Návod k použití CRC RAScan Combination Kit

Návod k použití CRC RAScan Combination Kit Souprava SURVEYOR Scan KRAS a NRAS Exons 2, 3 & 4 CE IVD se systémy Tento návod k použití si důkladně přečtěte před použitím tohoto produktu. Uschovejte si tento návod k použití, abyste se k němu mohli v případě potřeby vrátit.

Tato stránka je úmyslně ponechána prázdná.

Obsah 1 Výrobce... 3 2 Souprava CRC RAScan Combination Kit... 3 2.1 Použití... 3 2.2 Indikace pro použití... 3 3 Principy testu pro detekci mutací CRC RAScan KRAS a NRAS... 4 3.1 Geny KRAS a NRAS... 4 3.2 Analýza vzorků pacientů s použitím souprav SURVEYOR Scan... 4 3.3 Nukleáza SURVEYOR Nuclease... 5 4 Původ kontrol v soupravě... 6 5 Součásti... 7 5.1 Krabice SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710107)... 7 5.2 Krabice SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710400)... 8 5.3 Počet vzorků, které lze testovat pomocí jedné soupravy... 8 5.4 Sekvenování DNA... 9 6 Další požadované vybavení a reagencie... 9 7 Příprava reagencií... 9 8 Skladování a doba použitelnosti... 10 9 Upozornění a preventivní opatření... 10 10 Získání primárního vzorku, manipulace a uchovávání... 10 11 Postup testu... 11 11.1 Detekce somatických mutací s použitím souprav SURVEYOR Scan přehled... 11 12 Pokyny pro jednotlivé kroky... 12 12.1 POČÁTEČNÍ nastavení/kalibrace systému... 12 12.2 Před analýzou vzorků KRAS a NRAS... 12 12.3 Templát... 12 12.4 Pracovní schéma... 12 12.5 Amplifikační protokol... 15 12.6 Program termocykleru pro amplifikační protokol... 17 12.7 Kontrola kvality produktů PCR... 18 12.8 Digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease... 18 13 Kontrolní postupy... 20 13.1 Kontrola kvality soupravy CRC RAScan Combination Kit... 20 13.2 Použití kontrolních plasmidových DNA... 20 14 Interpretace výsledků... 21 14.1 Analýza KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 pomocí nukleázy SURVEYOR Nuclease... 21 14.2 Kontrola výsledků SURVEYOR Scan... 21 14.3 Příklady výsledků... 22 15 Co je třeba dodržovat... 29 15.1 Detekční hladina mutací získaných soupravou SURVEYOR Scan... 29 15.2 Potvrzení sekvence... 29 15.3 Omezení testu... 30 Příloha A... 31 A.1 Návrh uspořádání destičky pro soupravy SURVEYOR Scan... 31 A.2 Označení na kontrolní DNA... 31 A.3 Požadavky pro denaturaci v systému HPLC ()... 32 A.4 Uspořádání laboratoře pro testy PCR... 34 A.5 Odkazy na literaturu... 35 Příloha B... 36 Pokyny pro řešení problémů... 36 Podrobnosti pro objednávku... 43 Kontaktní údaje... 43 Překlad Prohlášení... 43 Licence, obchodní známky a autorská práva... 44

1 Výrobce 1 Výrobce Výrobce Zástupce pro EU M P Transgenomic, Inc. 12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA Tel: 1-402-452-5400 Transgenomic Limited 40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK Tel: +44-141-892-8800 2 Souprava CRC RAScan Combination Kit 2.1 Použití Pouze pro profesionální použití. Souprava od společnosti Transgenomic CRC RAScan Combination Kit tvoří diagnostický test in vitro, kterým se zjišťují somatické mutace v úsecích Exons 2, 3 a 4 genů KRAS a NRAS. Tyto mutace jsou indikovány píky, které jsou výsledkem štěpení enzymem SURVEYOR Nuclease a zahrnují mutace známé svým potenciálním klinickým významem. Tato souprava je určena pro použití v klinické diagnostické laboratoři příslušně školenými pracovníky provádějícími testování DNA extrahované z tkání zalitých v parafínu a fixovaných formalinem. Souprava je identifikována katalogovým číslem 710077. Tento návod k použití je k dispozici ke stažení na http://world.transgenomic.com/files/literature/482427-en.pdf. 2.2 Indikace pro použití Kliničtí pracovníci mohou používat soupravu CRC RAScan Combination Kit se systémem jako vodítko k rozhodnutí, zda nádor kolorektálního karcinomu pacienta nebude vykazovat odezvu vůči léčivům na bázi anti-egfr (receptor pro epidermální růstový faktor), jako je panitumumab. Souprava CRC RAScan Combination Kit nesmí být používána k diagnóze kolorektálního ani jiného druhu karcinomu. Souprava CRC RAScan Combination Kit je testem používaným ke zjišťování možných somatických mutací v úsecích Exons 2, 3 a 4 genů KRAS a NRAS, avšak neumožňuje potvrzení identity sekvence mutace. K identifikaci přesné zjištěné mutace je třeba použít další analytickou metodu, jako je sekvenování DNA. Ačkoli výsledky analýzy získané těmito soupravami ukáží mutační stav pacienta, je třeba zvážit i další klinické faktory. Výsledky získané soupravou CRC RAScan Combination Kit nesmí být jedinou cestou k učinění rozhodnutí o léčbě pacienta s kolorektálním karcinomem. Je důležité mít na mysli, že použití systému k identifikaci vzorků pozitivních na mutaci genů KRAS a/nebo NRAS lze brát pouze jako vodítko a všechny mutace musí být potvrzeny další analýzou, jako je např. sekvenování DNA. Návod k použití soupravy CRC RAScan se systémy strana 3

3 Principy testu pro detekci mutací SURVEYOR Scan KRAS a NRAS 3 Principy testu pro detekci mutací CRC RAScan KRAS a NRAS 3.1 Geny KRAS a NRAS Léčivé přípravky cílící na receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) prokázaly svoji účinnost vůči kolorektálnímu karcinomu. Výzkum ukázal, že přibližně 40 % kolorektálních nádorů obsahuje somatické mutace genu KRAS a klinické studie ukázaly, že mutace v úseku KRAS exon 2 (kodony 12 a 13) předpovídají nedostatečnou odezvu vůči léčbě cílené na EGFR. Poslední výzkumné studie ukázaly, že populaci pacientů lze dále specifikovat jako pacienty, jejichž metastazovaný nádor mcrc obsahuje další mutaci v úseku KRAS exony 3 a 4 a/nebo v úseku NRAS exony 2, 3 a 4 rovněž vykazoval tendenci k nedostatečné odezvě vůči léčbě cílené na EGFR 1-7. Tato souprava je určena k použití v diagnostické analýze somatických mutací v úseku KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4. Souprava CRC RAScan Combination Kit tvoří test pro zjišťování všech sekvenčních a malých inzerčních/delečních změn v Exons 2, 3 a 4 genů KRAS a NRAS. Mutace v kodonech 12, 13, 59, 61, 117 a 146 genů KRAS a NRAS souvisejí s nedostatečnou účinností přípravku panitumumab. Pro mutace v kodonech 12, 61, 117 a 146 jsou v této soupravě dodány kontroly Positive Control. V této soupravě je použita chráněná technologie společnosti Transgenomic s názvem SURVEYOR Nuclease, která spolu se systémem poskytuje jednoduchou a citlivou detekci potenciálních mutací. Tato technologie může zjistit 2-5% směs mutantů na pozadí nezmutované DNA. Validační studie ukázaly extrémně vysokou konkordanci se sekvenováním kvalitně charakterizovaných vzorků kolorektálního karcinomu. Použití soupravy CRC RAScan Combination Kit sníží pro uživatele nároky na sekvenování a umožní zjištění sekvence, když software pro automatické sekvenování nezjistí přítomnost mutace nízké hladiny. Vzhledem vysoké citlivosti tohoto testu vůči Sangerově metodě sekvenování se doporučuje uspořádat laboratoř tak, aby se zabránilo příčné kontaminaci vzorků a kontrol. Ukázku optimálního uspořádání laboratoře naleznete v Příloze A.4 Uspořádání laboratoře pro testy PCR. 3.2 Analýza vzorků pacientů s použitím souprav SURVEYOR Scan Souprava CRC RAScan Combination Kit je určena pouze pro použití v rámci níže znázorněného pracovního schématu. Pracovní schéma Vzorek pacienta Test genů KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 Záznam výsledku Obrázek 1 Pracovní schéma použití soupravy CRC RAScan Combination Kit ke screeningu genů KRAS a NRAS Návrh uspořádání 96jamkových destiček pro analýzu všech úseků KRAS and NRAS Exons 2-4 naleznete v příloze A.1 Uspořádání destiček v soupravě CRC RAScan Combination Kit Návod k použití soupravy CRC RAScan se systémy strana 4

