artus CMV QS-RGQ Kit Manuál

Prosinec 2010 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 24 Verze 1 In vitro diagnostikum pro kvantitativní stanovení Pro použití s přístroji QIAsymphony SP/AS a Rotor-Gene Q 4503363 1060926CS QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D-40724 Hilden R2 1060926CS Sample & Assay Technologies

QIAGEN Sample and Assay Technologies QIAGEN je vedoucím poskytovatelem inovativních technologií pro přípravu vzorků a jejich rozbory, které umožňují izolaci a detekci obsahu jakéhokoliv biologického vzorku. Naše pokročilé, vysoce kvalitní produkty a služby Vám zajistí úspěšný výsledek. QIAGEN určuje standardy pro: purifikaci DNA, RNA a proteinů rozbor nukleových kyselin a proteinů microrna výzkum a RNAi automatizaci technologií pro přípravu vzorků a jejich rozbory Naší misí je umožnit Vám dosáhnout vynikajících výsledků a průlomů. Více informací naleznete na www.qiagen.com.

Obsah Obsah soupravy 5 Symboly 5 Skladování 6 Zamýšlený účel použití 6 Zvláštní pokyny pro použití produktu 6 Technická podpora 7 Bezpečnostní informace 7 Kontrola kvality 7 Úvod 9 Princip 9 Informace o původci 9 Charakteristika výkonu 10 Pracovní schéma 18 Potřebné vybavení a reagencie nedodávané se soupravou 23 Důležitá upozornění 25 Všeobecná preventivní opatření 25 Odběr, skladování a přeprava vzorků 25 Práce s přístroji QIAsymphony SP/AS 27 Příprava vzorků 30 Příprava směsí nosiče RNA (CARRIER) a AVE pufru (AVE) pro vzorky plazmy 30 Používání interní kontroly 30 Kontrolní sady a sady parametrů 32 Běhy s více rozbory 33 Výtěžek nukleových kyselin 33 Skladování nukleových kyselin 33 Nastavení mezní hodnoty pro PCR analýzu 34 Kvantifikace 34 Protokoly: Izolace DNA na QIAsymphony SP 35 Nastavení rozboru na QIAsymphony AS 43 PCR a analýza dat na přístroji Rotor-Gene Q 49 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 3

Řešení problémů 60 Literatura 65 Informace o objednání 66 4 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Obsah soupravy artus CMV QS-RGQ Kit (24) Katalogové čís. 4503363 Počet reakcí 24 Modrá CMV RG Master 3 x 300 µl Žlutá CMV Mg-Sol* 600 µl Červená CMV QS 1 (1 x 10 4 kopií/µl) 200 µl Červená CMV QS 2 (1 x 10 3 kopií/µl) 200 µl Červená CMV QS 3 (1 x 10 2 kopií/µl) 200 µl Červená CMV QS 4 (1 x 10 1 kopií/µl) 200 µl Zelená CMV IC 1000 µl Bílá Water (PCR grade) 1000 µl Manuál 1 * Roztok hořčíku. Kvantifikační standard. Interní kontrola. Symboly <N> Obsahuje reagencie pro <N> testů Použitelné do Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro Katalogové číslo Číslo šarže Číslo materiálu Komponenty artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 5

Obsahuje Počet Teplotní rozmezí Výrobce Přečtěte si informace uvedené v manuálu Důležité upozornění Skladování Komponenty soupravy artus CMV QS-RGQ Kit se skladují při 20 C a jsou stabilní do data uvedeného na štítku. Zabraňte opakovanému rozmrazení a zmrazení (>2 x), snižuje se tím výkon testu. Zamýšlený účel použití artus CMV QS-RGQ Kit je in vitro amplifikační test nukleové kyseliny pro kvantifikaci DNA cytomegaloviru (CMV) z lidské EDTA plazmy nebo z lidské plné krve EDTA. Tato diagnostická souprava využívá polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a je konfigurována pro použití s přístroji QIAsymphony SP/AS a Rotor-Gene Q. artus CMV QS-RGQ Kit je určen k prognóze nemoci ve spojení s klinickou prezentací a jinými laboratorními ukazateli. Zvláštní pokyny pro použití produktu Všechny reagencie se smí používat výhradně pro diagnostiku in vitro. Produkt by měli používat pouze pracovníci, kteří jsou speciálně poučeni a vyškoleni v metodice diagnostiky in vitro (EN375). Přesné dodržování protokolu je bezpodmínečně nutné k dosažení optimálních výsledků PCR. Dbejte na konec doby použitelnosti uvedený na balení a na štítcích jednotlivých komponent. Nepoužívejte reagencie s prošlou trvanlivostí. V ojedinělých případech mohou mutace ve vysoce konzervovaných oblastech virového genomu, které jsou pokryty primery a/nebo sondami soupravy, vést k nedostatečné kvantifikaci nebo k selhání detekce přítomnosti viru. Validita a výkon testu jsou pravidelně kontrolovány. 6 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Technická podpora Společnost QIAGEN se pyšní kvalitou a dostupností technické podpory. V našich odděleních technické podpory pracují zkušení vědci s rozsáhlými praktickými a teoretickými zkušenostmi s technologiemi pro přípravu vzorků a jejich rozbory a s použitím QIAGEN produktů. Máte-li dotazy nebo potíže s artus CMV QS-RGQ Kit nebo jiným produktem QIAGEN, neváhejte nás kontaktovat. Zákazníci firmy QIAGEN jsou hlavním zdrojem informací pro pokročilé a specializované použití našich produktů. Tyto informace jsou velmi užitečné pro ostatní vědce i výzkumníky u společnosti QIAGEN. Proto bychom Vás rádi vyzvali k tomu, abyste nás kontaktovali, pokud máte připomínky k výkonu produktu nebo návrhy pro nové aplikace a techniky. Pro technickou podporu a více informací navštivte náš technický servis na www.qiagen.com/support, zavolejte nebo kontaktujte Vašeho místního distributora (viz zadní strana nebo www.qiagen.com). Bezpečnostní informace Při práci s chemikáliemi noste vždy laboratorní oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle. Více informací naleznete v příslušných bezpečnostních listech (material safety data sheets, MSDS). Tyto listy jsou k dispozici v podobě kompaktního a snadno použitelného PDF souboru na www.qiagen.com/support/msds.aspx, kde můžete nalézt, prohlédnout a vytisknout MSDS ke každé QIAGEN soupravě nebo komponentě. Pro bezpečnostní informace k soupravě QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit konzultujte prosím QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Handbook. Pro bezpečnostní informace k soupravě QIAsymphony DNA Mini Kit konzultujte QIAsymphony DNA Handbook. Bezpečnostní informace k přístrojům naleznete v odpovídajících uživatelských manuálech dodávaných s přístroji. Odpad ze vzorků a rozborů likvidujte podle místních bezpečnostních předpisů. 24 hodinové tísňové volání V případě nouze získáte lékařské informace 24 hodin denně (v anglickém, francouzském a německém jazyce) na: Toxikologická informační služba v Mohuči (Giftnotruf der Beratungsstelle bei Vergiftungen in Mainz), Německo Tel: +49-6131-19240 Kontrola kvality V souladu se systémem managementu jakosti společnosti QIAGEN certifikovaným podle norem ISO byla každá šarže artus CMV QS-RGQ Kit artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 7

testována podle předem stanovených specifikací, aby byla zaručena jednotná kvalita produktu. 8 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Úvod artus CMV QS-RGQ Kit je systém k přímému použití pro průkaz CMV DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) na přístrojích Rotor-Gene Q s přípravou vzorků a nastavení rozboru za užití přístrojů QIAsymphony SP/AS. CMV RG Master obsahuje reagencie a enzymy pro specifickou amplifikaci 105 bp dlouhého úseku genomu CMV a také pro bezprostřední detekci specifického amplifikátu ve fluorescenčním kanálu Cycling Green přístroje Rotor-Gene Q. Kromě toho obsahuje artus CMV QS-RGQ Kit druhý heterologní amplifikační systém pro průkaz potenciální PCR inhibice. Tento systém je detekován jako interní kontrola (IC) ve fluorescenčním kanálu Cycling Yellow přístroje Rotor- Gene Q. Limit detekce analytické CMV PCR přitom není negativně ovlivněn. Spolu s produktem se dodávají externí pozitivní kontroly (CMV QS 1 4), s jejichž pomocí lze určit množství původce ve vzorku. Další informace viz Kvantifikace, strana 34. Princip Průkaz původce pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) je založen na amplifikaci specifické oblasti genomu původce. Detekce probíhá při PCR v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv. Barviva jsou zpravidla vázaná na oligonukleotidové sondy, které se vážou specificky na PCR amplifikát. Detekce intenzity fluorescence v průběhu PCR v reálném čase umožňuje průkaz a kvantifikaci produktů, aniž by bylo nutné po PCR znovu otevírat reakční zkumavky.* Informace o původci Lidský cytomegalovirus (CMV) lze u infikovaných osob prokázat v krvi, v tkáni a téměř ve všech sekretech. Virus se přenáší orálně, pohlavním stykem, krevní transfuzí nebo při transplantaci orgánu, dále intrauterinně nebo perinatálně. Lidský CMV způsobuje zpravidla asymptomatickou infekci, po které virus v lidském těle celoživotně persistuje. Jestliže se u mládeže nebo dospělých projeví příznaky, podobají se příznakům mononukleózy s horečkou, lehké hepatitidy a celkové indispozice. Těžký průběh infekce CMV byl pozorován především při intrauterinním přenosu a u imunosuprimovaných pacientů. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 9

