VZTAH GENOTYPU A FENOTYPU

Transkript

1 Teoretický úvod: VZTAH GENOTYPU A FENOTYPU Praktikum fyziologie rostlin 1

2 Teoretický úvod: VZTAH GENOTYPU A FENOTYPU Zajisté jste už slyšeli pojmy forward - pímá a reverze - zptná genetika. Tyto pojmy odrážejí pracovní strategie, kterými se dopracujeme k poznatku, resp. teorii. Forward genetika zahrnuje strategie mnohem starší. Pi jejím uplatování nás zajímá konkrétní dj (resp. fenotyp) a cílem je odhalení gen, které jsou pro tento dj dležité. Vycházíme z velkého potu semen s náhodn vnesenými mutacemi, ze kterých vybereme semena s mutacemi pro nás zajímavými 1. Tato fáze se nazývá forward screen. Pokud by nás napíklad zajímala skotomorfogeneze (vývoj rostliny v tm), vysejeme statisíce semen a budeme je pstovat ve tm. Za zajímavé budeme považovat ty, které rostou stejn, jako kdyby byly na svtle. V další, komplikované fázi budeme hledat, ve kterém genu je naše zajímavá mutace (dlá se to teba kížením s již popsanými mutacemi a poítáním genetické vazby). Pak osekvenujeme (peteme sekvenci celého úseku pomocí sekvenaní PCR a sekvenátoru) místo, ve kterém by se mutace mla nacházet. Pro kontrolu pak zjištný gen naklonujeme (bez mutace) a natransformujeme do mutantní rostliny, která ztratí fenotypový projev této mutace. Takto byly teba popsané mutanty COP a DET (od COnstitutive Photomorphogenesis a DE-eTiolated). Reverzní genetika je celá opravdu naruby. Již nehledáme geny odpovdné za fenotyp, ale obrácen ptáme se, jakých dj se úastní produkt našeho genu (tj. genu, který nám z nejrznjších dvod nedá spát)? Pro tento pístup se užívá tzv. T-DNA inzerních mutant. T-DNA je tzv. transferová DNA, vnášená Agrobakteriem vícemén náhodn do genomu hostitelské rostliny. Po jejím zalenní do genomu T-DNA rozruší pvodní sekvenci. T-DNA je peliv navržená a asto obsahuje další geny, teba geny kódující rezistenci k herbicidu. Lokalizovat T-DNA inzerci v genomu není tak obtížné jako pi bodových mutacích, a to pomocí sekvenace z oligonukleotidu nasedajícího pímo na T-DNA. Dnes existují laboratoe specializující se na masivní produkci popsaných T-DNA inzerních linií Arabidopsis, a proto není problém najít a objednat si i nkolik T-DNA inzerních linií v genu, 1 asi vám zcela správn vrtá hlavou, jak to, že mutace je najednou v obou chromozomálních sadách. Trik spoívá v použití haploidních rostlin odvozených z pylu, které zaruí, že v další generaci bude mutace v obou chromozomálních sadách. 2