3 Principy testu pro detekci mutací SURVEYOR Scan KRAS a NRAS 3.3 Nukleáza SURVEYOR Nuclease Nukleáza SURVEYOR Nuclease od společnosti Transgenomic je mismatch - specifická (specifická pro chybné párování) endonukleáza z rostlinné DNA, která skenuje známé i neznámé mutace a polymorfismy v heteroduplexní DNA 8. Tento enzym štěpí s vysokou specificitou DNA v místech substituce báze chybným párováním a v místech jiných odchylek. Tato DNA endonukleáza štěpí oba řetězce heteroduplexu DNA na straně 3 chybně párovaného místa. Rozpoznává se chybné párování vzniklé inzercí/delecí a substitucí bází, avšak účinnost štěpení se mění podle sekvence chybného párování. Obrázek 2. Obrázek 1. Mechanismus účinku nukleázy SURVEYOR Nuclease. Endonukleáza rozpoznává chybné párování a provádí štěpení na straně 3 každé báze v chybném párování. Tím je štěpena dvoušroubovice DNA s přesahující jednou bází na konci 3. Nukleáza SURVEYOR Nuclease byla použita v širokém rozsahu situací pro přesnou detekci mutací a genetického polymorfismu. SURVEYOR Nuclease byla například použita k ověření přítomnosti známých mutací v řadě genů spojených s karcinomem ledvin, plic, hlavy a krku, s leukémií, endometriálním karcinomem a s předpovědí výsledku radioterapie 9,10,11. Souprava CRC RAScan Combination Kit je určena pro štěpení chybných párování v genech KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 před další analýzou v systému. Poznámka: Je-li vzorek 100% mutantní DNA, nebudou se tvořit žádné heteroduplexy a vzorek se bude jevit jako Wild-Type. Avšak vzorky z biopsie nádoru budou obsahovat buňky typu Wild- Type v důsledku heterogenity nádoru a/nebo kontaminace normální tkání; 5% a 95% mutantní DNA budou mít identické elektroferogramy. Poznámka: Pro část testu zahrnující PCR lze používat pouze polymerázu DNA Polymerase dodávanou v soupravě. Poznámka: Dodržujte konkrétní pokyny v příručce pro systém. V zájmu úspěšného používání této soupravy důrazně doporučujeme, abyste si tuto příručku důkladně přečetli a pozorně postupovali podle pokynů a návodů v ní obsažených. Uživatelé pracující s touto soupravou poprvé by měli provést kontrolní experimenty uvedené v části Použití kontrolních plasmidových DNA. Máte-li další dotazy nebo potřebujete-li asistenci, zatelefonujte na číslo (888) 233-9283 (pouze pro severní Ameriku), +1 (402) 452-5400 nebo +44 (0) 141 892 8800 (Evropa) a požádejte o KRAS a NRAS support (podporu pro KRAS a NRAS). Další možností je poslat nám e-mail na: SURVEYORscan@Transgenomic.com Návod k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémy strana 5

4 Původ kontrol v soupravě 4 Původ kontrol v soupravě Kontroly dodávané s touto soupravou jsou plasmidové klony úseků KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4. Všechny klony byly sekvenovány, aby byla ověřena věrnost jejich sekvence ve srovnání s referenční NCBI Reference Sequence: NG_007524.1 (KRAS) a NG_007572 (NRAS). Kontroly mají genetickou známku. Viz Příloha A.2 Označení na kontrolní DNA; tyto varianty sekvencí KRAS nebo NRAS Wild-Type v úseku, kde se mutace nepředpokládají, lze použít k řešení problémů s kontaminací vzorků kontrolami Positive Control. Ukázku takové kontaminace ukazuje křivka SURVEYOR Scan v Příloze B - Pokyny pro řešení problémů, 8. Kontrola KRAS Control Wild-Type je zkonstruována syntézou a klonováním úseku KRAS Exons 2, 3 a 4 s použitím NCBI Reference Sequence NG_007524.1. Kontrola KRAS Positive Control exon 2 byla vytvořena syntézou sekvence KRAS Exon 2 s použitím výše uvedené referenční sekvence, avšak obsahující mutaci G12D. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 12, a to změna GGT>GAT (mutace G12D). Tento klon je poté zkombinován s DNA KRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní kombinace. Kontrola KRAS Positive Control Exon 3 byla vytvořena syntézou sekvence KRAS Exon 3 s použitím výše referenční sekvence obsahující mutaci Q61H. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 61, a to změna CAA>CAC (mutace Q61H). Tento klon je poté zkombinován s DNA KRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní kombinace. Kontrola KRAS Positive Control Exon 4A byla vytvořena syntézou úseku KRAS Exon 4 s použitím výše uvedené reference, avšak obsahující mutaci K117N. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 117, a to změna AAA>AAT (mutace K117N). Tento klon je poté zkombinován s DNA KRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní kombinace. Kontrola KRAS Positive Control Exon 4B byla vytvořena syntézou úseku KRAS Exon 4 s použitím výše uvedené referenční sekvence, avšak obsahující mutaci A146T. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 146, a to změna GCA>ACA (mutace A146T). Tento klon je poté zkombinován s DNA KRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní kombinace. Kontrola NRAS Control Wild-Type je zkonstruována syntézou a klonováním úseku NRAS Exons 2, 3 a 4 s použitím NCBI Reference Sequence NG_007572. Kontrola NRAS Positive Control Exon 2 byla vytvořena syntézou sekvence NRAS Exon 2 s použitím výše referenční sekvence obsahující mutaci G12D. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 12, a to změna GGT>GAT (mutace G12D). Tento klon je poté zkombinován s DNA NRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní směsi. Kontrola NRAS Positive Control Exon 3 byla vytvořena syntézou sekvence NRAS Exon 3 s použitím výše referenční sekvence obsahující mutaci Q61K. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 61, a to změna CAA>AAA (mutace Q61K). Tento klon je poté zkombinován s DNA NRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní směsi. Kontrola NRAS Positive Control Exon 4 byla vytvořena syntézou sekvence NRAS Exon 4 s použitím výše referenční sekvence obsahující mutaci A146T. Sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že jediná změna v sekvenci je v kodonu 146, a to změna GCC>ACC (mutace A146T). Tento klon je poté zkombinován s DNA NRAS Control Wild-Type za vytvoření heterozygotní směsi. Návod k použití soupravy CRC RAScan se systémy strana 6

