Zvýšení antioxidační kapacity řasy Chlorella vulgaris přídavkem polyfenolů

Transkript

1 Seznam sekcí a složení komisí ústav 319 Komise: Předseda: Členové: Soutěžící: Biotechnologie I (přednášková) Knihovna ústavu 319, 9:00 doc. Dr.Ing. Petra Patáková Ing. Martin Halecký, PhD Ing. Olga Schreiberová, PhD. Bc. Eliška Beldíková () Bc. Jana Chrastná () Bc. David Kadlec () Filip Kaufman (B3) Bc. Martina Majdáková () Bc. Jan Řezanina () Monika Šebestiánová (B3) Biotechnologie I Zvýšení antioxidační kapacity řasy Chlorella vulgaris přídavkem polyfenolů Bc. Eliška Beldíková Ústav biotechnologie doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D. Jednobuněčné řasy náleží mezi mikroorganismy s širokým biotechnologickým potenciálem, a to zejména v oblasti potravinářského, krmivářského a farmaceutického průmyslu. Buněčné stěny zelených řas rodu Chlorella disponují mnohými doménami, schopných vázat na svůj povrch některé fenolové látky přítomné ve vodných a slabě alkoholických roztocích. Tato práce se zabývá studiem antioxidační kapacity řasy Chlorella vulgaris obohacené o polyfenoly ze skupiny flavan-3-olů a prenylovaných flavonoidů (významné rostlinné fytoestrogeny a antioxidanty). Během práce bylo potvrzeno, že ke zvýšení antioxidační aktivity dochází a to v případě kvercetinu až o téměř 60%. V budoucnu by výsledky tohoto výzkumu mohly sloužit k vývoji nových doplňků stravy, obohacených o řadu látek s prokazatelně pozitivními účinky na lidské zdraví, a jako náhrada synteticky připravených antioxidantů.

2 Biotechnologie I Vývoj metody pro identifikaci chmelových terpenů v pivu Bc. Jana Chrastná Ústav biotechnologie Ing. Marcel Karabín, Ph.D. Přestože jsou chmelové silice a sloučeniny od nich odvozené látkami významně ovlivňujícími výsledné aroma produktu, neexistuje doposud jednotná metoda pro jejich stanovení v pivu a meziproduktech jeho výroby. Postupy pro stanovení těchto látek ve chmelu nelze použít, protože v průběhu chmelovaru dochází v důsledku odparu a nízké rozpustnosti těchto látek ve vodě k významnému poklesu jejich koncentrace. Kromě toho dochází při přípravě vzorku pro kvantitativní analytické stanovení k interferenci se širokým spektrem těkavých produktů kvašení. Zmíněné obtíže vedly k tomu, že prozatím používané metody slouží pouze ke stanovení některých vybraných sloučenin (linalool, geraniol a některé oxidované terpeny), případně jsou pro rutinní používání příliš náročné na čas a přístrojové vybavení. Tato práce si klade za cíl vytvořit prvotní verzi metody, založené na kombinaci destilačních a moderních extrakčních (SPE, SPME) postupů, pomocí které by bylo možno identifikovat zástupce všech hlavních typů látek odvozených od chmelových silic (terpeny, terpenické alkoholy, terpenické epoxidy) a která by se stala základem pro kvantifikaci těchto látek v pivu. Biotechnologie I Syntéza a vlastnosti esterů kyseliny p-hydroxybenzoové Bc. David Kadlec Ústav biotechnologie Ing. Iveta Hrádková, Ph.D. Parabeny jsou skupinou alkylových esterů p-hydroxybenzoové kyseliny. Patří mezi chemické konzervanty, hojně využívané v potravinářském, farmaceutickém i kosmetickém průmyslu. Vzhledem ke špatné rozpustnosti methyl-, ethyl- a propylparabenů ve vodném prostředí je snaha získat paraben polárnější, jenž umožní v daném průmyslovém odvětví snazší aplikaci. Za tímto účelem byl transesterifikací methylparabenu s glycerolem za vysoké teploty připraven glycerolparaben, systematicky nazvaný 1-O-(4-hydroxybenzoyl)glycerol. Standardy methyl-, ethyl- a propylparabenů byly získány esterifikační reakci p-hydroxybenzoové kyseliny s příslušným alkoholem v přítomnosti kyselého katalyzátoru. Zásadní vlastností parabenů je antimikrobiální aktivita, která byla stanovena na základě vyhodnocení minimální inhibiční koncentrace. Byla zkoumána inhibice syntetizovaných parabenů spolu s kyselinou p-hydroxybenzoovou (antimikrobiální standard), na mikroorganismy Escherichia coli a Staphylococcus aureus. Naměřené hodnoty prokázaly, že s rostoucí délkou alkylového řetězce vzrůstá antimikrobiální aktivita, se silnějším účinkem na grampozitivní bakterie.

3 Biotechnologie I Mikrobiální syntéza jantarové kyseliny Filip Kaufman B3 Ústav biotechnologie prof. Ing. Mojmír Rychtera, CSc. Kyselina jantarová je využívána v chemickém průmyslu jako výchozí látka pro výrobu herbicidů, pesticidů, pryskyřic, plastů a mnoha dalších produktů. Ve farmaceutickém průmyslu nachází uplatnění pro další syntézy. V dnešních dnech se jantarová kyselina vyrábí hlavně chemickou syntézou z ropných produktů. Během posledních několika let se biotechnologický výzkum zaměřil na ověřování technologie jantarové kyseliny pomocí vybraných mikroorganismů kultivovaných na různých médiích získaných z obnovitelných surovin. Cílem mé práce bylo otestovat několik sbírkových kmenů anaerobních bakterií. Zjistil jsem, že anaerobní mikroorganismy Wolinella succinogenes DSM 1740, Succinivibrio dextrinosolvents DSM 3072, Succinimonas amylolytica DSM 2873 a Mannheimia ruminalis DSM získané z Německé sbírky mikroorganismů nejsou pro produkci kyseliny jantarové vhodné z důvodu minimální produkce této kyseliny. Další cíl mé práce je určit a popsat růstové a produkční schopnosti bakterie Actinobacillus succinogenes DSM 22257, který je v literatuře hodnocen jako vhodný producent jantarové kyseliny. Biotechnologie I Přírodní látky jako nástroj regulující tvorbu biofilmu Bc. Martina Majdáková Ústav biotechnologie prof. Ing. Alena Čejková, CSc. Rhamnolipidy jsou povrchově aktivní přírodní látky produkované mikroorganismy, které jsou nadějným zdrojem nových léčiv. Jejich použití v lékařství může představit nový směr v řešení problémů rezistence biofilmů vůči antibiotikům. Kombinace vhodných koncentrací antibiotika a rhamnolipidů může usnadnit dispergaci zralého biofilmu, jehož tvorba má za následek chronické, obtížně léčitelné infekce. Tato práce se zabývá hledáním vhodné kombinace koncentrací rhamnolipidů (produkovaných bakteriemi Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter asburiae a Acinetobacer calcoaceticus) a antimikrobiálních látek a antibiotik vůči růstu kvasinek Trichosporon cutaneum a Candida parapsilosis a bakterie Rhodococcus erythropolis. Byly zjištěny minimální inhibiční koncentrace (MIC) rhamnolipidu a amphotericinu B pro kvasinku Trichosporon cutaneum a MIC amphotericinu B pro kvasinku C. parapsilosis. Pro bakterii R. erythropolis byly stanoveny také frakční inhibiční indexy (FIC) kombinace daného rhamnolipidu a chlorhexidinu. Dále byla sledována adheze buněk bakterie Rhodococcus erythropolis pod vlivem přítomnosti koncentrací rhamnolipidů a chlorhexidinu zjištěných při stanovení FIC.

