Campylobacter jejuni/coli

Transkript

1 Campylobacter jejuni/coli

2 Campylobacter jejuni

3 Campylobacter spp. úvod Termotolerantní kampylobaktery známe jako významné původce alimentárních onemocnění teprve posledních 20 let. Roční incidence kampylobakterióz se v humánní populaci pohybuje kolem 210 případů na obyvatel. C.jejuni patří k nejvýznamnějším druhům tohoto rodu postinfekční syndrom Guillain-Barré

4 Campylobacter Gram negativní, zkřivená, tvar S nebo sférická tyčinka Mikroaerofilní / 5-10% O2 3-5%CO2 Pohyblivá Neroste pod 30 oc Hlavní lidské patogeny: C.jejuni a C. coli Některé druhy působí systémové onemocnění C. concisus

5 Úvod Rod Campylobacter - zakřivená bakterie 0,2-0,5 μm široká, 0,5-8,0 μm dlouhá původně rod Vibrio Gram-negativní, nesporulující, oxidasa pozitivní, indol negativní, nefermentuje ani neoxiduje sacharidy, energii získává se metabolismem aminokyselin. GC obsah kolísá pro jednotlivé druhy mezi mol%. Vibrio fetus - původce potratů u ovcí, dysenterie hospodářských zvířat od 50.let organismus izolován z krve pacientů a označen jako podobný Vibriu Sebald a Veron Campylobacter

6 Kultivace ze stolice pacientů v 80. letech pokračovala taxonomická upřesnění mnoha druhů, která pokračuje dodnes Campylobacter pylori a Campylobacter mustelae (Goodwin et al.1989) přejmenován na Helicobacter pylori a H. mustelae Sekvence 5S a 16S rrna pomohly k rozlišení současných druhů

7 Zařazení rodu Campylobacter Kmen Proteobacteria Třída Epsilonproteobacteria Řád Campylobacteriales Čeleď Campylobacteraceae Rod Campylobacter

8 Taxonomie Bakterie rodu Campylobacter (čeleď Campylobacteriaceae) jsou charakterizovány následovně: Gram negativní, mikroaerofilní, malé spirálkovitě zahnuté tyčinky s charakteristickým vývrtkovitým pohybem Jsou oxidáza pozitivní s negativní reakcí na indol, redukují nitráty, ale nefermentují uhlohydráty K termotolerantním kampylobakterům (schopnost růstu při 42 C) patří C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis a C. lari

9 campylobacter

10 Kritické teploty Všechny druhy rodu Campylobacter rostou při 37 oc C. jejuni a C.coli mají optimum mezi oc C. jejuni a C.coli nerostou při 28 oc Mohou přežít v mléce a vodě při 4 oc Rovněž mohou přežít v mrazení drůbeže Za nepříznivých teplotních a dalších podmínkách v prostředí mění fyziologii a tvoří viable non-culturable formy VBNC Resuscitace VBNC probíhá v živočišném hostiteli.

11 Campylobacter přežívání v potravinách Teplota v rozmězí 30 42/45 oc Velmi citlivý na teplotu Usmrcen pasterizací ph nejnižší hodnota při které je shopen růstu je 4,5 aw Je citlivý vůči NaCl v koncentraci 1-2% v závislosti na na teplotě a druhu potraviny Atmosféra Mikroaerofilní redukované hladina kyslíku, zvýšená hladina CO2, růst je podporován H2

12 Campylobacter Zdroje infekce: domací a volně žijící zvířata a ptáci Syrové mléko je hlavní zdroj infekce in USA, drůběž in UK Infekční dávka je velmi nízká, v potravině se nerozmnožuje Obecně je v současné době více rozšířen než salmonela, hlavně na jaře a v ůlétěu dětí a starších lidí Pathogenese není ještě dostatečně popsána, a není jasné, který toxin je produkován

13 Campylobacter přežívání v potravinách Teplota v rozmězí 30 42/45 oc Velmi citlivý na teplotu Usmrcen pasterizací ph nejnižší hodnota při které je shopen růstu je 4,5 aw Je citlivý vůči NaCl v koncentraci 1-2% v závislosti na na teplotě a druhu potraviny Atmosféra Mikroaerofilní redukované hladina kyslíku, zvýšená hladina CO2, růst je podporován H2