5 Součásti 5 Součásti Souprava CRC RAScan Combination Kit se dodává ve dvou samostatných krabicích: (a) krabice reagencií pro analýzu úseku KRAS exony 2, 3 a 4 a (b) krabice reagencií pro analýzu úseku NRAS Exons 2, 3 a 4. Krabice společně obsahují dostatečné množství reagencií k provedení počtů analýz uvedených v části 5.3. 5.1 Krabice SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710107) Krabice s komponentami pro analýzu úseku KRAS Exons 2, 3 a 4 obsahuje dvě další krabice: (1) krabici s komponentami pro digesci SURVEYOR s 10 reagenčními zkumavkami a (2) složky pro PCR a kontroly s nosičem zkumavek obsahujícím 20 reagenčních zkumavek. Katalogové číslo Komponenta Krabice se složkami pro digesci SURVEYOR Barva víčka zkumavky Objem pro 130 reakcí 710160 SURVEYOR Nuclease W růžová 3 x 105 µl 710161 SURVEYOR Enhancer W2 černá 2 x 105 µl 708049 SURVEYOR Enhancer Cofactor růžová 2 x 105 µl 708027 0.15 M MgCl 2 Solution hnědá 2 x 105 µl 708030 Stop Solution červená 250 µl Krabice se složkami pro PCR a s kontrolami 703310 DNA Polymerase čirá 2 x 100 µl 703315 10x DNA Polymerase Reaction Buffer čirá 1 ml 703065 dntps (10 mm) čirá 2 x 500 µl 710155F KRAS Primer: Exon 2 Forward (10 µm) modrá 125 µl 710155R KRAS Primer: Exon 2 Reverse (10 µm) modrá 125 µl 710157F KRAS Primer: Exon 3 Forward (10 µm) modrá 90 µl 710157R KRAS Primer: Exon 3 Reverse (10 µm) modrá 90 µl 710154F KRAS Primer: Exon 4A Forward (10 µm) modrá 90 µl 710154R KRAS Primer: Exon 4A Reverse (10 µm) modrá 90 µl 710156F KRAS Primer: Exon 4B Forward (10 µm) modrá 90 µl 710156R KRAS Primer: Exon 4B Reverse (10 µm) modrá 90 µl 710131 KRAS Control Wild-Type žlutá 120 µl 710135 KRAS Positive Control Exon 2 zelená 40 µl 710136 KRAS Positive Control Exon 3 zelená 40 µl 710137 KRAS Positive Control Exon 4A zelená 40 µl 710138 KRAS Positive Control Exon 4B zelená 40 µl 710153F Universal Sequencing Primer 1 (10 µm) oranžová 125 µl 710153R Universal Sequencing Primer 2 (10 µm) oranžová 125 µl Návod k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémy strana 7

5 Součásti 5.2 Krabice SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710400) Krabice s komponentami pro analýzu úseku NRAS Exons 2, 3 a 4 obsahuje dvě další krabice: (1) krabici s komponentami pro digesci SURVEYOR s 10 reagenčními zkumavkami bez prázdných otvorů a (2) složky pro PCR a kontroly s nosičem zkumavek obsahujícím 14 reagenčních zkumavek. Katalogové číslo Komponenta Krabice se složkami pro digesci SURVEYOR Barva víčka zkumavky Objem pro 100 reakcí 710160 SURVEYOR Nuclease W růžová 2 x 105 µl 710161 SURVEYOR Enhancer W2 černá 105 µl 708049 SURVEYOR Enhancer Cofactor růžová 105 µl 708027 0.15 M MgCl 2 Solution hnědá 105 µl 708030 SURVEYOR Stop Solution červená 250 µl 710153F Universal Sequencing Primer 1 (10 µm) oranžová 2 x 125 µl 710153R Universal Sequencing Primer 2 (10 µm) oranžová 2 x 125 µl Krabice se složkami pro PCR a s kontrolami 703310 DNA Polymerase (250 U) červená 100 µl 703312 DNA Polymerase (50 U) červená 20 µl 703315 DNA Polymerase 10X PCR Buffer čirá 1 ml 703065 dntps (10 mm) čirá 500 µl 710452F NRAS Primer Exon 2 Forward (10 µm) modrá 90 µl 710452R NRAS Primer Exon 2 Reverse (10 µm) modrá 90 µl 710453F NRAS Primer Exon 3 Forward (10 µm) modrá 90 µl 710453R NRAS Primer Exon 3 Reverse (10 µm) modrá 90 µl 710454F NRAS Primer Exon 4 Forward (10 µm) modrá 90 µl 710454R NRAS Primer Exon 4 Reverse (10 µm) modrá 90 µl 710441 NRAS Control Wild-Type Mix žlutá 120 µl 710442 NRAS Positive Control Exon 2 zelená 40 µl 710443 NRAS Positive Control Exon 3 zelená 40 µl 710444 NRAS Positive Control Exon 4 zelená 40 µl 5.3 Počet vzorků, které lze testovat pomocí jedné soupravy Souprava CRC RAScan Combination Kit je určena pro testování 230 reakcí. Celkový počet vzorků, které lze testovat pomocí soupravy, závisí na průměrné velikosti testované dávky vzorků, neboť v každé destičce s reakčními směsmi musí být zahrnuta jedna sada kontrolních reakcí (kontroly Wild-Type Control, Positive Control a kontroly bez templátu). Níže uvedená tabulka ukazuje počet vzorků, které lze analyzovat soupravou KRAS a NRAS v závislosti na průměrné velikosti dávky vzorků. To zahrnuje (a) 21 kontrol (7x Wild-Type, 7x Positive Control, 7x kontroly bez templátu) požadovaných pro každý běh a (b) limit 230 reakcí na jednu soupravu. Poznámka: Analyzuje-li se více destiček, musí být na každé destičce zahrnuta každá sestava z 21 výše uvedených kontrol. Proto pro dvě destičky je zapotřebí 42 kontrolních reakcí; pro 3 destičky je zapotřebí 63 kontrolních reakcí, atd. Návod k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémy strana 8

5 Součásti Zvýší-li se velikost dávky vzorků, zvýší se tím i počet vzorků, které lze testovat pomocí jedné soupravy a tím se sníží průměrné náklady na reagencie vztažené na jeden vzorek. Níže uvedená tabulka slouží jako vodítko pro počet vzorků, které lze testovat pomocí souprav. Velikost dávky vzorků Počet kontrolních reakcí + Počet amplikonů vzorků Počet vyžadovanýc h na jeden běh Celkový počet běhů dávek vzorků na soupravu Celkový počet vzorků testovaný ch jednou soupravo u 1 21 + 7 28 8 8 2 21 + 14 35 6 12 3 21 + 21 42 5 15 4 21 + 28 49 4 16 5 21 + 35 56 4 20 5.4 Sekvenování DNA Pro sekvenování DNA všech testovaných vzorků jsou k dispozici primery (PN 710153F a 710153R). Pro sekvenování je třeba používat amplikony PCR vytvořené před digescí nukleázou SURVEYOR Nuclease. 6 Další požadované vybavení a reagencie Další komponenty a vybavení potřebné k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémem zahrnují následující: Systém, kolona, pufry, velikostní standard DNA - viz Příloha A.3.1 Specifikace systému pro aplikace SURVEYOR Scan, kde naleznete popis vhodného systému pro použití s touto soupravou Voda jakosti pro molekulární biologii 0,2 ml zkumavky pro PCR, pásy nebo 96jamková destička Mikropipety Pipetové špičky Ledová lázeň Míchadlo vortex Mikrocentrifuga Termocykler Agarózové gely a zařízení pro elektroforézu v agarózovém gelu 10% chlornan nebo podobný čisticí přípravek 7 Příprava reagencií Všechny reagencie dodávané v soupravě jsou připravené k použití. Některé komponenty je nutné před použitím rozmrazit, zamíchat na vortexu a/nebo odstředit v mikrocentrifuze; příslušné podrobnosti naleznete v níže uvedeném postupu testování. Sloučením reagencií se získají výchozí směsi a reakční směsi; úplné podrobnosti jsou uvedené v níže popsaném postupu testování. Návod k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémy strana 9