4 Biotechnologie I Využití Pythium oligandrum jako biofungicidu ve sladařství Bc. Jan Řezanina Ústav biotechnologie prof. Ing. Pavel Dostálek, CSc; Ing. Michaela Poštulková Plísňová kontaminace ječmene a sladu je problém, se kterým se potýká řada sladoven i pivovarů. Při výrobě sladu je dosaženo vhodných podmínek pro růst plísní produkujících mykotoxiny a jiné nežádoucí metabolity. Kromě chemických a fyzikálních metod eliminace plísňové kontaminace se často uplatňují i metody biologické, které se vyznačují vysokou účinností, bezpečností a šetrností k životnímu prostředí. V průmyslových sladovnách je známo využití mléčných bakterií a kvasinky Geotrichum candidum. Cílem této práce bylo ověřit, zda lze za tímto účelem využít oomycetu Pythium oligandrum. Tento agresivní mykoparazit se běžně využívá například v zemědělství nebo farmacii pro potlačení plísňových chorob zemědělských plodin resp. živočichů včetně člověka. Jeho využití ve sladařství zatím není známo. V průběhu sladovacího procesu v mikrosladovně byl sledován vývoj plísně Fusarium oxysporum na sladovaném ječmeni po aplikaci P. oligandrum na základě kvantitativní analýzy RT-PCR (polymerázová řetězcová reakce v reálném čase). Pomocí této metody byl zjištěn počet molekul DNA sledované plísně, který je úměrný počtu přítomných buněk. Bylo prokázáno, že P. oligandrum potlačuje růst plísně F. oxysporum účinněji než běžně používaná kvasinka G. candidum. Biotechnologie I Úloha nukleokapsidového proteinu Mason-Pfizerova opičího viru při tvorbě retrovirové částice Monika Šebestiánová B3 Biochemie a mikrobiologie doc. Ing. Pavel Ulbrich, Ph.D. Retroviry jsou obalené RNA viry, zodpovědné za řadu vážných onemocnění u zvířat i člověka. Nejznámějším je virus lidské imunodeficience, způsobující onemocnění AIDS. Existuje mnoho přístupů k léčbě retrovirové infekce, většinou se jedná o inhibici jednotlivých kroků životního cyklu retrovirů. Proto je jedním z důležitých a studovaných kroků životního cyklu retrovirů skládání nezralých retrovirových částic. Po vypučení z hostitelské buňky částice zrají proteolytickým štěpením strukturního polyproteinu Gag, který se skládá ze tří hlavních domén (matrixové, kapsidové a nukleokapsidové (NC)). NC protein je bazický protein, který obsahuje vysoce konzervativní motivy zinkových prstů a specificky váže genomovou RNA. Role NC a zinkových prstů při skládání částic ještě nebyla příliš intenzivně studována, nicméně z našich dřívějších studií vyplývá, že má vliv na morfologii částic. Pro naše studium byl použit deleční mutant strukturního polyproteinu Gag, konkrétně fúzní kapsidový a nukleokapsidový protein Mason-Pfizerova opičího viru s delecí N-terminálního prolinu, který je schopen tvořit nezralé virům podobné částice (VLP). Cílem mé práce byla příprava a purifikace proteinů nesoucích mutace v zinkovém prstu a studium následné tvorby a morfologie VLP pomocí transmisní elektronové mikroskopie.

5 Komise: Předseda: Členové: Biotechnologie II (přednášková) Pracovna vedoucího ústavu 319, 9:00 prof. Ing. Alena Čejková, CSc. Dr. Ing. Leona Paulová Ing. Lucie Kyselová, PhD Soutěžící: Bc. Gabriela Hozová Bc. Markéta Koukalová Bc. Nikol Krmenčíková Bc. Martina Paldrychová Bc. Nikola Podolová Bc. Kateřina Rádlová Bc. Tereza Tůmová Biotechnologie II Syntéza amidů betulinové kyseliny Bc. Gabriela Hozová Ústav chemie přírodních látek Prof. Ing. Zdeněk Wimmer, DrSc.; Ing. Jana Šusteková Přírodní látky se používají v léčbě různých onemocnění po tisíce let. Mezi tyto látky patří i betulinová kyselina, pentacyklický triterpenoid, nacházející se napříč celou rostlinnou říší. V posledních 20 letech je předmětem mnoha výzkumů právě díky svým biologickým účinkům. Mezi tyto účinky patří protinádorové, anti-hiv, antibakteriální, protizánětlivé atd. Může tedy být uplatněna v medicinální chemii jako potenciální léčivo, avšak kvůli špatné rozpustnosti ve vodě a dalším nepříznivým vlastnostem je stále snaha připravit její deriváty. Mezi tyto deriváty patří estery, amidy, oximy, N-heterocyklické deriváty a další. Mým úkolem je připravit konjugáty betulinové kyseliny s aminokyselinami v poloze C(28). O O H H H H O NH R R= L-, D-fenylalanin methylester R= L-, D-tryptofan benzylester

6 Biotechnologie II Vliv magnetického pole na vývoj přirozených biofilmů Bc. Markéta Koukalová Ústav biotechnologie prof. RNDr. Vladimír Jirků, DrSc.; Ing. Richard Ježdík Mikroorganismy jsou v biofilmech obecně velmi odolné vůči nepříznivým vnějším podmínkám, lépe degradují polutanty nebo lépe produkují sekundární metabolity. Tato práce byla zaměřena na vystavení modelových mikroorganismů magnetickému poli s cílem zjistit počáteční fázi buněčné adheze v porovnání s kontrolním měřením bez působení magnetického pole v definovaných podmínkách průtočného reaktoru. Zařízení, které bylo pro účely těchto pokusů zkonstruováno, umožňuje vystavit homogennímu magnetickému poli statickou i recyklující buněčnou populaci a je k dispozici ve dvou variantách. Ty se liší objemem průtočné kyvety a maximální pracovní hodnotou magnetické indukce. Bylo zjištěno, že u zástupce prokaryot, bakterie Rhodococcus erythropolis, byla výsledná buněčná adheze magnetickým polem při hodnotách magnetické indukce 10 mt a 100 mt ovlivněna pozitivně, zatímco u zástupce eukaryot, kvasinky Trichosporon cutaneum, byla počáteční buněčná adheze při stejných hodnotách magnetické indukce inhibována. Míra indukce nebo inhibice buněčné adheze byla také závislá na intenzitě magnetického pole. Biotechnologie II Ověření použitelnosti imunochemické metody ROSA pro stanovení deoxynivalenolu v ječmeni a sladu Bc. Nikol Krmenčíková Ústav biotechnologie Ing. Marcel Karabín, Ph.D. Jedním z nejvýznamnějších problémů současného sladařství je plísňová kontaminace ječmene a sladu a s tím spojené uvolňování zdravotně závadných sekundárních metabolitů, mezi něž patří i rozsáhlá skupina mykotoxinů, do sladu a následně i piva. Deoxynivalenol jako jeden z nejvýznamnějších zástupců mykotoxinů je produkován celou řadou polních i skladištních plísní. Ačkoli nebyla prozatím potvrzena jeho akutní toxicita, je pro svou dobrou rozpustnost ve vodě, termostabilitu a zdravotní obtíže (zvracení, nemoci trávicího traktu), které způsobuje, v poslední době pečlivě monitorován. Legislativně je určena jeho limitní hodnota v obilovinách určených pro lidskou výživu (1250 µg/kg). Stanovení mykotoxinů pomocí chromatografických metod je časově i finančně nákladné a je nahrazováno rychlými imunochemickými postupy. Tato práce si klade za cíl ověřit použitelnost jedné z komerčně dostupných sad pro stanovení deoxynivalenolu v ječmeni a sladu a porovnání získaných výsledků se stanovením pomocí LC/MS.

