Studium genetické diverzity planého hrachu

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Studium genetické diverzity planého hrachu Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Pavel Hanáček, Ph.D. Konzultant: Ing. Petr Smýkal, Ph.D. Vypracoval: Oldřich Trněný Brno 2014

2 ČESTNÉ PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem práci: vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne: podpis bakaláře

3 Poděkování Děkuji všem, kteří musí pracovat, abych já mohl studovat. Děkuji!

4 Abstrakt Studium genetická diverzity planého hrachu Rod hrách (Pisum) je rozdělen do tří druhů Pisum sativum, P. fulvum a P. abyssinicum, kdežto mezi plané formy řadíme P. sativum ssp. elatius, P. fulvum a P abyssinicum. Genetická diverzita planých druhů byla tvořena v průběhu evolučního vývoje v jejich přirozeném místě výskytu. Protože kulturní hrách je důležitá plodina, která byla v minulosti domestifikována právě z planých druhů rodu Pisum, je hodnota informací o struktuře genetické diverzity planých druhů vysoká, s ohledem na potenciální využití planých druhů jako donorů genů plasticity a rezistence při procesu šlechtění kulturního hrachu. Součástí této bakalářské práce je kromě souhrnu informací o planých druzích hrachu a o využití molekulárních markerů při studiu variability rostlin také studie genetické diverzity metodou RBIP (Retrotransposon Based Insert Polymorphysm) souboru 50 položek složeného z druhů P. abyssinicum a P. fulvum a získaných z genofondových kolekcí hrachu. Z tohoto souboru bylo dále vybráno 12 položek, na kterých byla provedena analýza DNA sekvenčních dat jaderné oblasti ITS a chloroplastových oblastí trnsg a matk. Výsledky všech provedených analýz v kontextu již dříve zjištěných informací nám znázornili genetickou diverzitu druhů P. fulvum a P. abyssinicum. Klíčová slova: analýza sekvencí DNA, ITS, matk, Pisum, Pisum abyssinicum, Pisum fulvum, RBIP, retrotransposon, trnsg

5 Abstract Study of genetic diversity of wild pea The genus pea (Pisum) is divided into three species Pisum sativum, P. fulvum and P. abyssinicum, while we sort P. sativum ssp. elatius, P. fulvum and P abyssinicum into group of wild type. Genetic diversity of wild species was formed in their natural habitat during the event of evolution. Pea is an important crop that was domesticated from the wild species of the genus Pisum in the past. We can use wild species potentially as donors of genes of resistance and plasticity in the process of peas breeding. Hence the value of the information about the structure of the genetic diversity of wild species is quite high. The literary part of this work is focused to the summary information about the wild pea and application of molecular markers in the study of variability of plants. The research part of this work is aimed to study of genetic diversity on set of 50 accessions,which are composed of the species P. abyssinicum and P. fulvum, by RBIP (Retrotransposon Based Insert Polymorphysm) method. Furthermore, 12 selected accessions were sequenced in nuclear region ITS and chloroplast region matk and trnsg. In context of others studies our results of all analyzes illustrate the genetic diversity of the species P. fulvum and P. abyssinicum. Key words: ITS, matk, Pisum, Pisum abyssinicum, Pisum fulvum, RBIP, retrotransposon, DNA sequence analyzing, trnsg

6 Obsah 1 Úvod 8 2 Cíl práce 10 3 Literární rešerše Zařazení rodu Pisum do systému Zařazení rodu Pisum do systému dle ITIS (2011) Vývoj klasifikace rodu Pisum Fylogenetické vztahy mezi rody uvnitř tribu Fabeae Biologie rodu Pisum Morfologie rodu Pisum Historie a domestifikace Využití molekulárních markerů pro stanovení genetické příbuznosti u rodu Pisum Molekulární biogeografie hrachu Genetická diverzita Genetické zdroje a ochrana genetické diverzity hrachu Studium variability u rostlin pomocí molekulárních markerů Přehled 5 nejpoužívanějších metod DNA molekulárních markerů na rostlinách dle Semagn (2006): Genotypizace pomocí detekce retrotransposonů Metoda RBIP Analýza DNA sekvenčních dat Materiál a metody Použitý rostlinný materiál Použité metody molekulární biologie Izolace DNA Elektroforetická analýza a detekce DNA nebo PCR produktů Kvantifikace DNA RBIP analýza Příprava vzorků

7 4.3.2 Použité směsi primerů PCR protokol Sekvenace Výsledky Výsledky RBIP analýzy Zpracování sekvenčních dat z vybraných oblastí Diskuse 40 7 Závěr 43

8 1 Úvod Hrách (Pisum sativum L.) je jedna z nejstarších hospodářských plodin světa. V současnosti je hrách třetí nejpěstovanější luskovinou mírného pásu. Jeho semena jsou oblíbenou součásti potravy lidí. V mnoha zemích je hrách dokonce surovinou pro výrobu národních nebo místních tradičních pokrmů, jako je například kanadská hrachová polévka Soupe aux pois. Semena kulturních forem hrachu jsou tvořena z 25 % rostlinnými bílkovinami, od čehož se odvíjí jejich vysoká nutriční hodnota (Smýkal, 2011). Hrách je nedílnou součástí krmiv hospodářských zvířat nebo jej lze využít při výrobě bioplastů nebo bioplynu. Dále je hrách díky své symbióze s bakteriemi, které jsou schopny vázat vzdušný dusík, známý jako výborná předplodina nebo zelené hnojení. Do dnešní podoby se hrách vyvinul zásluhou člověka, který si ho v době neolitické revoluce vybral, a postupem času ho v míře, kterou mu dovolila příroda, přeměnil na rostlinu považovanou za domestifikovanou. Posléze se i tuto formu rostliny pokusil modifikovat, tak aby stále více vylepšoval její vlastnosti užitečné pro člověka. Šlechtěním tak vznikaly nové mnohočetné odrůdy, kultivary a variety. Kulturní formy hrachu vzešly z hrachu, který byl ve své podstatě hrachem planým, jehož vznik byl dán pouze přirozenými evolučními mechanizmy. Tyto druhy se nám zachovaly v podobě jejich přirozených potomků, kteří dosud tvoří součást flóry ve svých biotopech navazujících na ty původní, a nesou s sebou ve svém genetickém materiálu údaje o průběhu vývoje svého i svých předků a svých příbuzných. Podstatou genetické diverzity jsou zděděné vlastnosti živého organismu, jenž jsou zakódovány v jeho DNA, a jsou velmi specifické na úrovni jedince, populace či druhu (Stevenson, 2013). Jsou-li informace získané analýzou DNA spojeny se souvislostmi, které nám předkládá příroda ve svých principech, jsme schopni vytvořit pravděpodobný scénář vývoje živého organismu v prostoru a v čase. U druhů, které jsou samosprašné, mezi než patří i hrách, je genetická diverzita omezena v závislosti na míře cizosprášení a četnosti mutací. Genetická diverzita je u kulturních forem hrachu z větší části určena odrůdou a u planých forem hrachu ji lze zkoumat především na úrovni mezidruhové diverzity. U jednotlivých druhů planého hrachu byla genetická diverzita vytvořena především přestavbami chromozomů, křížením a introgresí. Znalost poměrů na úrovni genetické diverzity je základní charakteristikou daného rodu, která by měla být dle možností prostudována, zvláště tehdy jedná-li se o rod, do kterého patří hospodářsky významná plodina, jako je hrách. Využitelnost těchto poznatků není založena pouze na teoretických znalostech, jako 8

9 jsou vývoj a historie hrachu. Ačkoli i ty mají sami o sobě svoji hodnotu, jsou pro nás tyto poznatky důležité v souvislosti s možnostmi rozšiřování genetické diverzity kulturního hrachu, a tedy jeho plasticitou, nebo využití planých druhů jako donorů genů rezistence. Obsahem této bakalářské práce je kromě literární rešerše na téma genetická diverzita planého hrachu i analýza 50 položek planého hrachu, u kterých byla provedena analýza inzercí retrotransposomových sekvencí v daných místech genomu položek metodou RBIP (Retrotransposon Based Insert Polymorphysm). Na základě získaných údajů, které byly zpracovány fylogenetickým softwarem, byl vytvořen dendrogram, který nám vypovídá o jejich podobnosti a fylogenezi. Dále byly u 12 vybraných položek analyzovány sekvence jaderného genomu hrachu z oblastí ITS a sekvence z chloroplastového genomu hrachu matk a trnsg, které také sloužily k studuji fylogenetických vztahů. V části diskuze jsou výsledky provedených analýz začleněny a porovnány s rozsáhlým souborem dat o genetické diverzitě hrachu z dřívějších studií. 9

