diagnostiky LF a FN Hradec Králové

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "WWW.DYNEX.CZ. diagnostiky LF a FN Hradec Králové"

Dominika Šimková
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 Možnosti a úskalí detekce DNA Borrelia burgdorferi sensu lato Bolehovská R., Plíšková L., Ústav klinické i ké biochemie i a diagnostiky LF a FN Hradec Králové

2 obtížná Diagnostika lymeské boreliózy klinický obraz velmi rozmanitý anamnestické údaje (přisátí klíštěte ~ 60 %) laboratorní l b í - nejednoznačnost laboratorních nálezů ů elektronová mikroskopie, průkaz Ab (ELISA), western blot, imunofluorescenční analýza, PCR, CSF - vyšetření leukocytů (pleocytóza, zejm. mononukleáry), celkové bílkoviny (, někdy gamaglobuliny) někdy norm. nález

elektronová mikroskopie, průkaz Ab (ELISA), western blot, imunofluorescenční analýza, PCR, CSF

3 Molekulárně biologické metody (PCR) výhody rychlost, citlivost, specifita, možnost vyšetření v jakémkoliv materiálu úskalí preanalytická fáze výběr pacientů, materiálů a jejich načasování, podmínky transportu apod. příprava vzorků, izolace (optimalizace), uchování DNA výběr primerů, optimalizace a validace metody kontrola kvality (VKK, EHK)

a jejich načasování, podmínky transportu apod.

4 Preanalytická fáze výběr pacientů dif. dg. akutní LB - genom. DNA ve vyšších konc. chronická LB stopová množství genom. DNA (doplnit o detekci plazmidové DNA) záchytnost y??? výběr materiálů, načasování odběru materiály krev, likvor, moč, č synoviální tekutina, tkáň, vzorky kůže z EM apod. X klíště volba materiálu dle příznaků, stádia a doby onem. transport v chladu (nemrazit!!!) vysoká teplota snižuje procento pozitivity, hemolytické materiály inhibicí

?? výběr materiálů, načasování odběru materiály krev, likvor, moč, č synoviální tekutina, tkáň, vzorky kůže z EM

5 Materiály krev k nízká senzitivita boreliémie pouze krátkodobá, přechodná, pouze v období diseminovaného onem. (EM, neuroborelióza, karditidy) plazma (10) X sérum (20) X plná krev (100 spirochet/ml) - Mouritsen et al., Am.J.Clin.Pathol., 1996 CSF neuroborelióza nepřímá závislost na délce trvání onem. do 2 týdnů PCR pozit. u 50 % X více než 2 týdny pouze u 13 % - Lebech et al., Mol. Diagn., 2000 možnost adheze ke tkáním nízká senzitivita v pozdních stádiích, význam PCR pouze v časných ý h stádiích

, 1996 CSF neuroborelióza nepřímá závislost na délce trvání onem. do 2 týdnů PCR pozit.

6 močč Materiály nižší senzitivita, nereprodukovatelnost neodebírat 1. proud ranní moče centrifugace při g (při g všechny moče negat.) Bergmann et al., J. Clin. Microbiol., 2002 synoviální tekutina artritida vyšší procento pozitivit závislost na antibiotické terapii po léčbě negat. PCR v synoviální tekutině, ale možnost detekce BB v synoviální membráně Priem et al., Ann. Rheum. Dis., 1998

7 Materiály kůže kožní manifestace vysoká senzitivita léze EM - 36 až 88 % pac. s chron. atrofickou akrodermatitidou 54 až 100 % uchování v transportním, kultivačním médiu po 24 hod. migrace spirochét do média izolace DNA z kůže, ale i z média klíště výpovědní hodnota??? pozitivní nález nemusí znamenat nákazu (doba přisátí klíštěte odstranění do 24 hod. riziko rozvoje LB velmi nízké) význam pro epidemiologické a jiné vědecké studie

migrace spirochét do média izolace DNA z kůže, ale i z média klíště výpovědní hodnota?

8 Izolace co nejdříve (zamrazit max. 3 měsíce) porovnání 3 izolací Exner et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2003 fenol-chloroformová extrakce, QIAamp DNA kity (OIAGEN), automatická izolace na přístroji MagNA Pure (mg. partikule) stejná citlivost u vzorků krve, CSF, synov. tekutiny X moč horší citlivost u QIAamp DNA kitu ÚKBD porovnání 2 izolací QIAamp DNA Mini Kit (TQ), MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III srovnatelná citlivost CSF, plazma, moč, synoviální tekutina atd. centrifugace max. otáčky sediment uchování DNA 2 až 8 C ( teplota - citlivost)

partikule) stejná citlivost u vzorků krve, CSF, synov.

9 Výběr primerů neobvyklý genom BB lineární chromozom + různý počet lineárních a cirkulárních plazmidů (BB je mohou ztrácet ) škála Ag specifit výběr primerů (schopnost detekce DNA BB) funkce proteinů (NC_001318) G - transport a metabolizmus sacharidů J - translace, ribosomální struktura a biogeneze L - DNA replikace, rekombinace a oprava M biogeneze buněčného obalu, vnější membrány O - posttranslační modifikace, proteinové přeměny, chaperony R hlavní funkce je pouze předpokládána U neznámá funkce

sacharidů J - translace, ribosomální struktura a biogeneze L - DNA replikace, rekombinace a oprava M biogeneze buněčného

