejich redukce. Nejprve se oxiduje grafit, který se díky přítomnosti kyslíkatých funkčních skupin stane hydrofilnější a molekuly vody se mohou interkalovat mezi vrstvy grafitu. Po prudkém zahřátí se molekuly vody začnou vypařovat a rozbije se tak grafitový kus na jednotlivé pláty GO. Nebo lze k exfoliaci oxidovaného grafitu na pláty GO použít sonifikaci [28]. GO jsou oxidované pláty grafenu, jehož základní planární struktura je hustě pokryta funkčními skupinami, jako jsou epoxid, hydroxyl, karbonyl nebo karboxyl. Ukázka této struktury je vidět na Obrázku 10. Obrázek 10 Struktura GO - převzato z [32] 29

30 Funkční skupiny se nacházejí především na okrajích grafenových plátů [28][38]. Struktura GO, na rozdíl od čistého grafenu, není tvořena pouze vazbami v sp 2 hybridizaci, ale díky kyslíkatým funkčním skupinám jsou zde i vazby v hybridizaci sp 3, které jsou rozmístěny buď nad nebo pod rovinou grafenového plátu. Planární struktura je poměrně deformovaná. Mkhoyan et al. tuto strukturu zkoumali a došli k zajímavým závěrům. Podle nich, i přesto, že se ve struktuře nachází značné množství funkčních skupin a struktura tedy není dokonale planární, celkově se dá říci, že struktura GO je velmi podobná grafenu. Základní síť šestičlenných kruhů totiž zůstává zachována, i když se ne vždy jedná o kruhy aromatické. Lze tedy říci, že GO jsou pláty grafenu obsahující náhodně rozmístěné oxidované části (s kyslíkatými funkčními skupinami), které se střídají s částmi neoxidovanými, kde si většina uhlíkových atomů zachovává sp 2 hybridizaci [38]. GO nevede elektrický proud (především díky přítomnosti epoxidových a hydroxidových funkčních skupin) a je tepelně nestabilní. Kyslíkaté funkční skupiny je tedy třeba zredukovat [28]. GO je možné vytvořit oxidativním působením na grafit, a to pomocí tří různých metod (nebo jejich variant), které vyvinuli 3 různí vědci: Brodie, Hummers a Staudenmaier [28]. Výsledkem těchto metod jsou různé stupně oxidace. Brodie a Staudenmaier použili kombinaci chloridu draselného a kyseliny dusičné pro oxidaci grafitu. Zatímco metoda dle Hummerse spočívá v působení manganistanu draselného a kyseliny sírové. Zredukovat GO lze tepelně (např. v mikrovlnné troubě), chemicky nebo elektrochemicky. Chemická cesta je nejběžnější [31]. Lze ji provést za pokojové teploty. Náročnost na vybavení a energie je nižší a tím i levnější (v porovnání s tepelnou redukcí) [38]. Jako redukční činidla se nejčastěji používá hydrazin, ale použit lze i NaBH4, HI, kyselinu askorbovou, prášek železa nebo cukry, jako je glukóza či fruktóza. Problémem redukce GO je ovšem to, že ve vodném prostředí se rgo stane méně hydrofilní a grafenové pláty se začnou rychle shlukovat, což může vyústit v jejich precipitaci. Tento problém lze vyřešit tím, že se zmíněná redukce provede v nevodném prostředí např. nevodným hydrazinem, nebo lze použít solvatační činidlo [30][38]. 30

31 Tato metoda syntézy grafenu je sice poměrně levná, jednoduchá a použitelná při masové výrobě, ale vytvořený grafen touto metodou vykazuje nižší kvalitu než grafen získaný např. epitaxálním růstem. Grafen připravený přes GO může obsahovat zbytkové funkční skupiny a jiné strukturní defekty, které mohly vzniknout při oxidaci i redukci grafitu, respektive grafenu. Kompletní redukce GO je obtížné dosáhnout (obzvláště, obsahuje-li GO velké množství funkčních skupin), zatímco částečná redukce je snadná a je známo poměrně dost metod, pomocí nichž lze redukci uskutečnit. Vzhledem ke zmíněným nedostatkům této metody lze grafen připravit přes redukci GO pouze v případech, kdy pro využití připraveného grafenu není potřeba vysoce čistý materiál (např. v elektronice). V těchto případech se spíše využívají metody: epitaxální růst a chemická depozice z plynné fáze. Nespornou výhodou této metody je možnost přípravy modifikovaného grafenu. Funkční skupiny na GO mohou vázat jiné molekuly nebo funkční skupiny a lze tak vytvořit modifikovaný grafen se specifickými vlastnostmi [30][38]. 2.4 Mechanismus adsorpce a ovlivňující parametry Adsorpčních vlastností grafenu se může využít, když je potřeba adsorbovat kovy, organické látky nebo plyny. Na toto téma bylo v posledních letech vypracováno několik studií [39] Adsorpce organických látek V poslední době je snaha grafenové materiály využít pro adsorpci různých organických nečistot. K adsorpci na grafen dochází díky nekovalentním interakcím, mezi které patří Van der Waalsovy síly, elektrostatické interakce, vodíkové vazby, π-π interakce, hydrofobní interakce a donorové vazby. Díky delokalizovanému π elektronovému systému je grafen schopen adsorbovat aromatické kruhy organických sloučenin, a to pomocí silných π-π interakcí. Na π elektrony grafenu se mohou vázat také kationty. Během takové interakce dochází k polarizaci vyvolané kationtem a vzniku elektrostatické síly mezi kationtem a aromatickou strukturou grafenu bohatou na π elektrony (viz adsorpce kovů). 31