10 2 Cíl práce Cílem této bakalářské práce je blíže se seznámit a informovat o planých druzích rodu Pisum a o vývoji a příbuzenských vztazích jednotlivých taxonů uvnitř rodu, které se vytvořily v průběhu jeho evoluce. Dále se tato práce zabývá využitím molekulárních markerů při studiu variability rostlin se zaměřením na retrotransposonové markery a analýzu DNA sekvenčních dat. Hlavním cílem této bakalářské práce bylo využití retrotransposonových markerů metodou RBIP k genotypizaci souboru 50 položek vybraných z druhů Pisum fulvum a P. abyssinicum, dále sekvenace jaderných oblastí ITS a chloroplastových oblastí matk a trnsg DNA z 12 položek tohoto souboru a následná analýza získaných dat. 10

11 3 Literární rešerše 3.1 Zařazení rodu Pisum do systému Rod hrách (Pisum L.) řadíme do čeledi Leguminosae, podčeledi Papilionoideae a tribu Fabeae. Společně s rodem Pisum patří do tribu Fabeae též rody Lathyrus L., Lens Mill., Vicia L. a Vavilovia Al.Fed. (Mackinder et.al., 2014). Samotná taxonomie a vztahy mezi druhy v rodě Pisum se v minulosti mění v závislosti na autorech a typu studie Zařazení rodu Pisum do systému dle ITIS (2011) Říše: Plantae Podříše: Viridaeplantae Oddělení: Tracheophyta Pododdělení: Spermatophytina Třída: Magnoliopsida Nadřád: Rosanae Řád: Fabales Čeled : Fabaceae Rod: Pisum L Vývoj klasifikace rodu Pisum Rod Pisum. je komplexní agregát různých druhů a poddruhů zaujímající vzájemně rozdílné stupně vývojových vztahů. Rod Pisum, ačkoli je blízce příbuzný s rodem Lathyrus, je již plně reprodukčně izolován (Ochatt et.al., 2004). Botanická společnost stále není jednotná ve svém názoru na zařazení jednotlivých druhů. Rod Pisum někteří autoři člení na dva druhy Pisum fulvum Sibth. & Sm. a P. sativum. P. sativum je dále členěno na dva morfologicky rozlišné typy vyšší P. elatius a stepní P. humile. Toto členění vychází 11

12 z výsledků analýzy zásobních proteinů obsažených v semenech a z pokusů, v kterých byla zkoumána křížitelnost mezi jednotlivými údajnými druhy. P. sativum, P. elatius a P. humile byly mezi sebou navzájem plně křížitelné, kdežto P. fulvum byl od těchto druhů více reprodukčně izolován (Ben Ze ev & Zohary,1973). Později bylo dokázáno, že touto překážkou je částečně kolize cytoplasmatické a jaderné DNA (Bogdanova et.al., 2009). Ben-Ze ev & Zohary (1973) cytogeneticky vymezili dvě skupiny. Do jedné skupiny patří jižní typ P. humile a P. elatius a do druhé skupiny patří severní typ P. humile a P. sativum. Dále předpokládají, že díky této podobnosti tvoří severní typ P. humile genetický základ pro kulturní druhy hrachů, ale podle novějších informací se předpokládá, že genetický základ pro kulturní druhy hrachu může pocházet nejen ze severního P. humile, ale je zároveň podmíněn určitou kombinací plastidové, mitochondriální a jaderné DNA (Kosterin et.al., 2010). Podle novější a využívanější klasifikace (Maxted & Ambrose, 2001; ILDIS, 2005) se rod Pisum dělí na druhy P. sativum L., P. fulvum Sibth. a Sm. a P. abyssinicum A.Br. Tab. 1 Klasifikace rodu Pisum (Maxted & Ambrose, 2001) druh poddruh varieta P. sativum L. sativum sativum arvense (L.) Poiret elatius brevipedunculatum Davis a Meikle pumilio Meikle (syn. P. humile) P. fulvum Sibth. a Sm. P. abyssinicum A.Br P. fulvum je planý druh, který je zřetelně ohraničen a spíše homogenní. Druh P. abyssinicum je morfologicky blíže druhu P. sativum, ale jeho kulturní formy byly domestifikovány nezávisle na P. sativum (Jing et.al., 2010). Z důvodu podobnosti byl také v jiných taxonomických studiích řazen jako poddruh druhu P. sativum (Makasheva, 1979). Oba výše zmíněné druhy se od druhu P. sativum liší v důsledku četných chromozomových přestaveb, které jsou většinou důvodem reprodukční izolovanosti. Reprodukční bariéra je však více rozvinuta mezi druhy P. sativum a P. fulvum než mezi P. abyssinicum a P. sativum. Zbylé taxony považované za druhy jsou v širším slova smyslu zástupci druhu P. sativum. (Kosterin & Bogdanova, 2008; Ben Ze ev & Zohary,1973) Fylogenetické vztahy mezi rody uvnitř tribu Fabeae Do tribu Fabeae řadíme pět rodů, v kterých je zaznamenáno okolo 360 druhů. Mezi těchto pět rodů patří vikev (Vicia), hrachor (Lathyrus), hrách (Pisum), čočka (Lens) a Vavilovia (Mackinder et.al., 2014). Jediný zástupce svého rodu Vavilovia formosa je vytrvalá bylina, 12

13 která je považována za nejbližšího příbuzného rodu hrách. Zásluhou rozvoje nástrojů molekulární biologie a biochemie se podařilo vyčíst historický vývoj jednotlivých druhů a objasnit jaké vztahy mezi sebou navzájem zaujímají. Fylogenetická analýza zkoumající 70 % druhů uvnitř tribu Fabeae nám na základě zkoumání plastidové a jaderné DNA dokázala, že druhy vikev a hrachor nejsou monofyletické, jak nám určovalo třídění založené na morfologii. Dále nám ukazuje, že monofyletické sesterské rody hrách a Vavilovia jsou svým původem vnořeny uvnitř rodu hrachor a monofyletický rod čočka je vnořen uvnitř rodu vikev. Některé druhy, mezi něž patří Vicia hirsuta, Vicia sylvatica a několik endemitů z oblasti středomoří, tvoří samostatnou sesterskou vývojovou větev oddělenou od zbylých rodů z tribu Fabeae (Schaefer et al., 2012). Obrázek 3.1: Vztahy jednotlivých rodů uvnitř tribu Fabeae (převzato z Smýkal, 2011) 3.2 Biologie rodu Pisum Hrách je dvouděložná jednoletá rostlina z čeledi bobovitých (Fabaceae) s širokým rozsahem hospodářského využití. Rozmnožuje se generativně samosprášením. Jádra buněk všech druhů hrachu obsahují 7 párů chromozomů (2n=14). Velikost genomu u hrachu je Mb s vysokým sekvenčním polymorfismem v rodě, s průměrnou frekvencí 1 záměna na 15 nukleotidů a s vysokým zastoupením repetitivních oblastí v genomu (Macas et al.,2007; Smýkal, 2011). Hrách žije v symbióze s hlízkovitými bakteriemi rodu Rhizobium, které tvoří hlízky na jeho kořenech, a pomocí fixace vzdušného dusíku rostlině zajišt ují přísun přijatelné formy dusíku. Kulturní hrách Pisum sativum subsp. sativum var. sativum a P. sativum subsp. sativum var. arvense (peluška) je pěstován v oblastech mírného podnebného pásu jako hospodářsky významná rostlina. Také v přírodě však nalézáme hrách jako součást přirozené flóry. P. sativum se vyskytuje v Evropě v oblasti středomoří, v oblasti Blízkého východu a v se- 13

14 verozápadní Indii. Druh P. fulvum je omezen svým výskytem na oblast Blízkého východu a P. abyssinicum je endemitním druhem v africké Etiopii a v jižním Jemenu (Maxted & Ambrose, 2001) Morfologie rodu Pisum Hrách je rostlina s přímými, vystoupavými nebo popínavými lodyhami. Její kořeny jsou vřetenovité, zasahující hluboko pod povrch půdy. Listy hrachu jsou sudozpeřené s koncovým úponkem. Jednotlivé lístky jsou v mládí složené podél střední žilky. V úžlabí listů se vyskytují velké bylinné palisty. Dlouze stopkatá úžlabní květenství jsou chudokvěté hrozny. Na zvonkovitý kalich nasedá bílá nebo různě zbarvená koruna, která se skládá z pavézy, dvou křídel a člunku. V květu je přítomno 10 tyčinek, 9 z nich je srostlých do stejné výše svými nitkami a 1 je volná nebo je k ostatním z poloviny přirostlá. Pestík se skládá z přisedlého semeníku a z dorzálně zploštělé čnělky, která se rozšiřuje v bliznu. Na vnější straně je čnělka rýhovaná a na vnitřní straně je pod vrcholem chlupatá. Plody hrachu jsou podlouhlé nezaškrcované mnohosemenné lusky, které se otvírají ve švech po obou stranách. Lusky se na vrcholu zúžují v zobánek. Semena jsou kulovitá až zaobleně mnohostranná (Chrtková, 1995). Morfologický popis jednotlivých planých druhů (Smýkal et.al., 2013). Pisum fulvum se rozlišuje podle slabého štíhlého stonku, cm dlouhého, listy se skládají z jednoho až dvou párů lístků. Na stopce vyrůstající z úžlabí zubatých listenů je obvykle jeden malý (10 15 mm) oranžovožlutý květ. Lusky jsou malé (30 40x5 10 mm) a pigmentované. Semena jsou zabarvena od tmavě hnědé až po sametově černou barvu osemení. Někteří jedinci P. fulvum vykazují amfikarpní charakter, kdy bazální lusky mohou růst v zemi. Roste v aridních oblastech na skalnatých vápencových svazích s ročním úhrn srážek okolo mm. Pisum abyssinicum je cm vysoký, s vejčitými, tupými, 4 5 cm dlouhými palisty, které jsou až po vrchol a také podél vnitřního okraje polosrdčitých bazálních laloků, nepravidelně zubaté. Palisty jsou stejně dlouhé jako internodia stonku. Stopky květů jsou v době kvetení kratší než délka palistů (1/3 až 2/3), ale po odkvětu se prodlouží. Na stopce je jeden bledý květ, kališní lístky jsou úzce kopinaté, bělavá pavéza je pouze polootevřená, křídla jsou světlá nebo bledě nachově červená, úzký člunek je kratší než křídla. Lusky jsou 4 5 cm dlouhé, obsahující od 4 do 6 semen, která jsou zaobleně hranatá, hnědočervená, fialová, hnědozelená nebo šedozelená. Listy se skládají většinou z jednoho páru lístků a z rozvětveného úponku. Lístky jsou 3 4 cm dlouhé, eliptické, vejčité nebo obvejčité, kromě jejich spodní třetiny jsou zubaté. Celá rostlina má modrozelené zabarvení. 14