7 Biotechnologie II Mohou stilbeny ovlivnit aktivitu antibiotik? Bc. Martina Paldrychová Ústav biotechnologie Ing. Irena Kolouchová, Ph.D Současně s objevem a uvedením prvních antibiotik na trh docházelo též k rozvoji antibiotické rezistence. Proto byla snaha objevovat stále nové struktury a později je modifikovat nebo stávající antibiotika s různými mechanismy účinku vzájemně kombinovat. V neposlední řadě se nabízí možnost kombinovat konvenční antibiotikum a přírodní antimikrobiální láku. Stilbeny (resveratrol, pinosylvin, pterostilben a polydatin) jsou látky disponující mimo jiné i antimikrobiální aktivitou. Tato vlastnost byla zkoumána u gram-pozitivní bakterie Rhodococcus erythropolis a u kvasinky Trichosporon cutaneum. Pomocí mikrokultivačního zařízení Bioscreen byly stanoveny minimální inhibiční koncentrace (MIC) těchto látek. V této práci byl dále studován vliv stilbenů na růst mikrobiální populace v kombinaci s konvenčními antibiotiky chlorhexidinem a amphotericinem B. Biotechnologie II Kvantifikace adheze anaerobních pivovarských kontaminantů Bc. Nikola Podolová Ústav biotechnologie doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D. V rámci modernizace pivovarských technologií byl za účelem zajištění senzorické stability produktu značně redukován přístup kyslíku do piva. Z toho důvodu se ale zvýšila četnost kontaminací piva anaerobními bakteriemi rodu Pectinatus a Megasphaera. Přítomnost těchto bakterií byla zjištěna např. v prostorech stáčíren, tedy i v aerobním prostředí, přestože jsou zmíněné bakterie striktně anaerobní. Vysvětlením tohoto fenoménu je fakt, že se studované mikroorganismy stanou součástí biofilmu, což je organizované mnohobuněčné konsorcium umožňující buňkám vzájemnou komunikaci, koordinaci a především vyšší odolnost v nepříznivých podmínkách. Cílem předložené práce bylo kvantifikovat adhezi (první krok v procesu tvorby biofilmů) bakterií Pectinatus frisingensis a Megasphaera cerevisiae. Adheze byla studována na modelových nosičích s upraveným povrchem (hydrofilní, hydrofobní s pozitivním a negativním povrchovým nábojem) tak, aby povrch nosičů simuloval vlastnosti materiálů běžně používané v průmyslu (sklo, plasty, nerez a další). Modelové nosiče byly umístěny v drip-flow reaktoru společně s cirkulující suspenzí zkoumaných bakterií. Ke kvantifikaci adheze byly použity mikroskopické metody s následnou obrazovou analýzou.

8 Biotechnologie II Interakce fenolických polutantů v průběhu mikrobiálních degradací jejich směsí Bc. Kateřina Rádlová Biotechnologie prof. Ing. Jan Páca, DrSc. Nitrofenoly jsou průmyslově důležité chemikálie využívané zejména pro výrobu farmaceutik, barviv, pesticidů nebo výbušnin. Kvůli jejich hojnému využití jsou častým zdrojem znečištění půdních a vodních ekosystémů. Mikrobiální odbourávání jednotlivých nitroaromatických látek bylo již poměrně dobře prozkoumáno, avšak dosud nejsou dostatečně popsány interakce nitroaromatických sloučenin při degradaci jejich směsí. Při našem experimentu jsme se zaměřili na odbourávání 4-nitrofenolu ve směsi s jinými nitroaromatickými sloučeninami, 2-nitrotoluenem a 3-nitrotoluenem. Experiment byl prováděn v náplňových bioreaktorech za aerobních podmínek pomocí směsné bakteriální kultury imobilizované na expandované břidlici. 4-nitrofenol byl utilizován jako jediný zdroj uhlíku, dusíku a energie. Pomocí HPLC/DAD byla v médiu měřena koncentrace nitroaromatických sloučenin a také dusitanových a dusičnanových iontů, vzniklých odštěpením nitroskupiny z aromatického jádra. Nejprve byl 4-nitrofenol odbouráván samostatně, následně bude odbouráván ve směsi s 2-nitrotoluenem a 3-nitrotoluenem a budou sledovány interakce těchto sloučenin. 4- nitrofenol byl odbouráván až do koncentrace 200 mg.l -1, odpovídající organické zátěži 650 mg.l -1.den -1. Mikrobiální kulturou byl kompletně mineralizován s dusitanovými a dusičnanovými ionty jako jedinými produkty degradace. Biotechnologie II Zvýšení trvanlivosti nefiltrovaného piva Bc. Tereza Tůmová Ústav biotechnologie prof. Ing. Pavel Dostálek CSc., Ing.Blanka Kotlíková Nefiltrované pivo je legislativou definováno jako pivo, které neprošlo filtrací. Zejména v případě restauračních minipivovarů to znamená, že se k zákazníkovi dostává takové, jaké je, když opouští ležácké tanky. Obsahuje velké množství živých kvasinek a proto je spotřebiteli tolik ceněno. Právě kvůli vysokému obsahu živých mikroorganismů je nefiltrované pivo určeno k velmi rychlé spotřebě. Protože je po tomto pivu mezi konzumenty stále větší poptávka, je nutné prodloužení jeho trvanlivosti, která je v současnosti při správném skladování zhruba dva týdny. Trvanlivost tohoto piva lze prodloužit jen inaktivací mikroorganismů. Inaktivace pak umožní konzumovat toto pivo i jinde než na místě výroby. Metoda inaktivace, kterou jsme se přednostně zabývali, je pasterace. Hlavním předmětem této práce je nalezení optimální teploty a doby pasterace, která zajistí požadovanou dobu trvanlivosti, a zároveň bude mít co nejmenší vliv na senzorické vlastnosti piva, jejichž hodnocením se budeme zabývat v další etapě.

9 Komise: Předseda: Členové: Biotechnologie III (přednášková) A12, 9:00 prof. Ing. Pavel Dostálek, CSc. Ing. Irena Kolouchová, PhD Ing. Gita Procházková Soutěžící: Bc. Hana Bahounková Bc. Jan Bílek Bc. Petra Boledovičová Bc. Jakub Nešpor Bc. Zuzana Pacáková Bc. Andrej Suchánek Bc. Karel Zeman Biotechnologie III Měření spotřeby kyslíku použitím optických mikrosenzorů kyslíku Hana Bahounková Ústav biotechnologie prof. Georg Gübitz, Dr. Ing. Leona Paulová Alkydové pryskyřice jsou polyestery, obsahují nenasycené mastné kyseliny, které se používají jako pojiva v barvách a nátěrových hmotách. Vysušení polyesterů je založeno na zesítění funkčních skupin nenasycených mastných kyselin katalyzované těžkými kovy. Nejúčinnějšími katalyzátory jsou komplexy kobaltu, u kterých byly prokázány karcinogenní účinky. Z toho důvodu byla hledána netoxická alternativa. V rámci práce byl zkoumán účinek mediátorů a lákázy na různé substráty. Již dříve bylo prokázáno, že zesítění pomocí tohoto systému může nahradit katalyzátory těžkých kovů. Při postupné akumulaci molekulové hmotnosti dochází ke snížení obsahu kyslíku v médiu. Spotřeba kyslíku byla měřena optickými mikrosenzory kyslíku. Imobilizovaný indikátor na špičce čidla je podněcován k vyzařování světla. Je-li přítomen kyslík, dojde k převodu a přebytek energie je přenesen na molekuly kyslíku. Míra zhášení fluorescence odpovídá koncentraci kyslíku. Z testovaných látek byla prokázána nejvyšší spotřebu kyslíku u amoniové soli. Byla jedinou látkou, u které bylo dosaženo 0% koncentrace kyslíku, a to již po 200 minutách měření. Maximální spotřeba kyslíku byla navíc konstantně zachována až do ukončení měření.