32 Oproti tomu GO má v porovnání s grafenem nižší hustotu π elektronů, ale je bohatý na kyslíkaté funkční skupiny. A právě ty hrají při adsorpci také klíčovou roli. Umožňují vodíkové a elektrostatické interakce s organickými sloučeninami obsahujícími kyslíkaté a dusíkaté funkční skupiny. Je tedy zřejmé, že i navzdory jiným vlastnostem má GO podobnou adsorpční kapacitu (pro látky s aromatickým kruhem) jako grafen. Adsorpce je však dána jinými interakcemi (především vodíkovou vazbou) [21, 25]. Adsorpční kapacita nezávisí pouze na charakteru a množství adsorbentu, rozpouštědle nebo ph, ale i na charakteru analyzované látky. Wu et al. zkoušeli odstranit kyseliny p-toluensulfonovou a 1-naftalensulfonovou z odpadních vod. Využili k tomu grafen, jako adsorbent. Zjistili, že adsorpční kapacita a rychlost adsorpce roste se zvyšující se molekulovou hmotností a množstvím benzenových kruhů obsažených v adsorbované organické látce [21] Adsorpce kovových iontů Materiály na bázi grafenu mají velký potenciál k tomu, aby se staly efektivními adsorbenty pro extrakci různých druhů kovů, zvláště těch těžkých. Mechanismus adsorpce kovových iontů na grafenové materiály je velmi komplikovaný. K adsorpci přispívá velké množství různých interakcí, jako jsou elektrostatické interakce, fyzikální interakce či chemické interakce [21]. Kovové kationty v hydratované formě nebo ve formě komplexů s jednoduchými anionty na grafenové pláty bohužel nejsou adsorbovány. Pro adsorpci kovových iontů je nutné vytvoření kovového komplexu. Úplně jiná situace byla pozorována v případě GO. Funkční skupiny obsahující kyslíkové atomy mají volný elektronový pár a sdílením tohoto volného elektronového páru mohou efektivně vázat kovový ion a vytvořit tak kovový komplex. V mnoha studiích se ukázalo, že adsorpční kapacita GO je mnohem vyšší než adsorpční kapacita jakýchkoliv jiných sorbentů včetně nanomateriálů, jako jsou uhlíkové nanotrubičky. Je to dáno, vedle velkého povrchu GO, především vysokým obsahem atomů kyslíku. Množství kyslíku obsaženého v oxidovaných uhlíkových nanotrubičkách je daleko méně než v GO. Funkční skupiny 32

33 hrají v adsorpci kovových iontů z vodných roztoků důležitou roli, proto má grafen maximální kapacitu pro adsorpci kovových iontů nižší než GO [21, 25]. Jelikož adsorpce na GO závisí na vlastnostech kovů, různé kovové ionty mají ke GO různou afinitu. Provedené experimenty ukázaly, že afinita stoupá s elektronegativitou kovových iontů a disociační konstantou hydroxidu kovu. Adsorpce kovových iontů je obvykle nezávislá na jejich iontové síle. Na čem je ale výrazně závislá, je ph roztoku. Hodnota ph ovlivňuje ionizaci kyslíkatých funkčních skupin na povrchu GO. Náboj GO je nulový přibližně při ph = 3,9 (phpzc). Když je ph roztoku vyšší než 3,9, povrchový náboj GO je negativní a elektrostatické interakce mezi kovovými ionty a GO jsou silnější. Výsledkem je tedy i vyšší adsorpce kovových iontů. Kdyby bylo ph roztoku nižší než phpzc, povrch GO bude mít pozitivní náboj a kovové ionty se adsorbovat nebudou kvůli odpudivým elektrostatickým silám. Z tohoto důvodu je nutné pečlivě vybírat ph prostředí, aby byla adsorpce dostatečná. Adsorpce kovových iontů na GO ale nezávisí jen na ph. Při adsorpci hraje roli také přítomnost organických látek (balastů) v analyzovaném vzorku. Tyto látky jsou schopné vytvořit komplexy s kovovými ionty, a to díky tomu, že obsahují velké množství kyslíkatých funkčních skupin. Kovové ionty se pak neadsorbují na pevnou fázi. Kromě zmíněného může adsorpci kovových iontů ovlivnit teplota nebo délka pokusu [21, 25] Adsorpce plynů Grafen adsorbuje dobře plyny. Je tedy velmi výhodné ho použít jako senzor plynů nebo čistič ovzduší. Senzory molekul plynů hrají čím dál důležitější roli během kontroly chemických procesů a monitorování životního prostředí. Vzhledem k tomu, že grafenové nanomateriály jsou citlivé na změny v jejich okolí, mohou sloužit jako ideální vysoce citlivé senzory pro detekci různých plynů. V struktuře grafenu v některých prostředích dochází k určitým defektům. Bylo zjištěno, že tyto defekty mohou být způsobeny zachycením molekuly plynu. Leenaerts et al. zkoumali a počítali fyzikální adsorpci molekul NO2, H2O, NH3, CO, O3 a NO na povrch grafenu. Během adsorpce dochází k narušení struktury delokalizovaných 33