Charakteristika výkonu Analytická senzitivita plazma Analytický limit detekce s ohledem na izolaci (limit senzitivity) byl pro soupravu artus CMV QS-RGQ Kit určen na základě CMV pozitivních klinických vzorků v kombinaci s extrakcí na přístroji QIAsymphony SP. Analytický limit detekce s ohledem na izolaci soupravy artus CMV QS-RGQ Kit byl pro plazmu určen řadou ředění CMV virového materiálu od 1000 do nominálně 0,316 CMV kopií/ml smíšeného v klinických vzorcích plazmy. Tyto vzorky byly podrobeny izolaci DNA pomocí QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit v kombinaci s protokolem Cellfree1000 (extrakční objem: 1 ml, eluční objem: 60 µl). Každé ředění z celkově 10 bylo za užití artus CMV QS-RGQ Kit analyzováno ve 4 bězích ve 4 různých dnech formou osminásobných určení. Výsledky byly zjištěny probitovou analýzou. Grafické vyhodnocení probitové analýzy je zobrazeno na obrázku 1. Analytický limit detekce s ohledem na izolaci soupravy artus CMV QS-RGQ Kit v kombinaci s přístrojem Rotor-Gene Q leží u 42,5 kopií/ml (p = 0,05). To znamená, že bude s 95 % pravděpodobností detekováno 42,5 kopií/ml. 1.0 95% Proportions 0.8 0.6 0.4 1.63 1,63 ~ 42.5 42,5 copies/ml kopií/ml (95%) (95%) (29,4 (29.4 70.2 70,2 kopií/ml) copies/ml) 0.2 0.0-1 0 1 2 3 log log (dose) (dose) Obrázek 1. Probitová analýza: plazma, CMV (Rotor-Gene Q). Analytická senzitivita s ohledem na izolaci (plazma, za užití QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit) soupravy artus CMV QS-RGQ Kit na přístroji Rotor Gene Q. Specificita plazma Specificita artus CMV QS-RGQ Kit je v první řadě zaručena výběrem primerů a sond, jakož i volbou přísných reakčních podmínek. Primery a sondy byly na základě sekvenční analýzy přezkoušeny na eventuální homologie se všemi 10 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

sekvencemi publikovanými v genových bankách. Detekovatelnost všech relevantních genotypů byla takto zajištěna. Validace specificity byla provedena na 100 různých CMV negativních vzorcích plazmy, které spolu s CMV specifickými primery a sondami obsaženými v CMV RG Master negenerovaly žádný signál. Potenciální křížová reaktivita soupravy artus CMV QS-RGQ Kit byla testována pomocí kontrolní skupiny uvedené v tabulce 1 (níže). Žádný z testovaných původců nebyl reaktivní. Při smíšených infekcích se nevyskytly žádné křížové reaktivity. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 11

Tabulka 1. Testování specificity diagnostické soupravy pomocí potenciálně křížově reaktivních původců Kontrolní skupina Lidský herpesvirus 1 (Herpes simplex virus 1) Lidský herpesvirus 2 (Herpes simplex virus 2) Lidský herpesvirus 3 (Varicella zoster virus) Lidský herpesvirus 4 (virus Epsteina a Barrové) CMV (Cycling Green) Interní kontrola (Cycling Yellow) + + + + Lidský herpesvirus 6A + Lidský herpesvirus 6B + Lidský herpesvirus 7 + Lidský herpesvirus 8 (herpesvirus asociovaný s Kaposiho sarkomem) + Virus hepatitidy A + Virus hepatitidy B + Virus hepatitidy C + Virus lidské imunodeficience 1 + Lidský virus leukémie T-buněk 1 + Lidský virus leukémie T-buněk 2 + Západonilský virus + Enterovirus + Parvovirus B19 + Lineární oblast kvantifikace plazma Lineární oblast kvantifikace s ohledem na izolaci soupravy artus CMV QS- RGQ Kit byla určena analýzou řady ředění CMV virového materiálu v rozsahu od 1,00 x 10 8 kopií/ml do 3,16 x 10 1 kopií/ml v plazmě. Izolace byla provedena v replikátech (n = 4 pro koncentrace 1,00 x 10 7 kopií/ml; n = 8 pro koncentrace <1,00 x 10 7 kopií/ml) za užití QIAsymphony DSP Virus/Pathogen 12 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Midi Kit v kombinaci s Cellfree1000 protokolem (extrakční objem: 1 ml, eluční objem: 60 µl). Všechny vzorky byly analyzovány pomocí artus CMV QS-RGQ Kit. Lineární oblast kvantifikace s ohledem na izolaci soupravy artus CMV QS- RGQ Kit byla pro plazmu určena analýzou řady ředění CMV virového materiálu v rozsahu od 7,94 x 10 1 kopií/ml do 1,00 x 10 8 kopií/ml (obrázek 2, strana 14). Robustnost plazma Přezkoušení robustnosti slouží k stanovení celkové četnosti chyb soupravy artus CMV QS-RGQ Kit. Za tímto účelem bylo 100 CMV negativních vzorků plazmy smíseno se 130 kopiemi/ml CMV (cca třínásobná koncentrace analytického limitu senzitivity). Po izolaci pomocí QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit v kombinaci s protokolem Cellfree1000_DSP pro plazmu (extrakční objem: 1 ml, eluční objem: 60 µl), byly tyto vzorky analyzovány pomocí artus CMV QS-RGQ Kit. Robustnost interní kontroly byla přezkoušena izolací a analýzou 100 smísených vzorků plazmy. Inhibice nebyly pozorovány. Robustnost soupravy artus CMV QS-RGQ Kit činí tedy 99%. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 13

10 log10 očekávaná 10 estimated koncentrace concentration (kopie/ml) (copies/ml) 8 6 4 2 0 y = 1,0521x 1.0521x 0,3653 0.3653 R 2 = 0,9991 0.9991 0 2 4 6 8 10 log 10 nominální nominal concentration koncentrace (kopie/ml) (copies/ml) Obrázek 2. Lineární oblast kvantifikace soupravy artus CMV QS-RGQ Kit (plazma). Výpočet lineární oblasti kvantifikace. Přímka byla stanovena lineární regresí log 10 vypočítaných koncentrací s log 10 nominálními koncentracemi. Rovnice regresních přímek je zahrnuta v obrázku. Analytická senzitivita plná krev Analytický limit detekce s ohledem na izolaci (limit senzitivity) byl pro soupravu artus CMV QS-RGQ Kit určen na základě CMV pozitivních klinických vzorků v kombinaci s extrakcí na přístroji QIAsymphony SP. Analytický limit detekce s ohledem na izolaci soupravy artus CMV QS-RGQ Kit byl pro plnou krev určen řadou ředění CMV virového materiálu od 1000 do nominálně 3,16 CMV kopií/ml smíšeného v klinických vzorcích lidské plné krve. Tyto vzorky byly podrobeny izolaci DNA pomocí QIAsymphony DNA Mini Kit v kombinaci s protokolem VirusBlood200 (extrakční objem: 200 µl, eluční objem: 60 µl). Každé ředění z celkově 8 bylo za užití artus CMV QS-RGQ Kit analyzováno ve 3 bězích ve 6 různých dnech formou jedenáctinásobných určení. Výsledky byly zjištěny probitovou analýzou. Grafické vyhodnocení probitové analýzy je zobrazeno na obrázku 3. Analytický limit detekce s ohledem na izolaci soupravy artus CMV QS-RGQ Kit v kombinaci s přístrojem Rotor-Gene Q leží u 164,55 kopií/ml (p = 0,05). To znamená, že bude s 95 % pravděpodobností detekováno 164,55 kopií/ml. 14 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