3 který nás zajímá 2. Práce se tak hodn urychluje pvodní otázku jakých dj se úastní náš gen, tedy zaneme ešit tak, že si prost mutanta objednáme a zkoumáme fenotypový projev mutace. Fenotypový projev se ovšem projeví pouze u rostlin, nesoucích mutaci v obou chromozomálních sadách. Proto je zapotebí metody, kterou rychle a nenáron zjistíme pítomnost T-DNA inzerce v každé chromozomální sad. Obecn se tento postup nazývá genotypování.!"#!"$ Rostliny, narozdíl od živoich, postrádají klasický imunitní systém produkující speciální buky jako T-lymfocyty, které napadají a eliminují patogeny. Obranné strategie rostlin jsou jiné. Jedna z tch, která má analogii u živoich, je indukce programované bunné smrti (programmed cell death dále jen PCD). U rostlin se tento fenomén nazývá hypersenzitivní reakce (HR). Vzniká v míst vniku patogena a šíí se, až vytvoí malou lézi mrtvých bunk. Jejím úelem je izolace patogena od zdravých bunk. Jak celý tento dj probíhá? Rostliny jsou vybavené tzv. R-proteiny (R od rezistence odolnost). Tyto receptory jsou odpovdné za vnímání patogenem produkovaných látek - elicitor. Elicitorem mohou být rzné látky, které patogeny vyluují a kterými se patogen prozradí. Napíklad to mže být toxin, fragment flagellinu, složka bakteriální stny anebo enzym, který bakterie vpravila do rostliny (známé jsou teba cysteinproteázy). R proteiny pak vyvolají aktivaci gen, které vedou k ad odpovdí, mezi které patí zvýšení koncentrace kyseliny salicylové (SA). Kyselina salicylová je rostlinný hormon nezbytný k vyvolání HR. V pítomnosti salicylové kyseliny se do jádra buky pemísuje protein NPR1, který aktivuje syntézu ady gen, které jsou nezbytné pro HR. NPR1 také indukuje syntézu ady obranných protein, jakými jsou teba PR proteiny (pathogenesis - related). PR proteiny jsou obvykle glukanázy, chitinázy a jiné enzymy poškozující bakteriální bunnou stnu. Ty se obvykle ukládají ve vakuole, nebo jsou vyluované ven z buky. 2 souhrn dat z rzných databází najdete na Zkuste si teba najít gen s kódem At5g64850 (zadejte do políka query a zmáknte search). Kolik T-DNA inzercí vidíte? 3

4 Obr. 1. Souhrnné schéma prbhu odpovdi buky na pítomnost patogena Samotná hypersenzitivní reakce je provázena nejdíve pohybem iont výdejem (effluxem) draselných a hydroxylových iont a píjmem (influxem) vápníkových a vodíkových iont. Zastaví se pohyb cytoplazmy, piemž aktinový cytoskelet zstává funkní, zmizí kortikální mikrotubuly. V této fáze taktéž pozorujeme fragmentaci jaderné DNA, která je typickým projevem PCD. Pak ve fázi prudké oxidace (oxidative burst) buka vytvoí vysoké koncentrace reaktivních forem kyslíku (ROS reactive oxygen species; H 2 O 2. 4 OH -., O 2 - ). Plazmatická membrána ztrácí semipermeabilitu a buka kolabuje. Do bunné stny se uvolní reaktivní formy kyslíku, které zpsobí její autofluorescenci pozorovatelnou mikroskopem pod UV. V rostlinné bunné stn se nacházejí proteiny bohaté na prolin, které jsou po psobení reaktivních forem kyslíku zesíovány, ímž bunnou stnu vyztuží, a posílí tak obranu ped patogenem. Viz Obr.1. Hypersenzitivní reakcí v míst patogena není imunitní odpov rostliny zdaleka u konce. Kyselina salicylová se dále šíí cévním systémem z místa napadení do celé rostliny, kde v prbhu nkolika dn indukuje tzv. získanou systemickou imunitu (systemic acquired resistance). Ta spoívá v píprav na patogena, rostlina zane syntetizovat fytoalexiny a PR