15 Pisum sativum ssp. elatius je popínavá rostlina až 3 m dlouhá, má často dvoubarevné květy mm velké. Stopka květu je 2 4x delší než délka palistů, nejčastěji nesoucí dva květy. Velikost lusku je 50 80x10 12 mm. Listy jsou složeny z dvou až čtyř párů vejčitých nebo eliptických lístků, celokrajných nebo částečně zubatých. Varianta P. humile má kratší internodia (20 40 cm), kratší stopky květů, menší a často pigmentované lusky (40 45x7 10 mm) a menší květy (15 18 mm). Roste především na stepních biotopech Historie a domestifikace Tribus Fabeae do kterého hrách náleží má původ v dávném geologickém období neogénu. Zde v epoše miocén (před miliony let) se z východního středomoří začal šířit napříč tehdejším světem (Schaefer et al., 2012). Hrách jako zdroj potravy provází lidstvo již dlouhou dobu. Společně s hrachem byly i ostatní luskoviny důležitý zdroj obživy v době před zemědělskou revolucí, v době lovců a sběračů. Archeologické nálezy z jeskyně duchů (tham phi maen), která se nachází v severozápadním Thajsku, dokazují, že již v 10. tisíciletí před Kristem byl planý hrách součástí potravy lidí hoabihnské kultury (Gorman, 1971). Cílené pěstování a domestifikace hrachu je vázána na začátky zemědělství do doby před 8 10 tisíci lety. V té době v oblasti Blízkého východu a Středomoří začali lidé nejdříve intuitivně a poté i cíleně vybírat a pěstovat semena rostlin s nejlepšími vlastnostmi (Zohary & Hopf, 2000). Největšími překážkami domestifikace hrachu byla nejspíše explozivní pukavost lusků a příliš velká dormance semen (Smartt, 1990). Další modifikované znaky byly výška rostliny, větvení stonku, velikost a kvalita semen, vliv délky dne na kvetení a obsah toxických látek (Pratap & Kumar, 2012). Mezi nejstarší domestifikované druhy rostlin patří nejen dvě hlavní rostliny Starého světa pšenice a ječmen, ale právě i hrách. Hospodářské využití hrachu nám dokazují archeologické nálezy z oblastí jižní Sýrie, jihovýchodního Turecka a v severozápadním Jordánsku (Zohary & Hopf, 2000). Ačkoli původ druhu P. abyssinicum nebyl doposud zcela objasněn, jeho domestifikace proběhla nezávisle na domestifikaci P. sativum přibližně před 5000 lety pravděpodobně v severovýchodní části Afriky (Jing et al., 2010). Obrázek 3.2: Semena hrachu z archeologických nálezů (vlevo) a moderní kulturní formy hrachu (vpravo) (převzato z Hopf, 1986) 15

16 Následné šíření hrachu do okolního světa bylo závislé na migraci lidí a na osidlování dané oblasti. Severně se hrách šířil do Ruska, cestou na západ do Evropy a východním směrem do Indie a Číny. Do Ameriky byl hrách introdukován až v průběhu 16. století (Pratap & Kumar, 2012). Nelze opomenout ani významnou úlohu hrachu v novověku, když při šlechtění hrachu vznikalo mnoho variant rostlin pro různé účely, ale i to, že hrách stál na počátku nového pojetí principů živé přírody v oblasti dědičnosti. Pomocí hrachu jako modelové rostliny byly v roce 1865 vysvětleny zákony dědičnosti opatem augustiniánského kláštera v Brně Johannem Gregorem Mendlem ( ). 3.3 Využití molekulárních markerů pro stanovení genetické příbuznosti u rodu Pisum S nástupem molekulárních a biochemických metod, které dovolují zkoumat vývoj živých organismů, se v druhé polovině 20. století začal na základě evoluční teorie tvořit tzv. strom života. Z fylogenetických analýz lze vyčíst historii vývoje organizmů i jejich vzájemné příbuzenské vztahy. V praxi se poté ukázalo, že výsledky fylogenetických analýz leckdy nepodporují strukturu binomického systému, který založil Carl Linné ( ), ale s promyšlenou syntézou obou směrů je potřeba systém aktualizovat. Obecně ve fylogenezi rodu Pisum má velký vliv na genetickou diverzitu a vývoj druhu výměna genů při hybridizaci mezi dvěma druhy a následná hybridizace s rodičovskými druhy (tzv. introgrese), ačkoli míra opylení vlastním pylem přesahuje 99 %. I když se jednotlivé druhy skládají z rozdílných částí genomu, která každá vykazuje různou diverzitu, je možné při porovnání fylogenetických analýz a správné interpretaci jejich výsledků vytvořit pravděpodobně správný fylogenetický strom (Jing et al., 2010; Smýkal, 2011). Mezi první fylogenetické analýzy využívající elektroforetické metody patřila analýza zásobních proteinů albuminů a globulinů. Zde byly prokázány rozdíly mezi složkami albuminů a globulinů u planých a kulturních druhů hrachu, ale nebyla prokázána korelace mezi rozložením složek albuminů a globulinů a morfologickými variantami rostlin hrachu, které byly vytvořeny v průběhu domestifikace (Waines, 1975). Analýza chloroplastové DNA potvrzovala správné rozlišení druhu P. fulvum a druhu P. sativum jako agregátu zkoumaných skupin humile, P. elatius a P. sativum (Palmer et.al., 1985). Hoey et.al. (1996) ve své fylogenetické analýze propojili studii morfologických vlastností, allozymů a RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markerů. Mimo jiné výsledky uvedených analýz podporovaly hypotézu, že severní P. humile je velice pravděpodobně nejbližší příbuzný kulturního hrachu, ačkoli důsledné zhodnocení analýz odhalilo vysokou míru příbuznosti mezi P. elatius, severním P. humile a P. sativum. Recentní studie polymorfismu sekvence ITS (Polans & Saar, 2002) a analýzy sek- 16

