PROTEOMIKA 2017 SHOT-GUN METODY

Transkript

1 PROTEOMIKA 2017 SHOT-GUN METODY LC, IEF peptidů Kvantitativní přístupy SILAC,iTRAQ, dimetylace, 18 O, AQUA Label free MRM/SRM

2 proteiny proteiny 2-DE LC-MS shotgun peptidy peptidy

3 SPECIFICKÉ ŠTĚPENÍ BÍLKOVIN Cíl fragmentace: Definovaně fragmentovat protein, aby jednotlivé peptidy byly dostatečně malé na optimální MS analýzu, ale zároveň poskytly dostatečnou sekvenční informaci Optimum 6-20 AA, cca Da Proteáza Místo štěpení Poznámka Trypsin za Lys, Arg nenásleduje Pro Glu-C (Proteáza V8) za Glu a Asp nenásleduje Pro Chymotrypsin za Phe,Trp,Tyr, Leu, Ileu, Val, Met nenásleduje Pro Lys-C za Lys nenásleduje Pro Arg-C za Arg nenásleduje Pro Asp-N před Asp, Cys Chemická digesce CNBr Met organika, hydrofobní P.

4 Shot-gun strategies proteins TRYPSIN ~ peptides (2D)LC-MS IEF-LC-MS SDS-PAGE-LC-MS (gel-lc)

5 Shotgun postupy v proteomice 1D SDS-PAGE (2D) LC (SCX)-RP, RP-RP DIGESCE Extrémně komplexní směs peptidů různých IEF- RP LC In gel digesce řízků a extrakce Komplexní směs peptidů různých ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS RP-LC

6 Metody chromatografické separace peptidů VELIKOST AKTUÁLNÍ NÁBOJ Gelová filtrace (Size-exclusion chromatography) Iontoměničová chromatografie (Ion exchange chromatography) SPECIFICKÉ INTERAKCE Afinitní chromatografie (Affinity chromatography) HYDROFOBICITA HYDROFILNOST Chromatografie v reverzní fázi (Reverse phase chromatography) Chromatografie hydrofilních interakcí (Hydrophilic interaction LC, HILIC)

7 Identifikace proteinů v shot-gun experimentech Až stovky tisíc různých peptidů kontinuálně eluovaných z (RP) LC On-line MS přímé spojení LC kolony s ESI-MS. V reálném čase ( minut) jsou eluované peptidy ionizovány. Změřeno MS, izolován prekurzor a provedena fragmentace. Cyklus přepnutí MS-MS/MS až několikrát za sekundu. Off-line MS např. LC-MALDI. Frakce eluujících peptidů jsou sbírány a MS probíhá až po sběru. Typicky sběr mikrofrakcí (nl) na MALDI destičku s následným měřením MS a MS/MS.

8 RP-LC

9 RP-LC ESI

10 RP-LC ESI

11 RP-LC ESI

12 RP-LC ESI

13 RP-LC MS ESI

14 RP-LC MS ESI

15 RP-LC MS MS/MS ESI

16 RP-LC MS ESI

17 RP-LC MS ESI

18 RP-LC MS MS/MS ESI

19 LC-MALDI MS Nano LC s robotickým mikrosběračem frakcí. Frakce jsou on-line míchány s matricí a spotovány na MALDI destičku

20 Shotgun postupy v proteomice DIGESCE (2D) LC (SCX)-RP, RP-RP Extrémně komplexní směs peptidů různých ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS

21 MudPIT (2002) Multidimensional protein identification technology 1484 proteinů identifikováno (kvasinka - cca 5000 ORF)

22 Peptidová online 2D HPLC-MS Nejčastěji ion-exchange/rp

23 Peptidová online 2D HPLC-MS Nejčastěji ion-exchange/rp

24 Shotgun postupy v proteomice DIGESCE (2D) LC (SCX)-RP, RP-RP Extrémně komplexní směs peptidů různých IEF- RP LC ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS

25 IEF-IPG peptidů Distribuce lidských peptidů dle pi Výhody IPG-IEF peptidů vysoká separační účinnost možnost vyšší nanášky informace o pi může sloužit k verifikaci ID snížení komplexity vzorku při zachování pokrytí proteomu Informace o pi může pomocí při ID stejné vybavení jako pro IEF proteinů 1/3 lidských peptidů má pi v rozmezí 3,5-4,5 Je zde zastoupeno 96% známých proteinů jednotlivé frakce jsou ze stripu extrahovány