1.0 95% 0.8 Proportions 0.6 0.4 2,21631 2.21631 ~ ~ 164,55 164.55 kopií/ml copies/ml (95%) (95%) (82,01 (82.01 636.34 636,34 kopií/ml) copies/ml) 0.2 0.0-1 0 1 2 3 log log (dose) (dose) Obrázek 3. Probitová analýza: plná krev, CMV (Rotor-Gene Q). Analytická senzitivita s ohledem na izolaci (plná krev, za užití QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Kit) soupravy artus CMV QS-RGQ Kit na přístroji. Specificita plná krev Specificita artus CMV QS-RGQ Kit je v první řadě zaručena výběrem primerů a sond, jakož i volbou přísných reakčních podmínek. Primery a sondy byly na základě sekvenční analýzy přezkoušeny na eventuální homologie se všemi sekvencemi publikovanými v genových bankách. Detekovatelnost všech relevantních genotypů byla takto zajištěna. Validace specificity byla provedena na 100 různých CMV negativních vzorcích plné krve, které spolu s CMV specifickými primery a sondami obsaženými v CMV RG Master negenerovaly žádný signál. Potenciální křížová reaktivita soupravy artus CMV QS-RGQ Kit byla testována pomocí kontrolní skupiny uvedené v tabulce 1 (viz strana 12). Žádný z testovaných původců nebyl reaktivní. Při smíšených infekcích se nevyskytly žádné křížové reaktivity. Lineární oblast kvantifikace plná krev Lineární oblast kvantifikace s ohledem na izolaci soupravy artus CMV QS- RGQ Kit byla určena analýzou řady ředění CMV virového materiálu v rozsahu od 5,00 x 10 7 do 1,00 x 10 2 v plné krvi. Izolace byla provedena v replikátech (n = 4 pro koncentrace 1,00 x 10 7 kopií/ml; n = 8 pro koncentrace <1,00 x 10 7 kopií/ml) za užití QIAsymphony DNA Mini Kit v kombinaci s protokolem VirusBlood200 (extrakční objem: 200 µl, eluční objem: 60 µl). Všechny vzorky byly analyzovány pomocí artus CMV QS-RGQ Kit. Lineární artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 15

oblast kvantifikace s ohledem na izolaci soupravy artus CMV QS-RGQ Kit se vztahuje na koncentrace od 1,00 x 10 3 kopií/ml do 5,00 x 10 7 kopií/ml pro plnou krev (obrázek 4). log10 10 očekávaná estimated concentration koncentrace (kopie/ml) (copies/ml) 10 8 6 4 2 0 y y = = 1,0514x 1.0514x 0,2366 0.2366 R 2 R = 2 0,9999614 = 0.9999614 0 2 4 6 8 10 log log 10 nominální koncentrace (kopie/ml) 10 nominal concentration (copies/ml) Obrázek 4. Lineární oblast kvantifikace soupravy artus CMV QS-RGQ Kit (plná krev). Výpočet lineární oblasti kvantifikace. Přímka byla stanovena lineární regresí log 10 vypočítaných koncentrací s log 10 nominálními koncentracemi. Rovnice regresních přímek je zahrnuta v obrázku. Robustnost plná krev Přezkoušení robustnosti slouží k stanovení celkové četnosti chyb soupravy artus CMV QS-RGQ Kit. Za tímto účelem bylo 100 CMV negativních vzorků plné krve smíseno se 500 kopiemi/ml CMV (cca třínásobná koncentrace analytického limitu senzitivity). Po izolaci pomocí QIAsymphony DNA Mini Kit v kombinaci s protokolem VirusBlood200 pro plnou krev byly tyto vzorky analyzovány pomocí artus CMV QS-RGQ Kit. Robustnost interní kontroly byla přezkoušena izolací a analýzou 100 smísených vzorků plné krve. Inhibice nebyly pozorovány. Robustnost soupravy artus CMV QS-RGQ Kit činí tedy 99 %. Přesnost Údaje o přesnosti soupravy artus CMV QS-RGQ Kit umožňují stanovení celkové variability testovacího systému. Tato celková variabilita se skládá z Intra-Assay variability (variabilita výsledků vzorků stejné koncentrace v rámci jednoho pokusu), z Inter-Assay variability (variabilita výsledků rozboru generovaných na různých přístrojích stejného typu a provedených různými osobami v jedné laboratoři) a z Inter-Batch variability (variabilita výsledků 16 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

rozboru za užití různých šarží). Získaná data byla použita k vypočítání standardní odchylky, variance a koeficientu variace jak pro specifickou PCR původce, tak i pro PCR interní kontroly. Analytické údaje o přesnosti soupravy artus CMV QS-RGQ Kit (bez ohledu na izolaci) byly stanoveny pomocí kvantifikačního standardu s nejnižší koncentrací (QS 4; 10 kopií/µl). Experimenty byly provedeny formou osminásobných určení. Údaje o přesnosti byly vypočítány na základě C T hodnot amplifikačních křivek (C T : threshold cycle, viz tabulka 2, níže). Údaje o přesnosti pro kvantitativní výsledky v kopiích/µl byly určeny pomocí odpovídajících C T hodnot (tabulka 3, strana 18). Na základě těchto výsledků činí celkový statistický rozptyl libovolného vzorku uvedené koncentrace 1,21 % (C T ) resp. 14,38 % (koncentrace), a 1,93 % (C T ) pro průkaz interní kontroly. Tyto hodnoty se zakládají na souhrnu všech dílčích hodnot zjištěných variabilit. Tabulka 2. Údaje o přesnosti na základě C T hodnot Intra-assay variability: CMV QS 4 Intra-assay variability: Interní kontrola Inter-assay variability: CMV QS 4 Inter-assay variability: Interní kontrola Inter-batch variability: CMV QS 4 Inter-batch variability: Interní kontrola Celková variabilita: CMV QS 4 Celková variabilita: Interní kontrola Standardní odchylka Variance Koeficient variace (%) 0,17 0,03 0,57 0,31 0,10 1,16 0,38 0,14 1,27 0,47 0,22 1,77 0,33 0,11 1,10 0,53 0,28 2,02 0,36 0,13 1,21 0,51 0,26 1,93 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 17

Tabulka 3. Údaje o přesnosti na základě kvantitativních výsledků (v kopiích/µl) Intra-assay variability: CMV QS 4 Inter-assay variability: CMV QS 4 Inter-batch variability: CMV QS 4 Celková variabilita: CMV QS 4 Standardní odchylka Variance Koeficient variace (%) 1,34 1,80 13,30 1,54 2,38 15,25 1,46 2,12 14,41 1,45 2,11 14,38 Reprodukovatelnost Údaje o reprodukovatelnosti jsou pořizovány za účelem pravidelného hodnocení výkonnosti artus CMV QS-RGQ Kit a výkonnostního srovnání s ostatními produkty. Tyto údaje jsou získávány na základě účastí v uznávaných programech pro výkonnostní hodnocení. Křížové kontaminace Nepřítomnost křížových kontaminací mezi vzorky po dobu celého pracovního procesu byla pro reprezentativní artus QS-RGQ systém prokázaná správnou detekcí všech známých pozitivních a negativních vzorků ve střídajících se pozicích (šachovnicové rozmístění). Pracovní schéma Pracovní schéma QIAsymphony RGQ začíná purifikací nukleových kyselin ze vzorků lidské plazmy nebo plné krve na přístroji QIAsymphony SP. Eluáty z přípravy vzorku obsahující purifikované nukleové kyseliny jsou převedeny do QIAsymphony AS modulu, který poté provede nastavení rozboru (obrázek 5). Rozbory jsou poté za účelem PCR a analýzy dat přeneseny do přístroje Rotor- Gene Q (obrázek 6). Přehled pracovního procesu se nachází na stranách 20 22. Více informací naleznete v podrobných protokolech v tomto manuálu (strany 35, 43 a 49). 18 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Obrázek 5. Bezproblémová automatizace na přístrojích QIAsymphony SP/AS. Vzorky, reagencie a spotřební materiál jsou vloženy do odpovídajících zásuvek. Příprava vzorků a nastavení rozborů jsou poté na přístrojích QIAsymphony SP/AS plně automatizované. Obrázek 6. Přenos vzorků do přístroje Rotor-Gene Q. Po přípravě vzorků a nastavení rozborů jsou reakce vloženy do 72-jamkového rotoru přístroje Rotor-Gene Q za účelem PCR analýzy v reálném čase. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 19