10 - Borrelia burgdorferi B31 NC_001318, lineární dsdna, délka bp, 874 genů, 21 plazmidů (9 lineárních a 12 cirkulárních) 93 % kódujících sekvencí, GC obsah 28 %, 23 strukturálních RNA - Borrelia afzelii PKo NC_008277, lineární dsdna, délka bp, 894 genů, 8 plazmidů (6 lineárních a 2 cirkulárních) - Borrelia garinii Pbi NC_006156, lineární dsdna, délka bp, 904 genů, 2 plazmidy (1 lineární a 1 cirkulární)

afzelii PKo NC_008277, lineární dsdna, délka 905 394 bp, 894 genů, 8 plazmidů (6 lineárních a 2

11 Výběr primerů 1. PCR 1989 (chromozomální gen) publikováno o mnoho sekvencí primerů rů z různých genů - chromozomální m oblast 5S/23S rrna, reca, flagellin - plazmidová oblast OspC, OspA komerční kity nejčastěji flagelin. gen (FlaB) př. QIAGEN, GeneProof, Dynex

12 flagellin flagellin bičík BB se skládá ze 2 podjednotek FlaA (37 kda) a majoritního FlaB = flagellar filament 41 kda core protein, velikost genu 1011, proteinu 336 AMK, imunogenní protein, chemotaxe a motilita (v závislosti na teplotě) OspC (reduktin) outer surface protein C, 21 až 25 kda, umístěn na cirkulárním plazmidu cp26, dominantní povrchový Ag (velikost genu 633, proteinu 210 AMK), 21 různých typů, aktivace v závislosti na teplotě, průnik BB do slin. žláz, slin OspA (adhezin) - 31 kda, lieární plazmid lp54, povrchový Ag (gen 822, protein 273 AMK), fce vazba na střevo, shlukování BB další proteiny vnější membrány (OspB 34 kda, OspD 28 kda, OspE 19 kda a OspF 26 kda) VlsE variable major like sequence E, umístěn na cirkulárním plazmidu lp28-1, povrchový Ag, BB neustále mění povrchově exprimovaný VlsE snaha uniknout rozpoznání a eliminaci imunitním systémem

motilita (v závislosti na teplotě) OspC (reduktin) outer surface protein C, 21 až 25 kda, umístěn na cirkulárním plazmidu cp26, dominantní povrchový Ag (velikost genu 633, proteinu 210 AMK), 21

13 Klíště hypostom průnik do kůže, vylučování slin tvorba cementové zátky, látky potlačující lokální imunitu, tišící bolest, bránící í srážení krve (ixodin) apod. navíc buňky hostitele produkují histamin, ale ve slinách klíště bílkovin. látku, která ho vyváže ranka nebolí, nesvědí střevo klíštěte - ukotvení BB v epitelu střev pomocí OspA sání krve teploty a ph exprese OspA (odpoutání BB od epitelu střeva) exprese OspC (průnik spirochét do slinných žláz přibližně po 24 hod.) krev v těle klíšťat zahuštěna a sliny, přebytečná voda spolu s BB zpět do hostitele IO klíčové postavení subsetů TH lymfocytů - aktivace TH2 T-lymfo časná a dostatečná produkce specif. Ab a eliminace BB - aktivace TH1 T-lymfo odpovědná za buňkami zprostředkovanou cytotoxickou reaktivitu, nevede k eliminaci BB, možnost perzistence (hypotéza plazmidy)

látku, která ho vyváže ranka nebolí, nesvědí střevo klíštěte - ukotvení BB v epitelu střev pomocí OspA sání krve teploty a ph exprese OspA (odpoutání BB od epitelu střeva) exprese OspC (průnik

14 Validace metody detekce DNA BB a IC v jedné zkumavce (multiplex realtime PCR) IC HLA-DQ gen srovnatelná ná s publik. závěry 0,39 pg/ml

15 Porovnání různých metod DYNEX

16 Kontrola kvality - VKK pozitivní, í negativní a inhibiční hbč kontrola nutnost real-time PCR možnost sledování rozmezí SD a 1 řádu standardizace metody

17 EX YN.D W W W Z.C

18 kontrola 25 org./ml Kontrola kvality - VKK kontrola 10 org./ml

19 EHK - INSTAND e. V. Kontrola kvality mezilaboratorní porovnání (reprodukovatelnost) r laboratoří ověření metody (validace) komutabilita EHK vzorků????

20 Soubor pacientů 2007 CSF x krev 1 : CSF x krev 7 : 3 za 15 měsíců vyšetřeno 1822 materiálů likvorů (63,2 %), 609 krví (33,4 %) a 62 jiných materiálů (3,4 %) - punktát kolene, moč, vzorek kůže, cysta 17 vzorků pozitivních (0,9 %) - 14 likvorů, 1 krev a 2 kolenní punktáty u 4 vzorků přítomnost inhibitorů DNA polymerázy (0,2 %)

%) - punktát kolene, moč, vzorek kůže, cysta 17 vzorků pozitivních (0,9 %) - 14

21 Závěr PCR není v dg. LB 100% negativní výsledky nevylučují onemocnění X pozitivní výsledky onemocnění potvrzují nutnost výběru pacientů, resp. načasování odběru, výběr biologického materiálu, dodržení preanalytické fáze v laboratoři udělat maximum (validní výsledky) klinická korelace PCR je neuspokojivá

22 Děkuji za pozornost

Podobné dokumenty

Plíšková L. Ústav klinické biochemie a diagnostiky LF a FN Hradec Králové

PCR v diagnostice Lymeské boreliózy Plíšková L. Ústav klinické biochemie a diagnostiky LF a FN Hradec Králové obtížná Diagnostika lymeské boreliózy klinický obraz velmi rozmanitý anamnestické údaje (přisátí