8 Skladování a doba použitelnosti 8 Skladování a doba použitelnosti Souprava se skladuje až do použití při teplotě mezi 18 ºC a -25 C v mrazáku s konstantní teplotou. Poznamenejte si datum použitelnosti u každé dodané soupravy. Po vypršení data použitelnosti soupravu nepoužívejte. Směs s nukleázou SURVEYOR Nuclease připravená v kroku 7 Digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease se musí použít okamžitě, neboť nukleáza SURVEYOR Nuclease W se v přítomnosti ostatních složek reakční směsi nukleázy SURVEYOR Nuclease během času deaktivuje. 9 Upozornění a preventivní opatření Žádná z reagencií v této soupravě není v dodaném množství nebezpečná pro lidské zdraví. Dokument společnosti Transgenomic pod číslem MSD-710077 lze stáhnout z http://world.transgenomic.com/files/literature/710077-en.pdf Souprava neobsahuje žádné látky lidského nebo živočišného původu, které by mohly způsobit infekci. Tuto soupravu mohou používat pouze osoby, které jsou vyškolené v příslušných laboratorních metodách. Při práci s komponentami této soupravy vždy používejte laboratorní plášť, jednorázové rukavice a ochranu očí. Po použití soupravy zlikvidujte komponenty, jako je např. nemocniční odpad, v souladu s místními pravidly a předpisy. Alikvotní množství reagencií odpipetovaná ze zkumavek v soupravě jsou určená pouze pro jedno použití. Komponenty soupravy zůstávají stabilní i po 25 cyklech zmrazení-rozmrazení. Po překročení tohoto počtu cyklů zmrazení-rozmrazení soupravu nepoužívejte. 10 Získání primárního vzorku, manipulace a uchovávání Souprava CRC RAScan Combination Kit je validována pro použití s DNA extrahovanou ze vzorků nádorů kolorektálního karcinomu zalitých v parafínu a fixovaných formalinem (FFPE). V zájmu optimální extrakce DNA je třeba tkáň 14-24 hodin před zalitím v parafinu fixovat ve formalinu. Biopsie z nádorů jsou heterogenní směsi nádorových a nenádorových buněk. Nádor samotný je navíc heterogenní směsí národových buněk s mutacemi a nádorových buněk bez mutací. Vzhledem k tomu, že tyto somatické mutace nemusí být rozptýleny v nádoru rovnoměrně, mohou být výsledné analýzy mutací z různých částí stejného nádoru různé. Aby se zvýšila pravděpodobnost detekce mutace, je třeba izolovat DNA z nádorové části tkáně oddělením pouze nádorové části ze sklíčka pomocí čerstvě sterilizovaného skalpelu pro každé nové sklíčko. V zájmu úspěšného použití této soupravy musí extrahovaná DNA splňovat kritéria v části Templát. POZNÁMKA: Extrahované vzorky DNA neurčené k okamžité analýze touto soupravou je třeba uchovávat zmrazené při teplotě od -20 ºC do -80 ºC. Návod k použití soupravy CRC RAScan se systémy strana 10

11 Postup testu 11 Postup testu 11.1 Detekce somatických mutací s použitím souprav SURVEYOR Scan - přehled Detekce mutace a potvrzení nukleázou SURVEYOR Nuclease zahrnuje tři kroky:. Krok 1 - Připravte amplikony PCR z mutantní (testované) a normální (referenční) DNA, v návaznosti na konečný amplifikační cyklus PCR rozpusťte veškeré dvoušroubovice a poté pomalu ochlazujte, čímž dojde k optimalizované tvorbě heteroduplexů a homoduplexů (heteroduplexy se tvoří, když jeden řetězec se sekvencí Wild-Type se spáruje s jedním řetězcem mutantní sekvence). Krok 2 - Aplikujte na směs spárovaných heteroduplexů/homoduplexů nukleázu SURVEYOR Nuclease. SURVEYOR Nuclease rozštěpí oba dva řetězce heteroduplexní DNA za vzniku fragmentů DNA. DNA Control Wild-Type, vystavená obdobnému postupu, slouží jako kontrola na pozadí. Krok 3 - Proveďte analýzu fragmentů DNA v systému. Tvorba nových produktů štěpení je v důsledku jednoho nebo více chybných párování indikována přítomností dodatečných chromatografických píků. Migrační časy produktů štěpení indikují velikost fragmentů a tím i přibližné umístění chybného nebo více chybných párování. Návod k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémy strana 11

12 Pokyny pro jednotlivé kroky 12 Pokyny pro jednotlivé kroky 12.1 POČÁTEČNÍ nastavení/kalibrace systému Při přípravě destičky SURVEYOR Nuclease pro analýzu v se obraťte na Přílohu A.3 Požadavky pro denaturaci v systému HPLC (). 12.2 Před analýzou vzorků KRAS a NRAS Před analýzou vzorků v systému se musí provést běh s velikostním standardem DNA, aby se ověřila správná funkce systému. Před analýzou musí laboratorní pracovník používající přístroj zkontrolovat kvalitu rozlišení velikostního standardu DNA. 12.3 Templát 1. U izolované templátové FFPE DNA proveďte pomocí běžných laboratorních postupů kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení extrahované DNA, aby bylo jisté, že je k dispozici dostatečné množství templátu pro PCR. 2. Poměr absorbance 260/280 musí být >1,80. 3. Pro optimální nastavení PCR musí být pracovní koncentrace templátu přibližně 12,5 ng/µl. Je-li třeba, zřeďte templátovou DNA ve vodě o jakosti pro molekulární biologii. 12.4 Pracovní schéma Souprava umožňuje analýzu 130 reakcí. Lze analyzovat i menší dávky vzorků, avšak s každou dávkou vzorků musí být zahrnuty kontroly ze soupravy i kontrola bez templátu. Souprava obsahuje dostatečný materiál pro kontrolu 130 reakcí všech kombinací používaných velikostí dávek vzorků. Zpracování vzorků musí být všeobecně prováděno od zahájení až do konce podle popisu v tomto návodu k použití. Musí-li být před dokončením celého postupu zpracování vzorku zastaveno, je nutné DNA uložit do -20 C, jak je ukázáno. Avšak zmrazené vzorky nemají být vystavovány opakovanému zmrazování a rozmrazování a zmrazená DNA amplifikovaná pomocí PCR ani produkty digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease nemají být skladovány při teplotě od -18 do - 25 C po delší dobu (>1 týden). Analýza vzorků se provádí podle níže znázorněného pracovního schématu: Návod k použití soupravy CRC RAScan se systémy strana 12

12 Pokyny pro jednotlivé kroky Oddělení tkáně 1 Izolace DNA a PCR 2 Gelová elektroforéza 3 5 Neúspěšný SURVEYOR Scan Vyhodnocení robustní/slabá PCR 4 SURVEYOR Nuclease a analýza v SURVEYOR Scan Pozitivní SURVEYOR Scan Negativní 7 6 Potvrzení sekvence NVD (varianta nedetekována) 8 Kvalita sekvence neúspěšná Kvalita sekvence prošla 9 Mutace v kodonech G12, G13, A59, Q61, K117 nebo A146 NVD Obrázek 3: Pracovní schéma analýzy se soupravou CRC RAScan Combination Kit Návod k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémy strana 13