Přehled pracovního schématu QIAsymphony RGQ QIAsymphony SP Naplňte zásuvku Waste (Odpad). Vložte stojánek na eluční zkumavky do zásuvky Eluate (Eluát). Nezávislá operace Integrovaná operace Vložte stojánek na eluční zkumavky do drážky 1. Vložte stojánek na eluční zkumavky s adaptérem, včetně transferního podstavce, do drážky 1. Naplňte zásuvku Reagents and Consumables (Reagencie a spotřební materiál). Naplňte zásuvku Sample (Vzorek). Definujte běh/sadu pomocí uživatelského rozhraní pro přípravu vzorku. Spusťte protokol. Poté co je zpracování vzorků dokončeno, buďto manuálně vyjměte stojánek s elučními zkumavkami ze zásuvky Eluate (nezávislá operace) nebo proveďte přímý přenos stojánku s elučními zkumavkami do přístroje QIAsymphony AS pomocí transferního modulu (integrovaná operace). Nezávislá operace Integrovaná operace Na dotekové obrazovce zrušte přiřazení eluční drážky, poté otevřete zásuvku Eluate a manuálně vyjměte stojánek na eluční zkumavky. Stiskněte Transfer pro přenos stojánku s elučními zkumavkami z přístroje QIAsymphony SP do přístroje QIAsymphony AS. Stáhněte QIAsymphony SP soubor s výsledky. 20 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

QIAsymphony AS Na dotekové obrazovce přepněte na uživatelské rozhraní k nastavení rozboru. Spusťte proces definice rozboru. Nezávislá operace Integrovaná operace Stiskněte "New" (Nový). Objeví se hlášení, zda se má stojánek s elučními zkumavkami použít jako stojánek na zkumavky se vzorky. Stiskněte "Yes" pro potvrzení. Definujte rozbor. Hlášení, která se objeví na dotekové obrazovce, Vás krok po kroku provedou procesem definice rozboru. Do zásuvek Eluate and Reagents (Eluáty a reagencie) a Assays (Rozbory) vložte odpovídající vzorky, reagencie a spotřební materiál. Podrobné informace o vkládání naleznete na obrazovce "Loading Information" (Informace o vkládání). Alternativně stiskněte "Queue" (Zařadit) a stáhněte si soubor s informacemi o vkládání. Spusťte test. Po dokončení běhu vyjměte rozbory. Tuto akci provedete tak, že stisknete Remove (Vyjmout) a poté manuálně vyjmete stojánky ze zásuvky Assays. Přeneste stojánky do přístroje Rotor-Gene Q. Stáhněte si QIAsymphony AS soubor s výsledky a soubor cykléru. Přeneste soubor cykléru do přístroje Rotor-Gene Q. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 21

Rotor-Gene Q Zvolte nebo vytvořte teplotní profil. Stiskněte Start Run. Po dokončení běhu analyzujte výsledky. Údržba Proveďte údržbu přístrojů QIAsymphony SP/AS a Rotor-Gene Q podle uživatelských manuálů. Viz oddíl 8 manuálu QIAsymphony SP/AS User Manual General Description a oddíl 9 manuálu Rotor-Gene Q User Manual pro více podrobností k denní, pravidelné a týdenní údržbě. 22 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Potřebné vybavení a reagencie nedodávané se soupravou Při práci s chemikáliemi noste vždy laboratorní oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle. Více informací naleznete v příslušných bezpečnostních listech (material safety data sheets, MSDS) dostupných u dodavatele. Pipety (nastavitelné)* a sterilní pipetovací špičky s filtrem Vortex mixer* Stolní centrifuga* s rotorem pro 2 ml reakční zkumavky, schopná centrifugace o 6800 x g Pro přípravu vzorků Přístroj QIAsymphony SP (kat. čís. 9001297)* QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (kat. čís. 937055) pro vzorky plazmy nebo QIAsymphony DNA Mini Kit (kat. čís. 931236) pro vzorky plné krve Adaptéry pro QIAsymphony SP: Stojánek na eluční mikrozkumavky Elution Microtube Rack QS (Cooling Adapter, EMT, v2, Qsym, kat. čís. 920730) Vložka pro zkumavky Tube Insert 3B (Insert, 2.0ml v2, samplecarr. (24), Qsym, kat. čís. 9242083) Spotřební materiál pro QIAsymphony SP: 8-jamkové zásobníky Sample Prep Cartridges, 8-well (kat. čís. 997002) Kryty hrotů (po osmi) 8-Rod Covers (kat. čís. 997004) Špičky s filtrem, 1500 µl (kat. čís. 997024) Špičky s filtrem, 200 µl (kat. čís. 990332) Eluční mikrozkumavky CL (kat. čís. 19588) Odpadní sáčky na špičky (kat. čís. 9013395) 2 ml mikrozkumavky typu H nebo 2 ml mikrozkumavky typu I (Sarstedt, kat. čís. 72.693 a 72.694, www.sarstedt.com) pro použití se vzorky a interními kontrolami * Ujistěte se, že byly přístroje kontrolovány a kalibrovány podle doporučení výrobce. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 23

Pro nastavení rozboru Přístroj QIAsymphony AS (kat. čís. 9001301)* Adaptéry a držáky na reagencie pro QIAsymphony AS: Držák na reagencie Reagent holder 1 QS (Cooling Adapter, Reagent Holder 1, Qsym, kat. čís. 9018090) Držák na reagencie Reagent holder 2 QS (Cooling Adapter, Reagent Holder 2, Qsym, kat. čís. 9018089) Stripy se zkumavkami RG Strip Tubes 72 QS (Cooling Adapter, RG Strip Tubes 72, Qsym, kat. čís. 9018092) Spotřební materiál pro QIAsymphony AS: Stripy se zkumavkami a víčky Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (kat. čís. 981103) 2 ml kónické zkumavky, Qsym AS (kat. čís. 997102) nebo 2 ml mikrozkumavky typu I (Sarstedt, kat. čís. 72.694.005, www.sarstedt.com) 5 ml kónické zkumavky, Qsym AS (kat. čís. 997104) nebo polypropylenové zkumavky s plochým podstavcem (Sarstedt, kat. čís. 60.558.001, www.sarstedt.com) Reagenční lahvičky, 30 ml, Qsym AS (kat. čís. 997108) Eluční mikrozkumavky CL (kat. čís. 19588) Špičky s filtrem, 1500 µl (kat. čís. 997024) Špičky s filtrem, 200 µl (kat. čís. 990332) Špičky s filtrem, 50 µl (kat. čís. 997120) Odpadní sáčky na špičky (kat. čís. 9013395) Pro PCR Přístroj Rotor-Gene Q 5plex HRM* Rotor-Gene Q software verze 2.02 nebo vyšší * Ujistěte se, že byly přístroje kontrolovány a kalibrovány podle doporučení výrobce. Prosím informujte se o dostupnosti. 24 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Důležitá upozornění Všeobecná preventivní opatření Vždy dbejte na následující: Používejte sterilní pipetovací špičky s filtrem. Během manuálních kroků ponechávejte zkumavky pokud možno zavřené, aby se předešlo kontaminacím. Všechny komponenty před počátkem rozboru úplně rozmrazte při pokojové teplotě (15 25 C). Následně komponenty řádně promíchejte (opakovaný náběr pipetou a vypuštění pipety nebo krátký vortex) a krátce centrifugujte. Ujistěte se, že v reagenčních zkumavkách není žádná pěna nebo bubliny. Nepoužívejte dohromady komponenty souprav jiných šarží. Ověřte, že jsou potřebné adaptéry předem vychlazeny na 2 8 C. Pracujte rychle a udržujte PCR reagencie před vkládáním na ledu nebo v chladicím bloku. Pracujte plynule od jedné části pracovního schématu ke druhé. Nepřekročte dobu jedné hodiny při přenosech mezi jednotlivými moduly (QIAsymphony SP do QIAsymphony AS do Rotor-Gene Q). Odběr, skladování a přeprava vzorků Se všemi vzorky se musí zacházet jako s potenciálně infekčními. Přípustné jsou pouze následující materiály vzorků, u kterých je nezbytné přesně dodržovat následující předpisy pro odběr, skladování a přepravu. Interní validace soupravy artus CMV QS-RGQ Kit byla provedena pomocí vzorků lidské EDTA plazmy a lidské plné krve EDTA. Jiné materiály vzorků nejsou validovány. Prosím používejte pro přípravu vzorku pouze doporučenou DNA-izolační soupravu (viz Protokol: Izolace DNA na QIAsymphony SP, strana 35). Při užití některých materiálů vzorků je nezbytné dodržovat následující předpisy pro odběr, skladování a přepravu. Odběr vzorků Každý odběr krve je podmíněn narušením krevních cest (tepny, žíly, kapiláry). Používat se smí pouze nezávadný a sterilní materiál. Pro odběr krve by měly být k dispozici odpovídající jednorázové pomůcky. K punkci žil by se neměly používat příliš jemné kanyly. Odběr žilní krve by měl být proveden na vhodných místech v oblasti loketní jamky, předloktí nebo na hřbetu ruky. Krev odebírejte do standardních odběrových zkumavek (červený uzávěr, Sarstedt artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 25

