Produkcia bioaktívnych diterpénových metabolitov aktinomycétami. Školiteľ: Doc. Ing. Mária Šturdíková, PhD. Doktorand: Ing.

Transkript

1 Produkcia bioaktívnych diterpénových metabolitov aktinomycétami Školiteľ: Doc. Ing. Mária Šturdíková, PhD. Doktorand: Ing. Michal Maruna

2 Zameranie laboratória Mikrobiálna produkcia sekundárnych bioaktívnych metabolitov Riešenie v rámci projektu Projekt APVV (riešenie od roku 2006) Využitie mikroorganizmov žijúcich s vyššími rastlinami pre alternatívnu biotechnologickú produkciu protinádorových taxánov, fytochemikálií ihličnanu Taxus

3 Úvod Prírodné produkty sa oddávna používali ako účinné prostriedky na liečenie rôznych chorôb a aj v dnešnej dobe príroda zostáva hlavným zdrojom liečiv v prípade antibiotík a protirakovinových látok Potreba objavovať nové účinnejšie liečivá z dôvodu prudkého nárastu civilizačných chorôb (napr. rakovina predstavuje 20 % úmrtí). Diterpenoidu taxolu a ďalšiemu liečivu kamptotecínu sa pripisuje úspech vo výskume prírodných látok, v posledných desaťročiach je taxol signifikantným prínosom v chemoterapii. Taxány ako podskupina diterpénov boli prvýkrát izolované z extraktov kôry Taxus baccata, doteraz je známych 300 taxánov, najúčinnejší je taxol, používaný v chemoterapii. Pre nízky obsah taxánov v rastlinách 0,01 % sa začali skúmať alternatívne produkčné systémy, bunkové kultúry Taxus spp. ako aj endofytické a epifytické mikroorganizmy rastlín.

4 Protirakovinové molekuly z rastlín Vinca alkaloidy (vinblastin, vincristin) z rastliny zimozeleň Catharanthus roseus. Liečenie rakoviny prsníkov, pľúc, KS, leukémie. Podophyllotoxíny (etoposid, tenoposid) rastlina Podophyllum hexandrum endofytická huba Trametes hirsuta Rakovina dýchacích ciest, lymfóm testikulárna rakovina. A B A- Podophyllotoxin, B- Etoposid a Teniposi

5 Protirakovinové molekuly z rastlín Kamptotecíny (topotecan, irinotecan), strom Camptotheca acuminata Rakovina vaječníkov, pľúc, hrubého čreva. Combretastatíny (A-1, A-4), africký strom Combretum caffrum A-4 A-1

6 Protirakovinové molekuly z rastlín Taxány (Taxol, Taxotere), rastlina Taxus spp. Taxol (Paclitaxel), C 47 H 51 NO 14 a molekulovou hmotnosťou 852, prvý krát izolovaný v roku 1971, používaný na liečbu rakoviny od roku 1992.

7 Taxol sa považuje za najúspešnejšie protirakovinové liečivo posledných rokov. V predchádzajúcom období boli v našom laboratóriu izolované desiatky endofytických a epifytických mikroorganizmov z Taxus baccata. Autentický strom Taxus baccata (Tis čierny) Zdroj skúmaných kmeňov aktinomycét

8 Biologická aktivita a terapeutické využitie taxánových metabolitov Hlavný účinok taxánov je cytotoxicita, taxány predstavujú nový prototyp chemoterapeutík, pôsobia voči niekoľkým druhom rakoviny (prsníkov, močových ciest, pľúc, hrubého čreva). Vykazujú aj antifungálnu aktivitu, u rastlín Taxus sa nespozorovalo zahnívanie koreňov vo vlhkom prostredí močiarov. Pôsobia voči psoriáze a majú taktiež protizápalové účinky. Účinok taxánov spočíva v antimitotickom ireverzibilnom zhlukovaní tubulínu deliaceho vretienka, tým sa potlačí dynamika mikrotubúl, zabráni sa nádorovému bujneniu buniek.

9 Spôsoby získania z taxánov: 1. Izolácia z rastlín n (neefektívna, nízky n obsah účinnej látky 0,01 %, deštrukcia stromov). 2. Semisyntézou z neaktívnych rastlinných taxánov (baccatin, 10-deacetylbaccatin deacetylbaccatin). 3. Alternatívne spôsoby biotechnologicky rastlinné bunkové kultúry endofytické mikroorganizmy geneticky modifikované mikroorganizmy. 4. Chemická syntéza komplikovaná,, nemá komerčný význam. Zamerali sme sa na taxány produkované mikroorganizmami predovšetkým etkým aktinomycétami. tami. Tis čierny (Taxus baccata) Izolát aktinomycét z tisu

10 Ciele dizertačnej práce Vhodnými technikami izolovať mikroorganizmy, ktoré majú alebo možno predpokladať schopnosť produkovať cytotoxické diterpénové metabolity s protirakovinovým účinkom. Preveriť paletu sekundárnych metabolitov produkovaných izolovanými mikroorganizmami na cytotoxickú aktivitu na vybraných modeloch. U vybraných mikrobiálnych producentov hľadať efektívny spôsob fermentácie scieľom maximalizácie hľadaných metabolitov a potlačenia produkcie iných skupín sekundárnych metabolitov. Hľadať možnosti účinnej a jednoduchej izolácie bioaktívnych metabolitov z fermentačného média a zároveň nájsť vhodnú a rýchlu metódu stanovenia substancíí fermentačných produktov. Pomocou dostupných analytických metód ako napríklad UV-VIS, HPLC, LC-MS, IČ ako aj NMR spektroskopie potvrdiť štruktúru hľadaných taxánových metabolitov. Štúdium ostatných majoritných metabolitov nachádzajúcich sa vo fermetačnom médiu z hľadiska napríklad bioaktivít, atď.

11 Experimentálna práca overenie produkčných schopností izolovaných kmeňov aktinomycét na modifikovanom ARG médiu hodnotenie biologickej aktivity produkovaných látok inhibícia aktivity katepsínu B účinkom metabolitov v extraktoch médií aktinomycét výber jedného produkčného kmeňa aktinomycét s najlepšími parametrami kultivačné experimenty optimalizácia podmienok kultivačného procesu s cieľom stimulácie produkcie taxánov kvantitatívne stanovenie taxolu vo vzorkách extraktov z kultivácií rôznych regulátorov metabolizmu do média s prídavkami enzýmovým imunologickým testom (VULM, a.s.) HPLC metóda

12 Záver Aktinomycéty produkujúce taxány boli selektované v skríningu mikroorganizmov izolovaných z hostiteľskej rastliny Taxus baccata. Výber produkčného mikroorganizmu aktinomycéty bol uskutočnený na základe dvoch kritérií: chemický profil produkovaných sekundárnych metabolitov biologická aktivita produktov (inhibícia aktivity katepsínu B). Odskúšali sme rôzne spôsoby na stimulovanie produkcie taxánov izolovaným kmeňom v submerzných kultiváciách izolátu viaceré sacharidy boli vhodné pre produkciu taxánov zvýšenie produkcie taxolu sme dosiahli účinkom prekurzora fenylalanínu v médiách s rôznymi sacharidmi odskúšali sme niektoré stimulátory a inhibítory metabolických dráh, rastlinné produkty a elicítor metyljasmonát na ovplyvnenie biosyntézy taxolu optimalizovanie procesu kultivácie produkčného kmeňa pozitívne ovplyvnilo výťažky taxánov

13 Ďakujem za pozornosť