12 Pokyny pro jednotlivé kroky Poznámky k obr. 3 1. DNA izolujte z FFPE (tkáň zalitá v parafínu a fixovaná formalinem) podle standardních laboratorních postupů. 2. Proveďte PCR a ověřte kvalitu DNA gelovou elektroforézou., 3. Vyhodnoťte a proveďte záznam, zda je proužek PCR Robustní ( 20 ng/µl) nebo Slabý (<20 ng/µl). Dojde-li k vytvoření více proužků PCR, připravte čerstvou genomickou DNA z FFPE. 4. U vzorků vyhodnocených po amplifikaci pomocí PCR buď jako Robustní PCR nebo Slabá PCR proveďte krok s nukleázou SURVEYOR Nuclease a analýzu v systému. Se slabou PCR může být množství DNA k získání smysluplných výsledků systémem nedostatečné, avšak může být dostatečné pro sekvenování. 5. Viz Příloha B Pokyny k řešení problémů, kde naleznete příklady neúspěšných výsledků ze SURVEYOR Scan. Všechny vzorky s neúspěšným výsledkem ze SURVEYOR Scan musí být znovu zpracovány jedním z následujících způsobů: a. opakování PCR, zbývá-li dostatečné množství genomické DNA b. nová extrakce DNA z FFPE; to by měla být až sekundární volba, neboť obvykle není žádoucí řezat další blok FFPE. c. použije-li se další řez nebo blok, musí být celý test znovu opakován, neboť vzhledem k heterogenní povaze nádoru může dojít k odchylkám při digesci. 6. Nejsou-li žádné viditelné píky v důsledku štěpení, zaznamenejte si negativní výsledek ze SURVEYOR Scan, tj. NVD = varianta nedetekována. 7. Ukazuje-li vzorek produkty štěpení enzymem SURVEYOR Nuclease (neshodující se s příslušnou kontrolou Wild-Type Control), je třeba je předat k ověření sekvenováním. 8. Je-li ověřovací analýza sekvence nevyhovující, poté zvolte jeden z následujících kroků: a. opakujte PCR, zbývá-li dostatečné množství genomické DNA b. proveďte novou extrakci DNA z FFPE; to by měla být až sekundární volba, neboť obvykle není žádoucí oddělovat další řezy z bloku FFPE. 9. Je-li ověřovací analýza sekvence vyhovující, potom výsledky znamenají jedno z následujícího: a. Sekvence Wild-Type, tzn. varianta nedetekována (NVD); nebo b. Varianta detekována. Ukazuje-li ověření sekvence jakoukoli změnu báze s výsledkem změny aminokyseliny v: i. kodonech 12 nebo 13 ii. kodonech 59 nebo 61 iii. kodonu 117; nebo iv. kodonu 146 vyhodnoťte jako pozitivní mutaci v KRAS o/nebo NRAS. Poznámka: je možné získat pozitivní výsledek ze SURVEYOR Scan, který bude sekvenováním zároveň potvrzen jako varianta nedetekována. Hladina detekce (LOD) pro SURVEYOR Nuclease v systému je pro některé mutace 2% mutantů v 98% typu Wild-Type, zatímco hodnota LOD sekvenování je přibližně 10-25% mutantů v 90-75% typu Wild-Type. Pozn: Je-li vzorek 100% mutantní DNA, nebudou se tvořit žádné heteroduplexy a vzorek se bude jevit jako Wild-Type. Avšak vzorky z biopsie nádoru budou obsahovat buňky typu Wild-Type v důsledku heterogenity nádoru a/nebo kontaminace normální tkání. Poznámka: vzorky s 5% a 95% mutantní DNA budou mít identické elektroferogramy. Návod k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémy strana 14

12 Pokyny pro jednotlivé kroky Poznámka: pozitivní výsledky SURVEYOR Scan lze získat i v důsledku jiných změn bází než jsou ty, které aktivují geny KRAS a/nebo NRAS. Tyto mutace jsou sice vzácné, avšak je nutné potvrzení další metodou, jako je např. sekvenování DNA, aby se určilo, zda pozitivní výsledek ze SURVEYOR Scan je či není KRAS a/nebo NRAS aktivující mutací. Pozn: proces fixace ve formalinu, požívaný při přípravě FFPE, může vést k deaminaci cytosinů. Během této deaminace se cytosin převádí na uracil. Polymeráza bude detekovat tento uracil jako thymin a začlení do kopírovaných řetězců adenin. To může být považováno za mutaci, při které se normální G nahrazuje za A s výsledkem mutace GC na AT, což je uměle vytvořená mutace, nikoli skutečná somatická mutace. Jedná se o vzácné případy, avšak dojde-li k brzkému kopírování při cyklování PCR, mohou být považovány za mutace. Při duplikované analýze se neopakují. Příklady potenciálních mutací vyvolaných deaminací cytosinu, které by byly zvažovány při rozhodování o léčbě pacienta, jsou v případě KRAS: - Kodon 12: AGT (G12S) a GAT (G12D) - Kodon 13: AGC (G13S), GAC (G13D) a GGT (G13G, tichá mutace) - Kodon 146: GCA>ACA (A146T) Příklady potenciálních mutací vyvolaných deaminací cytosinu, které by byly zvažovány při rozhodování o léčbě pacienta, jsou v případě NRAS: - Kodon 12: GGT> AGT (G12S) nebo GAT (G12D) - Kodon 13: GGT> AGT (G13S), GAT (G13D) nebo GGC (G13G, tichá mutace) - Kodon 146: GCC>ACC (A146T) Proto se doporučuje ověřit takové mutace duplikovanou analýzou stejné genomické DNA nebo podrobením všech vzorků duplikované analýze od začátku analýzy. 12.5 Amplifikační protokol 1. K dispozici jsou předmíchané roztoky dntp od Transgenomic (PN 703065 a 705020) s celkovou pracovní koncentrací deoxynukleotidů 10 mm (2,5 mm na každý ze čtyř deoxynukleotidů). 2. Primery KRAS a NRAS Forward a Reverse PCR (KRAS PN 710155F/R, 710157F/R, 710154F/R a 710156F/R; NRAS PN 710452F/R, 710453F/R a 710454F/R) se dodávají o koncentraci 10 µm. 3. Vyjměte 10µM primery, 10mM dntp a pufr DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN 703315) z mrazáku a nechte rozmrazit na ledu. 4. Po rozmrazení důkladně promíchejte všechny složky soupravy na vortexu (~10 sekund), krátce odstřeďte (~10 sekund), aby na víčkách zkumavek nezůstala žádná kapalina, a umístěte do ledu. 5. Na ledu připravte výchozí směsi. 6. Podle následující tabulky jako vodítka připravte výchozí směs pro každou z reakcí: KRAS Exon 2, KRAS Exon 3, KRAS Exon 4A, KRAS Exon 4B, NRAS Exon 2, NRAS Exon 3 a NRAS Exon 4: Počet reakcí (7 vzorků + 3 kontroly): 10 Výpočet objemu: Objem vody (µl) 330** DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl) 50 dntp (µl) 40 Forward Primer (µl) 25 Forward Primer (µl) 25 DNA Polymerase (µl) 10 Celkový objem výchozí směsi 48,0 Návod k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémy strana 15