26 Shotgun postupy v proteomice 1D SDS-PAGE (2D) LC (SCX)-RP, RP-RP DIGESCE Extrémně komplexní směs peptidů různých IEF- RP LC In gel digesce řízků a extrakce Komplexní směs peptidů různých ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS RP-LC

27 Protein identification in shot-gun experiments Unique (proteotypic) peptides X peptides present in different proteins Protein 1 Protein 2 Protein 3

28 Present in more proteins Unique

30 Kvatifikace pomocí MS? MS není kvantitiativní, z výšky individuálního signálu ve spektru nelze přímo odvozovat abundanci daného peptidu ve vzorku. Nelze získat (semi) kvantitativní informaci pouhým porovnáním dvou různých spekter. Relativní kvantifikace může být provedena u dvou chemicky identických látek v jednom spektru. Tyto látky se mohou lišit v izotopickém složení.

31 ENZYMATICKÉ CHEMICKÉ METABOLICKÉ Kvatifikace pomocí MS SILAC Stable Isotope Labeling with Aminoacids in Culture itraq - isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation Dimethylation isotope labeling 18 0 labeling enzymatic digestion in 18 0 and 16 0 water AQUA a QconCAT Absolute Quantification of Abundance

32 SILAC Stable Isotope Labeling with Aminoacids in Culture HEAVY 1-2 AMK značené stabilním izotopem LIGHT běžné AA 13 C, 15 N-lysin 13 C, 15 N-arginin smíchání subcell. frakcionace separace štěpení trypsinem LC-MS/MS Esenciální AMK Bezsérové systémy nebo dializované sérum! Kvantifikace: MS Identifikace: MS/MS MW

33 SILAC MYŠ F1 F2 F3-F4 93% 13 C 6 lysine 97% 13 C 6 lysine nearly 100 % 13 C 6 lysine Kruger, Moser et al.

34 ITRAQ Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation

35 m/z

36 itraq experiment (relativní exprese proteinu ve 4 vzorcích) 1 a b c 114- A B b 114- C c Naštěpení trypsinem Všechny peptidy jsou značeny, vždy jedním typem značky na vzorek

37 Skupiny smíchány a peptidy separovány HMOTNOSTNÍ ANALÝZA IEF-HPLC nebo 2D HPLC a b c MS spektrum MS/MS spektrum 4700 MS/MS Precursor Spec #1 MC=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NF0.7=>TR[BP = 117.1, 838] % Intensity Mass (m/z) Kvantifikace Reportérových iontů Dvojnásobná exprese ve vzorcích 3 a 4 Odečtení sekvence peptidu a identifikace proteinu EPMQTGIK ATP syntáza, H+ transportující, mitochondriálníl F1 komplex, podjednotka alfa

38 itraq isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation 8plex Reagents Reporter Group mass (Retains Charge) Skip 120 N Isobaric Tag Total mass = 305 N N O O O ~~~~~ N N N O O O Balance Group Mass Skip 185 O O Amine specific peptide reactive group (NHS) N N N N 13 CH 2 N+ N+ 15 N+ 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 13 CH CH 3 13 CH 3 13 CH 3 N 15 N 15 N 15 N 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 15 N+ 13 CH 2 13 CH 2 13 CH 2 13 CH

39 Dimetylace peptidů (N-konec a e-aminoskupina Lys) Reakce formaldehydu s primárními aminy (v přítomnosti kyanoborohydridu) + 28 Da light D D + 32 Da intermediate C + 36 Da heavy Kvantifikace MS, identifikace MS/MS Hsu JL, et al. Anal Chem. 2003;75(24):

40 18 O enzymatické značení Digesce jednoho vzorku v normální vodě a druhého vzorku ve značené vodě 18 O Dochází k inkorporaci 16/18 O vzorky se smíchají a analyzují. Podle intenzit píků peptidu s 16 OH a 18 OH určujeme relativní kvantitu peptidu. H 2 N R 1 C H 18 OH C O N H R 2 C C H O N H H R 3 C COOH H H 2 N R 1 C H C O + R 3 COOH N H R 2 C C H O 18 OH H 2 N C trypsin H H 2 18 O

41 AQUA Absolute Quantification of Abundance Princip: kvantifikace signálu peptidu se signálem identického (ale značeného) peptidu známého množství Použitelné pro kvantifikaci jednoho nebo několika vybraných peptidů.. Kritický je výběr vhodného peptidu. Kvantifikace MS Identifikace MS/MS