nebo ekvivalentní zkumavky jiných výrobců). Odeberte 5-10 ml EDTA krve. Zkumavky by měly být bezprostředně po odběru promíchány opakovaným obracením (8x, netřepat). Vzorky heparinizovaných osob se nesmí používat (viz Rušivé látky plazma a Rušivé látky plná krev, níže). Skladování vzorků Pro plazmu, plná krev by měla být během šesti hodin rozdělena na plazmu a buněčné elementy centrifugací při 800-1 600 x g po dobu 20 minut. Oddělená plazma musí být převedena do sterilní polypropylenové zkumavky. Výkonnost testu může být opakovaným zmrazováním nebo delším skladováním vzorků narušena. Přeprava vzorků Vzorky by měly být zasílány zásadně v nerozbitných transportních nádobách, aby se zabránilo eventuálnímu nebezpečí infekce při úniku vzorku. Vzorky musí být zaslány podle platných místních a státních předpisů pro přepravu látek vyvolávajících nákazu.* Přeprava nesmí trvat déle než šest hodin. Skladování na místě odběru se nedoporučuje. Transport poštou je možný, musí se však dbát na zákonné předpisy. Doporučujeme přepravu kurýrem. Krevní vzorky by měly být zasílány chlazené (2 8 C) a oddělená plazma hluboce zmrazená ( 15 až 30 C). Rušivé látky plazma Zvýšené hodnoty albuminu ( 6 g/dl), bilirubinu ( 30 mg/dl) a lipidů ( 1 g/dl triglyceridů), stejně jako hemolytické vzorky ( 2 g/dl hemoglobinů) analytický systém neovlivňují. Heparin narušuje PCR. Vzorky, které byly odebrány do zkumavek, které obsahují heparin jako antikoagulant, nesmí být použity. Stejně tak se nesmí používat vzorky heparinizovaných osob. Rušivé látky plná krev Zvýšené hodnoty bilirubinu ( 30 mg/dl), lipidů ( 1 g/dl triglyceridů) a lidské genomické DNA ( 30 µg/dl) analytický systém neovlivňují. Heparin narušuje PCR. Vzorky, které byly odebrány do zkumavek, které obsahují heparin jako antikoagulant, nesmí být použity. Stejně tak se nesmí používat vzorky heparinizovaných osob. * International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations. 26 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Práce s přístroji QIAsymphony SP/AS Zavřete všechny zásuvky a víka. Zapněte přístroje QIAsymphony SP/AS a vyčkejte, dokud se neobjeví obrazovka Sample Preparation (Příprava vzorků) a nedokončí se inicializační proces. Přihlaste se do systému přístroje (zásuvky se odemknou). Vkládání zásobníků s reagenciemi (RC) do zásuvky Reagents and Consumables (Reagencie a spotřební materiál). Reagencie pro purifikaci nukleových kyselin jsou obsaženy v inovativních zásobnících s reagenciemi (RC) (viz obrázek 7). Každá vanička zásobníku s reagenciemi (RC) obsahuje speciální reagencie jako např. magnetické částice, lyzační pufr, promývací pufr nebo eluční pufr. Jen částečně použité zásobníky s reagenciemi (RC) lze znovu uzavřít pomocí opětovně použitelných uzavíracích proužků, čímž se předchází vytváření odpadu v důsledku zbylých reagencií na konci purifikační procedury. Děrovací víčko (PL) Stojánek s enzymy (ER) Drážky pro šroubovací víčka ze zkumavek s enzymy Opětovně použitelné uzavírací proužky Vanička s magnetickými částicemi Mřížka s vaničkami obsahujícími reagencie Držák na zásobník s reagenciemi Obrázek 7. QIAsymphony zásobník s reagenciemi (RC). Zásobník s reagenciemi (RC) obsahuje všechny reagencie potřebné pro purifikační proces. Před začátkem procedury se ujistěte, že jsou magnetické částice úplně resuspendovány. Před prvním použitím vyjměte vaničku s magnetickými částicemi z podstavce zásobníku s reagenciemi, rázně ji minimálně 3 minuty vortexujte a vložte zpátky do podstavce. Vložte zásobník s reagenciemi (RC) do držáku zásobníků s reagenciemi. Vložte stojánek s enzymy (ER) do držáku zásobníků s reagenciemi. Před prvním použitím zásobníku s reagenciemi (RC) umístěte děrovací víčko (PL) navrch zásobníku s reagenciemi (RC) (obrázek 8). artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 27

Děrovací víčko je ostré (PL). Buďte opatrní při jeho umístění navrch zásobníku s reagenciemi (RC). Ujistěte se, že jste umístili děrovací víčko (PL) na zásobník s reagenciemi (RC) ve správném směru. Poté, co byla vyjmuta vanička s magnetickými částicemi a byly otevřeny zkumavky ze stojánku s enzymy (šroubovací víčka mohou být uložena do příslušných drážek, viz obrázek 5), se zásobník s reagenciemi (RC) vloží do zásuvky Reagents and Consumables. Děrovací víčko (PL) Obrázek 8. Jednoduché nastavení pracovní plochy pomocí zásobníků s reagenciemi (RC). Částečně použité zásobníky s reagenciemi (RC) lze do dalšího použití skladovat, viz kapitola "Storage" v manuálu QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Handbook nebo QIAsymphony DNA Handbook. Vkládání umělohmotného materiálu do zásuvky Reagents and Consumables Zásobníky pro přípravu vzorků, kryty hrotů (oboje je seskládáno do boxů na jednotky) a jednorázové špičky s filtrem (200 µl špičky se dodávají v modrých stojáncích, 1500 µl špičky v černých stojáncích) se vkládají do zásuvky "Reagents and Consumables". Ujistěte se, že jsou víka boxů s jednotkami před vložením boxů do zásuvky Reagents and Consumables odstraněna. Špičky mají filtry jako prevenci křížových kontaminací. Do drážek pro stojánky na špičky na pracovní ploše QIAsymphony SP lze vložit kterýkoliv typ stojánku na špičky. QIAsymphony SP definuje typ vložených špiček během kontroly vloženého obsahu ( inventory scan ). 28 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Nedoplňujte manuálně stojánky na špičky ani boxy se zásobníky pro přípravu vzorků nebo kryty hrotů před spuštěním dalšího běhu. QIAsymphony SP umí použít částečně užité stojánky na špičky a boxy s jednotkami. Plnění zásuvky Waste Zásobníky pro přípravu vzorků a kryty hrotů použité během běhu se seskládají zpět do prázdných boxů v zásuvce "Waste". Ujistěte se, že zásuvka "Waste" obsahuje dostatečné množství prázdných boxů pro plastový odpad generovaný při běhu. Ujistěte se, že jsou víka boxů s jednotkami před vložením boxů do zásuvky Waste odstraněna. Používáte-li boxy pro kryty hrotů pro sběr použitých zásobníků pro přípravu vzorků a kryty hrotů, ujistěte se, že z nich byla odstraněna distanční vložka. Sáček pro použité špičky s filtrem musí být připevněn k přední straně zásuvky "Waste". Přítomnost odpadního sáčku na špičky není systémem kontrolována. Před začátkem běhu se ujistěte, že je odpadní sáček správně připevněn. Více informací naleznete v uživatelských manuálech dodávaných s Vaším přístrojem. Vyprázdněte odpadní sáček po zpracování maximálně 96 vzorků, aby se zamezilo nakupení špiček. Odpadní kontejner sbírá tekutý odpad generovaný během purifikační procedury. Zásuvku Waste lze zavřít jen tehdy, pokud je odpadní kontejner na místě. Tekutý odpad likvidujte podle místních bezpečnostních a ekologických předpisů. Naplněné odpadní nádoby neautoklávujte. Vyprázdněte odpadní nádoby po zpracování maximálně 96 vzorků. Plnění zásuvky Eluate Vložte požadovaný stojánek s elučními zkumavkami do zásuvky Eluate. Použijte drážku Elution slot 1 s odpovídajícími chladicími adaptéry. Pro integrované operace umístěte stojánek s elučními zkumavkami s adaptérem, včetně transferního podstavce, do drážky 1. Kontrola vloženého obsahu ( inventory scan ) Před spuštěním běhu přístroj zkontroluje, zda bylo do příslušných zásuvek vloženo pro testované sady dostatečné množství spotřebního materiálu. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 29