12 Pokyny pro jednotlivé kroky **Poznámka: Je třeba dosáhnout minimálního množství 25 ng DNA na 50 µl reakční směsi PCR. Je-li koncentrace extrahované DNA nižší než 12,5 ng/µl, zvyšte úměrně objem extrahované DNA, abyste zajistili množství 25 ng na reakční směs. Rovněž snižte odpovídajícím způsobem objem vody ve výchozích směsích, abyste získali 50 µl na reakční směs. Ve všech vzorcích připravených s použitím těchto výchozích směsí bude muset být extrahovaná DNA naředěna na přibližně stejnou nejnižší hladinu koncentrace. Nedoporučuje se používat extrahovanou DNA o koncentraci <5 ng/µl. 7. Pro každou výchozí směs vypočítejte požadované objemy s použitím výše uvedené tabulky a dbejte na následující: (a) Pro výchozí směs 1 KRAS Exon 2 se vyžadují tři další reakce na jednu destičku se vzorky: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 2 a kontrola KRAS Exon 2 bez templátu (NTC1). (b) Pro výchozí směs 2, KRAS Exon 3, se vyžadují tři další reakce na jednu destičku se vzorky: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 3 a kontrola KRAS Exon 3 bez templátu (NTC2). (c) Pro výchozí směs 3 KRAS Exon 4Ase vyžadují tři další reakce na jednu destičku se vzorky: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4A a kontrola KRAS Exon 4A bez templátu (NTC3). (d) Pro výchozí směs 4 KRAS Exon 4B se vyžadují tři další reakce na jednu destičku se vzorky: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4B a kontrola KRAS Exon 4B bez templátu (NTC4). (e) Pro výchozí směs 5, NRAS Exon 2 budou zapotřebí do destičky se vzorky tři další reakce pro kontroly NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 2 a kontrolu NRAS Exon 2 bez templátu (NTC5). (f) Pro výchozí směs 6, NRAS Exon 3 budou zapotřebí do destičky se vzorky tři další reakce pro kontroly NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 2 a kontrolu NRAS Exon 3 bez templátu (NTC6). (g) Pro výchozí směs 7, NRAS Exon 4 budou zapotřebí do destičky se vzorky tři další reakce pro kontroly NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 2 a kontrolu NRAS Exon 4 bez templátu (NTC7). Poznámka: vezměte na vědomí, že bude zapotřebí poněkud větší objem výchozí směsi, aby se tak kompenzovaly ztráty během pipetování. 8. Označte 0,2ml zkumavky pro PCR a/nebo jamky na 96jamkové destičce údajem příslušného vzorku. 9. Označte 2,0ml centrifugační zkumavky pro přípravu výchozí směsi. 10. Přidejte do 2,0ml centrifugačních zkumavek s označením Výchozí směs požadovaný objem vody o jakosti pro molekulární biologii. 11. Přidejte do zkumavek s výchozí směsí požadované množství pufru DNA Polymerase 10X PCR Buffer. 12. Přidejte do zkumavek s výchozí směsí požadovaný objem 10mM nukleotidů dntp. 13. Přidejte do příslušných zkumavek s výchozí směsí požadovaný objem primerů KRAS a/nebo NRAS Forward Primer. 14. Přidejte do příslušných zkumavek s výchozí směsí požadovaný objem primerů KRAS a/nebo NRAS Reverse Primer. 15. Vyjměte enzym DNA Polymerase (PN 703310) z mrazáku. 16. Odstřeďte enzym DNA Polymerase přibližně 10 sek. 17. Zamíchejte enzym DNA Polymerase na vortexu přibližně 10 sek. 18. Přidejte požadovaný objem polymerázy DNA Polymerase do zkumavek s výchozí směsí. 19. Zavřete zkumavky s výchozí směsí víčkem. Návod k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémy strana 16

12 Pokyny pro jednotlivé kroky 20. Před použitím zkumavky s výchozí směsí zamíchejte na vortexu přibližně 30 sek. a poté krátce odstřeďte přibližně 10 sek. 21. Až do použití uložte do ledu. 22. Odpipetujte 48,0 µl (viz poznámka v kroku 6 výše) výchozí směsi do příslušných jamek; používáte-li jednokanálovou pipetu, vyměňujte špičky pipety mezi jednotlivými jamkami. Používáte-li opakovací pipetu, nesmí mezi jamkami docházet k úniku nebo rozstřiku. Uložte destičku na led. 23. Do příslušných jamek přidejte 2,0 µl (viz poznámka výše v kroku 6) templátové DNA ze všech vzorků nebo vodu (kontrola bez templátu, NTC). Pro každý vzorek použijte novou pipetovou špičku; snažte se zabránit kontaminaci mezi vzorky v důsledku rozstřikování. Zakryjte jamky obsahující DNA ze vzorků a NTC pásem s 8 kryty (používáte-li 96jamkovou destičku) a/nebo uzavřete 0,2ml zkumavky pro PCR. Zkontrolujte, že kryty jsou bezpečně utěsněny. 24. Až poté postupně otevřete kontroly s templátovou DNA ze souprav (PN 710131, 710135, 710136, 710137, 710138, 710441, 710442, 710443 a 710444). Nakonec odpipetujte 2,0 µl z každého kontrolního templátu, aby se zminimalizovala možnost kontaminace vzorků DNA. Znovu zakryjte každou jamku pásem s 8 kryty (používáte-li 96-jamkovou desku) a/nebo uzavřete 0,2ml zkumavky pro PCR. Zkontrolujte, že kryty jsou bezpečně utěsněny. POZNÁMKA: Správnou praxí je umístit kontroly bez templátu (NTC) do jamek, které nesousedí s kontrolou Positive Control ani se vzorky. POZNÁMKA: Návrh uspořádání 96jamkových destiček pro analýzu všech úseků KRAS and NRAS exony 2-4 naleznete v Příloze A.1 Uspořádání destiček v soupravách SURVEYOR Scan. 25. Zamíchejte na vortexu 10 sek. (při přibližně poloviční rychlosti). 26. Odstřeďte 1-2 minuty, aby se všechny roztoky shromáždily na dně jamek a/nebo zkumavek. Přesvědčte se, že roztoky jsou na dně každé jamky a/nebo zkumavky. Pokud tomu tak není, odstřeďte znovu. 12.6 Program termocykleru pro amplifikační protokol 1. Pro amplifikaci PCR a tvorbu heteroduplexů použijte následující protokol pro termocykler: 15 cyklů 30 cyklů Počáteční denaturace 95 C 5 minut Touchdown amplifikace 95 C 30 sekund 62 C, -0,5 ºC/cyklus 30 sekund 72 C 25 sekund Amplifikace 95 C 30 sekund 55 C 30 sekund 72 C 25 sekund Konečné prodloužení 1 cyklus 72 C 2 minuty Tvorba heteroduplexů 95 ºC 2 minuty 12 C Ponechat Návod k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémy strana 17