34 π elektronů. Je narušena symetrie vazeb aromatických kruhů a následkem toho dochází k porušení celého planárního uspořádání grafenu. Například v případě ozonu se na plátu grafenu vytváří epoxidové můstky za uvolnění molekul kyslíku. Pro zvýšenou citlivost grafenu k různým plynům je nutné grafen různě modifikovat. Například Ao et al. vyrobili grafen modifikovaný hliníkem. Hliník tohoto adsorbentu je schopen vázat CO. Po navázání CO se zvyšuje elektrická vodivost tohoto materiálu a díky této změně je možné CO detekovat [39]. 2.5 Použití grafenu v SPE Díky schopnosti adsorbovat organické molekuly, kovové ionty nebo plyny se z grafenu stává výjimečný adsorbent pro různé metody úpravy vzorku, jako jsou extrakce a mikroextrakce na pevné fázi [21]. Jak již bylo zmíněno, SPE využívá afinity analytů (rozpuštěných v kapalině) k sorbentu [23]. Je to velmi známý přístup k prekoncentraci vzorků. Spočívá v průtoku kapaliny kolonkou obsahující adsorbent, který zadrží analyty. Adsorbované analyty jsou pak získány promytím adsorbentu vhodným rozpouštědlem. Získání analytu je tedy ovlivněno použitím vhodného sorbentu a rozpouštědla [25]. Z toho vyplývá, že adsorbent je jádrem této metody a určuje účinnost a selektivitu extrakce [21, 23]. Liu et al. Poprvé použili grafen, jako sorbent v SPE. Extrahovali osm chlorofenolů ze vzorků vody odebraných v přírodě [23]. Došli k následujícím poznatkům, které je nutno brát v potaz při využití grafenu v SPE. Grafen připravili redukcí hydrazinem přes grafen-oxid. Zjistili, že rgo, připravený touto metodou, má adsorpční povrch 433,1 m 2 /g, zatímco teoretická hodnota je 2630 m 2 /g. Touto metodou lze tedy připravit grafen s adsorpčním povrchem přibližně šestkrát nižším. Je to pravděpodobně díky tomu, že během redukce došlo k částečné agregaci rgo částic. Tento fakt však nebrání ve využití grafenu, jelikož jeho adsorpční kapacita je stále dostatečně velká. Je několikanásobně vyšší než u uhlíkových nanotrubiček [26]. 34

35 Sorbent rgo umístili mezi dvě frity, aby zabránili jeho ztrátě během promývání a zkoumali jeho neporušitelnost, která by umožnila jeho opakované použití. Opakované použití mohou ohrozit buď velmi malé částečky grafenu, které mohou proniknout fritou během promývání, nebo třeba nezredukované grafen-oxidové částice. Čistý GO je pravděpodobně nevhodný adsorbent, jelikož obsahuje velké množství hydrofilních skupin. Je tedy rozpustný ve vodě a během promývání může být jednoduše odplaven. V případě rgo toto nehrozí. Po přípravě sorbentu, Liu et al. Promývali rgo nejrůznějšími organickými rozpouštědly, jako je methanol, acetonitril, etanol, 2-propanol, tetrahydrofuran, aceton, ethylacetát, hexan, cyklohexan, dichlormethan, chloroform a mehtylbuthylether. K žádným ztrátám sorbentu během promývání nedošlo. Široké množství použitých rozpouštědel ukazuje na širší možnost uplatnění grafenu. Navíc bylo zjištěno, že některé hydrofilní nezredukované části (hydroxylové a karboxylové skupiny) na grafenu mohou zvýšit jeho adsorpční schopnost. Protože zvyšují jeho smáčivost vodou, posiluje se tím adsorpce polárních látek na jeho povrchu, což je výhodné [26]. Výše zmíněným nevýhodám (agregace rgo a únik malých částeček grafenu z kolonky) lze předejít. Je tedy možné zdánlivé nevýhody grafenu potlačit, a to tvorbou grafenového derivátu. Liu et al. v jiné své studii vytvořili grafen a GO vázaný na silikagel. Karboxylové skupiny GO byly navázány na koncové aminoskupiny silikagelového adsorbentu. Takto vznikl nový adsorbent použitelný pro normální fázi SPE. Pro přípravu adsorbentu pro reverzní fázi se GO navázaný na silikagelu zredukuje hydrazinem. Tím je rozšířeno použití grafenových sorbentů v SPE na polární i organické systémy [23, 25]. Přestože je grafen kompatibilní s velkým množstvím rozpouštědel, ne všechna rozpouštědla jsou vhodná pro následnou analýzu vzorku pomocí HPLC. Mezi rozpouštědla kompatibilní s grafenem i HPLC patří MeOH, ACN a THF. Ani jedno z těchto rozpouštědel nevykázalo uspokojivý výtěžek při získávání chlorfenolů ze sorbentu. Sorbent promyly vždy nedostatečně. Proto se Liu et al. rozhodli změnit podmínky eluce. Alkalizovali methanol a měli úspěch. Zásadité prostředí methanolu příznivě ionizovalo chlorfenoly, snížilo jejich afinitu ke grafenu a umožnilo jejich eluci 35