17 vence genu His5 pro Histon H1 podtyp 5 (Zaytseva et al., 2012) tuto hypotézu potvrzují. Dále probíhaly rozsáhlé fylogenetické studie, které rozkrývaly podstatu genetické diverzity hrachu. Ellis et al. (1998), Pearce et. al. (2000) a Vershinin et al. (2003) využili metody AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) a od ní odvozenou metodu sledování markerů retrotransposonových inzercí metodou SSAP (Sequence-Specific Amplification Polymorphisms). Jing et al.(2007) a Zaysteva et al. (2012) využili metody sekvenace genů. Získané data podrobně vysvětlují fylogenetické vztahy uvnitř rodu Pisum. Druhy P. fulvum a P. abyssinicum tvoří oddělené sousední větve fylogenetického stromu. Podskupina P. sativum ssp. elatius je v něm umístěna mezi P. fulvum a P. abyssinicum a další větve fylogenetického stromu vyústily v kulturní hrách (Smýkal et al., 2013). Další fylogenetické studie, které zkoumaly přítomnost inzercí sekvence retrotransposonu v daném místě genomu hrachu, nám potvrdily fylogentickou podstatu druhu P. sativum. P. sativum ssp. elatius je parafyletickou skupinou ve které jsou vnořeny zbylé taxony druhu P. sativum (Jing et al., 2010; Smýkal et al., 2011). P. abyssinicum je podle posledních studií řazen mezi P. fulvum a podskupinu P. sativum ssp. elatius. Dále je zde zkoumán jeho nízký stav genetické diverzity, jenž je vysvětlován stádiem efektu hrdla lahve v průběhu evolučního vývoje druhu (Vershinin et al., 2003; Jing et al., 2010, Smýkal et.al., 2011). Tyto studie by také odpovídaly myšlence, že předek dnešního druhu P. abyssinicum byl nejspíše hybrid předků druhů P. sativum ssp. elatius a P fulvum, ten byl pravděpodobně následně přenesen za dob faraónů do severovýchodní Afriky, kde mohl být domestifikován, a vyvinul se zde do dnešní podoby P. abyssinicum (Vershinin et al., 2003; Jing et al., 2010). Analýzy, které zkoumaly genetickou diverzitu planých druhů hrachu na základě kombinací mitochondriálních, chloroplastových a jaderných markerů, nám rozdělily položky do 4 kombinací. Jednotlivé markery nesou následující informace (Kosterin & Bogdanova, 2008; Kosterin et al., 2010): O přítomnosti rozpoznávácího místa pro restrikční endonukleázu AspLEI v plastidovém genu velké podjednotky ribulóza 1,5-bisfosfát karboxylázy rbcl. (rbcl+ vs. rbcl-) O přítomnosti rozpoznávácího místa pro restrikční endonukleázu PsiI v plastidovém genu podjednotky I cytochrom oxydázy cox1. (cox1+ vs. cox1-) O variantě jaderného genu pro rychlý (SCA F ) nebo pomalý (SCA S ) zásobní protein albumin. V populaci hrachu se vyskytují 4 kombinace těchto markerů Varinata A je tvořena kombinací SCA F,cox1+ a rbcl+. 17

18 Varinata B je tvořena kombinací SCA S,cox1- a rbcl-. Varinata C je tvořena kombinací SCA F,cox1- a rbcl+. Varinata D je tvořena kombinací SCA F,cox1- a rbcl-. Většina zkoumaných položek měla kombinaci A nebo kombinaci B, ty se shodovaly s rozložením do cytogenetických skupin dle Ben-Ze ev & Zohary (1973). Kombinace A byla nalezena ve všech položkách P. fulvum, P. abyssinicum a u přibližně poloviny položek planého P. sativum a odpovídala skupině jižní typ P. humile a P. elatius. Kombinace B byla nalezena u většiny zbylých položek planého P. sativum a u většiny položek kulturního hrachu (Kosterin & Bogdanova, 2008) a odpovídala skupině severní typ P. humile a kulturní formy P. sativum. Zbylé kombinace C a D jsou vzácné a byly určeny u několika planých nebo kulturních položek P. sativum. Jejich nižší frekvence výskytu je pravděpodobně dána mírou fixace těchto mutací, spíše než že vznikly vlivem introgrese mezi kombinacemi A a B v sympatrických populacích. Posloupnost přeměny jednotlivých kombinací v důsledku mutace byla určena v pořadí A, C, D, B. Zbylé možné kombinace těchto alel byly zjištěny u velmi malého počtu jedinců a jejich původ je dán genetickou introgresí mezi regulerními kombinacemi A, B, C a D (Kosterin et al., 2010). Obrázek 3.3: Pravděpodobné schéma fylogeneze hrachu (převzato z Kosterin & Bogdanova, 2008) Molekulární biogeografie hrachu Z centra diverzity, které se nachází ve Středomoří a na Blízkém východu, se hrách v průběhu tisíciletí rozšířil do většiny oblastí mírného klimatického pásu severní polokoule. Je pravděpodobné, že v průběhu historie pěstování kulturní hrách zplaňoval, nebo se v sympatrických populacích plané a kulturní formy mezi sebou navzájem křížili. Díky těmto 18

19 skutečnostem je často složité rozlišovat, kde má hrách svou oblast původního výskytu. Dalším problémem jsou chybějící kompletní údaje o položkách hrachu v genofondových sbírkách. V tomto případě se jedná především o údaje udávající zeměpisné místo nálezu položky (Smýkal et.al, 2013). Obrázek 3.4: Biogeografie druhů hrachu P. fulvum, P. abyssinicum (malé kruhy) a planých forem P. sativum subsp. elatius (velké kruhy) s vyznačením alel tří studovaných DNA markerů. Ve výřezu je oblast dnešního Izraele. Čísla u některých kruhů udávají počet položek stejného původu. Kombinace A: Malá Asie, Izrael a ostrovy v západním Středomoří; kombinace B: východní Středomoří, Kaspická oblast a Krym, Turecko, Sýrie; kombinace C: Středomoří (Francie, Itálie, Řecko, Turecko), Etiopie; kombinace D: Egypt, Sicílie, Španělsko (upraveno z Kosterin et al., 2010) Na základě již dříve uvedených studií Kosterin & Bogdanova (2008) a Kosterin et al. (2010) byly určeny 4 linie rodu hrách, lišící se v kombinaci 3 různých molekulárních markerů. Autory byl navržen pravděpodobný scénář vývoje rodu hrách v závislosti na jejich rozšíření. Kombinace A byla určena jako kombinace, z které ostatní kombinace vycházeli. Proto je v největší míře zastoupena u zkoumaných položek z oblastí východního středomoří, v Izraeli, Sýrii, Libanonu a v Turecku. Tyto oblasti jsou považovány za oblasti původu rodu hrách. Zde rostou v sympatrických populacích druhy P. sativum a P fulvum, jejichž předci dali nejspíše genetický základ dalšímu druhu výhradně s kombinací A, druhu P. abyssinicum, který roste v oblastech Etiopie a Jemenu. Kombinace A se nachází i v západní části středomoří, kam se nejspíše rozšířila v období pleistocénu, když hladina středozemního moře dosahovala výrazně nižší úrovně, a cesta po souši tak byla možná. Od té doby se dochovala refugia na ostrovech Sardinie a Menorka. Během šíření populace hrachu západní cestou byla vytvořena kombinace C a ta se následně rozšířila do oblastí severovýchodní Afriky, do Etiopie a do oblastí jižní Evropy, do Řecka a jižní 19

20 Francie. Kombinace D byla nalezena u kulturní formy hrachu v Egyptě a v Tadžikistánu a u planých položek na Sicílii a v Turecku. Kombinace B se vytvořila mutací, která vedla ke změně elektroforetické mobility zásobního proteinu albuminu SCA z kombinace C, někde v okolí Černého moře a Kavkazu. Malá Asie, respektive dnešní Turecko, se stalo místem, kde se potkaly populace hrachu kombinace A, která se šířila z jihu, a kombinace B, která se sem šířila ze severu. Ačkoli nebyla určena datace rozšíření hrachu do této oblasti, předpokládá se, že kombinace A byla v této oblasti rozšířena již dříve, protože tato kombinace je vývojově starší. Kombinace B vznikla postupnou přeměnou z kombinace A v oblasti centrálního a západního středomoří, kde byly zanechány jednotlivé mezistupně přeměny kombinace C a D, a odtud se kombinace B dále šířila severovýchodním směrem (Kosterin et al., 2010). 3.4 Genetická diverzita Základ biologické rozmanitosti svojí podstatou vychází z genetické diverzity živých organismů, která je založena na rozdílnostech v primární struktuře DNA. Genetickou diverzitu sledujeme na úrovni druhů, populací, uvnitř jednotlivých populací nebo na úrovní jednotlivců. Organismy s vyšším stupněm genetické diverzity se dokáží lépe přizpůsobit změně životního prostředí a šlechtitelskými postupy je z nich možné vyselektovat různorodé odrůdy, variety a kultivary. Změny genetického kódu jednotlivých úrovní vznikají deterministicky genovým tokem a přirozenou nebo záměrnou selekcí, nebo náhodně mutacemi a působením genetického driftu (Stevenson, 2013). Mutačními změnami v genomu organismu vznikají nové alely genů, které mohou být genetickým driftem náhodně fixovány v populaci. Častěji se tak děje v menších populacích, kde je více pravděpodobné, že se daná alela ujme. Selekční tlak zajišt uje dynamickou odezvu živého organismu na své životní prostředí. Významný evoluční faktor tok genů znamená přenášení genů z jedné populace do druhé nejčastěji pomoci migrujících jedinců. Intenzita tohoto jevu je vysoce závislá na počtu migrantů a děje se na všech úrovních populací. Ačkoli jsou jednotlivé druhy většinou od sebe reprodukčně izolovány, následkem mezidruhového křížení může docházet i ke genovému toku mezi nimi (Flegr, 2009). I když je hrách samosprašná rostlina a jeho mezidruhoví kříženci jsou z velké části reprodukčně izolováni, je zde nenulová pravděpodobnost výskytu toku genů. 20