10 Biotechnologie III Determinace polycyklických aromatických uhlovodíků a jejich polárních derivátů v atmosféře Bc. Jan Bílek Ústav biotechnologie Ing. Martin Halecký, PhD.; Ing. Tomáš Vaněk Polycyklické aromatické uhlovodíky jsou látky disponující značným karcinogenním a mutagenním charakterem. Vznikají zejména provozem dieselových motorů a spalováním tuhých paliv. V emisích pak vstupují do zemské atmosféry, čímž bezprostředně ohrožují zdraví lidí i zvířat. Jejich stanovení v plynné fázi je podrobně popsáno v mnoha odborných publikacích, avšak existuje jen málo experimentů popisujících jejich chování na partikulárních částicích (aerosolech) generovaných již uvedenými procesy. Právě přítomnost pevné fáze a dále samotné složení a podmínky v atmosféře přispívají k formování polárních derivátů, např. oxy, hydroxy nebo nitropolycyklických aromatických uhlovodíků, které jsou pro člověka toxičtější a působí v nižších koncentracích než nesubstituované formy. V rámci tohoto projektu jsem pracoval s laboratorním průtočným reaktorem, jímž protékaly kombinace syntetických plynů vyskytujících se v atmosféře (N 2, NO X, O 3, O 3 + NO X ), které následně podléhaly reakcím se směsí polycyklických aromatických uhlovodíků. Pomocí plynové chromatografie s hmotnostním detektorem jsem poté identifikoval a kvantifikoval vznikající produkty s ohledem na implementaci metody do reaktoru s objemem o dva řády větším simulujícího reálné podmínky v atmosféře včetně generace partikulárních částic. Biotechnologie III Povrchové vlastnosti termofilních bakterií vyskytujících se jako kontaminanty v potravinářském průmyslu Bc. Petra Boledovičová Ústav biotechnologie Ing. Lucie Kyselová, Ph.D. Termofilní a termotolerantní zástupci některých bakteriálních rodů, především Alicyclobacillus, Geobacillus, Bacillus, Clostridium, Thermoanaerobacter a Moorella, jsou rozšířenými kontaminanty v potravinářském průmyslu, které mohou zapříčinit kažení potravin. Fakt, že byly izolovány z výrobních zařízení či potravinářských produktů, souvisí se schopností těchto bakterií tvořit vysoce termorezistentní spory, které jim umožňují přežít tepelné zpracování při výrobě potravin. Zároveň mají spory oproti vegetativním buňkám obvykle vyšší schopnost adheze na pevné povrchy, kde mohou dlouhodobě přežívat ve formě biofilmů. Práce je zaměřena na povrchové vlastnosti vegetativních buněk a spor vybraných bakteriálních kmenů s cílem předpovědět jejich adhezivní schopnosti na základě měření kontaktních úhlů a zeta potenciálů modelových nosičů a bakteriálního materiálu s využitím výpočtů volných interakčních energií podle XDLVO teorie. Součástí práce je také testování a vyhodnocení vhodných kultivačních a izolačních metod, které umožní získání co nejvyššího procenta spor a jejich následnou separaci.

11 Biotechnologie III Optimalizace chromatografické metody na základě centrálně kompozičního návrhu experimentu Bc. Jakub Nešpor Ústav biotechnologie Ing. Marcel Karabín, Ph.D. Používání nových analytických metod v pivovarství klade stále vyšší požadavky zejména na přípravu vzorků, ale i samotné provedení analytického postupu. V případě chromatografických metod je obvykle nejdůležitějším výsledkem optimalizace maximální plocha chromatografických pásů při zachování dostatečné separace stanovovaných látek. Dříve bylo pro tento účel používáno víceméně náhodné volby jednotlivých parametrů isolačního postupu i chromatografického stanovení, takže výsledkem byl soubor diskrétních hodnot s omezenou použitelností pro modifikaci metody mimo předem zvolený rámec. Značnou výhodou moderních optimalizačních postupů, jakým je i centrálně kompoziční návrh (CCD), je možnost nalezení spojité závislosti mezi volenými parametry a sledovanou hodnotou na základě relativně nízkého počtu analýz. Tato práce je zaměřena na seznámení se základními principy CCD a na jeho aplikaci pro stanovení senzoricky aktivních látek v pivu. Biotechnologie III Produkce jantarové kyseliny pomocí bakterie Actinobacillus succinogenes Zuzana Pacáková Ústav biotechnologie prof. Ing. Mojmír Rychtera, CSc.; doc. Dr. Ing. Petra Patáková Jantarová kyselina je významným průmyslovým prekurzorem pro velké množství praktických aplikací, zejména syntézy 1,4 butandiolu, tetrahydrofuranu, gama butyrolaktonu, biodegradabilních polymerů nebo jako součást léků a potravin. V současnosti je z velké části vyráběna chemickou syntézou. Avšak je možná realizace produkce biologickou cestou, například pomocí fakultativně anaerobní, kapnofilní bakterie Actinobacillus succinogenes. Ta je možným doplňkem chemického způsobu výroby. Tato cesta by mohla přinést ekonomicky výhodnou, a udržitelnou ekologickou výrobu. Dále vzhledem k využití CO 2 touto bakterií je možné spojení s jiným CO 2 produkujícím procesem a snížení tak jeho emisí. Cílem naší práce je testování schopností bakterie Actinobacillus succinogenes DSM jako producenta jantarové kyseliny, optimalizace podmínek a volba strategie kultivace v její prospěch, dále pak eliminace vedlejších produktů zejména C3 kyselin. To by mělo velký vliv pro ekonomickou izolaci a purifikaci, a následně přiblížení celého procesu komerčnímu využití. Dosavadní nejlepší výsledky při realizaci našich experimentů je koncentrace jantarové kyseliny 21,75 g/l při produktivitách 0,3-0,9 g/l.h. a při koncentraci mléčné kyseliny 19,48 g/l. Celková výtěžnost všech organických kyselin na utilizovanou glukosu činí %.