42 QconCAT - absolutní kvatnifikace (AQUA) pomocí značených peptidů produkovaných v arteficiálním proteinu složeném z tryptických peptidů z různých bílkovin (konkatemeru ) v E.coli

43 ENZYMATICKÉ CHEMICKÉ METABOLICKÉ Kvatifikace pomocí MS SILAC jen živé buňky, metabolické značení, kvantifikace MS itraq (TMT) dimetylace značí aminoskupiny, značení na úrovni peptidů, multiplex, kvantifikace až při MS/MS značí aminoskupiny, značení na úrovni peptidů, kvantifikace MS 18 O digesce v místě štěpení trypsinem, kvantifikace MS, identifikace při MS/MS AQUA QCONCAT jen pro předem vybrané peptidy, je možná absolutní kvantifikace,

44 SHOT-GUN přístupy v kombinaci se značením SILAC 18 O 1D SDS-PAGE itraq, dimetylace DIGESCE Extrémně komplexní směs peptidů různých In gel digesce řízků a extrakce 2D LC SCX-RP IEF- RP LC Komplexní směs peptidů různých ESI MS/MS LC-MALDI MS/MS RP LC

45 Rat model of chronic heart failure Chronic volume overload iduced by aorto-caval fistula Garcia R, Diebold S:Cardiovasc Res. 1990; 24(5):430-2.

46 Hart Failure in 24th week after fistula ACF CTRL AVF = arterio-venous fistula 6 Heart weigth/ BW, g/kg Symptoms: x p< AVF CTRL n=6/group Water retention Increased LV ED pressure Breathlessness Lethargy

47 IEF-LC-MALDI/MS/MS analysis using itraq chemistry HF CTRL Digestion IEF of peptides 32 fractions MALDI-MS/MS collection RP-nLC

48 160 nlc runs ~ MALDI spots ~ MS/MS 2030 identified proteins + itraq based quantitation ~ 66 diferentially expressed proteins

49 gi acyl-coa synthetase long-chain family member 1 [Rattus norvegicus] GFQGSFEELCR LLLYYYDDVR LLLEGVENK

50 gi EH-domain containing 4 [Rattus norvegicus] ADQVDTQQLMR AMQEQLENYDFTK EYQISAGDFPEVK

51 Mechanism of fludarabine resistance in Mantle cell lymphoma Mantle cell lymphoma, MCL a rare B-cell lymphoma t(11;14)(q13;q32) overexpression of cyclin D1 therapy includes antinucleosides frequent drug resistance poor prognosis

52 Resistance of MCL to antinucleoside fludarabine Deoxyadenosine Fludarabine (phoshate) Incorporation to DNA Inhibition of replication

53 The mechanism of fludarabine resistance in MCL Cross resistance to all tested antinucleosides Sensitivity to other drug types preserved

54 Proteomic analysis of Mino a Mino/FR cells SILAC Stable Isotope Labeling with Amino acids in Culture FORWARD REVERSE Mino Mino/FR Mino/FR Mino HEAVY 13 C 6, 15 N 2 Lys 13 C 6, 15 N 4 Arg Digestion with trypsin Digestion with trypsin

55 Proteomic analysis of Mino a Mino/FR cells 312 diferentially expressed proteins forward a reverse SILAC correlation Bioinformatic anlysis (KEGG via DAVID) DNA replication and repair Missmatch repair NER Purine a pyrimidine metabolism Deoxycytidine kinase

56 DEOXYCYTIDINE KINASE the rate limiting enzyme of nucleoside utilization and salvage Fludarabine ENT 1,2 DEOXYCYTIDINE KINASE Fludarabine Fludarabine-P Fludarabine-P-P Fludarabine-P-P-P

57

58

59

60

61 Proteins upregulated in Mino/FR

62 Proteins downregulated in Mino/FR Bruton tyrosine kinase Disrupted B cell signaling?

63 Decreased bruton tyrosine kinase (BTK) expression and resistance to ibrutinib

64

65 Proteiny upregulované v Mino/FR

66

67 Upregulation of Bcl-2 and the toxic efect of Bcl-2 inhibitor ABT-199 ABT-199

68 Lorkova L, et al. PLoS One; 2015,10(8):e Klanova M, et al. Mol Cancer Jun 27;13:159.

69 Resistance to fludarbine in MCL is associated with cross resistence to all other anti-nucleosides due to the marked downregulation of DCK. MCL patients with the antinucleoside resistance should be treated with drugs with different mechanism of action (cisplatin, ibrutinib, bortezomib, bendamustine ). However ibrutinib and rituximab may be less effective in these cells. ABT199 seems highly promissing. Lorkova L, et al. PLoS One; 2015,10(8):e Klanova M, et al. Mol Cancer Jun 27;13:159.