5 proteiny. Fytoalexiny pedstavují skupinu nejrznjších sekundárních metabolit, které mají spolené to, že mají antimikrobiální vlastnosti a syntetizují se v okolí výskytu patogena. Spolu s SA rostlina syntetizuje také volatilní látku - methylester kyseliny salicylové, která se šíí vzduchem. Je vnímán okolními rostlinami jako signál o výskytu patogena. Mutace, jejíž pítomnost budeme detekovat, se nachází v kódující oblasti genu s názvem Exo70B1. Tuto mutaci jsme pracovn pojmenovali exo70b1-2. Funkce proteinu kódovaného genem Exo70B1 zatím zstává objasnna jenom ásten, je však pravdpodobné, že tento gen se úastní vezikulárního transportu do vakuoly. Vakuola je hlavním místem pro degradaci nejen kyseliny salicylové, ale i jiných fytohormon. Mutace v genu Exo70B1 zpsobí, že kyselina salicylová se zane nekontrolovan hromadit v cytoplazm, což má za následek náhodný vznik hypersenzitivní reakce na listech. Ta se projeví tak, že na rostlinách se zanou objevovat nejdíve malé léze (Obr.2), které se rozrstají, až v koneném dsledku odemou rostlin tém všechny listy. Léze se objevují kolem 4-5 týdne vývoje rostlin v závislosti na svtelných podmínkách. To, že jde o hypersenzitivní reakci, mžeme dokázat detekcí hladiny kyseliny salicylové anebo také sledováním intenzity transkripce gen charakteristických pro hypersenzitivní odpov, jakým je teba gen PR1, kódující jeden z PR protein (Obr.3). Obr. 3a. Semikvantitativní RT-PCR pro detekci míry exprese genu PR1 s kontrolou aktin Obr. 2. Vzhled mutanta exo70b1-2 (homozygot) v porovnání s rostlinou bez této mutace (WT, odvozeno od wild-type) Obr.3b. Analýza fytohormon u WT a exo70b1-2 SA- kys. salicylová JA- kys. jasmonová JA-ILE jasmonát izoleucin 5

6 Zadání praktických úloh k tématu: VZTAH GENOTYPU A FENOTYPU Pehled úloh k vypracování: Úkol 1: Porovnejte genotyp a fenotyp kontrolních a mutantních rostlin Arabidopsis thaliana 1a) Ovte pítomnost normální nebo mutantní alely genu pro podjednotku exocystu Exo70B1 u rostlin Arabidopsis thaliana pomocí metody PCR 6

7 Praktické úlohy: VZTAH GENOTYPU A FENOTYPU Úkol. 1: Porovnejte genotyp a fenotyp kontrolních a mutantních rostlin Arabidopsis thaliana Cíl: Seznámit se s technikou genotypování rostlinného materiálu, odlišit pítomnost mutantní alely v homozygotní píp. heterozygotní linii a následn ovit, zda stanovený genotyp odpovídá fenotypu Hypotéza, kterou v prbhu práce ovíme: Vedle možnosti odlišit transgenní rostliny na základ fenotypového projevu lze prokázat pítomnost vnesené alely pomocí metody genotypování. Dílí úlohy: 1a) Ovte pítomnost normální nebo mutantní alely genu pro podjednotku exocystu Exo70B1 u rostlin Arabidopsis thaliana pomocí metody PCR Princip: Náš mutant nese T-DNA inzerci v kódující oblasti genu Exo70B1, o které(m) jste se dozvdli víc v pedchozí kapitole. Pro zjištní genotypu experimentálních rostlin budeme používat detekní PCR 3. Celkov budeme dlat pro každý vzorek 2 reakce a použijeme 3 primery (Obr.4). V první reakci použijeme 2 z tchto primer zelená (levý primer - LP) a modrá šipka (pravý primer - RP) na obrázku, nasedají (jsou pln komplementární) na místa v genomu, mezi kterými oekáváme mutaci. Bez inzerce jsou tato místa od sebe vzdálená cca 1000 bazí. V pípad, že T-DNA inzerce na míst není, reakce vyprodukuje PCR produkt o této velikosti (A). Pítomnost T-DNA inzerce zpsobí, že tyto primery se od sebe vzdálí až na cca 8000 bazí (z grafických dvod je nakreslena kratší). Tento PCR produkt je tak velký, že Taq DNA polymeráza ho nestihne dokonit v 1 cyklu. Proto tato reakce zstane bez produktu (B). 3 princip metody PCR zde nebudeme vysvtlovat do podrobností, jelikož jde o obecné znalosti studenta biologie. Pro toto praktikum nám bude stait zjednodušení, že pomocí PCR lze pomnožit (do takového množství, které lze snadno detekovat) libovolný úsek DNA, který je definovaný alespo dvma oligonukleotidy (cca bazí). Tyto oligonukleotidy se nazývají primery. 7