12 Pokyny pro jednotlivé kroky 12.7 Kontrola kvality produktů PCR 1. Před digescí nukleázou SURVEYOR Nuclease se doporučuje zkontrolovat kvalitu a množství amplikonů gelovou elektroforézou (nebo jí ekvivalentním způsobem). 2. Proveďte analýzu alikvotního podílu produktu PCR s různým množstvím hmotnostního žebříčku 100-bp DNA. 3. S použitím žebříčku proveďte odhad koncentrace amplifikované DNA. 4. Měl by být zřetelný pouze jediný proužek >20 ng/µl odpovídající hlavnímu produktu PCR. 5. Je-li přítomno více proužků, zkontrolujte, že byla dostačující kvalita vstupní templátové DNA (viz Příloha B Pokyny k řešení problémů). 6. Není-li přítomen žádný produkt, zkontrolujte, že byla dostačující kvalita vstupní templátové DNA (viz Příloha B Pokyny k řešení problémů). Splňuje-li kvalita požadované specifikace, zvyšte objem templátu na 4,0 µl/ 50µl reakci (snižte množství vody na reakci na 31,0 µl). 7. V kontrolním vzorku bez templátu by neměly být viditelné žádné produkty PCR. Jsou-li v této kontrole produkty DNA zřetelné, je pravděpodobná kontaminace; viz Příloha B Pokyny k řešení problémů. 8. Vyhodnoťte, zda PCR je robustní nebo slabá. a. Robustní PCR se projevuje jedním proužkem > 20 ng/µl. b. Slabá PCR se projevuje jedním proužkem < 20 ng/µl. c. Pro obě vyhodnocení, robustní i slabou PCR, přejděte k digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease. RADA: v této fázi mohou být produkty PCR skladovány při teplotě < -20 ºC až 1 týden. 12.8 Digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease 1. Je-li PCR vzorku o dostatečné kvalitě a množství, proveďte digestivní reakci s nukleázou SURVEYOR Nuclease podle níže uvedeného popisu. K optimální digesci enzymem SURVEYOR Nuclease je zapotřebí vzorek o koncentraci >40 ng/µl. 2. Rozmrazte na ledu zkumavky obsahující roztok 0.15 M MgCl 2 Solution a SURVEYOR Enhancer Cofactor 3. Do nové 0,2ml zkumavky pro PCR a/nebo do jamky v 96 jamkové destičce přidejte 10,0 µl z každého vzorku amplifikovaného pomocí PCR. 4. Připravte čerstvou směs z následujícího: roztok 0,15 M MgCl 2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 a SURVEYOR Nuclease W (směs SURVEYOR Nuclease). Použijte následující tabulku jako vodítko pro přípravu výchozí směsi pro digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease k analýze více vzorků. Níže uvedený příklad představuje objem výchozí směsi pro 10 vzorků. Návod k použití soupravy CRC RAScan se systémy strana 18

12 Pokyny pro jednotlivé kroky Vezměte na vědomí, že bude zapotřebí mírně větší objem výchozí směsi než je tento výpočet, aby se tak kompenzovaly ztráty během pipetování. Počet digestivních reakcí s nukleázou SURVEYOR Nuclease: Výpočet objemu: 0.15 M MgCl 2 Solution (µl) 10,0 SURVEYOR Enhancer Cofactor (µl) 10,0 SURVEYOR Enhancer W2 (µl) 10,0 SURVEYOR Nuclease W (µl) 20,0 Celkový objem výchozí směsi: 50,0 Přidejte 5 µl výchozí směsi SURVEYOR Nuclease do vzorku amplifikovaného pomocí PCR (µl) 10,0 Celkový objem digestivní reakce s nukleázou SURVEYOR Nuclease: 15,0 a. Před použitím každou reagencii odstřeďte. b. Před pipetováním každou reagencii mírně promíchejte na vortexu; po každém promíchání krátce odstřeďte asi 10 sekund. c. Pro každou digesci přidejte do 0,2 ml (nebo větší) mikrocentrifugační zkumavky pro PCR následující komponenty. 1,0 µl 0.15 M MgCl 2 Solution (PN 708027) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer W2 (PN 710161) 2,.0 µl SURVEYOR Nuclease W (PN 710160) A/nebo přidejte 5 µl výchozí směsi připravené podle výše uvedené tabulky. 5. Mírně zamíchejte výchozí směs pro digesci se SURVEYOR Nuclease na vortexu po dobu 10 sek. při nízké rychlosti. 6. Mírně odstřeďte výchozí směs pro digesci se SURVEYOR Nuclease po dobu 10 sek. při nízké rychlosti. 7. Uložte výchozí směs pro digesci se SURVEYOR Nuclease do ledu, dokud ji nepoužijete. Poznámka: Výchozí směs pro digesci nukleázou SURVEYOR Nuclease připravená v kroku 7 musí být použita okamžitě, neboť u enzymu SURVEYOR Nuclease W dochází za přítomnosti ostatních složek této reakční směsi SURVEYOR Nuclease k jeho deaktivaci. 8. Odpipetujte 5,0µl alikvotní podíl výchozí směsi pro digesci se SURVEYOR Nuclease do každé zkumavky a/nebo jamky obsahující 10,0µl alikvotní podíl amplifikovaného produktu PCR (viz krok 3 výše). 9. Po dokončení pipetování odstřeďte 0,2ml zkumavky PCR nebo 96jamkovou destičku po dobu 10 sek. 10. Mírně zamíchejte na vortexu 0,2ml zkumavky PCR a/nebo 96jamkovou destičku se vzorky po dobu 10 sek. 11. Odstřeďte po dobu 10 sekund při nízké rychlosti (tento krok je velmi důležitý, je-li digesce prováděna v přístroji bez zahřívaného krytu). 12. Inkubujte při teplotě 42 C po dobu 30 min. 13. Do každé zkumavky nebo jamky přidejte 1,0 µl roztoku SURVEYOR Stop Solution (PN 708030) a mírně zamíchejte na vortexu (celkový reakční objem s nukleázou SURVEYOR Nuclease je 16,0 µl). 10 RADA: Produkty digesce SURVEYOR lze uchovávat po dobu až jednoho týdne při teplotě -20 ºC. 14. Umístěte digestované vzorky do systému. Návod k použití soupravy CRC RAScan se systémy strana 19

12 Pokyny pro jednotlivé kroky Poznámka: Navrhované nastavení gradientu v systému pro analýzu produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease naleznete na http://world.transgenomic.com/diagnostictools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings. 13 Kontrolní postupy 13.1 Kontrola kvality soupravy CRC RAScan Combination Kit Souprava obsahuje kontrolní plasmidovou DNA pro provádění kontroly kvality během specifických kroků testu. V Amplifikačním protokolu se pomocí těchto kontrol ověřuje, zda jsou výchozí směsi správně připraveny a zda amplifikace probíhá správně. Vyžaduje se používat i kontroly bez templátu (s vodou místo templátové DNA), aby se tak mohla zjistit možná kontaminace složek souprav jakýmkoli cizorodým templátem DNA. Během kroku digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease umožňují amplikony z kontrolní plasmidové DNA účinnou kontrolu, zda podmínky při štěpící reakci (příprava výchozí směsi pro digesci enzymem SURVEYOR Nuclease a podmínky inkubace) byly uspokojivé. Ve fázi analýzy poskytují elektroferogramy digestovaných kontrolních amplikonů nukleázou SURVEYOR Nuclease v systému vodítko, zda se píky produktů digesce odpovídající těmto mutacím v úseku KRAS and NRAS Exons 2, 3 a 4 budou eluovat i při nízké hladině (viz obr. 4-10). Píky produktů štěpení odpovídající jiným mutacím v úseku KRAS a/nebo NRAS Exons 2, 3 a 4 se mohou eluovat v mírně odlišných pozicích. Pokud amplikony PCR neodpovídají výsledkům uvedeným v části Kontrola kvality produktů PCR, obraťte se na Přílohu B - Pokyny pro řešení problémů nebo kontaktujte technickou podporu společnosti Transgenomic, než přejdete k dalším krokům analýzy vzorků. 13.2 Použití kontrolních plasmidových DNA Součástí soupravy je devět kontrolních DNA: KRAS Control Wild-Type; PN 710131 KRAS Positive Control Exon 2; PN 710135 KRAS Positive Control Exon 3; PN 710136 KRAS Positive Control Exon 4A; PN 710137 KRAS Positive Control Exon 4B; PN 710138 NRAS Control Wild-Type; PN 710441 NRAS Positive Control Exon 2; PN 710442 NRAS Positive Control Exon 3; PN 710443 NRAS Positive Control Exon 4; PN 710444 Tyto kontrolní DNA jsou plasmidy s inzerty. Každá kontrola Positive Control obsahuje dva plasmidy: směs KRAS a/nebo NRAS Control Wild-Type a mutační klon odlišující se od typu Wild- Type v jediném páru bází. Kontroly se dodávají v samostatných lahvičkách o koncentraci 10 5 kopií/µl. KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 a primery PCR Forward a Reverse pro amplifikaci pomocí PCR se dodávají v soupravách samostatně. Při používání těchto kontrol dodržujte pokyny uvedené v částech Amplifikační protokol, Digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease a Analýza KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 pomocí nukleázy SURVEYOR Nuclease. PŘI PRVNÍM POUŽITÍ SOUPRAVY DŮRAZNĚ DOPORUČUJEME PROVÉST PŘED TESTOVÁNÍM GENOMICKÝCH VZORKŮ NEJPRVE EXPERIMENTY SE SAMOTNÝMI KONTROLAMI Návod k použití soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémy strana 20