14 Campylobacter Zdroje infekce: domácí a volně žijící zvířata a ptáci Syrové mléko je hlavní zdroj infekce v USA, drůbež v UK Infekční dávka je velmi nízká, v potravině se nerozmnožuje Obecně je v současné době více rozšířen než salmonela, hlavně na jaře a v létě u dětí a starších lidí Pathogenese není ještě dostatečně popsána, a není jasné, který toxin je produkován

15 Patogeneze Po požití kontaminované potravy pronikají bakterie do tenkého střeva, kde se množí. Bakterie adherují ke střevní sliznici v proximální části tenkého střeva a produkují toxin, toxin který proniká do lymfatického a krevního oběhu. U některých postižených osob se onemocnění vyvíjí v až v hemoragickou enteritídu a ulcerativní změny v kolonu. U tekutin (voda, mléko) je průchod žaludkem rychlý a tím se zvyšuje množství živých buněk, které pronikají do tenkého střeva, kde se pomnožují.

16 Patogeneze Po požití kontaminované potravy pronikají bakterie do tenkého střeva, kde se množí. Bakterie adherují ke střevní sliznici v proximální části tenkého střeva a produkují toxin, toxin který proniká do lymfatického a krevního oběhu. U některých postižených osob se onemocnění vyvíjí v až v hemoragickou enteritídu a ulcerativní změny v kolonu. U tekutin (voda, mléko) je průchod žaludkem rychlý a tím se zvyšuje množství živých buněk, které pronikají do tenkého střeva, kde se pomnožují.

17 Patogeneze Infekční dávka je u zdravého člověka přibližně bakterií Inkubační doba je nejčastěji udávána 2-5 dní Příznaky onemocnění jsou horečka, intenzivní bolesti břicha, průjem

18 Výskyt v prostředí a v potravinách K nejpravděpodobnějším způsobům infekce člověka patří: nízká hygienická úroveň při manipulaci se syrovou drůbeží v domácnostech i v provozech veřejného stravování a skladování drůbeže v lednici společně s ostatními potravinami určenými k přímé spotřebě, kontaminace pracovních ploch a kuchyňského náčiní při porcování a zpracováním drůbeže před tepelnou úpravou Vzhledem k nízké infekční dávce je možný i přímý přenos kontaminovanýma rukama např. při přípravě syrového masa z matky na dítě nebo při hře s domácími zvířaty.

19 Výskyt v potravinách K nejčastěji kontaminovaným potravinám patří: syrové maso (drůbeží, vepřové) syrové mléko některé mražené potraviny (zelenina)

20 Taxonomie Campylobacter a Helicobacter Druh C.fetus C.jejuni C.coli C.laridis C.upsaliensis C.hyointestinalis C.mucosalis C.cinaedi C.fennelliae C.sputorum C.concisus C.cryaerophila C.nitrofigilis H.pylori H.mustelae Poddruh Biovar fetus,venerealis jejuni,doylei sputorum,bubulus,faecalis

21 Vliv technologií Sušení je účinným prostředkem k eliminaci kampylobakterů. Použití organických kyselin redukuje počty kampylobakterů a proto je v některých státech na jatkách před chlazením drůbeže zařazeno ošetření povrchů těl kyselinou mléčnou nebo octovou.

22 Výskyt v prostředí a v potravinách Termotolerantní baktérie rodu Campylobater se vyskytují ve střevním traktu domácích i volně žijících teplokrevných zvířat často bez klinických příznaků onemocnění. Těmito baktériemi může být člověk infikován buď: přímo (např. přímým kontaktem se zvířetem) nepřímo kontaminovanou vodou, potravinou C. jejuni bývá velmi často izolován z drůbeže i volně žijících ptáků. C. coli převažuje u prasat nad C. jejuni C. lari bývá izolován z volně žijících ptáků, převážně racků C. upsaliensis bývá izolován vzácně a to např. z faeces domácích mazlíčků (např. psů a koček).