36 [26]. Výběr vhodného rozpouštědla tedy závisí nejen na jeho kompatibilitě s grafenem, ale i na metodě následné analýzy a především na charakteru eluované látky. Co se nesmí opomenout, je optimalizace objemu eluentu. Objem musí být tak velký, aby se eluovalo veškeré množství adsorbované látky, zároveň nesmí být příliš velký pro pohodlnou manipulaci a úsporu organického rozpouštědla. V analýze chlorfenolů Liu et al. pro eluci chlorfenolů použili 1 ml alkalizovaného MeOH. A po eluci byl ještě promyt čistým MeOH a vodou, aby byl sorbent připraven pro další extrakci [26]. Ve své studii Liu et al. ještě zkoumali vliv ph a objemu vzorku na výtěžnost extrakce. Zatímco změny ph v rozmezí 3-9 významný vliv na extrakci neprokázaly, objem vzorku až tak zanedbatelný nebyl. Kolonka byla promývána standardizovanými roztoky obsahujícími 2 μg každého chlorfenolu a to v objemech od 1ml do 100 ml vodného roztoku. Výtěžnost extrakce byla až do 50 ml stejná, při použití 100 ml byla už nižší. 50 ml byl tedy označen za průlomový objem, který je u grafenu daleko vyšší než u jiných sorbentů o stejném množství. Například průlomový objem uhlíkových disků je 10 ml [26]. Na základě této studie lze konstatovat, že reprodukovatelnost SPE metody s grafenovým sorbentem je poměrně dobrá, navzdory nejednotnosti grafenových plátů. Vzhledem k obrovskému povrchu grafenu oproti jiným sorbentům a jeho velkému průlomovému objemu, stačí malé množství tohoto sorbentu při využití v SPE. Stejně tak je potřeba malé množství organického rozpouštědla. Kolonky s grafenovým sorbentem jsou opakovaně použitelné a lze je použít více než padesátkrát. Dále bylo zjištěno, že vyschnutí sorbentu nemá na jeho další použití významný vliv, jako je tomu u jiných sorbentů. Grafen je tedy velmi slibným materiálem pro využití v SPE [23, 26]. 36

37 3 Cíl práce Hlavním cílem práce je zhodnocení adsorpčních vlastností anexu na bázi oxidu zirkoničitého - modifikovaného grafenem (Gr-ZrAx) a jeho využitelnosti při extrakci bazických léčiv. Záměrem je zjistit, jaký vliv na adsorpční vlastnosti má metoda přípravy sorbentu, extrakční podmínky (použité organické rozpouštědlo, ph prostředí) a také, zda jsou testované kolonky opakovaně použitelné. Dále bylo cílem porovnat připravený sorbent s komerčně dostupným silikagelovým materiálem. 37

38 4 Experimentální část 4.1 Přístrojové vybavení Vybavení pro SPE SPE Manifold Supelco Visiprep, Polypropylenové SPE kolonky 1 ml, PE frity pro 1ml SPE kolonky - Sigma-Aldrich (St. Luis, USA) Vybavení pro analýzu HPLC Systém Prominence spda detektorem SPD-M20A - Shimadzu (Kyoto, Japonsko): pumpy LC-20AD autosampler SIL-20AC r ídící jednotka CBM-20A kolonový prostor CTO-20AC kolona Symmetry C18, 100 Å, 5 μm, 3,9 150 mm - Waters Corporation (Massachusetts, USA) Ostatní laboratorní zařízení Acidimetr 333 ph-metr - Druopta Praha (Praha, C R) Kraintek K-10 ultrazvuková vana - Kraintek s.r.o. (Podhájska, Slovenská republika) Kern ABT 220-4M analytické váhy - KERN & SOHN GmbH (Balingen, Ne mecko) Mikropipety, Eppendorf (Německo( Laboratorní magnetická míchačka - Laboratorní přístroje (Praha, ČR) Laboratorní sklo, pomu cky a zar ízení pro sus ení dusíkem 38