Příprava vzorků Souprava QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit je vhodná pro použití se vzorky lidské plazmy a QIAsymphony DNA Mini Kit pro užití se vzorky lidské plné krve. Zamezte vytvoření pěny na nebo ve vzorcích. Vzorky by měly být před začátkem protokolu ekvilibrovány na pokojovou teplotu (15 25 C). Příprava směsí nosiče RNA (CARRIER) a AVE pufru (AVE) pro vzorky plazmy Při užití soupravy QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit se musí použít nosič RNA (CARRIER). Pro přípravu základního roztoku nosiče RNA (CARRIER) přidejte 1350 µl AVE pufru (AVE) (dodávaný v 2 ml nádobkách) do zkumavky obsahující 1350 µg lyofilizovaného nosiče RNA (CARRIER), abyste získali roztok o 1 µg/µl. Nosič RNA (CARRIER) důkladně rozpusťte, rozdělte jej do vhodně velkých alikvotů a skladujte jej při 2 8 C po dobu až dvou týdnů. Výpočet objemu směsi nosiče RNA (CARRIER) na jednu zkumavku Minimální objem směsi nosiče RNA (CARRIER) a AVE pufru (AVE) musí obsahovat dostatečný nadbytečný objem, aby se zohlednila ztráta tekutiny při pipetování nebo vypařování. V tabulce 4 jsou uvedeny objemy, které se používají při analýze pomocí soupravy artus CMV QS-RGQ Kit. Zkumavky obsahující směsi nosiče RNA (CARRIER), AVE pufru (AVE) a interní kontroly jsou umístěny v nosiči zkumavek. Nosič zkumavek obsahující směs(i) nosiče RNA (CARRIER) a AVE pufru (AVE) musí být umístěn do drážky A zásuvky pro vzorky. Na jednu sadu lze použít až 8 zkumavek této směsi, na běh se 4 sadami až 24 zkumavek. Používání interní kontroly Spolu se soupravou artus CMV QS-RGQ Kit se dodává interní kontrola (CMV IC). Uživatel má tak možnost kontrolovat jak izolaci DNA, tak také možnou inhibici PCR. Pokud bude na přístroji Rotor Gene Q analyzována CMV a EBV v jednom PCR běhu (viz Běhy s více rozbory, strana 33), použijte CMV IC pro všechny vzorky a ne EBV RG IC dodávanou se soupravou artus EBV QS-RGQ Kit. Ta samá CMV IC by měla být použita také pro nastavení rozboru PCR kontrol (krok 13 v protokolu k nastavení rozboru, strana 45). 30 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Použití QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit nebo QIAsymphony DNA Mini Kit ve spojení s artus CMV QS-RGQ Kit vyžaduje zapojení interní kontroly (CMV IC) do purifikační procedury, aby se mohla monitorovat efektivita přípravy vzorku a následných rozborů. U vzorků plazmy musí být interní kontrola přidána spolu se směsí nosiče RNA (CARRIER) a AVE pufru (AVE). Celkový objem směsi interní kontroly, nosiče RNA (CARRIER) a AVE pufru (AVE) zůstává 120 µl. U vzorků plné krve musí být interní kontrola rozředěna v pufru ATE. Ke každému vzorku se přidává celkový objem o 60 µl směsi interní kontroly a ATE pufru. Pro tuto aplikaci přidejte interní kontrolu do izolace tak, jak je uvedeno v tabulce 4. To představuje přidání interní kontroly k izolaci v poměru 0,1 µl na 1 µl elučního objemu. Doporučujeme připravit pro každý běh čerstvé směsi bezprostředně před použitím. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 31

Tabulka 4. Příprava směsi interní kontroly a nosiče RNA (CARRIER) Vzorky plazmy Vzorky plné krve Komponenta Objem (µl) Objem (µl) Základní carrier RNA (CARRIER) 5 0 Interní kontrola* 9 9 Pufr AVE 106 0 Pufr ATE 0 51 Konečný objem na jeden vzorek (vyjma mrtvého objemu) 120 60 Celkový objem pro n vzorků (n x 120) + 360 (n x 60) + 240 * Výpočet množství interní kontroly se zakládá na výchozích elučních objemech (90 µl). Dodatečný mrtvý objem závisí na typu použité zkumavky na vzorek. Nenaplňujte více než 1,92 ml (odpovídá maximu 13 nebo 26 vzorků; tento objem je specifický pro 2ml mikrozkumavky typu H a 2ml mikrozkumavky typu I, Sarstedt kat. čís. 72.693 a 72.694). Požadována je směs interní kontroly odpovídající 3 dodatečným vzorkům (tj. 360 µl) (tento objem je specifický pro 2ml mikrozkumavky typu H a 2ml mikrozkumavky typu I, Sarstedt kat. čís. 72.693 a 72.694). Požadována je směs interní kontroly odpovídající 4 dodatečným vzorkům (i.e., 240 µl) (tento objem je specifický pro 2ml mikrozkumavky typu H a 2ml mikrozkumavky typu I, Sarstedt kat. čís. 72.693 a 72.694). Kontrolní sady a sady parametrů Kontrolní sady jsou kombinací protokolu a dodatečných parametrů, jako např. interní kontroly, pro purifikaci vzorku na QIAsymphony SP. U každého protokolu je předinstalována výchozí kontrolní sada. Pokud bude na přístroji Rotor-Gene Q analyzována CMV a EBV ve stejném PCR běhu (viz Běhy s více rozbory, níže), použijte pro purifikaci vzorku odpovídající CMV kontrolní sadu. Sady parametrů jsou kombinací definice rozboru s dodatečnými definovanými parametry, jako např. součtem replikátů a počtem standardů v rozboru, pro nastavení rozboru na QIAsymphony AS. 32 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Běhy s více rozbory V některých případech je v rámci QIAsymphony RGQ procedury možné během stejné PCR analyzovat jeden vzorek na přítomnost více patogenů. Toto se označuje jako běh s více rozbory. Pro běh s více rozbory musí být splněno několik podmínek. Souprava artus CMV QS-RGQ Kit může být použita společně s artus EBV QS-RGQ Kit (kat. čís. 4501363) v běhu s více rozbory, pokud jsou splněny následující požadavky. Příprava vzorků na QIAsymphony SP Pro purifikaci vzorků, které budou testovány na CMV a EBV za užití stejného eluátu, použijte CMV IC pro všechny vzorky a ne EBV RG IC dodávanou s artus EBV QS-RGQ Kit. Použijte pro purifikaci vzorku správnou CMV kontrolní sadu. Nastavení rozboru na QIAsymphony AS Pro správnou kvantifikaci, stejně jako pro platné informace získané pomocí interní kontroly, musí interní kontrola pro nastavení obou rozborů odpovídat interní kontrole použité při přípravě vzorku (CMV IC). Použijte CMV IC ze stejné šarže jak pro přípravu vzorku, tak pro nastavení PCR kontrol (krok 13 v protokolu k nastavení rozboru, strana 45). Nepoužívejte CMV IC s rozdílnými čísly šarží. PCR na Rotor-Gene Q Kvůli rozdílům ve fluorescenčních intenzitách, které vznikají při používání dvou různých rozborů v jednom běhu, je nutné před spuštěním PCR běhu provést kalibraci výsledků pro každý artus systém odděleně (kroky 9 15 v PCR protokolu, strany 54 57). Výtěžek nukleových kyselin Eluáty připravené pomocí nosiče RNA (CARRIER) mohu obsahovat mnohem více nosiče RNA (CARRIER) než cílové nukleové kyseliny. Doporučujeme pro určení výtěžků používat kvantitativní metody amplifikace. Skladování nukleových kyselin Pro krátkodobé skladování po dobu až 24 hodin doporučujeme skladovat purifikované nukleové kyseliny při 2 8ºC. Pro dlouhodobé skladování přes 24 hodin doporučujeme skladování při 20ºC. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 33