70 Největší část proteomu (včetně kvantifikace) Molecular & Cellular Proteomics 7: , 2008.

71 Mouse Embryonic Stem Cells (SILAC) Graumann et al. Molecular & Cellular Proteomics 7: , Digest v roztoku IEF peptidů 24 x Extrakce a čištění (tips) 24x RP-LC-MS/MS Frakcionace (cytosol,jádra a membrány) SDS page in gel digest 3 x 15 gel slices 45x RP-LC-MS/MS MS/MS peptidů 3972 proteinů Celkem 5100 proteinů včetně kvantifikace MS/MS peptidů 4036 proteinů

72 Boisvert FM, et al. A quantitative spatial proteomics analysis of proteome turnover in human cells. Mol Cell Proteomics Mar;11(3):M HeLa Cells/SILAC SDS-PAGE (16 frakcí) RP-LC peptidů 8041 bílkovin

73 > proteinů v jednom experimentu Beck M, et al. (Aebersold R.) The quantitative proteome of a human cell line. Mol Syst Biol Nov 8,7:549 (peptide IEF-LC) Nagaraj N, et al., (Mann M.) Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line. Mol Syst Biol Nov 8;7:548. (SAX-LC) Geiger T, et al. (Mann M.) Comparative proteomic analysis of eleven common cell lines reveals ubiquitous but varying expression of most proteins. Mol Cell Proteomics Mar;11(3):M (SAX-LC)

75 Kvatifikace pomocí MS MS není kvantitiativní, z výšky individuálního signálu ve spektru nelze přímo odvozovat abundanci daného peptidu ve vzorku. Nelze získat (semi) kvantitativní informaci pouhým porovnáním dvou různých spekter. Nebo ano?

76 Label Free MS metody relativní kvantifikace bílkovin Při dodržení identických podmínek separace Existuje vztah mezi intenzitou MS signálu peptidu a jeho abundancí porovnávání (iontových) intenzit peptidů

77

78 Label Free MS metody relativní kvantifikace bílkovin Při dodržení identických podmínek separace Existuje vztah mezi intenzitou MS signálu peptidu a jeho abundancí porovnávání iontových intenzit peptidů Při dodržení identických podmínek separace Existuje vztah mezi abundancí daného proteinu a počtem jeho naměřených MS/MS spekter Spectral (a)counting

79 Porovnávání iontových intenzit peptidů (AUC) Spectral counting

80 Label Free Quantitation Only works for almost identical samples Requires absolutely reproducible LC separation Needs more MS equipment time (more replicates) More sensitive but less accurate compared to SI labeling

81 shot-gun metody (pros and cons) až proteinů v jednom experimentu izotopická nebo label-free kvantifikace náročnost na instrumentaci a (bio)informatiku problém s inferencí proteinu (stejné peptidy v různých proteinech) analýza PTM je možná ztráta informace o proteoformách

83 Když víme co chceme detekovat či kvantifikovat, ale nemáme protilátku. SRM/MRM (Selected Reaction Monitroing, Multiple Reaction Monitroing) Western bez protilátky

84 Když víme co chceme detekovat či kvatifikovat, ale nemáme protilátku.. SRM/MRM Single/Multiple reaction monitoring Triple quadrupole MS (2 molekulární filtry a jedna kolizní cela) Známý protein k detekci Reprezentativní peptide známé hodnoty m/z Fragment téhož peptidu o známé hodnotě m/z Retenční čas 1. Q1 - Filtr je nastaven na známou m/z rodičovského peptidu 2. Q2 Vybraný peptid je fragmentován 3. Q3 - Filtr je nastaven na známou m/z vybraného fragmentu

85 SRM/MRM Single/Multiple reaction monitoring Výběr vhodného peptidu: Proteotypický peptid peptid unikátní pro daný protein dobře ionizovatelný, pozrovatený MS vhodná velikost, známá retenční doba na LC nesmí být náchylný k PTM Fragment hojný, dobře ionizovatelný, pozrovatený MS Absolutní kvatifikace je možná při použití známé koncentrace izotopicky značeného peptidu identické sekvence (AQUA)