39 4.2 Chemikálie a materiál Atenolol (ATE), Diazepam (DIA), Karvedilol (CAR), Tamsulosin (TAM), Tetrahydrofuran, Kyselina octová, Hydrazin, Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), Kyselina 2-(N-morfolino)ethansulfonová (MES) - Sigma Aldrich (St. Louis, USA) Lidokain (LID), Hydrogenfosforec nan disodny dodekahydra t - AstraZeneca (Německo) Methanol gradient grade HPLC, Amoniak 25% GR, Acetonitril gradient grade HPLC - Merck (Německo) Dihydrogenfosforec nan sodny dihydra t - Chemifarm s.r.o. (C eska republika) Hydroxid sodný, Kyselina dusičná - Penta-Praha (Česká republika) Octan amonný - Lachema Brno-Neratovice (Česká republika) Silikagel 40 μm/60 A - Merck Millipore (Darmstadt, Ne mecko) C is te na voda, pr ipravena reverzní osmo zou, FaF UK, Hradec Kra love, C eska republika 4.3 Příprava zásobních roztoků 5mM octanový pufr V 50ml odměrné baňce bylo rozpuštěno 0,019 g CH3COONH4 ve vodě. Pomocí CH3COOH bylo upraveno ph na 3,5 a baňka byla doplněna vodou po rysku. 5mM pufr MES V 50ml odměrné baňce bylo rozpuštěno 0,049 g MES ve vodě. Pomocí NaOH bylo upraveno ph na 4,3 a baňka byla doplněna vodou po rysku. 5mM pufr TRIS V 50ml odměrné baňce bylo rozpuštěno ve vodě 0,030 g TRIS. Pomocí HCl bylo upraveno ph na 8,0 a baňka byla doplněna po rysku vodou. 39

40 5mM fosfátový pufr Fosfátový pufr, použitý jako jedna z mobilních fází při HPLC metodě, byl připraven rozpuštěním 0,5 g NaH2PO4 a 0,25 g Na2HPO4 ve vodě. K roztoku bylo přidáno 25 ml ACN, následně se roztok byl doplněn vodou na 500 ml. Hodnota ph pufru byla 6,4. roztok modelových analytů 1 mg od každé analyzované látky (LID, TAM, DIA, CAR, ATE) byl rozpuštěn v 1 ml MeOH. Všechny tyto připravené roztoky byly smíchány a naředěny příslušným prostředím na koncentraci 10 μg/ml. Roztok analytů byl připravován před každým nanesením vzorku na kolonku. porovnávací roztok 1 mg od každé analyzované látky (LID, TAM, DIA, CAR, ATE) byl rozpuštěn v 1 ml MeOH. Všechny tyto připravené roztoky byly smíchány a naředěny příslušným prostředím na koncentraci 100 μg/ml ředění NH3 NH3 se ředil MeOH, ACN, THF, nebo vodou, a to na potřebnou koncentraci, dle potřeby. 4.4 Příprava sorbentu Sorbent pro SPE, testovaný v této práci, byl připraven následujícím způsobem. 50 mg připraveného grafenu bylo ponořeno do 50 ml vody a směs byla sonifikována 45 min. Vzniklý roztok grafenu, 500 mg ZrAX a 500 μl 1% kys. octové byly zahřívány 1 hodinu při 40 C na vodní lázni. Suspenze byla dekantována. Pevná látka byla promyta a přidalo s k ní 3 ml vody. K suspenzi bylo potom přidáno 50 μl hydrazinu a směs byla zahřívána 30 minut při 95 C na vodní lázni. Vzniklá suspenze byla nanesena SPE kolonku opatřenou fritou. Usazený sorbent na fritě byl ponechán vyschnout. Nakonec byl připravený sorbent rozvážen do kolon, a to vždy po 50 mg, přičemž byla dána vždy jedna frita pod a nad sorbent. Sorbent byl připravován 40

41 několikrát, vždy z grafenu 3 a 5, což jsou 2 typy grafenu, které se liší přípravou, a to konkrétně dobou oxidace. Grafen 3 byl oxidován v řádu hodin, přičemž grafen 5 v řádu dní. Vlastnosti sorbentů připravených z těchto dvou typů grafenů byly mezi sebou porovnávány. Pro zjištění opakovatelnosti metody byl zkoušen připravit sorbent také několikrát ze stejného grafenu. 4.5 Provedení SPE metody SPE probíhala následovně: aktivace: 1 ml MeOH kondicionace: 1 ml vody, nebo pufru nanesení vzorku: 0,5 ml roztoku analyzovaných látek ve vodě nebo pufru promytí: 1 ml vody, nebo pufru eluce: 2 ml elučního činidla. Elučních činidel se používalo několik za sebou: 0,2% NH3 v MeOH, 5 % NH3 v ACN, 5 % NH3 v THF Jednotlivé eluce byly vysušeny proudem dusíku a následně rekonstituovány pomocí 0,5 ml 50% ACN. Vzniklé roztoky byly převedeny do vialek, v nichž byly následně analyzovány. Jako porovnávací roztok bylo použito 50 μl porovnávacího roztoku o koncentraci 100 μg/ml, která byla také vysušena dusíkem a rekonstituovala roztokem 50% ACN. 4.6 Podmínky HPLC Promyté vzorky a jednotlivé eluce byly analyzovány pomocí HPLC. Jako mobilní fáze A byl použit fosfátový pufr o ph 6,4 (připravený dle postupu v kapitole 4.3). Jako mobilní fáze B byl použit ACN. Byla použita metoda binární gradientové eluce, kdy byl gradient mobilní fáze B: min => 30 %, min. => 30 % 80 %, dále 80 % 30 %, kdy analýza končila 10. minutou. Průtok mobilní fáze byl 1,0 ml/min. Teplota na koloně byla 25 C. Nástřik na kolonu byl 20 l. Vzorky byly hodnoceny při = 220 nm. Retenční časy jednotlivých složek (v minutách) byly následující: ATE: 2,4; DIA: 3,25; LID: 3,65; TAM: 4,57; CAR: 5,8. 41