23 Odolnost kampylobakterů vůči vnitřním a vnějším faktorům optimální teplota je 42 C, minimální teplota růstu je 32 C, maximální 45 C, hraniční hodnota aktivity vody pro množení je od 0.98 rozmezí hodnot ph při kterých se mohou pomnožovat jsou od , optimum je při neutrálním ph, koncentrace soli nad 1,5 % působí baktericidně optimální složení atmosféry pro růst kampylobakterů je 5 % O % CO % N bakterie rodu Campylobacter jsou citlivé k většině desinfekčních látek včetně chlorových preparátů (chlorování pitné vody je vhodnou obranou proti onemocnění)

24 Vliv technologií Bakterie rodu Campylobacter jsou málo odolné k vnějšímu prostředí, nepřežívají za přítomnosti kyslíku a v suchém prostředí (živé, ale nekultivovatelné formy). my) Sterilační ani pasterační teploty nepřežívají, Chlazení působí zastavení růstu, ale zlepší přežívání buněk v porovnání s pokojovou teplotou Mrazením je v potravinách počet kampylobakterů redukován, ale ne eliminován a baktérie mohou za příznivých podmínek přežívat i několik měsíců.

25 Izolace a identifikace Mnoho typů nabohacovacích medií bylo testováno Prestonovo medium Směs antibiotik: polymyxin B, trimethoprim,a další Kultivační media obsahují vychytávače kyslíku, krev, FPB (směs FeSO4, Na2S2O5, Na pyruvát) + směs antibiotik

26 Typical Formula*gm/litre Meat peptone 10.0 Lactalbumin hydrolysate 5.0 Yeast Extract 5.0 Sodium chloride 5.0 Alpha-ketoglutaric acid 1.0 Sodium pyruvate 0.5 Sodium metabisulphite 0.5 Sodium carbonate 0.6 Haemin 0.01 ph 7.4 ± 25 C

27 Obsah 1 vialky každá stačí na 500ml media na 1 vialku na 1 litr Cefoperazone 10,0 mg 20,0 mg Vancomycin 10,0 mg 20,0 mg Trimethoprim. 10,0 mg 20,0 mg Cycloheximide 25,0 mg 50,0 mg Návod 13,8 g Boltonova media do 500 ml destilované vody. Sterilizace v autoklavu při 121 C po 15 min. Ochladit na 50 C. Asepticky se přidá 25ml Laked Horse Blood SR0048 a 1 vialka Bolton Broth Selective Supplement SR0183, rozpustí se podle návodu. Dobře se promíchá a rozdělí se do sterilních lahviček se šroubovacím uzávěrem.

28 Vzhled kolonií a buňky Karmali agar

29

30 Podstata zkoušky ČNS ISO Zkušební vzorek (x g nebo x ml) buď + 9x bujon podle Prestona nebo 9x bujon podle Parka a Sanderse přímé vyočkování výchozí suspenze pomnožení - inkubace inkubace za mikroaerofilních podmínek (42oC, 18 h) Vyočkování za mikroaerofilních podmínek (32oC, 4 h) přidání roztoku antibiotik B agar podle Karmaliho a 2.selektivní půda inkubace za mikroaerofilních podmínek (37o C, 2h) inkubace za mikroaerofilních inkubace za mikroaerofilních podmínek (42o C, až 72 h) podmínek (42o C, až 42h) 5 charakteristických kolonií další testy a vyjádření výsledků

31

32 Jaké mikroorganismy nyní sledujeme? Listeria monocytogenes Salmonella Enterobacter sakazakii Escherichia coli Koagulasa-pozitivní stafylokoky Bacillus cereus Enterobacteriacae

33 Enterobacter sakazakii Cronobacter sakazakii

34 Kontaminace kojenecké mléčné výživy Enterobacter sakazakii je jednou z vysoce virulentních baktérií, také Salmonella sp. + Clostridium byly nalezeny ve výrobcích kojenecké mléčné výživy Sušená kojenecká mléka NEJSOU sterilní výrobky Mohou být kontaminovány při výrobě patogenními baktériemi rezistentními vůči teplu

35 Americký úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) varoval, že 14% z testovaných sušených kojeneckých mlék bylo kontaminováno E. sakazakii a že: Klinici by si měli být vědomi toho, že sušená kojenecká mléka nejsou sterilní výrobky a mohou obsahovat bakteriální patogeny Duben