8 V druhé reakci použijeme opt pravý primer, levý však nahradíme jiným. Tento primer (ervená šipka, LB) nasedá pímo na T-DNA inzerci. V její nepítomnosti reakce pochopiteln nebude fungovat (C). Naopak, když je pítomná inzerce, spolu s pravým primerem vyprodukují produkt velký zhruba 500 bazí (D). A B C D 1000bp produkt 500bp produkt T-DNA inzerce Obr. 4. Schéma fungování rzných kombinací primer na templátové DNA bez inzerce (A,C) a s inzercí (B,D). Reakce, které neprobhnou, jsou oznaeny kížkem. Produkty PCR tchto dvou reakcí budeme vizualizovat pomocí elektroforézní separace v agarózovém gelu. Z rzných kombinací produkt pak usoudíme, jaký genotyp má zkoumaná rosltlina. Pítomnost 1000 bp fragmentu znamená pítomnost nemutované (+) alely v alespo jedné chromozomální sad. Stejn tak je to s 500bp fragmentem, jehož pítomnost znaí výskyt mutantní alely (-). Pokud tedy vidíme produkty oba, víme, že jde o heterozygota (+/-). Pokud vidíme jen 1000bp produkt, jde o rostlinu bez mutace. Pítomnost pouze 500bp produktu znamená, že rostlina má mutaci v obou sadách chromozom. Zde tedy lze oekávat fenotypový projev mutace. 1000bp 500bp +/+ +/- -/- Obr. 5. Interpretace výskytu PCR produkt na gelu. + : WT alela, - : mutovaná alela 8

9 Laboratorní postup: Poteby: 2 rostliny Arabidopsis thaliana (5 týdn staré) kontrolní a mutantní s pozmnnou sekvencí v genu Exo70B1 mikrozkumavky pinzeta a nžky mikropipety extrakní pufr (200mM Tris-HCl ph 7,5, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0,5%SDS) homogenizaní tyinky chloroform centrifuga vortex nádobka s ledem izopropanol roztok 2mM TRIS ph 8,5 PCR cycler sada oligonukleotid (primer) pro identifikaci kontrolní a mutantní alely 10x pufr pro PCR reakci (dodáván spolu s polymerázou) 10mM dntp Dream Taq polymeráza agaróza 1x roztok TBE (TRIS, kyselina boritá, EDTA) Roztok GelRed Barvika pro nanášení na gel (loading dye) Elektroforéza se zdrojem naptí, heben gelový dokumentaní systém (GEN-DOC), pípadn UV komora pro vizualizaci. Provedení úkolu: Izolace DNA 1. Rostliny si oznate (íslo skupiny, datum, vzorek). Pro oznaení použijte párátka. 2. Pipravte si poteby pro extrakci (nžky pinzetu, kelímek s vodou, mikrozkumavky, mikropipety se špikami, extrakní pufr, homogenizaní tyinky, chloroform). 3. Víkem 1,5 ml mikrozkumavky vyíznte koleko ze stedn velkého listu anebo odeberte z listu odpovídající plochu. Umístte do též mikrozkumavky. Mezi odbry omyjte nástroje v pipravené vod, abyste snížili riziko kížové kontaminace. 4. Do mikrozkumavky pidejte 400µl extrakního pufru a pomocí homogenizaní tyinky se pokuste materiál co nejpelivji rozmlnit. 5. K extrakní smsi pidejte 300 µl chloroformu a umístte na vortex. Tepejte 5 min. 6. Centrifugujte 3 min pi plném výkonu. Mezitím si pipravte nové zkumavky o shodném znaení. 9