42 5 Výsledky a diskuze V této práci jsme zkoumali retenční schopnosti nově vytvořeného sorbentu (Gr-ZrAX). Jako modelové analyty jsme zvolili lidokain, tamsulosin, diazepam, karvedilol a atenolol, jejichž struktury jsou vyobrazeny na Obrázku 11. V této práci jsme se zaměřili na vliv experimentálních podmínek na retenční schopnosti sorbentu. Porovnávali jsme různě připravený sorbent, různá prostředí, v kterých se analyty nacházely (ph). Testovali jsme také opakovatelnost metody a znovu použitelnost používaných kolonek. V neposlední řadě jsme porovnali retenční schopnosti námi připraveného sorbentu se silikagelovým sorbentem. Obrázek 11 Struktury analyzovaných látek 5.1 Porovnání stejných SPE kolonek Nejprve jsme zkoumali, jak bude probíhat retence analytů a jejich eluce při použití stejného sorbentu, tzn. sorbentu jednou připraveného a následně rozváženého do dvou různých kolon. Pro přípravu sorbentu byl použit grafen 3. Vzniklý sorbent jsme proto nazvali Gr3-ZrAX. Tato extrakce probíhala ve vodném prostředí. Sorbent se po nanesení vzorku (směs modelových analytů) promyl vodou (obojí bylo dohromady zachyceno), a poté se vzorek eluoval těmito elučními činidly: 2 ml MeOH a 3 ml 42

43 1,1M NH3 v MeOH. Eluční činidla jsme po nanesení na kolonku zachytili a analyzovali zvlášť. Vzorek jsme po nanesení na kolonku zachytili a zanalyzovali spolu s promývací vodnou fází (v grafu označeno, jako voda). Nanesení vzorku, eluce i následná analýza probíhaly současně za stejných podmínek a za použití stejných (jednou připravených) zásobních roztoků. Procentuální hodnoty extrakčních výtěžností jsou graficky znázorněny na Obrázku 12, kdy u každé látky 1. sloupec představuje 1. kolonku a 2. sloupec 2. kolonku. Obrázek 12 Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr3-ZrAX, 1. a 2. kolonka Na Obrázku 12 je vidět, že extrakční výtěžnosti dvou stejně provedených extrakcí se mírně liší, ale přesto jsou velmi srovnatelné. 5.2 Vliv ph a opakovatelnost přípravy grafenu Zjišťovali jsme, jaký vliv na retenci a eluci analyzovaných látek má prostředí extrakce. Extrakci jsme provedli ve vodném prostředí a ve třech prostředích o různém ph: TRIS (ph = 8,0), MES (ph = 4,3) a octanový pufr (ph = 3,5). Extrakce byla provedena podle postupu uvedeného v kapitole 4.5, přičemž během kondicionace a promývací fáze se použila buď voda nebo zmíněné roztoky s upravenou hodnotou ph - vždy 1 ml. Vliv ph na SPE jsme zjišťovali při použití sorbentů Gr3-ZrAX a Gr5-43

44 ZrAX. Eluce proběhla za pomoci 2 ml následujících elučních činidel: MeOH, 0,2% NH3 v MeOH, 5% NH3 v ACN, 5% NH3 v THF. Extrakční výtěžnosti jsou graficky znázorněny na Obrázcích Porovnáním extrakčních výtěžností při použití sorbentů Gr3-ZrAX a Gr5-ZrAX, jsme mohli srovnat vliv přípravy grafenu na jeho extrakční vlastnosti. Obrázek 13 Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr3-ZrAX Obrázek 14 Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr5-ZrAX 44

45 Po provedeném experimentu na sorbentu Gr3-ZrAX (vzorky připraveny ve vodě), jsme zjistili, že sorbent nejpevněji adsorboval karvedilol a tamsulosin. o něco méně atenolol a nejméně potom lidokain, kterého bylo v extraktu po promytí vodou analyzováno 20 % (viz Obrázek 13). Čistý MeOH se projevil jako nedostačující eluční činidlo. Eluoval pouze většinu diazepamu a lidokanu, které ale na sorbentu byly nedostatečně zachyceny už po promytí vodou. U karvedilolu se jeho eluční schopnost neprojevila vůbec, stejně jako eluční schopnost ostatních činidel. Karvedilol se podařilo eluovat pouze z necelých 5 %, a to především pomocí NH3 v THF. U atenololu by na dostatečnou eluci stačilo NH3 v MeOH a následně NH3 v ACN. Tamsulosin se eluoval ze 55 %, a to pomocí 0,2% NH3 v MeOH, 5% NH3 v ACN a 5% NH3 v THF. Při použití sorbentu Gr5-ZrAX, došlo k nižší retenci analytů. Extrakční výtěžnosti tohoto sorbentu jsou uvedeny na Obrázku 14. Např. po promytí vodou bylo v eluátu analyzováno 41 % lidokainu, ale i atenololu a diazepamu bylo více než při použití Gr3-ZrAX. Poměrově však byly extrakční výtěžnosti při použití různých elučních činidel na obou sorbentech podobné Sorbent Gr3-ZrAX Vliv ph na SPE jsme zkoumali při použití sorbentů Gr3-ZrAX a Gr5-ZrAX. Na Obrázcích jsou graficky znázorněny extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr3-SHAX v prostředí různých ph. Oranžové označení pufr označuje množství analytu po promytí kolonky pufrem. Roztoky modelových analytů byly připraveny v příslušném pufru. 45