14 Interpretace výsledků 14 Interpretace výsledků 14.1 Analýza KRAS a NRAS Exons 2, 3 a 4 pomocí nukleázy SURVEYOR Nuclease Pro účely porovnání a kontroly VŽDY proveďte digesci enzymem SURVEYOR Nuclease u každé kontroly (Wild-Type a Positive Control) a u kontroly bez templátu (NTC), u DNA vzorků a analyzujte je na stejné destičce pro vzorky v systému. Během kroku digesce nukleázou SURVEYOR Nuclease umožňují amplikony z těchto kontrolních plazmidových DNA účinnou kontrolu, zda podmínky při štěpící reakci (příprava směsi SURVEYOR Nuclease a podmínky inkubace) byly uspokojivé. Ve fázi analýzy umožňují křivky digestovaných kontrolních amplikonů nukleázou SURVEYOR Nuclease v systému vodítko, kde dojde k eluci fragmentů DNA vzniklých štěpením v místech specifických mutací v důsledku chybného párování, a to i při jejich nízké koncentraci (viz obr. 4-10). Pokud ani amplikony PCR ani fragmenty štěpení nukleázou SURVEYOR Nuclease odvozené z kontrolní DNA neodpovídají uvedeným výsledkům, obraťte se na Přílohu B - Pokyny pro řešení problémů nebo kontaktujte technickou podporutransgenomic, než přejdete k dalším krokům analýzy vzorků. Níže uvedené ukázky jsou pouze pro účely ilustrace a NEJSOU určeny pro stanovení identity jakékoli konkrétní mutace. Potvrzení identity mutace je nutné, aby se jednoznačně stanovila přítomnost specifické záměny bází v Exons 2, 3 a 4 genů KRAS a NRAS. Enzym SURVEYOR Nuclease štěpí ve všech místech chybného párování vzniklých v důsledku tvorby heteroduplexů mezi typem Wild-Type a mutovanou DNA, nikoli pouze v mutacích v Exons 2, 3 a 4. Enzym SURVEYOR Nuclease umožňuje potvrzení přítomnosti chybného párování. Identita změny bází specifická pro danou mutaci se požaduje ke stanovení KRAS a NRASaktivujícího stavu a musí být ověřena jiným způsobem, např. sekvenováním. 14.2 Kontrola výsledků SURVEYOR Scan Prohlédněte chromatogramy a porovnejte náležející kontrolám Wild-Type a Positive Control s chromatogramem vzorku. Určete, zda chromatogram vzorku je svým charakterem podobný nebo odlišný od kontroly Wild-Type. Je-li odlišný, potom vzorek je Pozitivní SURVEYOR Scan a bude předán k analýze DNA sekvenováním. Příklady ukazují obr. 4-10 a příklady takových vzorků ukazuje Příloha B Pokyny pro řešení problémů, 7 a 8. Každý vzorek s charakterem SURVEYOR Nuclease odlišným od Wild-Type by měl být předán k ověření sekvence, i když není identický s kontrolou Positive Control. Viz příklad takového vzorku v Příloze B Pokyny pro řešení problémů, 7. Je-li třeba, zvětšete zkoumanou oblast a překryjte chromatogram vzorku chromatogramem kontroly Wild-Type Control pro daný amplikon. Pozorujte rozdíly mezi kontrolou Wild-Type Control a analyzovaným vzorkem. Důležité! Po důkladném prozkoumání každého vzorku vyhodnocující ověří, zda sousedící vzorky v analytické destičce mají identické pozitivní výsledky SURVEYOR Scan. Vyskytují-li se identické pozitivní výsledky, mohou být důsledkem příčné kontaminace mezi vzorky nebo kontrolami a analýza se musí zopakovat. Návod k použití soupravy CRC RAScan se systémy strana 21

14 Interpretace výsledků 14.3 Příklady výsledků Příklady výsledků získaných pomocí soupravy CRC RAScan Combination Kit se systémem jsou ukázány na obr. 4-10 níže. Tyto ukázky byly získány systémem WAVE 4500HT-HS System s použitím UV a fluorescenčních detektorů a s přesným dodržením pokynů v části Pokyny pro jednotlivé kroky. Pokyny pro navrhované nastavení gradientu v systému pro analýzu produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease naleznete na http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kitseu/dhplcsystemsettings. Obrázek 4A Průtok systémem G12D tvoří fragmenty 74 a 116-bp KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 2 UncleavedVzorek 1, KRAS Exon 2 200-bp Vzorek 2, KRAS Exon 2 amplicon Vzorek 3, KRAS Exon 2 Velikostní standard DNA Nerozštěpený amplikon 190-bp Promytí systému Obrázek 4B G12D tvoří fragmenty 74 a 116-bp KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 2 UncleavedVzorek 1, KRAS Exon 2 200-bp Vzorek 2, KRAS Exon 2 amplicon Vzorek 3, KRAS Exon 2 Velikostní standard DNA Nerozštěpený amplikon 190-bp Obrázky 4A a 4B: Analýza v systému WAVE s UV (obr. 4A) a fluorescenční (obr. 4B) detekcí produktů digesce enzymem SURVEYOR Nuclease kontroly KRAS Positive Control Exon 2 a kontroly KRAS Control Wild-Type a CRC DNA izolované z řezů FFPE. Při vizuálním prohlížení chromatogramů je třeba porovnávat vzorky po digesci s kontrolou Wild-Type Control (hnědá čára). Kontrola KRAS Positive Control Exon (modrá čára) je směsí typu Wild-Type a mutantních plasmidů G12D dávající digesční píky 74 a 116 bp; tato kontrola ukazuje, že krok digesce enzymem SURVEYOR Nuclease proběhl správně a ukazuje oblast chromatogramu, kterou je třeba vizuálně prozkoumat a určit, zda by měl být vzorek předán k analýze sekvence DNA. Z porovnání charakteru digesce u vzorků 1-3 s elektroferogramem typu Wild-Type bez digesce je zřejmé, že vzorky 1 a 2 (červená a tyrkysová čára) obsahují pravděpodobné mutace a měly by být sekvenovány, aby se potvrdila přítomnost či absence mutace v příslušném kodonu. Vzorek 3 (zelená čára) má podobný chromatogram jako kontrola Wild-Type Control a není třeba Návod k použití soupravy CRC RAScan se systémy strana 22