21 3.5 Genetické zdroje a ochrana genetické diverzity hrachu Z důvodu uchovávání jedinečného genetického materiálu je třeba systematicky a komplexně pečovat o genetické zdroje živých organismů, jejichž ztráta by měla negativní dopad. Tvorba genetických zdrojů je rozvíjena, jak z důvodu upotřebení genetických zdrojů v přítomnosti, jako zdrojů šlechtitelského a badatelského materiálu, tak z důvodu uchování cenného genetického materiálů pro potenciální využití v budoucnosti. Ochrana genetické diverzity se skládá z konzervace genetického materiálu a jeho udržování. Sběry vzorků se provádí nejčastěji v oblastech s vysokou genetickou diverzitou sbíraných rostlin a v oblastech s vysokým selekčním tlakem na určitý znak, jako jsou například suché nebo chladné oblasti. V současnosti je upřednostňován přístup sběru vzorků reprezentujících co nejobsáhlejší míru genetické variability a také je důraz kladen na shromáždění ohrožených druhů a druhů z odlehlých a málo přístupných oblastí. Ochrana genetické diverzity je zřizována na úrovni in situ, to znamená v místě přirozeného výskytu, což vyžaduje konzervaci celého ekosystému daného druhu, nebo přístupem uchovávání genetického materiálu mimo místo přirozeného výskytu, takzvaně přístupem ex situ, většinou se jedná o uchovávání genetického materiálu v genových bankách. S uvědomováním si potřeby systematického uchovávaní genetického materiálu se v průběhu 20. století začaly zakládat genové banky, kde se shromažd uje a uchovává genetický materiál vybraných jedinců, kteří reprezentují genetickou diverzitu daného živého organismu (Pratap & Kumar, 2013; Chloupek, 2008). Na celém světě se uchovává přibližně 98 tisíc položek v genofondových kolekcích hrachu, avšak většina položek je zastoupena vícenásobně. Plané druhy jsou zastoupeny nedostatečně a tvoří pouhé 2 % z uchovávaných položek (přibližně 1900 položek). Zbylé položky jsou tvořeny převážně kulturními formami hrachu, dále jsou uchováváni zástupci šlechtitelských materiálů, kříženci, krajové odrůdy a jedinci s různými mutacemi (Smýkal et.al., 2013). Nedostatečná ochrana genetické diverzity může vést ke genetické zranitelnosti, kdy nepředpokládaný problém způsobí velké ztráty u velkého podílu odrůd určité plodiny. Tento problém byl již v historii mnohokrát zaznamenán a jeho důsledky společně s ostatními okolnostmi například vedly v mezních případech až k hladomoru (Velký irský hladomor, ). Dále lze zredukováním genetické diverzity plodiny omezit genetický pokrok kvantitativních znaků při šlechtění dané plodiny. Tento jev se však velice těžko dokazuje, jelikož u plodin vždy pouze předpokládáme výnosové maximum, protože největší možné maximum není nikdy známo (Chloupek, 2008). 21

22 3.6 Studium variability u rostlin pomocí molekulárních markerů Molekulární markery (molekulární znaky) nám vypovídají většinou o pořadí monomerů v řetězcích biopolymerů, případně o chemických a fyzikálních vlastnostech biopolymerů. Jsou zjišt ovány molekulárně biologickými metodami. Informace, které lze pomocí molekulárních markerů získat, lze uplatnit v molekulární biologii, fyziologii, biochemii a v dalších biologických oborech. Konkrétně je lze využít k rekonstrukci fylogeneze druhů nebo i vyšších taxonů, dále pro rozpoznávání jednotlivých druhů živých organismů a jejich třídění. Důležité využití molekulárních markerů je při studii genealogické příbuznosti jedinců v rámci populace nebo druhu (Flegr, 2009). V současnosti je známá řada metod i jejich modifikací produkujících molekulární markery. Nejdříve byly vyvinuty metody analýzy proteinů a izoenzymů, které nám vypovídaly o přítomnosti polymorfismu pro expresi markerovacího genu v materiálu, který byl hodnocen. Následně byly postupně objevovány molekulární markery vycházející z analýzy DNA. Do této skupiny patří metody založené na restrikci vlákna DNA, metody detekující molekulární markery pomocí hybridizace, které byly velice rychle nahrazeny metodami využívající PCR reakci. V dalších etapách vývoje se přidaly molekulární markery získávané pomocí analýzy motivů nebo sekvencí DNA. Vývoj molekulárních markerů po celou dobu směřuje k účinějším metodám. V posledních letech vývoj molekulárních markerů stále více směřuje k vysoce účinným metodám založených na analýze dat získaných pomocí přístupů NGS (Next-Generation Sequencing) (Henry et.al., 2012) Přehled 5 nejpoužívanějších metod DNA molekulárních markerů na rostlinách dle Semagn (2006): 1. RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), též restrikční fingerprinting využívá vlastnosti restrikčních endonukleas štěpit DNA v daném místě za vzniku různě dlouhých fragmentů, podle vzájemných vzdálenosti jednotlivých míst na řetězci DNA, ve kterých ho restrikční endonukleasa štěpí. Při analýze se zpravidla vyštěpuje rozsáhlé spektrum fragmentů z DNA o vysoké komplexitě. Základní charakteristika této metody je její vysoká míra reprodukovatelnosti výsledků, potřeba velkého množství vstupní DNA, střední míra polymorfismu a že vypovídá o kodominantní dědičnosti (Flegr, 2009; Semagn, 2006). 2. Analýza mikrosatelitů využívá přítomnosti početných lokusů ve většině genomů, v nichž jsou mnohonásobné repetice jednoduchých sekvenčních motivů. Při analýze je pomocí PCR reakce s primery navrženými na hraniční sekvence těchto úseků sledován počet opakování dané repetice v daném lokusu, a tedy jeho délka, která 22

23 je u různých genomů variabilní. Základní charakteristika této metody je její vysoká míra reprodukovatelnosti výsledků, potřeba malého množství vstupní DNA, vysoká míra polymorfismu a že vypovídá o kodominantní dědičnosti. Další výhoda této metody je dobrá možnost její automatizace, a tím zlepšení její efektvity (Flegr, 2009; Semagn, 2006). 3. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) je typická DNA-fingerprintová metoda, kdy se využívá v PCR reakci vždy jednoho primeru o délce přibližně 10 nukleotidů. Pro tento primer existuje v genomu o vysoké komplexitě řada míst, která jsou k němu komplementární, a zároveň se vyskytnou ve vhodné vzdálenosti a směru, aby při PCR reakci byly amplifikovány úseky DNA o různé délce. Pro RAPD analýzu se často využívá již připravených komerčních rozsáhlých sad těchto primerů, v kterých se jednotlivé primery liší vzájemně obsahem nukleotidů a pořadím nukleotidů. Základní charakteristika této metody je její střední míra reprodukovatelnosti výsledků, potřeba malého množství vstupní DNA, vysoká míra polymorfismu a že vypovídá o dominantní dědičnosti (Flegr, 2009; Semagn, 2006). 4. AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) je metoda, při které se komplexní DNA rozštěpí dvěma restrikčními endonukleasami, z nichž jedna má nižší a druhá vyšší specifitu rozpoznání cílového místa. Dále se k vzniklým fragmentům ligací připojí dva různé adaptéry, jeden se napojí na konce fragmentů štěpené jednou restrikční endonukleasou a druhý na konce fragmentů štěpené druhou restrikční endonukleasou. Tyto adaptéry obsahují specifické sekvence na které při PCR nasedají primery. Následně proběhne preselektivní a poté selektivní PCR, v nichž použité primery přesahují v preselektvní PCR jedním nukleotidem do oblasti fragmetu, tím se amplifikuje v průměru pouze každý 16. fragment, a při selektivní PCR přesahují primery do oblasti fragmentů dvěma nukleotidy, čímž komplexita fragmentů klesne ještě 256x. Zároveň jsou fluorescenčně nebo radioaktivně označeny ty fragmenty, které byly alespoň na jednom ze svých konců štěpeny méně specifickou restrikční endonukleasou. Ve výsledku lze sledovat velikost takto označených fragmentů pomocí kapilární elektroforézy v automatickém sekvenátoru. Základní charakteristika této metody je její vysoká míra reprodukovatelnosti výsledků, potřeba středního množství vstupní DNA, vysoká míra polymorfismu a že tato metoda vypovídá o dominantní dědičnosti (Flegr, 2009; Semagn, 2006). 5. ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) je metoda založená na PCR amplifikaci fragmentů umístěných mezi dvěma identickými oblastmi mikrosatelitů, které jsou orientovány v opačném směru. Jako primerů se využívá sekvence opakujících se motivů z dané oblasti mikrosatelitu. V této metodě se využívá tří přístupů odvozených od modifikace připraveného primeru. V prvním případě primery obsahují pouze 23