36 Komise Codex Alimentarius Je společnou komisí FAO/WHO, která stanovuje standardy pro složení a bezpečnost potravin Jedním z výborů komise je Codex Committee on Food Hygiene (CCFH) CCFH se setkává každý rok ve Washingtonu. V roce 2005 se sešel v Buenos Aires v Argentině

37 CODEX - Profily rizika Codex požádal zástupce USA a Kanady, aby připravili Profil rizika pro Enterobacter sakazakii; který byl pak revidován v roce 2003 Profil rizika stanovil závažnost problému a zpochybnil platnost současných mikrobiologických standardů Codexu, zvláště pro novorozence a zranitelné kojence

38 E. sakazakii je přítomen v některých sušených kojeneckých mlékách, bylo prokázáno, že tato mléka způsobila onemocnění u novorozenců, a tato onemocnění mohou ohrožovat život dítěte. Tato skutečnost je dostatečnou pobídkou k vážnému zamyšlení nad vhodnými strategiemi ke snížení tohoto zdokumentovaného rizika. Souhrn Profilu rizika

39 Hlášené případy Červenec 2005 : Enfamil AR (Mead Johnson) kontaminovaný E. sakazakii hlášen v Argentině Leden 2005: Aptamil (Numico/Milupa) kontaminovaný E. sak., výrobek zakázán v Brazílii na dobu 6 měsíců Říjen 2004: : Pregestimil (Mead Johnson) kontaminovaný E. sak. Způsobil úmrtí kojenců ve Francii: celosvětové hlášení

40 Výrobci vlastní výzkum 2004 Nestlé Research Centre - E. sak. zjištěn ve vzorcích z prostředí u 8 z 9 potravinářských výroben, 4 z nich byly továrny na výrobu sušených mlék..

41 Zlepšení testů a detekce Nestlé Research Centre vyvinuli nový, senzitivnější test Analýza 192 vzorků z prostředí ze 4 různých továren na výrobu sušeného mléka Při použití starého USFDA testu zjištěno 26 % vzorků kontaminovaných E. sak. Při použití nového testu byl E. sak. zjištěn u téměř 40 % odebraných vzorků

42 Brány kontaminace Čerstvé mléko - transport a skladování Pasterizace a sušení + příprava směsi Plnění do obalů a skladování Příprava nápoje ze sušeného prášku

43 Pracovní skupina pověřená výborem (CCFH) Výbor pověřil pracovní skupinu provedením revize kodexu praxe a vypracováním mikrobiologických kritérií Tato Pracovní skupina Codexu je vedena kanadskými zástupci a je zastoupena účastníky z Belgie, EU, Francie, Německa, Itálie, Japonska, Nizozemí, Španělska, Švýcarska, UK, USA a Uruguay Plus NGOs jako jsou skupiny IBFAN a zastupující průmysl

44 Rezoluce WHA Vyzývá členské státy, aby zajistily, že kliničtí a ostatní zdravotničtí pracovníci, rodiny a rodiče a další opatrovníci budou informováni o tom, že sušená kojenecká mléka mohou obsahovat patogenní mikroorganismy a musí být připravována a používána správným způsobem; tato infomace by měla být součástí výslovného varování na obalu výrobků, kterých se to týká ;

45 INFOSAN International Food Safety Authorities Network (leden 2005) Nekojené děti informace poskytovaná matkám by měla zahrnovat instrukce pro správnou přípravu a upozornění na rizika z nevhodné přípravy a použití výrobku Doporučená příprava kojeneckou vodu přivést k bodu varu a nechat ochladit během několika minut na teplotu st. C, rozmíchat prášek a směs ochladit na tělesnou teplotu, zkrátit dobu mezi přípravou a konzumací, nepoužité zbytky mléka vyhodit

46 Enterobacter sakazakii Systematické zařazení Říše:Bakterie Kmen:Proteobakterie Třída:Gamma Proteobakterie Řád:Enterobacteriales Čeleď:Enterobacteriaceae Rod: Enterobacter Rod:Cronobacter od r.2007