Nastavení mezní hodnoty pro PCR analýzu Optimální nastavení mezní hodnoty pro danou kombinaci Rotor-Gene Q přístroje a soupravy artus QS-RGQ Kit by mělo být empiricky stanoveno testováním každé individuální kombinace, protože se jedná o relativní hodnotu závislou na celkovém diagnostickém pracovním postupu. Pro začátek může být mezní hodnota nastavena na úvodní hodnotu 0,04 pro analýzu prvního PCR běhu. Tato hodnota by ale měla být doladěna v komparativní analýze dalších běhů v pracovním schématu. Mezní hodnota by měla být nastavena manuálně těsně nad signál pozadí negativních kontrol a negativních vzorků. Průměrná mezní hodnota vypočítaná z těchto pokusů by měla s velkou pravděpodobností platit i pro většinu následujících běhů. Uživatel by přesto měl generované mezní hodnoty pravidelně kontrolovat. Mezní hodnota se pohybuje obvykle mezi 0,03-0,05 a měla by se zaokrouhlovat na maximálně tři desetinná místa. Kvantifikace S kvantifikačními standardy (CMV QS 1 4) dodávanými s artus CMV QS-RGQ Kit se zachází stejně jako s již izolovanými vzorky a přidávají se ve stejném objemu (20 µl). Standardní křivku na přístroji Rotor-Gene Q vytvoříte tak, že vložíte všechny čtyři kvantifikační standardy, definujete je v okně menu Edit Samples přístroje Rotor-Gene Q jako standardy a zadáte uvedené koncentrace (viz uživatelský manuál přístroje). Kvantifikační standardy jsou definovány jako kopie/µl. Pro přepočet hodnot získaných pomocí standardní křivky na kopie/ml vzorku se používá následující vzorec: Výsledek (kopie/ml) = výsledek (kopie/µl) x původní eluční objem (90 µl)* objem vzorku (ml) Do výše uvedeného vzorce se dosazuje zásadně původní objem vzorku. Toto se musí zohlednit, byl-li objem vzorku před izolací nukleových kyselin pozměněn (např. redukce objemu centrifugací nebo jeho zvýšení naplněním na objem požadovaný pro izolaci). * Výpočet se zakládá na výchozích elučních objemech (90 µl). 34 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Protokol: Izolace DNA na QIAsymphony SP Souprava QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (QIAGEN, kat. čís. 937055) je validována pro purifikaci virové DNA z lidské plazmy a souprava QIAsymphony DNA Mini Kit (QIAGEN, kat. čís. 931236) pro purifikaci virové DNA z lidské plné krve pro užití se soupravou artus CMV QS-RGQ Kit. Všeobecné informace o protokolu jsou uvedené v tabulce 5. Tabulka 5. Všeobecné informace o protokolu Diagnostická souprava QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit Materiál vzorku Plazma Plná krev Objem vzorku (včetně nadbytečného objemu) Jméno protokolu Výchozí kontrolní sada 1200 µl 300 µl Cellfree1000_V4_DSP* ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus CMV* Eluční objem 60 µl 60 µl Požadovaná verze softwaru Verze 3.1 nebo vyšší QIAsymphony DNA Mini Kit VirusBlood200_V4* ACS_VirusBlood200_V4_ artus_cmv* Verze 3.5 nebo vyšší * V4 nebo vyšší, podle toho, jak je vyžadováno používanou softwarovou verzí. Při běhu s více rozbory, kde CMV a EBV budou analyzovány v rámci stejné PCR, použijte pro přípravu vzorku správnou CMV kontrolní sadu. Důležité pokyny před začátkem Ujistěte se, že jste dobře obeznámeni s obsluhou přístrojů QIAsymphony SP/AS. Instrukce naleznete v uživatelském manuálu dodávaném s Vašimi přístroji. Před začátkem procesu si přečtěte Důležitá upozornění, strany 25 34. Před prvním použitím zásobníku s reagenciemi (RC) zkontrolujte, zda pufry QSL2 a QSB1 v zásobníku (RC) neobsahují precipitát. V případě potřeby vyjměte vaničky obsahující pufry QSL2 a QSB1 ze zásobníku s reagenciemi (RC) a inkubujte je po 30 minut při 37 C za příležitostného třepání, aby se precipitát rozpustil. Ujistěte se, že jsou vaničky znovu umístěny do správných pozic. Pokud je zásobník s reagenciemi (RC) již propíchnut, ujistěte se, že jsou vaničky zapečetěny pomocí opětovně artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 35

použitelných uzavíracích proužků a inkubujte celý zásobník s reagenciemi (RC) ve vodní lázni po 30 minut při 37 C za příležitostného třepání.* Pokuste se předejít prudkému třepání zásobníkem s reagenciemi (RC), jinak by se mohla vytvořit pěna, která může vést k problémům s detekcí hladiny tekutiny. Všechny komponenty soupravy QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit byly prokázány jako stabilní v přístrojích QIAsymphony SP/AS minimálně po běžnou dobu potřebnou pro zpracování 96 vzorků. Pokyny před začátkem Všechny potřebné směsi, včetně směsí obsahující nosič RNA (CARRIER) a interní kontrolu, připravte bezprostředně před začátkem procesu. Další informace viz Příprava směsí nosiče RNA (CARRIER) a AVE pufru (AVE) pro vzorky plazmy, strana 30 a Používání interní kontroly, strana 30. Ujistěte se, že je děrovací víčko (PL) umístěno na zásobníku s reagenciemi (RC) a že víčko vaničky s magnetickými částicemi bylo odstraněno nebo - pokud používáte částečně použitý zásobník s reagenciemi (RC) - se ujistěte, že byly odstraněny opětovně použitelné uzavírací proužky. Před začátkem procedury se ujistěte, že jsou magnetické částice úplně resuspendovány. Vaničku obsahující magnetické částice před prvním použitím minimálně 3 minuty rázně vortexujte. Před vložením zásobníku s reagenciemi (RC) odstraňte víčko z vaničky obsahující magnetické částice a otevřete zkumavky s enzymy. Ujistěte se, že byl stojánek s enzymy ekvilibrován na pokojovou teplotu (15-25 C). Ujistěte se, že je děrovací víčko (PL) umístěno na zásobníku s reagenciemi (RC) nebo - pokud používáte částečně použitý zásobník s reagenciemi (RC) - se ujistěte, že byly odstraněny opětovně použitelné uzavírací proužky. Pokud jsou vzorky opatřeny čárovým kódem, vložte je do nosiče zkumavky nasměrované tak, aby čárový kód ležel pod čtečkou čárových kódů v zásuvce "Sample" (Vzorek) na levé straně přístroje QIAsymphony SP. Provedení 1. Zavřete všechny zásuvky a víka přístrojů QIAsymphony SP/AS. 2. Zapněte přístroje a vyčkejte, dokud se neobjeví obrazovka Sample Preparation a nedokončí se inicializační proces. Vypínač je umístěn v levém spodním rohu přístroje QIAsymphony SP. * Ujistěte se, že byly přístroje pravidelně kontrolovány, udržovány a kalibrovány podle doporučení výrobce. 36 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

3. Přihlaste se do systému přístrojů. 4. Ujistěte se, že je zásuvka Waste správně připravená (viz tabulka 6) a proveďte kontrolu vloženého obsahu, včetně žlábku na špičky a na tekutý odpad. V případě potřeby vyměňte odpadní sáček. Tabulka 6. Příprava zásuvky Waste Držák boxů na jednotky 1 4 Držák odpadního sáčku Držák nádoby na tekutý odpad Prázdné boxy na jednotky Použijte odpadní sáček Vyprázdněte a vložte nádobu na tekutý odpad 5. Vložte požadovaný stojánek s elučními zkumavkami do zásuvky Eluate. Používejte pouze "Elution slot 1" s odpovídajícím chladicím adaptérem (Cooling Adapter, EMT, v2, Qsym, kat. čís. 920730). Pro integrovanou operaci umístěte stojánek s elučními zkumavkami s adaptérem, včetně transferního podstavce, do drážky 1. 6. Vložte požadované zásobníky s reagenciemi (RC) a spotřební materiál do zásuvky Reagents and Consumables (viz tabulky 7 a 8). Daný počet špiček s filtrem se může lišit od počtu zobrazeném na dotekové obrazovce v závislosti na nastavení. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 37