12 Biotechnologie III Ovlivnění produkce rhamnolipidů v bioreaktoru změnou podmínek kultivace Bc. Andrej Suchánek Ústav biotechnologie Ing. Olga Schreiberová, Ph.D; Ing. Richard Ježdík Rhamnolipidy jako povrchově aktivní látky biologického původu přitahují pozornost, protože představují ekologickou alternativu k jejich syntetickým protějškům. Velká výhoda v použití biosurfaktantů oproti chemickým surfaktantům spočívá v jejich velmi malé toxicitě a vysoké stabilitě vůči extrémním vnějším podmínkám prostředí (ph, obsah solí, teplota). V nízkých koncentracích rhamnolipidy zároveň nabízí vyšší aktivitu v kombinaci s velmi dobrou biologickou degradovatelností, což z nich dělá ekologicky šetrné sloučeniny. Biosurfaktanty nabízejí možnost širokého uplatnění, například ve farmaceutickém, potravinářském a kosmetickém průmyslu, využití nachází také v ochraně životního prostředí. Tato práce byla zaměřena na produkci rhamnolipidů v laboratorním bioreaktoru pomocí bakteriálních kmenů Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus a Enterobacter asburiae, které byly již dříve prokázány jako producenti rhamnolipidů. Bylo provedeno porovnání schopnosti produkovat rhamnolipidy u jednotlivých kmenů a zjišťovány změny v produkci způsobené rozdílnými podmínkami kultivace zahrnující vzdušnění, míchání, teplotu, ph a zdroj uhlíku. Biotechnologie III Porovnání metod stanovení hydrofobity buněčného povrchu u jednobuněčných mikroorganismů Bc. Karel Zeman Ústav biotechnologie prof. Ing. Jan Masák, CSc. Charakter povrchu jednobuněčných mikroorganismů zásadním způsobem ovlivňuje schopnosti a ochotu buněk vytvářet biofilm. Hydrofobita patří k nejvíce studovaným vlastnostem buněčného povrchu a je všeobecně uznávána jako determinující faktor adheze buněk. Hydrofobita se stanovuje pomocí metody měření kontaktního úhlu, která ve spojení s termodynamickým přístupem poskytuje velmi dobré výsledky. Tato metoda je ovšem časově a přístrojově náročná. Další metodou je metoda MATH (Microbial adhesion to hydrocarbons), která je založena na porovnávání afinity buněčného povrchu ve vodě a v nepolárním rozpouštědle. Tato metoda je velmi rychlá, nenáročná, ale výsledné hodnoty jsou spíše orientační. Obě metody se vyskytují ve značné šíři modifikací pro různé jednobuněčné mikroorganismy. Naším cílem je nalézt takové podmínky stanovení, které by byly jednotně použitelné pro G+, G- bakterie i pro kvasinky. A aby bylo možné pomocí změny parametru kultivace, na základě výsledků měření, předpovědět pravděpodobnost tvorby biofilmů s vysokou přesností.

13 Komise: Předseda: Členové: Biotechnologie IV (přednášková) A04, 9:00 doc. Ing.Tomáš Brányik, PhD Ing. Marcel Karabín, PhD Ing. Barbora Branská, PhD Ing. Stanislava Vilčková Soutěžící: Bc. Soňa Kotúčová Bc. Natálie Moravcová Bc. Táňa Papoušková Bc. Alexandra Petrisheva Bc. Hana Raschmanová Bc. Iryna Sitnik Biotechnologie IV Rostlinná biomasa jako surovina pro biotechnologickou výrobu biopaliv Soňa Kotúčová Ústav biotechnologie prof. Ing. Mojmír Rychtera, CSc., Dr. Ing. Leona Paulová Stoupající trend spotřeby ropy a současné zvyšování její ceny vede k hledání alternativních zdrojů uhlíku, například rostlinné biomasy, pro biotechnologickou výrobu biopaliv Biopaliva se začala vyrábět z potravinářských surovin, čímž docházelo k jejich konkurenčnímu využití. Proto byl vyvinut způsob výroby biopaliv tzv. 2. generace, které jsou vyráběny ze zemědělských odpadních materiálů (v naší práci pšeničná sláma, hobliny topolu) nebo energetických rostlin (Ozdobnice čínská - Miscanthus sinensis). Důležitý je obsah hemicelulózy a celulózy jako zdroj uhlíku, proto prvním krokem k efektivnímu využití biomasy je její komplexní rozbor. Metodou, kterou doporučuje National Renewable Energy Laboratory (NREL) byl stanoven obsah celulózy ve vzorku pšeničné slámy pomocí HPLC na 35,60±4,12 %, obsah hemicelulózy na 17,17±2,12 %, obsah rozpustného ligninu spektrofotometricky a nerozpustného ligninu gravimetricky, přičemž celkový obsah ligninu ve vzorku byl 21,72±2,05 % a obsah popela stanoveného gravimetricky byl 5,45±0,35 %. Ve vzorku topolových hoblin byl stanoven obsah celulózy na 29,20±0,38 %, obsah hemicelulózy na 9,83±0,74 %, obsah ligninu na 21,43±0,19 % a obsah popela byl 2,02 %. Ve vzorku Miscanthus sinensis byl stanoven obsah celulózy na 36,65±2,98 %, obsah hemicelulózy na 14,82±1,31 %, obsah ligninu na 35,57±1,87 % a obsah popela byl 2,03±0,05 %. Cílem další práce je kyselá předúprava lignocelulózové biomasy, která povede k získání zkvasitelných sacharidů.

14 Biotechnologie IV Vliv koncentrace dvojmocných kationtů na produkci rhamnolipidů Natálie Moravcová Ústav biotechnologie prof. Ing. Masák Jan CSc., Ing. Richard Ježdík Surfaktanty jsou amfifilní sloučeniny schopné snižovat povrchové napětí tekutin. Kromě výroby syntetickou cestou je možná i produkce pomocí mikrobiologických činitelů, což je výhodné zejména z hlediska možnosti biodegradability těchto látek a tím nesrovnatelnému ulehčení životnímu prostředí. Díky tomu mohou být potencionálně využívány v mnoha odvětvích průmyslu, ať už je to průmysl petrochemický, průmysl farmaceutický, potravinářský, či při čištění životního prostředí. Produkce rhamnolipidů jako zástupců biosurfaktantů je ovlivňována jak typem producenta, složením média (například zdrojem dusíku, uhlíku, koncentrací hořečnatých a železnatých iontů) a dalšími vnějšími podmínkami kultivace. V této práci byl zkoumán vliv dvojmocných kationtů na produkci rhamnolipidů při použití producentů rodu Pseudomonas, Acinetobacter a Enterobacter. Biotechnologie IV Vliv biocidních látek na adhezivní vlastnosti obalových vrstev mikroorganismů Bc. Táňa Papoušková Ústav biotechnologie Ing. Olga Schreiberová, Ph.D. Biofilm je definovaný jako společenství mikroorganismů přilnutých k pevnému povrchu, produkující matrix, který obklopuje buňku a je tvořen extracelulárními polymerními látkami (EPS). EPS tvoří struktury uchycující mikroorganismy k povrchu a chrání buňky před vnějšími vlivy. Biofilmy jsou jednou z významných příčin chronických, zánětlivých a infekčních onemocnění u rostlin a živočichů. Hlavními složkami EPS jsou proteiny, sacharidy a DNA. Kvasinka Trichosporon cutaneum je lidský patogen způsobující nehtové mykózy a onemocnění bíla piedra. V této práci byl zkoumán vliv širokospektrálního antimykotika amfotericinu B na produkci proteinů, sacharidů a DNA ve volných a vázaných EPS biofilmu kvasinky Trichosporon cutaneum. Amfotericin B byl aplikován v minimální inhibiční koncentraci (MIC) 0,1 mg/l a v subinhibičních koncentracích po dobu 24 hodin k narostlému biofilmu pro zjištění změn ve složení a stabilitě biofilmu a produkci EPS.