10 7. Zkumavky opatrn vyjmte, aby nedošlo k promísení fází, a umístte do stojánku. Do nové zkumavky peneste cca 300 µl horní fáze. Pracujte opatrn, nesmí dojít k promísení se spodní fází, což by narušilo další postup izolace. 8. K extraktu pidejte 300 µl izopropanolu, promíchejte a umístte do pipravené nádoby s ledem, kde bude 10 min probíhat srážení DNA. 9. Centrifugujte 5 min pi maximálních otákách. Následn odstrate všechnu tekutinu slitím, ve zkumavce by ml být patrný opaleskující bezbarvý sediment viditelný pi pohledu proti svtlu. Sediment asto není vidt vbec! (není to dvod k opakování extrakce). Zkumavku otote dnem vzhru a umístte na buniitou vatu. Izolovanou DNA sušte pi pokojové teplot cca 10 min. Pozor! Je teba, aby nedošlo k pesušení! (vzorek by se pak špatn rozpouštl) 10. Sediment rozpuste ve 100 µl 2mM TRIS ph 8,5. DNA se uvolní do roztoku poklepáváním na zkumavku. 11. Ped odebíráním DNA templá z jednotlivých zkumavek krátce centrifugujte pípadné nerozpustné neistoty. Amplifikace DNA Celou pípravu PCR reakcí provádjte na ledu! DNA polymerázu skladujte ve vymrazovacím bloku! 1. Pipravte si oznaené mikrozkumavky pro PCR reakce (objem 150µl), pro každý vzorek 2 zkumavky. Je nutné uvést oznaení použitých primer (viz dále). 2. Z 2 pipravených smsí (vody, pufru, deoxynukleozidtrifosfát dntp, primer ohraniujících amplifikovanou sekvenci, DreamTaq polymerázy odpipetujte do zkumavek 19 µl. Dbejte na to, aby nedošlo k zámn použité smsi do odpovídajících zkumavek (liší se jen v sekvenci primer, které ohraniují bu kontrolní nebo mutantní alelu). Pipetujte pesn, v opaném pípad by nemuselo stait pro kolegy! 3. Do každé zkumavky pidejte 1 µl DNA templátu. Pozor, na každou zkumavku použijte novou špiku, aby se zabránilo pípadným kontaminacím. 4. Pipravené PCR reakce krátce centrifugujte, umístte zpt na led a vykejte, až budou ostatní skupiny hotové. 5. Umístte spolen do PCR cycleru, uzavete a spuste nastavený program. 6. Po skonení amplifikace budou vzorky zamraženy a skladovány pi -20 C do následujícího praktika. 10

11 Vizualizace DNA fragment pomocí gelové elektroforézy, porovnání s fenotypem 1. Do zkumavek s PCR reakcemi pidejte 4 µl nanášecí barviky (loading dye). 2. Na pipravený elektroforetický gel (1 % agaróza rozpuštná v 1x TBE pufru s pidaným interkalaním barvivem GelRed (1:10000)) s otvory pro nanášení vzork naneste v obou adách úpln vlevo standard molekulových hmotností (sms fragment DNA o známé velikosti, která slouží jako mítko testovaných fragment). Do každého otvoru naneste 10 µl smsi tak, že do horní ady umístíte z každé skupiny 2 vzorky s primery pro identifikaci kontrolní alely a do spodní ady 2 vzorky s primery pro identifikaci mutatní alely. Pracujte rychle, aby se minimalizoval vliv difúze vzork v gelu! 3. Elektroforézu zakryjte víkem a pipojte ke zdroji naptí. Pozor, je nutno pamatovat na to, že vzorek se pohybuje od katody k anod!! Nastavte naptí 90 V a spuste. 4. Po cca ½ - ¾ h reakci zastavte, vyjmte gel, peneste do komory gelového dokumentaního systému a zhotovte fotografii. 5. Porovnejte získaná data z PCR amplifikací DNA a fenotypu vašich rostlin. Po penesení rostlin na krátký den se bhem 14 dní mutantní fenotyp projeví výskytem lézí na listech. Otázky: Co by ste stalo, kdyby v dsledku málo pelivé práce došlo ke kontaminaci DNA polymerázy vaším vzorkem DNA? Jaké by byly dsledky pro váš tým? K jakému pólu se pohybuje DNA v elektroforéze a pro? Kolik kopií DNA fragmentu teoreticky vznikne pi reakci, která má 30 cykl a v templátu se nachází 100 molekul templátu? 11