Transkript

1 PCR diagnostika lymeské borreliózy. Mgr. D. Berenová, J. Hořejší, Ing. A. Lukavská, RNDr. P. Kodym, CSc. Národní referenční laboratoř pro lymeskou borreliózu Centrum epidemiologie a mikrobiologie Státní zdravotní ústav Praha 2O12

2 Dlouhý P, Honegr K, Krbková L, Pícha D, Roháčová H, Šruncová V. Lymeská borrelióza: Doporučený postup v diagnostice, léčbě a prevenci. Vydán: květen 2011 PCR detekuje ve vyšetřovaném materiálu borreliovou DNA nejvyšší záchyt bývá v synoviální tekutině případně v bioptickém vzorku z kůže, vyšetření likvoru bývá často negativní. Vyšetřování moče či krve je nevhodné. Metoda je považována pouze za doplňkovou - není standardizována a dostupné komerční sety jsou určeny pouze pro výzkumné účely. K přímému průkazu původců LB v klinickém materiálu by bylo možné použít elektronové mikroskopie s identifikací spirochét v tkáňové biopsii či tělních tekutinách; jde o metodu vyhrazenou spíše k výzkumným účelům.

3 Přehled PCR metod 16S rrna v současnosti používáme endpoint kit Borrelia s.l. od firmy Sacace Biotechnologies (Dynex), dle námi provedených testů má záchyt na všech 5 patogenních borrelií v Evropě (Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzeli, B. valaisiana, B. lusitaniae) ospa nested využíváme pro potřeby genotypizace, sekvenace (Motter et al. 1994, Detection of Borrelia burgdoferi sensu lato in lesional skin of patients with erythema migrans and acrodermatis chronica atrophicans by OspA- specific PCR. J Clin Microbiol.) Artus Borrelia LC PCR kit (Qiagen) kit pro Real Time PCR, kvantifikace BBSL, výzkumné účely RT-PCR flagelín nízka senzitivita

4 Vhodný materiál Krev nesrážlivá (EDTA, Citrát) Likvor Biopsie kůže, sval, myokard, synovie Borreliová DNA obsahuje asi 29% G-C párů, což znamená, že její DNA není stabilní a podléhá rychlé degradaci, proto pro všechen uvedený materiál platí co nejrychlejší transport do vyšetřující laboratoře (nejpozději do 24 hod. nebo zamrazit, krev -zamrazit plasmu, biopsie zamrazit ve sterilním fyziologickém roztoku) Méně vhodné materiály - Moč, Biopsie ve formalinu, parafinu Nevhodný materiál - Krev srážlivá (afinita borrelií k aktivovaným destičkám)

5 Specifita PCR 16S rrna (Sacace) Druh 1. Treponema palidum 2. Chlamydia trachomatis 3. Chlamydia pneumoniae 4. Escherichia coli 5. Staphylococcus aureus 7. Anaplasma phagocytophylum 8. Leptospira interrogans 9. Borrelia garinii 10. Borrelia valeisiana 11. Borrelia lusitaniae 12. Borrelia afzelii 13. Borrelia burgdorferi s.s. původ kmenu Sacace, 16S rrna szu - szu - szu - szu - szu - szu - Instand - Instand + Instand + Instand + szu + szu + Citlivost PCR 16S rrna (Sacace) 500 kopií / ml.

6 Přehled vyšetřených materiálů a jejich pozitivity Celkem Pozitivní % pozitivních Krev ,2 Likvor ,8 Výpotek ,2 Myokard ,9

7 Procento pozitivních vzorků krve / likvoru podle měsíce odběru v r Březen Duben Květen Červen Červenec Srpen Září Říjen Listopad Prosinec Leden Únor Březen Krev Likvor

8 Procento pozitivních vzorků krve / likvoru podle základní diagnózy ( A=borrelióza, D=novotvary nemoci krve, G=nemoci nervové soustavy, M=nemoci pohybové soustavy, R=abnormality) A D G M R 1 Krev Likvor

9 Kvantifikace BBSL v biopsiích myokardu (Artus Borrelia LC PCR kit (Qiagen)) Č. 1 Kvalitativ. PCR biopsií myokardů 16S rrna+ OspA+ Kvalitativní PCR krve Kvantitativní PCR biopsií myokardů (kopie/mg) Druh borélie (NCBI kod) 16S rrna B.garinii(HQ173807) 2 16S rrna+ Negative 353 B.afzelii(JF262958) 3 16S rrna+ 16S rrna+ OspA+ OspA+ 1,7 B.burgdorferi sensu stricto (HQ173806) 4 16S rrna+ OspA+ Negative 5,9 B.garinii (JF772231) 5 16S rrna+ Negative 2,6 B.garinii(EF364112) 6 OspA+ 7 16S rrna+ OspA+ 38,1 Negative 16S rrna+ OspA+ 8 16S rrna+ Negative B.afzelii(HQ173808) B.burgdorferi sensu stricto (JN008941) 9 OspA+ Negative neg. Negative 10 OspA+ 16S rrna+ 5,9 B.garinii(JF262957) 11 OspA+ Negative 412,8 B.burgdorferi sensu stricto (JF772232) Kvantitativní PCR biopsií myokardů - průměrná kvantita 79 kopií/mg.

10 Detekce BBSL v biopsiích myokardu 41 biopsií myokardů z IKEMu za 2 roky 10/41 (24%) biopsií LB pozitivních B.burgdorferi s.s. 30% B.afzelii 20% B.garinii 40% Kubánek M, Šramko M, Berenová D, Hulínska D, Hrbáčková H, Malušková J, Lodererová A, Málek I, Kautzner J. Detection of Borrelie burgdorferi sensu lato in endomyocardial biopsy specimens in individuals with recent onset dilated cardiomyopathy. Eur J Heart Fail 2012

11 Závěr DNA borélií nestabilní důraz na dodržování podmínek preanalytické fáze Význam PCR LB u vyšetřeni biopsií (myokard 17,9% pozitivních) PCR v diagnostice LB doplňková metoda vedle serologie, význam ve včasných fázích, před tvorbou protilátek Význam PCR genotypizace Interpretace výsledků: Pozitivní výsledek PCR potvrzení BBSL ve vzorku, doporučení zopakovat PCR a provést serologické testy za 2-3 týdny. Negativní výsledek PCR LB nevylučuje.

12 Děkuji za pozornost