24 sekvenci opakujícího se motivu mikrosatelitu, tento přístup vede k nejasným výsledkům v důsledku nasedání primeru na nespecifická místa v genomu. Další dva přístupy se liší v ukotvení primeru několika nukleotidy, bud přidáním určených nukleotidů na 5 konci nebo 3 konci primeru. V případě modifikace na 3 konci primeru zasahují přidané nukleotidy do specifických oblastí mezi mikrosatelitní oblasti a výsledkem jsou čisté specifické produkty PCR reakce. V případě modifikace na 5 nasedají primery též na specifické oblasti a amplifikují fragmenty včetně mikrosatelitních oblastí. Základní charakteristika této metody je její spíše vysoká míra reprodukovatelnosti výsledků, potřeba malého množství vstupní DNA, vysoká míra polymorfismu a že vypovídá o dominantní dědičnosti (Semagn, 2006) Genotypizace pomocí detekce retrotransposonů Velká část znaků charakteristických pro různé skupinu živých organismů často procházela opakujícími se změnami v průběhu evoluce a stejný znak, nevyjímaje znaků molekulárních markerů, tak mohl vznikat u různých skupin nezávisle na sobě. Tento stav nabytí daného znaku tedy představuje homoplazii nikoli homologii, čemuž je potřeba přizpůsobovat daný přístup analýzy dat získaných při sledování jednotlivých znaků. V případě metod pozorování spojených s molekulární biologií lze najít skupinu znaků, u kterých je vzhledem k velikosti genomu vysoce nepravděpodobné opakování vzniku stejného znaku, a v praxi to lze zcela zanedbat. Například se jedná o přítomnost či absenci transposonu nebo retrotransposonu v daném místě v genomu. I když se v případě transposonu v průběhu dalšího vývoje daný transposon z daného místa v genomu ztratí, nebývá jeho vystřižení přesné a zanechává v daném místě alespoň nějaké stopy, které lze zjistit analýzou sekvence daného místa (Flegr, 2009). Využití retrotransposonů jako molekulárních markerů vyplývá ze způsobu, jakým se uplatňují v DNA živých organismů. S výhodou využíváme jejich dvou základních vlastností a to, že jsou v genomu přítomny v mnoha kopiích, a že ve své sekvenci obsahují konzervované úseky, díky kterým je možno navrhovat primery pro budoucí analýzy (Kalendar, 2010). Všechny metody molekulárních markerů založené na detekci retrotransposonu využívají metodu PCR, kdy jeden primer je vždy komplementární se sekvencí uvnitř sekvence retrotransposonu a místo, kde nasedají ostatní primery se liší dle typu metody (Cieslarová, 2011). Retrotransposony patří do skupiny transponovatelných elementů, které se v genomu šíří pomocí transkripce do RNA a následnou reverzní transkripcí se přepisují nazpět do DNA, ale na jiné místo v genomu. Retrontransposony se rozlišují podle přítomnosti či absence sekvenčních struktur LTR (Long Terminal Repeat) na okrajích své sekvence. Skupina LTR retrotransposonů je hlavní složkou repetitivních oblastí v genomu hrachu a může být 24

25 rozdělena do dvou skupin Ty1-copia a Ty3-gypsy, které se liší ve své struktuře. Skupina retrotransposonů Ty1-copia nezabírá tak velké procento genomu jako skupina Ty3-gypsy, ale je složena z většího počtu různých rodin retrotransposonů. Při genotypizaci rodu Pisum metodou RBIP se nejčastěji využívá retrotransposonů PDR1 typu Ty1-copia, které jsou v genomu hrachu zastoupeny přibližně v 500 kopiích (Macas et.al., 2007; Smýkal, 2011). Oproti většině ostatních skupin retrotransposonů, které se z důvodu selekčního tlaku nebo preference místa inzerce soustředí v genomu na neaktivních místech, což může vést například k seskupování inzercí retrotransposonů v centromerickém a pericentromerickém heterochromatinu, jsou inzerce retrotransposonů PDR1 v genomu hrachu rozloženy více náhodně, z určité části (přibližně 7%) dokonce i v místech genových sekvencí. Tato skutečnost tvoří ze skupiny PDR1 retrotransposonů vhodnou skupinu pro analýzu genetické diverzity metodou RBIP (Jing et.al., 2005; Jing et.al., 2010). Metody molekulárních markerů založené na detekci retrotransposonů RBIP (Retrotransposon-Based Insertion Polymorphism) REMAP (Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism) IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) SSAP (Sequence-Specific Amplified Polymorphism) RIVP (Retrotransposon Internal Variation Polymorphisms) Metoda RBIP Metoda RBIP je metodou určenou k detekci inzerce nebo absence retrotransposonu v přesně určeném lokusu. Při PCR reakci se používá tří primerů, jeden z nich nasedá v sekvenci retrotransposonu a zbylé dva nasedají každý z jedné strany na sekvence obklopující sekvenci retrotransposonu. Velikost výsledného produktu nám vypovídá o přítomnosti či absenci retrotransposonu v přesně určeném místě. Metoda RBIP má kodominantní charakter, lze tak určit i případný heterozygotní stav v daném lokusu (Flavell, 1998). Mimo přístup určený pro genotypizaci menšího počtu položek, skládajícího se z reakce PCR a detekce PCR produktů pomocí agarosové elektroforézy, byl také vyvinut přístup, který lze plně automatizovat a má sloužit k zpracování většího počtu položek. Tento přístup byl za použití metody TAM (Tagged Array Marker) využit k genotypizaci 3200 položek hrachu kolekce genové banky John Innes centrum ve Velké Británii 45 RBIP markery 25

26 (Flavell et.al., 2003; Jing et.al., 2010). Výhodou analýzy RBIP je jednoznačnost hodnocení za předpokladu, že mohou nastat pouze varianty, kdy je v daném lokusu retrotransposon přítomný (+,1) nebo nepřítomný (-,0). Také může nastat stav, kdy se nezíská žádný odpovídající produkt PCR reakce z důvodu záměny v místě nasednutí primeru, což se vysvětluje větší fylogenetickou vzdáleností (Smýkal, 2011). Obrázek 3.5: a) Schéma metody RBIP. Je-li retrotransposon přítomen v testovaném lokusu tvoří se PCR produkt odpovídající červenému pásu na obrázku, kdežto produkt odpovídající absenci primeru se netvoří. b) Není-li přítomen retrotransposon tvoří se PCR produkt na obrázku odpovídající modrému pásu, který je určen dvěma primery obklopující dané místo, kdežto PCR produkt odpovídající přítomnosti retrotransposonu se netvoří (upraveno z Kalendar et.al., 2010). c) Příklad použití přístupu TAM pro RBIP markery, každý bod značí jednu analyzovanou položku, zelený bod značí přítomnost retrotransposonu v daném lokusu, červený bod značí absenci retrotransposonu v daném lokusu (převzato z Jing et.al., 2010) Analýza DNA sekvenčních dat Sekvenací DNA zjišt ujeme přesné pořadí jednotlivých nukleotidů v řetězci DNA. Sekvenování DNA nám jako jediná metoda umožňuje odhalit největší procento genetických znaků, ve kterých se studované živé organismy skutečně liší, a zároveň lze předem určit skupinu znaků, které budou velice pravděpodobně selekčně neutrální, a tedy zde nemůže docházet k evoluční konvergenci i u vzájemně nepříbuzných živých organismů (Flegr, 2009). Samotné sekvence DNA lze získat několika rozdílnými způsoby. V 70. letech 20. století byly vyvinuty první metody sekvenace ribonukleových řetězců. Metoda Maxam- Gilbertova chemického sekvenování založená na specifickém štěpení řetězce DNA různými chemickými sloučeninami a Sangerova enzymová metoda sekvenování založená 26

27 na ukončování replikace v části vzorku za každou následující nukleotidovou bází v řetězci DNA. Sangerova metoda byla nadále rozvíjena různými modifikacemi a časem se z ní vyvinula automatizovaná metoda sekvenování DNA. I když v posledních letech byly vyvíjeny další a další metody sekvenování DNA, takzvané next-generation metody sekvenování, metoda automatického sekvenování s základem v Sangerově metodě má stále své uplatnění při přesné sekvenaci námi určených kratších řetězců DNA. Při studiu fylogenetiky a molekulární taxonomie je třeba vybrat oblast genu, která bude analyzována. Pro tyto účely je třeba zvažovat hlavně rychlost molekulární evoluce příslušného genu a časová měřítka, v kterých studované děje probíhají. Pro studium fylogeneze druhů blízce příbuzných a vnitrodruhové studie je zapotřebí vybírat oblasti, které charakterizuje vysoká substituční rychlost. Naopak při studiu druhů, které se odvětvovaly dříve, je třeba zvolit studované oblasti, které se vyvíjely co nejpomaleji (Flegr, 2009). V naší práci byly analyzovány tři oblasti genomu hrachu. Oblast jaderného ribosomálního genomu ITS a dvě oblasti lokalizované v genomu chloroplastů. Oblast ITS (Internal Transcribed Spacer) jsou oblasti mezerníků, které se nachází v jaderné ribosomální DNA (nrdna) kodující 18S, 5,8S a 26S podjednotky ribosomální RNA (rrna). Úseky nrdna se vyskytují v jaderném genomu vyšších rostlin v mnoha kopiích a právě pro oblasti mezerníků ITS je typická vysoká substituční rychlost. Díky tomu bývají jejich sekvence běžně používány pro studium fylogeneze blízce příbuzných druhů (Polans & Saar, 2002). Oblast trnsg je oblast intronu trng v chloroplastové DNA (cpdna), na kterou dále navazuje oblast mezigenového mezerníku trng-trns, pro tyto oblasti je typická vysoká substituční rychlost, a tedy jsou vhodné pro studium fylogeneze blízce příbuzných druhů (Shaw et.al., 2005). Oblat genu matk je lokalizována v cpdna, její analýza je díky její vysoké míře variability vhodná pro určení příbuzenských vztahů mezi blízce příbuznými rody. Analýza této oblasti byla v minulosti využita kromě jiného i k studiu fylogeneze rodů bobovitých rostlin (Wojciechowski et.al., 2004). 27