47 Enterobacter sakazakii - vlastnosti Gramnegativní, fakultativně -anaerobní, oxidasa negativní, Katalasa pozitivní, tyčinkovitá bakterie, čeledi Enterobacteriaceae. Pohyblivé, redukuje nitrát, utilizuje citrát, hydrolyzuje eskulin a arginin, také dekarboxylují L-ornithin. Kyseliny tvoří z D-glukosy, D-sukrosy, D-raffinosy, Dmelibiosy, D-cellobiosy, D-mannitolu, D-mannosy, Lrhamnosy, L-arabinosy, D-trehalosy, a D-maltosy. Cronobacter má pozitivní reakci na produkci acetoinu ( Voges Proskauer ) a negativní test na methyl červeň

48 Variabilita D hodnot pro 2 kmeny Enterobacter sakazakii zahřáté na 58 C Survivors [Log(CFU/mL)] 9 8 D = sec D = 30.5 sec Heating Time (sec)

49 Porovnání D58 C-Values pro různé Enterobacteriaceae E. sak azakii D-value (sec) E. coli O157:H7 E. sak azaki N&Fpooled K. pneuomoniae Salm onella Hartford E. coli E. aerogenes E. sak azakii 51329

50 Distribution of D58 C-values for 12 Enterobacter sakazakii strains 6 # of Strains D-value (sec)

51 Effect of Heating Temperature on D-Value for E. sakazakii 607 D-Value (sec) Heating Tem perature (C) 70

52 Reported Z-values Nazarowec-White and Farber (1997) Pooled food isolates: 5.6 C Pooled clinical isolates: 6.0 C All: 5.8 C Edelson-Mammel and Buchanan (2003) Strain 607: 5.6 C

53 Predicted Inactivation 100 Tim e to 5D inactivation (sec) Results of these heating trials indicate that heating rehydrated infant formula at 70 C for even a few seconds will result in a substantial inactivation of E. sakazakii ,1 0,01 0,001 Tem perature (C)

54 Effectiveness of Pasteurization 3 sec 10 sec 16 sec 30 sec 60 sec 59 C C C C C C C C C C 0.063

55 Resistances If Like Other Enterobacteriaceae Not heat resistant Moderate acid resistance if adapted Moderate alkali resistance if adapted Low to moderate chlorine resistance Low to moderate irradiation resistance Will remain viable in refrigerated and frozen products for extended periods, particularly if neutral ph Moderate to good resistance to drying

56 Surviving P opulation [Log(CFU/ m L)] Resistance to Dehydration 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2, Storage Tim e (m on) 8 10

57 Cronobacter sakazakii Modročerné kolonie na chromogenní půdě biomerieux Existuje ISO norma k průkazu C. sakazakii.

58 Escherichia coli Systematické zařazení Říše:Bakterie Kmen:Proteobakterie Třída:Gamma Proteobakterie Řád:Enterobacteriales Čeleď:Enterobacteriaceae Rod: Escherichia Druh: Escherichia coli

59 Escherichia coli E. coli náleží do čeledi Enterobacteriaceae. Katalasa-pozitivní, oxidasa-negativní, fermentativní, krátká Gram-negativní, nesporulující tyčinka, obvykle s bičíky,které jsou peritrichní. Často tvoří pouzdra (capsule) nebo mikrokapsule.

60 Escherichia coli

61 Záchyt Escherichia coli

62 TBX CHROMOGENNÍ AGAR Selektivní medium pro detekci a zjištění počtu Escherichia coli v potravinách

63 Chromogenní půda pro koliformní bakterie Escherichia coli Citrobacter freundii

64 Princip chromogenních půd

65 Escherichia coli Enterotoxigenní (ETEC), Enteroinvasivní (EIEC), Enteropatogení (EPEC), Enterohemoragický (EHEC), Enteroaggregativní (EaggEC), Adherentní E. coli (DAEC)

66 Úloha bakterií v gastrointestinálním traktu

67 Atypické enteropathogenní E.coli ATEC

68 Přehled dalších patogenů přenášených potravinami Aeromonas hydrophila Brucella Clostridium botulinum Clostidium perfringens Mycobacterium Plesiomonas shigelloides Shigella Vibrio Yersinia enterocolitica

69