15 Biotechnologie IV Stanovení hydrofobních glykoproteinů v pivu Bc. Alexandra Petrichsheva Ústav biotechnologie prof. Ing. Pavel Dostálek, CSc; Ing. Jana Olšovská, Ph.D. (VÚPS Praha); Ing.Pavel Čejka, CSc. (VÚPS Praha) Pěnivost českého piva je velmi důležitým znakem pro spotřebitele. Pěnivost piva záleží na mnoha faktorech. Vliv mají suroviny, technologický proces i vlastní skladování. Ačkoliv existuje mnoho metod pro stanovení stability pěny, je poměrně málo metod na předpověď pěnivosti piva na základě jeho složení. Pěna piva je přímo způsobena rozpustnými termostabilními proteiny. Tyto proteiny positivně ovlivňující pěnu můžeme rozdělit na skupinu proteinů s vyšší molekulovou hmotností (HMW kda) a skupinu s nižší molekulovou hmotností (LMW kda). Tyto proteiny většinou pochází ze sladu, ale malá část pochází z kvasinek. Největší význam z těchto dvou skupin na pěnu mají tzv.hydrofobní glykoproteiny. Cílem této práce bylo zavést metodu stanovení hydrofobních glykoproteinů v pivu. Metoda je založená na separaci hydrofobních glykoproteinů metodou chromatografie s hydrofobní interakcí (HIC). Následně se separované hydrofobní glykoproteiny byly stanoveny metodou podle Bradfordové. Tato spektrofotometrická metoda je velmi citlivá, rychlá a přesná. Touto metodou bylo proměřeno deset různých vzorků piv. Množství stanovených glykoproteidů bylo v pivech bylo porovnáno s jejich pěnivostí. Biotechnologie IV Produkce fúzního proteinu kvasinkou Pichia pastoris Hana Raschmanová Ústav biotechnologie Dr. Ing. Leona Paulová Pichia pastoris je methylotrofní kvasinka, jež je v současné době hojně využívána jako expresní systém pro produkci intracelulárních i sekretovaných rekombinantních proteinů. V této práci je použit kmen kvasinky Pichia pastoris, který má pod kontrolu methanolem indukovatelného alkoholoxidasového promotoru naklonovaný gen pro fúzní protein vepřový trypsinogen-fluorescenční protein EGFP. EGFP slouží jako značka umožňující monitorování produkce trypsinogenu pomocí fluorescenční mikroskopie, fluorimetrie a průtokové cytometrie. Cílem práce je sledování vztahu mezi specifickou růstovou rychlostí kmene, produkcí trypsinogenu a mírou jeho sekrece z buňky. Za účelem kvantifikace fluorescence měřené na fluorimetru byl izolován čistý EGFP,který byl použit jako standard pro sestrojení kalibrační přímky. Byly připraveny protokoly pro stanovení viability produkčního kmene a intracelulárního obsahu EGFP pomocí průtokové cytometrie, byly naměřeny základní růstové parametry daného kmene na glycerolu (µ max = (0,200±0,018) h -1, Y X/glycerol = (0,606±0,030) g.g -1 ) a methanolu (µ max = (0,067±0,021) h -1, Y X/methanol = (0,261±0,015) g.g -1 ) a byly provedeny první přítokované kultivace, při nichž bylo dosaženo koncentrace až 49 mg.l -1 trypsinogenu v médiu.

16 Biotechnologie IV Produkce kyseliny jantarové bakterií Basfia succiniciproducens Iryna Sitnik Ústav Biotechnologie doc. Dr. Ing. Petra Patáková Kyselina jantarová je důležitá chemikálie, která se používá v potravinářství, zemědělství, chemickém a farmaceutickém průmyslu. Kyselina jantarová se tradičně vyrábí z ropných produktů. Alternativně je však možné vyrábět kyselinu jantarovou bakteriální fermentací. Cílem realizovaných experimentů bylo optimalizovat kultivační podmínky pro bakterii Basfia succiniproducens DSM Byla testována možnost využití několika různých zdrojů uhlíku, jako jsou glukóza, sacharóza a škrob. V průběhu kultivace se kromě kyseliny jantarové vytvářely i jiné produkty fermentace, kyselina mléčná, jablečná a octová. Bylo zjištěno, že při využití sacharózy jako zdroje uhlíku se zvyšuje koncentrace cílového produktu ve srovnání s případy, kdy byla použita glukóza. Při využití 30 g/l glukózy jako zdroje uhlíku v průběhu 34-hodinové vsádkové fermentace byla nejvyšší dosažená koncentrace kyseliny jantarové 10,8 g/l, při čemž celková nejvyšší produkce kyselin byla 18,3 g/l. Výtěžnost a produktivita tvorby kyseliny jantarové byly 36 g/g glukózy a 0,32 g/l h -1.

17 Seznam sekcí a složení komisí ústav 320 Komise: Předseda: Členové: Studenti: Bioanalytika a bioinformatika (posterová) B21, 9:00 doc. Ing. Pavel Kotrba, Ph.D. Ing. Jiří Šantrůček, Ph.D. Ing. Mgr. Štěpánka Hrdličková Kučková, Ph.D. Ing. Tibor Füzik Ing. Lucie Musilová Bc. Václav Mareška () Bc. Terezie Marková () Bc. Veronika Martinská () Bc. Vladimíra Pavlíčková () Bc. Karolína Sobotková () Bc. Olga Součková () Bioanalytika a bioinformatika Stanovení konformačních rovnováh glycerolu pomocí molekulárních simulací Václav Mareška Biochemie a Mikrobiologie doc. Ing. Vojtěch Spiwok, Ph.D. Konformace glycerolu je dána dvěma torsními O-C-C-O úhly Φ a Ψ, které mohou zaujímat tři energetická minima α, β a γ. Kombinací minim pak vzniká 9 párů možných konformací αγ, βα, ββ, βγ, γα, γβ a γγ, z nichž 3 páry jsou identické díky symetrii (αβ=βα, αγ=γα, βγ=γβ). Konformační rovnováha glycerolu ve vodném prostředí může být predikována pomocí metod molekulárních simulací podobně, jako může být měřena pomocí experimentálních metod. V naší práci se snažíme předpovědět zastoupení jednotlivých konformací glycerolu pomocí metod simulace molekulové dynamiky a nově publikované metadynamiky well-tempered ensemble. Ta je založena na simulační technice zvané metadynamika, která poskytuje lepší vzorkování v porovnání s klasickou simulací molekulové dynamiky. Metadynamika well-tempered je vylepšená forma metadynamiky s adaptivním stupněm zaplavování. Metadynamika well-tempered ensemble je formou metadynamiky well-tempered se zaplavováním energetických minim v prostoru potenciální energie, což poskytuje lepší předpověď volné energie molekul. Výsledky našich výpočtů pak porovnáváme mezi sebou a s experimentálními výsledky získanými z literatury.