28 4 Materiál a metody 4.1 Použitý rostlinný materiál Jednotlivé položky planého hrachu, které byly zkoumány v této práci, byly získány ze zdrojů genetických materiálů genových bank. Metodou RBIP bylo analyzováno 50 položek planého hrachu z toho 16 položek Pisum abyssinicum a 34 položek P. fulvum. Zároveň bylo 12 položek sekvenováno v jaderné oblasti ITS a v chloroplastových oblastech trnsg a matk. Z toho 5 položek P. abyssinicum a 7 položek P. fulvum. Tabulka 4.1: Seznam analyzovaných položek kód země původu genová banka analýza Pisum abyssincum Etiopie USDA, Pullman, (USA) RBIP/sek Etiopie USDA, Pullman, (USA) RBIP Etiopie USDA, Pullman, (USA) RBIP/sek Etiopie USDA, Pullman, (USA) RBIP Etiopie USDA, Pullman, (USA) RBIP Etiopie USDA, Pullman, (USA) RBIP/sek Etiopie USDA, Pullman, (USA) RBIP Etiopie USDA, Pullman, (USA) RBIP Etiopie USDA, Pullman, (USA) RBIP Etiopie USDA, Pullman, (USA) RBIP Etiopie USDA, Pullman, (USA) RBIP Etiopie USDA, Pullman, (USA) RBIP JI 1876 Etiopie JIC, Norwich (UK) RBIP/sek. VIR3567 Etiopie Vavilovův institut, St.Petersburg (RUS) RBIP/sek. WL-1445 Etiopie Nordic gene bank (SWE) RBIP WL-808 Etiopie Nordic gene bank (SWE) RBIP Pisum fulvum Izrael USDA, Pullman, (USA) RBIP 701 Izrael PGB, Wiatrowo (PL) RBIP 702 Izrael PGB, Wiatrowo (PL) RBIP/sek. 28

29 kód země původu genová banka analýza Pisum fulvum 703 Izrael PGB, Wiatrowo (PL) RBIP 706 Izrael PGB, Wiatrowo (PL) RBIP/sek. 707 Izrael PGB, Wiatrowo (PL) RBIP 708 Izrael PGB, Wiatrowo (PL) RBIP JI 2203 Izrael JIC, Norwich (UK) RBIP L93 Izrael PGB, Wiatrowo (PL) RBIP L95 Izrael PGB, Wiatrowo (PL) RBIP L96 Izrael PGB, Wiatrowo (PL) RBIP JI 2523 Sýrie JIC, Norwich (UK) RBIP VIR3397 Izrael Vavilovův institut, St.Petersburg (RUS) RBIP VIR6070 Izrael Vavilovův institut, St.Petersburg (RUS) RBIP VIR6071 Izrael Vavilovův institut, St.Petersburg (RUS) RBIP WL 2140 Izrael Nordic Gene Bank (SWE) RBIP/sek. WT-301 Izrael PGB, Wiatrowo (PL) RBIP JI 2206 Izrael JIC, Norwich (UK) RBIP JI 2510 Sýrie JIC, Norwich (UK) RBIP/sek. JI 1012 Izrael JIC, Norwich (UK) RBIP JI 2513 Sýrie JIC, Norwich (UK) RBIP JI 2514 Sýrie JIC, Norwich (UK) RBIP JI 2515 Sýrie JIC, Norwich (UK) RBIP JI 2516 Sýrie JIC, Norwich (UK) RBIP/sek. JI 2517 Sýrie JIC, Norwich (UK) RBIP JI 2519 Sýrie JIC, Norwich (UK) RBIP/sek. VIR2523 Izrael Vavilovův institut, St.Petersburg (RUS) RBIP/sek. JI 2524 Sýrie JIC, Norwich (UK) RBIP JI 2525 Sýrie JIC, Norwich (UK) RBIP JI 2528 Sýrie JIC, Norwich (UK) RBIP JI 2540 Sýrie JIC, Norwich (UK) RBIP JI 3266 Izrael JIC, Norwich (UK) RBIP JI 3268 Izrael JIC, Norwich (UK) RBIP JI 3269 Izrael JIC, Norwich (UK) RBIP 4.2 Použité metody molekulární biologie Izolace DNA Pro získání DNA ze semen hrachu byla provedena její izolace pomocí komerční sady pro izolaci DNA DNeasy Plant Mini Kit od firmy Qiagen. V první fázi bylo ze semene hrachu odstraněno jeho osemení, poté následovala důkladná homogenizace paličkou ve třecí misce a následné přenesení homogenizovaného materiálu do mikrozkumavky. Dále bylo postupováno dle modifikovaného návodu z použité sady pro izolaci DNA za použití originálních roztoků v následujících krocích: 29

30 1. K přibližně 20 mg suchého homogenizovaného materiálu bylo přidáno 400 μl roztoku pufru AP1 a 2 μl zásobního roztoku RNase A a vzniklá směs byla důkladně promíchána. 2. Směs se inkubovala 10 minut při teplotě 65 C. Během inkubace byla směs přibližně 3x promíchána převrácením mikrozkumavky. 3. Do směsi bylo přidáno 130 μl pufru AP2, vzniklá směs byla promíchána a poté se nechala inkubovat 5 minut při 0 C. 4. Proběhla centrifugace 5 minut při x g. 5. Lyzát byl přemístěn do QIAshedder spin kolony, která byla umístěna v zásobní zkumavce 2 ml a proběhla centrifugace 2 minuty při x g. 6. Ze zásobní zkumavky bylo převedeno 260 μl kapalné frakce bez porušení peletu do nové mikrozkumavky. 7. Bylo přidáno 390 μl AP3 a vzniklá směs byla jemně promíchána. 8. Směs byla aplikována na DNeasy mini spin kolonu, která byla umístěna v zásobní zkumavce 2 ml a proběhla centrifugace 1 minutu při 6 000x g. 9. DNeasy mini spin kolona byla přemístěna do nové zásobní zkumavky, na kolonu bylo naneseno 300 μl pufru AW a proběhla centrifugace 1 minutu při 6 000x g. Po centrifugaci byla odstraněna kapalina ze zásobní zkumavky. 10. Na kolonu bylo naneseno dalších 300 μl pufru AW a proběhla centrifugace 2 minuty při x g. 11. Kolona byla přemístěna do nové mikrozkumavky (1,5 ml), na střed kolony bylo naneseno 100 μl předehřátého (65 C) pufru AE. Následovalo 5 minut inkubace při laboratorní teplotě a proběhla centrifugace 1 minutu při 6 000x g 12. Pro získání II. frakce byl krok 11. zopakován ještě jednou Elektroforetická analýza a detekce DNA nebo PCR produktů Pro analýzy izolované DNA nebo vzniklých PCR produktů byla využita horizontální agarosová elektroforéza. Pro detekci získané DNA na gelu bylo použito fluorescenční interkalační barvivo ethidium bromid, který se váže na dsdna. Vzniklý komplex lze visualisovat pomocí UV transluminátoru a v případě potřeby vytvořit fotodokumentaci. 30

31 Příprava 1% agarósového gelu proběhla následovně: 1. Bylo naváženo potřebné množství agarosy. 0,5 g pro střední gel (50 ml), 1,2 g pro velký gel (120 ml). 2. Navážená agarosa byla vsypána do erlenmayerovy baňky, doplněna do objemu 50 ml 1x TAE pufrem a vzniklý roztok byl uveden do varu pomocí mikrovlnné trouby. 3. Převařený roztok byl zchlazen na cca 60 C. 4. Bylo přidáno 1/ objemu zásobního roztoku ethidium bromidu. 5. Gel byl vylit do vany a do gelu byly umístěny hřebeny. 6. Po vychladnutí byly z gelu vyjmuty hřebeny a gel byl umístěn do elektroforézy. 7. Gel byl zalit 1x TAE pufrem tak, aby byl těsně ponořen (cca 1 mm pod hladinu). Použité chemikálie: agarosa 50 x TAE pufr (1 litr): 242 g TRIS báze; 57,1 ml ledové kyseliny octové; 100 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) 1x TAE - 50 x zředěný 50x TAE zásobní roztok ethidium bromidu: vodný roztok 10 mg/ml Nanášení vzorku na gel Vzorky byly na gel nanášeny pomocí mikropipety nebo multikanálové pipety. Pro možnost porovnání velikostí fragmentů a koncentrace DNA byl nanesen standart Quick-Load 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs). Do větších jamek gelu se vejde max. 25 μl vzorku, do užších jamek gelu se vejde max. 15 μl vzorku. V případě použití vodného roztoku DNA je nutné před nanášením provést smíchání vzorku s nanášecím pufrem, který nám omezí difuzi vzorku do TAE pufru. Po dokončeném nanášení byla elektroforéza připojena ke zdroji elektrického napětí a spuštěna. Napětí bylo regulováno dle velikosti gelu právě probíhající elektroforézy. Elektroforéza byla ukončena, až se nám fragmenty velikostního standartu dostatečně rozestoupily (přibližně 40 minut). Nanášecí pufr: 20% FICOL; 0,05% bromfenolová modř; TE pufr (10 mm Tris ph 8,0; 1 mm EDTA ph 8,0) 31