46 Obrázek 15 Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr3-ZrAX v prostředí octanového pufru (ph = 3,5) Jak je vidět na Obrázku 15, snížením ph na 3,5 se nám podařilo (v porovnání s vodným prostředím) zvýšit extrakční výtěžnost karvedilolu, která se zvýšila z 5 % na 30 %, přičemž 24 % bylo eluováno pomocí MeOH. Což je sice znatelný nárůst, ale pořád ne dostatečný. U ostatních látek došlo k významnému snížení síly adsorpce. Většina atenolou, lidokainu a tamsulosinu nebyly na kolonce zadrženy a byly vymyty při promytí kolonky pufrem. U diazepamu byla adsorpce vyšší, ale pořád extrakt po promytí pufrem nebylo 20 % látky na kolonce zadrženo. Obrázek 16 Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr3-ZrAX v prostředí MES (ph = 4,3) 46

47 Mírné zvýšení ph (na 4,3 za použití pufru MES) metodu extrakce nevylepšilo, jak je vidět na Obrázku 16. Extrakční výtěžnost všech látek se snížila přibližně o polovinu, přičemž již po promytí pufrem extrakt obsahoval velké množství atenololu a lidokainu. Extrakční výtěžnost karvedilolu se opět snížila. Diazepam nebyl po promytí pufrem v extraktu přítomen, což je výhodné, ale pak se nepodařilo použitými činidly všechen zachycený diazepam eluovat.. Obrázek 17 Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr3-ZrAX v prostředí TRIS (ph = 8,0) Pokusili jsme se tedy posunout ph jiným směrem. Zvýšili jsme ph na 8,0 (použitím pufru TRIS). Extrakční výtěžnosti při použití tohoto pufru jdou vidět na Obrázku 17. Tento posun ph velmi svědčil extrakci tamsulosinu. Dostatečně se na sorbent adsorboval, a zároveň se snadno eluoval - především pomocí MeOH, který dokázal tamsulosin eluovat ze 71 %. U ostatních analytů se změna ph moc neosvědčila. U atenolou, diazepamu a lidokainu byla nedostatečná adsorpce znatelná již při promytí pufrem. Karvedilol sice v extraktu přítomen nebyl, ale jeho extrakční výtěžnost se také nezvýšila. Eluoval se pouze z 8 % Sorbent Gr5-ZrAX Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr3-ZrAX jsme porovnali s extrakčními výtěžnostmi (stejných látek za stejných podmínek) při použití sorbentu Gr5-ZrAX. Extrakční výtěžnosti při použití Gr5-ZrAX jsou uvedeny na Obrázcích

48 Obrázek 18 Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr5-ZrAX v prostředí octanového pufru (ph = 3,5) Obrázek 19 Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr5-ZrAX v prostředí MES (ph = 4,3) Obrázek 20 Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr5-ZrAX v prostředí TRIS (ph = 8,0) 48

49 Jak je vidět, extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr3-ZrAX jsou extrakčním výtěžnostem při použití sorbentu Gr5-ZrAX velmi podobné. Pro shrnutí výše uvedených výsledků je nutné konstatovat, že adsorpce námi zvolených analytů na sorbent Gr-ZrAX je závislá na ph prostředí. Změna ph však ve většině případů extrakci neovlivnila příznivě. Až na výjimky způsobila nižší retenci analytů na sorbentu, a to bez ohledu na kyselost nebo zásaditost prostředí. Pouze prostředí o ph = 8,0 (TRIS) se při extrakci tamsulosinu ukázalo jako velmi výhodné. Při tomto ph se tamsulosin promývací fází (pufrem) vůbec nevymyl a elučními činidly se ho podařilo extrahovat skoro kompletně, oproti vodnému prostředí, kdy se eluovalo pouze 55 % (při použití Gr3-ZrAX). Pro ostatní látky jako nejvhodnější prostředí pro extrakci z výše uvedených zůstává prostředí vodné, i když ani to není optimální. Co se týče karvedilolu, ten se nám účinně extrahovat nepodařilo vůbec v žádném postředí. Optimální podmínky pro jeho extrakci jsme nenašli. 5.3 Délka sonifikace grafenu Dále jsme zkoumali, jaký vliv na retenci analyzovaných látek má délka sonifikace grafenu při přípravě sorbentu. Při přípravě sorbentu (podle metody uvedené v kapitole 4.5), jsme zkoušeli grafen 3 ve vodě sonifikovat 45, 60 a 90 minut. Připravený sorbent těmito třemi způsoby jsme použili při extrakci stejného analytu jako u ostatních zkoušek. Vzorek jsme promyli vodou a eluovali 2 ml MeOH a 3 ml 1,1M NH3 v MeOH. Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu, připraveného různou délkou sonifikace, jsou graficky znázorněny na Obrázcích