18 Bioanalytika a bioinformatika Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Vývoj metody pro stanovení opiátů v biologickém materiálu plynovou chromatografií s hmotnostní detekcí Terezie Marková Ústav biochemie a mikrobiologie; Laboratoře AGEL a. s., Nový Jičín prof. Dr. RNDr. Oldřich Lapčík; RNDr. Tomáš Gucký, PhD. Opiáty zahrnují skupinu látek odvozených od morfinu, hlavního alkaloidu opia. Opium je zaschlá šťáva rostliny mák setý (Papaver somniferum). Hlavní význam opiátů spočívá v jejich analgetickém účinku. Účinky jednotlivých opiátů se však mírně liší. Příkladem je morfin, který se používá jako analgetikum, mezi jeho negativní účinky patří útlum dechového centra a zvýšení tonu hladké svaloviny. Kodein má analgetické působení silně omezené, ale využívá se jako antitusikum díky inhibici centra pro kašel. Opiáty jsou často zneužívány pro své euforizující účinky. Klinický význam kvantitativní analýzy opiátů v biologickém materiálu spočívá v kontrole reakce organismu na terapii, a tedy účinku léčiv. Dále se kvantitativní analýza používá při podezření na intoxikaci nebo naopak neúčinnost léčby a při zneužívání opiátů. Cílem práce je vyvinout metodu, která by byla rychlá a univerzální, a zároveň splňovala všechny požadavky pro validaci a zavedení do praxe. Připravili jsme standardy jednotlivých opiátů a nyní se zabýváme hledáním vhodné úpravy vzorku a výběrem derivatizační metody, pro stanovení plynovou chromatografií s hmotnostně-spektrometrickou detekcí. Studium proteinů vnitřních buněčných membrán pomocí hmotnostní spektrometrie Veronika Martinská Ústav biochemie a mikrobiologie doc. Dr. Ing. Radovan Hynek; Ing. Lucie Maršálová Proteiny vnitřních buněčných membrán úzce souvisí s mnoha důležitými procesy v buňce, např. s transportem látek mezi organelami. Vystavení buňky stresu často vede k nefunkčnosti těchto proteinů, což může souviset s onemocněními. Tato problematika však v současné době není dostatečně prozkoumána, proto je nezbytné vyvinout spolehlivou metodu studia těchto proteinů, která by v budoucnosti zlepšila indikaci onemocnění a umožnila léčbu. Membránové proteiny představují ve srovnání s hydrofilními proteiny analytický problém vzhledem k jejich značné hydrofobicitě. Základem práce bylo ověření aplikace metodiky používané pro studium proteinů plasmatické membrány na proteiny vnitřních buněčných membrán. Metodika zahrnuje kombinaci technik chromatografie na reverzní fázi, umožňující rozdělení proteinů dle jejich hydrofobicity, štěpení proteinů v roztoku a LC-MS/MS analýzu, případně s použitím itraq značení. Celkově bylo identifikováno přes 300 různých proteinů, z nichž přibližně čtvrtinu tvoří proteiny s predikovanými transmembránovými doménami. Bylo také dokázáno, že použitá metodika umožňuje nejen identifikaci, ale i kvantifikaci hydrofóbních proteinů, což představuje možnost jejího využití při diagnostice.

19 Bioanalytika a bioinformatika Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Intracelulární lokalizace komplexů dimethiniových solí s barbituráty a jejich vliv na savčí buňky Vladimíra Pavlíčková Biotechnologie prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc. Polymethiniové sole (PMS) jsou přírodní či syntetické organické látky, jejichž základem je uhlíkatý řetězec s konjugovaným systémem dvojných vazeb, na jehož koncích jsou navázány heterocykly. Tyto látky jsou obvykle považovány za účinná barviva, která našla uplatnění v řadě průmyslových oblastí, ve fluorescenční mikroskopii, in vivo zobrazování a ve fotodynamické terapii při léčbě rakoviny. V této práci byly testovány nově navržené a syntetizované nesymetrické dimethiniové sole konjugované s barbituráty. Byl stanoven cytotoxický účinek PMS na nádorové buněčné linie U-2 OS, Mia PaCa-2, PaTu a HeLa. Intracelulární lokalizace PMS byla potvrzena pomocí fluorescenční mikroskopie na živých buňkách v reálném čase. Lokalizace PMS byla porovnána s komerčně dostupnými markery buněčných organel. Kvantitativní vztahy mezi strukturou a biologickou aktivitou (QSAR) studovaných dimethiniových solí byly testovány pomocí programu ACD/I-Lab. Vybrané PMS byly podrobně charakterizovány a bylo testováno jejich potenciální využití v oblasti biomedicíny a fluorescenční mikroskopie. Stanovení genotoxicity hořčíkových slitin metodou Comet assay Karolína Sobotková Ústav biochemie a mikrobiologie Ing. Jan Lipov, Ph.D.; Ing. Eva Jablonská Hořčíkové slitiny jsou považovány za nadějný biomateriál pro výrobu dočasných ortopedických implantátů. Hořčík, základní prvek Mg-slitin, je oproti jiným kovům, používaným ve zdravotnictví dnes (Ni, Cr, Co), biokompatibilní, odbouratelný a osteokonduktivní, což ho ke zmíněným aplikacím předurčuje. Nevýhodou Mg je však jeho vysoká rychlost koroze v těle a nedostatečná pevnost. Proto je snaha Mg modifikovat a zlepšovat tak jeho vlastnosti. Jednou z možností úprav je přídavek legujících prvků. Naším úkolem bylo otestovat biokompatibilitu (genotoxicitu) Mg-slitin na tkáňových kulturách metodou Comet assay, což je technika detekující poškození DNA (zejména zlomy DNA). Buňky U-2 OS či L 929 byly ovlivněny extrakty slitin, suspendovány do mikrogelu, lyzovány, následovala elektroforéza, barvení fluorescenčním barvivem a mikroskopická analýza. Dosud testované slitiny AZ31, WE43 a ZnMg (slitina na bázi Zn) nevykazovaly genotoxický efekt. Vhodnost těchto materiálů pro další biomedicínské aplikace bude nutno ověřit dalšími testy in vitro.

20 Bioanalytika a bioinformatika Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Virtuální screening ligandů lidské cystathionin-β-synthasy Olga Součková Ústav biochemie a mikrobiologie doc. Ing. Vojtěch Spiwok, Ph.D. Virtuální screening založený na protein-ligandovém dockingu je levnou a rychlou alternativou k high throughput screeningu a využívá se k vývoji nových léčiv. Jedná se o screening až milionů sloučenin, které lze získat z komerčně dostupných knihoven sloučenin. Postupnými kroky se z tohoto množství vyselektuje pouze pár nejlepších molekul. Přístupů k provedení dockingu je více. Cílový protein, kterým se v práci zabýváme, je enzym cystathionin-β-synthasa, který je jedním z enzymů transsulfurační dráhy. Katalyzuje reakci homocysteinu se serinem za vzniku cystathioninu a vody. Nedostatek nebo nestabilita tohoto enzymu se projevují zvýšenou koncentrací homocysteinu a methioninu v tělních tekutinách. Tento stav se nazývá homocystinurie, což je dědičné onemocnění. Naším záměrem je nalézt takové ligandy, které by daný enzym stabilizovaly a zvýšily tak jeho aktivitu. Cílovým místem pro screening ligandů enzymu je jeho N-koncová oblast, která váže kofaktor hem. Po nalezení vhodných ligandů bude přistoupeno k ověření jejich afinity k receptoru in vivo experimenty s radioaktivně značeným 14 C-serinem a k vyhodnocení pomocí tenkovrstevné chromatografie nebo kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostním detektorem.