32 Snímání gelu Gel byl opatrně přenesen do komory zařízení GDS (Gelový Dokumentační Systém). Byly zapnuty spínače na komoře a spuštěn program Vision Capt. Po zaostření, regulaci clony (na objektivu kamery) a času (na liště - Exposure time) byl gel nasnímán, vhodně pojmenován a uložen jako obrazový soubor s příponou tif Kvantifikace DNA Pro zjištění přibližné koncentrace získané DNA, a pro ověření úspěšnosti izolace DNA byla použita horizontální agarózová elektroforéza. Kvantifikace byla prováděna na základě porovnání izolované DNA s hmotnostním standardem. Měřený vzorek bylo potřeba kvantitativně nanést na gel, aby se měření koncentrace mohlo pokládat za přesné. Jako hmotnostní standart byl použit Quick-Load 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs). Obrázek 4.1: Quick-Load 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs), hmotnost je vztažena k 10 μl naneseného standartu. 4.3 RBIP analýza Genotypizace hrachu metodou RBIP přístupem PCR reakce, byla provedena následovně (Flavell et.al., 1998): 32

33 4.3.1 Příprava vzorků 1. Z mrazničky byla vyjmuta isolovaná DNA a potřebné množství odpovídajícího PCR pufru, dntp a RBIP primerů. Vše bylo ponecháno rozmrznout. 2. Bylo nachystáno a popsáno odpovídající množství PCR mikrozkumavek, popřípadě jejich celé plato. 3. Bylo nachystáno odpovídající množství PCR Master Mixu z odpovídajícího množství jednotlivých komponent uvedených níže v seznamu (Předpis pro PCR reakci). Jako termostabilní polymeráza byla využita GO Taq polymerasa od firmy Promega. Výsledná směs byla jemně promíchána pomocí vortexu a poté rozpipetována do jednotlivých mikrozkumavek. 4. Nakonec bylo do každé mikrozkumavky přidáno po 1 μl DNA vzorku a směs byla promíchána pomocí pipety a mikrozkumavky byly uzavřeny. 5. Vzorky byly vloženy do PCR Thermocycleru a následně byl spuštěn program určený pro RBIP analýzu. (Podrobně popsán níže v kapitole PCR protokol.) 6. Po skončení PCR programu byly vzorky ihned analyzovány nebo byly krátkodobě skladovány v lednici, popřípadě dlouhodobě v mrazničce při -20 C. 7. Vzniklé PCR produkty byly analyzovány na agarosovém gelu, následně byla provedena visualizace a detekce pomocí ethydium bromidu a UV transiluminátoru. Výsledek analýzy byl zdokumentován. Předpis pro PCR reakci (celkový objem reakce byl 15 μl): 1x voda 8.6 5x pufr mm dntp 0.3 5μM primer mix F/R 2 Taq /5 units/ μl 0.1 DNA vzorek Použité směsi primerů Pro zjištění inzerce či absence retrotransposonu v daném lokusu byla použita metoda RBIP analýzy pomocí PCR reakce, kde jednotlivé směsi primerů slouží k amplifikaci specifických PCR produktů amplifikovaných dle předlohy potenciálního místa výskytu sekvence retrotransposonu v genomu položky. 33

34 Seznam RBIP směsí primerů, které byly použity při genotypizaci studovaných položek hrachu: Birte X-16, Birte-X5, 281-R16-0, 281-X40, 2055-NR1, 1006-X19, , , 95-R2, 2055 MR23, 1794-R2, RBIP-3, RBIP-7, RBIP-4, RBIP-2, 281-R44, 64-R45, 45-x31, Birte-B1 (Jing et.al., 2005; Jing et.al., 2010) PCR protokol Optimalizovaný program PCR reakce určený pro genotypizaci hrachu metodou RBIP měl následující předpis: 35 cyklů teplota čas počáteční denaturace 94 C 3 min denaturace 94 C 40 s nasedání primerů 55 C 45 s prodlužování 72 C 1 min celková doba reakce 4.4 Sekvenace 3,5 4 hod V rámci této bakalářské práce byly sekvenovány tři oblasti genomu u 12 položek hrachu. Samotná sekvenace byla provedena firmou Macrogen. Před odesláním vzorků na sekvenaci byla provedena metodou PCR amplifikace sekvenovaných oblastí. Následně byla provedena purifikace vzorků a před odesláním vzorků ještě byla zkontrolována úspěšnost amplifikace a purifikace vzorků pomocí horizontální agarosové elektroforézy. Pro potřeby sekvenace byla stanovena velikost sekvenovaných oblastí a koncentrace DNA vzorků v roztoku porovnáním s hmotnostním markerem. 34

35 5 Výsledky 5.1 Výsledky RBIP analýzy RBIP analýza byla provedena přístupem PCR reakce v kombinacích každého vzorku s každým RBIP markerem. Výsledkem bylo 950 analyzovaných PCR reakcí s možností detekce inzerce či absence retrotransposonu v daném lokusu, či absence vhodného PCR produktu (Obrázek 5.1). Na základě těchto údajů byla vytvořena tabulka, kde byly zaznamenány jednotlivé stavy k příslušnému vzorku a RBIP markeru. Přítomnost PCR produktu odpovídající svojí délkou inzerci retrotransposonu v daném místě byla značena 1, absence 0 a absence odpovídajícího produktu -9. Pro vyhodnocení získaných dat byla provedena analýza (Obrázek 5.1) softwarem Ntsys pc metodou shlukové analýzy UPGMA (Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Mean). Shluková analýza UPGMA nám umožňuje na základě podobností vzorků v jednotlivých znacích hierarchicky řadit vzorky do shluků. Vzdálenost jednotlivých shluků od sebe a postup vnořování jednotlivých shluků do druhých nám určuje míru a charakter vzájemné podobnosti mezi tříděnými vzorky (Flegr, 2009). 35

36 Obrázek 5.1: Ukázka detekce RBIP markerů 1006 X19 a Zpracování sekvenčních dat z vybraných oblastí Mezi jednotlivými sekvencemi vybraných oblastí bylo provedeno mnohočetné přiřazení (Obrázek 5.3 5) pomocí softwaru ClustalX (Thompson et.al., 1997). V sekvenovaném úseku chloroplastové oblasti matk o velikosti přibližně 550 bp byl zaznamenán velice malý nukleotidový polymorfismus. V tomto sekvenovaném úseku se druhy Pisum abyssinicum a P. fulvum od sebe lišili pouze v jednom nukleotidu, proto nebylo vhodné tvořit fylogenetický strom. Zbylé oblasti ITS (z ní sekvenovaný úsek o přibližné délce 660 bp) a trnsg (z ní sekvenovaný úsek o přibližné délce 650 bp) již vykazují vyšší míru variability, která byla statisticky zpracována metodou maximální věrohodnosti v fylogenetický strom pomocí softwaru MEGA5.1 (Obrázek 5.6 7). Metoda maximální věrohodnosti hledá hypotetický model fylogenetického stromu mezi všemi variantami větvení stromu, který nese nejvyšší vypočítanou hodnotu maximální věrohodnosti na základě pozorovaných dat. V praxi se zde také využívá heuristických přístupů pro zrychlení výpočetní operace při minimálním snížení pravděpodobnosti získání správného výsledku (Tamura et.al., 2011). Pro větší vypovídající hodnotu analýzy byly k našemu souboru sekvenčních dat připojeny i sekvenční data dalších 12 vzorků planých druhů hrachu ze zdrojů Dr. Smýkala. 36

37 Obrázek 5.2: Fenogram vytvořený na základě RBIP analýzy Obrázek 5.3: Ukázka porovnání sekvencí v oblasti matk Obrázek 5.4: Ukázka porovnání sekvencí v oblasti ITS 37

38 Obrázek 5.5: Ukázka porovnání sekvencí v oblasti trnsg Obrázek 5.6: Fylogenetický strom vytvořený na základě analýzy oblasti ITS metodou maximální věrohodnosti, černé tečky označují námi sekvenované položky 38