50 Obrázek 21 Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr3-ZrAX, připraveného po 45min sonifikaci grafenu Obrázek 22 Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr3-ZrAX, připraveného po 60min sonifikaci grafenu Obrázek 23 Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr3-ZrAX, připraveného po 90min sonifikaci grafenu 50

51 Podle výše uvedených grafických znázornění se extrakční výtěžnosti Gr3-ZrAX sorbentů připravených různou délkou sonifikace nijak zásadně neliší. Určité odlišnosti pozorovat můžeme, ale u všech látek došlo v zásadě k podobné extrakční výtěžnosti ve všech případech. Poměry extrakčních výtěžností různých elučních činidel se také nijak zásadně neliší. Délka sonifikace grafenu při přípravě Gr-ZrAX sorbentu tedy nehraje významnou roli. 5.4 Opakovaná použitelnost kolon Bylo také důležité zjistit, zda jsou kolonky s nově vytvořeným sorbentem opakovaně použitelné. Proto jsme kolonky se sorbentem, připraveným různou délkou sonifikace, regenerovali (pomocí: 1 ml 0,1M NaOH, 1 ml vody, 1 ml 0,1M HCl a nakonec 2 ml vody). Pro ukázku jsou na Obrázku 24 graficky znázorněny extrakční výtěžnosti po dvou regeneracích Gr3-ZrAX připraveného po 60min sonifikaci grafenu. První sloupec u každé látky vždy představuje extrakční výtěžnost po první regeneraci sorbentu, neboli druhé použití sorbentu. Druhý sloupec znázorňuje vždy extrakční výtěžnost po druhé regeneraci sorbentu, čili třetí použití sorbentu. Extrakční výtěžnost první extrakce před regeneracemi je znázorněna na Obrázku 22. Obrázek 24 Extrakční výtěžnosti při použití 1x a 2x regenerovaného sorbentu Gr3-ZrAX, připraveného po 60min sonifikaci grafenu 51

52 Jak je vidět, extrakční výtěžnosti po regeneraci sorbentu a jeho opětovném použití se liší. Analyzované látky se na regenerovaný sorbent ve většině případů adsorbovaly slaběji, nebo se eluovali slabším elučním činidlem. Nejen, že se lišila 1. extrakce od 2. extrakce na regenerovaném sorbentu, ale lišily se také extrakční výtěžnosti 1 regenerovaného sorbentu a 2 regenerovaného sorbentu (2. a 3. použití). Po použití sorbentu, na něm pravděpodobně dochází k určitým změnám a mění se tak jeho adsorpční vlastnosti. 5.5 Porovnání Gr-ZrAX a silikagelu Zkusili jsme porovnat tento Gr-ZrAX sorbent s jiným sorbentem, a to s jedním z nejpoužívanějších sorbentů pro SPE. Jednalo se o silikagel. Uvádíme graficky znázorněnou extrakční výtěžnost při použití sorbentu Gr3-ZrAX, silikagelu a směsi grafenového sorbentu se silikagelem. Extrakce probíhala stejně jako metody předešlé. Analyzovali jsme ATE, DIA, LID, TAM a CAR. Aktivace se provedla pomocí 1ml MeOH a jako eluční činidla se opět použily 2 ml od: MeOH, 0,2% NH3 v MeOH, 5% NH3 v ACN, 5% NH3 v THF. Extrakční výtěžnosti s různými sorbenty jsou uvedeny na Obrázcích Obrázek 25 Extrakční výtěžnosti při použití sorbentu Gr3-ZrAX 52

53 Obrázek 26 Extrakční výtěžnosti při použití silikagelového sorbentu Jak je vidět na Obrázcích 25 a 26, při použití silikagelového sorbentu byla extrakční výtěžnost tamsulosinu a karvedilolu daleko vyšší, než při použití Gr-ZrAX sorbentu. Dá se říci, že pro extrakci těchto látek je silikagel vhodnější. Pro porovnání: při použití Gr3-ZrAX sorbentu byla extrakční výtěžnost tamsulosinu 57 %, zatímco při použití silikagelového sorbentu dosahovala extrakční výtěžnost 100 %. Navíc při použití silikagelového sorbentu se téměř všechna látka eluovala už při eluci MeOH. Další látkou, pro jejíž extrakci je silikagelový sorbent vhodnější je karvedilol. Při použití Gr3-ZrAX sorbentu došlo k extrakci pouze 5 % karvedilolu, zatímco při použití silikagelu se extrahovalo 90 % látky. Extrakční výtěžnost lidokainu a atenololu byla při použití silikagelu nepatrně nižší, ale za to se většina analytu extrahovala už pomocí MeOH a během promývací fáze zůstaly tyto dva analyty dostatečně adsorbovány. Látka, při jejíž extrakci je daleko vhodnější použít sorbent Gr-ZrAX, je diazepam. Při použití silikagelu, bylo v extraktu zaznamenáno 62% látky již během promývací fáze, což je nežádoucí. Při použití Gr-ZrAX se na sorbent neadsorbovalo jen 10 %. 53