21 Komise: Předseda: Členové: Studenti: Biologicky aktivní látky (posterová) B21, 9:00 doc. Ing. Vojtěch Spiwok, Ph.D. Ing. Michaela Marková, Ph.D. Ing. Martina Blažková, Ph.D. Ing. Jitka Viktorová Ing. Barbora Javůrková Bc. Martina Janoušková () Bc. Gabriela Kroneislová () Bc. Alice Michálková () Bc. Lucie Peterková () Bc. Klára Šulcová () Bc. Jan Weinberg () Biologicky aktivní látky Vliv přírodních látek na tvorbu extracelulárních polymerních látek v biofilmu Trichosporon cutaneum Martina Janoušková Ústav biochemie a mikrobiologie prof. Ing. Jan Masák, CSc. Biofilm je jako jedna z forem rezistence mikroorganismů v klinické praxi velkým problémem. Buňky, které se vyskytují v organismu v této formě, reagují na přítomnost antimikrobiálních látek odlišně než buňky planktonické. Mikroorganismy tvořící biofilm produkují a obalují se makromolekulárními látkami, které se nazývají extracelulární polymerní látky. Cílem práce bylo zjistit, jaký mají rhamnolipidy vliv na tvorbu extracelulárních polymerních látek v biofilmu Trichosporon cutaneum. Rhamnolipidy jsou přírodní látky produkované bakterií Pseudomonas aeruginosa. Řadí se mezi bakteriální surfaktanty, tedy látky, které snižují povrchové napětí. Kvasinka T. cutaneum je součástí kožní mikroflóry. U imunokompromitovaných pacientů může způsobit systémová onemocnění. Dalším onemocněním, které T. cutaneum způsobuje, je mykotické postižení kůže a vlasů, např. bílá piedra. Byl zkoumán vliv rhamnolipidů na biofilm a tvorbu a složení EPS kvasinky T. cutaneum. Biofilm T. cutaneum byl kultivován na silikonových nosičích v minerálním médiu po dva týdny. Po přidání rhamnolipidů byly sledovány změny v obsahu biomasy v biofilmu a složení a obsah proteinů a sacharidické části EPS pomocí spektrofotometrických metod.

22 Biologicky aktivní látky Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Syntéza antimikrobiálních krátkých peptidů a testování jejich biologické aktivity Gabriela Kroneislová Ústav biochemie a mikrobiologie Ing. Petra Lovecká, Ph.D. Vzhledem k zvyšujícímu se počtu mikroorganismů rezistentních vůči současným antibiotikům je potřeba hledat nové látky s antimikrobiálními účinky. Jednou z nadějných skupin jsou antimikrobiální peptidy, které mají široké spektrum účinku a vysokou specifitu. Jejich nedostatkem je však jejich možná cytotoxicita. Cílem této práce je příprava krátkých peptidů a studium jejich antimikrobiálních aktivit v porovnání s klasickými antibiotiky. Struktura byla navržena podle rostlinného antimikrobiálního peptidu izolovaného z kokosového mléka. Vedle syntetického kokosového peptidu byly nasyntetizovány jeho modifikované formy. Všechny tyto modifikace (amidace, substituce poslední aminokyseliny a esterifikace) by mohly vést ke zvýšení potenciálu antimikrobiální aktivity. Metodou chemické syntézy na pevné fázi bylo připraveno 6 peptidů, které byly následně přečištěny metodou RP-HPLC a jejich molekulová hmotnost byla ověřena pomocí ESI-q-TOF MS/MS. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) bude určena pomocí přístroje Bioscreen C a bude porovnávána s MIC klasických antibiotik. U vybraných peptidů bude posouzena cytotoxicita pomocí systému RTCA DP Analyzer (Roche) na tkáňových liniích jaterních nádorových buněk HepG2 a ledvinových embryonálních buněk HEK293T. Sledování rezistence bakterií mléčného kvašení k antibiotikům Alice Michálková Ústav biochemie a mikrobiologie Ing. Hana Sýkorová; Ph.D. Bakterie rodu Lactobacillus produkují řadu látek antimikrobiální povahy a současně s využitím některých typů mechanismů napomáhají chránit potravinářské výrobky či lidský organismus před pomnožením patogenních bakterií. V lidském organismu se bakterie rodu Lactobacillus vyskytují především v gastrointestinálním a urogenitálním traktu. Jejich antimikrobiálních vlastností můžeme využít při léčbě a zejména prevenci infekcí urogenitálního traktu. Tato práce je součástí projektu s názvem: Vývoj prototypu a ověření bezpečnosti a funkčnosti dámských hygienických prostředků s probiotickým účinkem pro prevenci urogenitálních infekcí, na kterém participuje Ústav biochemie a mikrobiologie a Ústav technologie mléka a tuků VŠCHT. Pro vývoj prototypu dámských hygienických prostředků s probiotickými účinky bylo použito několik různých kmenů rodu Lactobacillus izolovaných z poševních stěrů. Ze všech kmenů byly vybrány čtyři různé kmeny, kmeny G2 a MK291 jako hlavní kmeny pro aplikaci na tampón a kmeny MK33 a MK372 jako kmeny náhradní. U těchto kmenů je z hlediska bezpečnosti použití nutné testovat jejich rezistenci k antibiotikům a možný přenos rezistence na indigenní potenciálně patogenní mikroflóru.

23 Biologicky aktivní látky Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Biologická aktivita seskviterpenického laktonu trilobolidu a jeho derivátů Lucie Peterková Ústav biochemie a mikrobiologie prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc. Seskviterpenické laktony jsou bioaktivní přírodní látky s cytotoxickými, antimalarickými a imunomodulačními účinky, produkované řadou rostlin různých čeledí. Námi studovaný seskviterpenický lakton, trilobolid, svým působením pravděpodobně inhibuje sarko-/endoplasmatickou retikulární ATPasu (SERCA) udržující koncentrační gradient Ca 2+ iontů mezi sarko-/endo-plasmatickým retikulem a cytosolem. Porušení tohoto gradientu vyvolává stresovou odpověď endoplasmatického retikula, která po delším trvání indukuje apoptosu. WST-1 testem pro určení metabolické aktivity buněk jsme zjistili, že trilobolid je v závislosti na dávce a délce expozice cytotoxický pro testované nádorové linie U-2 OS, LNCaP, MIA PaCa, MCF-7 a HeLa. Deriváty trilobolidu, vzniklé modifikací postranního řetězce na pozici 8, ale u linie U-2 OS až do koncentrace 10 μm výrazný cytotoxický trend nevykazovaly. Dále byla pomocí fluorescenční mikroskopie živých buněk ověřována intracelulární lokalizace derivátů trilobolidu konjugovaných s porfyriny. Dosavadní výsledky naznačují lokalizaci těchto derivátů v mitochondriích, nebo lysosomech. Pro měření předpokládané interakce enzymu SERCA s trilobolidem metodou povrchové plasmonové resonance (SPR) je připravován rekombinantní enzym SERCA s histidinovou kotvou. Návrh a příprava krátkých peptidů s potenciální biologickou aktivitou Klára Šulcová Ústav biochemie a mikrobiologie doc. Dr. Ing. Zuzana Novotná Skupina antimikrobiálních peptidů je známá již od počátku 80. let 20. století. Jedná se o přírodní nebo syntetické látky s nízkou molekulovou hmotností. Byly izolovány z těl živočichů, rostlin, ale také z bakterií a mikroskopických vláknitých hub. Tyto sloučeniny poskytují široké spektrum biologických aktivit, a proto se mohou stát dobrými kandidáty pro nové léčebné prostředky. Cílem této práce bylo navrhnout a připravit čtyři syntetické peptidy. Peptidy byly připraveny chemickou syntézou na pevné fázi, přečištěny RP-HPLC a identifikovány ESI-q-TOF MS/MS. Dva z peptidů byly palmitoylovány na N-konci. U všech čtyř byla v pozici 11 připojena kyselina glutamová nebo její methylester. Antimikrobiální aktivita byla testována spektrofotometricky pomocí Bioscreenu C. Z výsledků vyplývá, že peptidy modifikované kyselinou palmitovou vykazují aktivitu proti bakteriím Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli a Pseudomonas aeruginosa a kvasince Candida albicans. Předběžné výsledky naznačují, že existuje souvislost mezi modifikací a antimikrobiální aktivitou studovaných peptidů.