Tabulka 7. Příprava zásuvky Reagents and Consumables RC pozice 1 a 2 Držák stojánků se špičkami pozice 1-4 Držák stojánků se špičkami pozice 5-18 Držák boxů s jednotkami pozice 1-3 Držák boxů s jednotkami pozice 4 Vložte 1 zásobník s reagenciemi (RC) pro až 48 vzorků plazmy nebo 2 nové zásobníky s reagenciemi (RC) pro až 96 vzorků plazmy při použití s QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit Vložte 1 zásobník s reagenciemi (RC) pro až 96 vzorků plné krve při použití s QIAsymphony DNA Mini Kit Vložte dostatečné množství jednorázových špiček s filtrem, 200 µl (viz tabulka 8) Vložte dostatečné množství jednorázových špiček s filtrem, 1500 µl (viz tabulka 8) Vložte 3 boxy obsahující zásobníky pro přípravu vzorků Vložte 1 box obsahující kryty hrotů 38 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Tabulka 8. Požadovaný plastový materiál pro 1-4 sady vzorků Jedna sada, 24 vzorků* Dvě sady, 48 vzorků* Tři sady, 72 vzorků* Čtyři sady, 96 vzorků* Vzorky plazmy (QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit) Jednorázové špičky s filtrem, 28 52 76 100 200 µl Jednorázové špičky s filtrem, 113 206 309 402 1500 µl Zásobníky pro přípravu vzorků 21 42 54 72 Kryty hrotů (po osmi) 3 6 9 12 Vzorky plné krve (QIAsymphony DNA Mini Kit) Jednorázové špičky s filtrem, 26 50 74 98 200 µl Jednorázové špičky s filtrem, 98 188 278 368 1500 µl Zásobníky pro přípravu vzorků 21 42 63 84 Kryty hrotů (po osmi) 3 6 9 12 * Užití více než jedné zkumavky s interní kontrolou na jednu sadu a provedení více než jedné kontroly vloženého obsahu vyžaduje dodatečné jednorázové špičky s filtrem. Jeden stojánek na špičky obsahuje 32 špiček s filtrem. Počet požadovaných špiček s filtrem zahrnuje špičky s filtrem pro 1 kontrolu vloženého obsahu na jeden zásobník s reagenciemi. Jeden box na jednotky obsahuje 28 zásobníků pro přípravu vzorků. Jeden box na jednotky obsahuje dvanáct krytů hrotů (po osmi). 7. Proveďte kontrolu vloženého obsahu zásuvky Reagents and Consumables. 8. Umístěte vzorky do správného nosiče zkumavek a vložte je do zásuvky Sample (viz tabulka 9). artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 39

Tabulka 9. Vkládání vzorků do zásuvky Sample Typ vzorku Plazma Plná krev Objem vzorku (včetně nadbytečného objemu) Zkumavky na vzorky Vložky 1200 µl 300 µl 2 ml mikrozkumavky typu H nebo 2 ml mikrozkumavky typu I (Sarstedt, kat. čís. 72.693 a 72.694) Vložka pro zkumavky 3B (kat. čís. 9242083) 9. Vložte zkumavku(y) obsahující směs nosiče RNA (CARRIER) a AVE pufru (AVE) (pro vzorky plazmy) nebo ATE pufru (pro vzorky plné krve), včetně interní kontroly, do nosiče zkumavek a vložte je do drážky A v zásuvce Sample. Více informací o přípravě směsi viz Příprava směsí nosiče RNA (CARRIER) a AVE pufru (AVE) pro vzorky plazmy, strana 30 a Používání interní kontroly, strana 30. Pokud bude na přístroji Rotor-Gene Q analyzována CMV a EBV ve stejném PCR běhu (viz Běhy s více rozbory, strana 33), použijte CMV IC pro všechny vzorky a ne EBV RG IC dodávanou se soupravou artus EBV QS-RGQ Kit. 40 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

10. Pomocí dotekové obrazovky zadejte požadované informace o každé zpracovávané sadě vzorků. Zadejte následující informace: Informace o vzorku Požadovaný protokol (zvolte kontrolní sadu Assay Control Set ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus CMV pro plazmu nebo ACS_VirusBlood200_V4_artus_CMV * pro plnou krev z kategorie artus QSRGQ ) Eluční objem 60 µl (viz tabulka 10) a výstupní pozice "slot 1" Zkumavku(y) obsahující směs nosiče RNA (CARRIER) a AVE pufru (AVE) (pro vzorky plazmy) nebo pufru ATE (pro vzorky plné krve), včetně interní kontroly (zvolte IC název ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus CMV * pro plazmu nebo ACS_VirusBlood200_V4_artus_CMV * pro plnou krev) Po zadání informací o sadě se status změní z "LOADED" (Naplněno) na QUEUED (Zařazeno). Jakmile je jedna sada zařazena, objeví se tlačítko "Run" (Spustit). Tabulka 10. Předvolený eluční objem Předvolený eluční objem (µl) Původní eluční objem (µl) 60 90 Eluční objem předvolený pro protokol. Toto je minimální dosažitelné množství eluátu ve výsledné eluční zkumavce. Původní objem elučního roztoku je vyžadován, aby bylo zajištěno, že skutečný objem eluátu odpovídá předvolenému objemu. 11. Stiskněte tlačítko Run pro spuštění purifikační procedury. Všechny kroky jsou plně automatizované. Na konci protokolu se status změní z RUNNING (Zpracovává se) na COMPLETED (Dokončeno). * V4 nebo vyšší, podle toho, jak je vyžadováno používanou softwarovou verzí. Při běhu s více rozbory, kde budou CMV a EBV analyzovány v rámci stejné PCR, použijte odpovídající CMV IC jméno. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 41

12. Poté co je zpracování vzorků dokončeno, buďto manuálně vyjměte stojánek s elučními zkumavkami ze zásuvky Eluate (nezávislá operace) nebo proveďte přímý přenos stojánku s elučními zkumavkami do přístroje QIAsymphony AS pomocí transferního modulu (integrovaná operace). Pro nezávislou operaci vyjměte stojánek s elučními zkumavkami z drážky pomocí dotekové obrazovky a poté otevřete zásuvku Eluate a manuálně vyjměte stojánek s elučními zkumavkami. Pro integrovanou operaci stiskněte Transfer pro přenos stojánku s elučními zkumavkami z drážky 1 přístroje QIAsymphony SP do drážky 2 přístroje QIAsymphony AS. Doporučujeme ihned ( 60 min) po dokončení běhu pokračovat s nastavením rozboru na přístroji QIAsymphony AS. V závislosti na teplotě a vlhkosti mohou eluáty ponechané v QIAsymphony SP po dokončení běhu podlehnout kondenzaci nebo evaporaci. Pro krátkodobé skladování po dobu až 24 hodin doporučujeme skladovat purifikované nukleové kyseliny při 2 8ºC. Pro dlouhodobé skladování přes 24 hodin doporučujeme skladování purifikovaných nukleových kyselin při -20ºC. Pro každý stojánek s elučními zkumavkami je generován soubor s výsledky. 13. Pokud byly zásobníky s reagenciemi (RC) použité pouze částečně, zapečeťte je ihned po skončení běhu protokolu pomocí dodávaných opětovně použitelných uzavíracích proužků a zkumavky obsahující proteinázu K uzavřete pomocí šroubovacích víček, aby se zamezilo vypařovaní. Více informací o skladování částečně použitých zásobníků s reagenciemi (RC) viz kapitola Storage v QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Handbook nebo QIAsymphony DNA Handbook. 14. Použité zkumavky na vzorky, destičky a odpad likvidujte podle místních bezpečnostních předpisů. Pro bezpečnostní informace viz manuál QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Handbook a QIAsymphony DNA Handbook. 15. Zavřete zásuvky přístroje a pokračujte s nastavením rozboru na přístroji QIAsymphony AS (strana 43). 16. Přístroj QIAsymphony SP vyčistěte během nastavení rozboru na přístroji QIAsymphony AS nebo později. Při integrované operaci vyčistěte všechny přístroje na konci celého procesu. Postupujte podle pokynů k údržbě v manuálu QIAsymphony SP/AS User Manual General Description. Zajistěte pravidelnou údržbu, aby se minimalizovalo riziko křížových kontaminací. 42 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Protokol: Nastavení rozboru na QIAsymphony AS Přístroj QIAsymphony AS provádí nastavení testu pro 6-216 reakcí. Vzorky zpracované na přístroji QIAsymphony SP mohou být do QIAsymphony AS přeneseny automaticky (integrovaná operace). Pro mimořádnou flexibilitu mohou být přístroje QIAsymphony SP a AS ovládány také nezávisle.* Podrobnosti o rozboru jsou uvedené v tabulce 11. Tabulka 11. Parametry rozboru za užití soupravy artus CMV QS-RGQ Kit Informace o procesu Vstupní materiál vzorku Objem master mixu 30 µl Objem templátu 20 µl Počet reakcí 6 24 Trvání běhu Požadovaná verze softwaru Podrobnosti Eluát Pro 6 reakcí: cca 9 minut Pro 72 reakcí: cca 35 minut Verze 3.1 nebo vyšší U nastavení testu pro CMV lze nastavit až 216 (9 x 24) rozborů v jednom běhu na přístroji QIAsymphony AS. Rozbory byly provedeny s každou reakcí zvlášť (žádné replikáty) a master mix byl připraven přístrojem pro běh zahrnující jeden templát, 4 standardy a jednu beztemplátovou kontrolu (NTC). Důležité pokyny před začátkem Před začátkem procesu si přečtěte Důležitá upozornění, strany 25 34. Objemy reagencií jsou optimalizované pro 24 reakcí na jednu soupravu a na jeden běh. Před každým použitím musí být všechny reagencie zcela rozmrazeny, dobře promíchány (opakovaným náběrem pipetou a vypuštěním pipety nebo krátkým vortexem) a minimálně 3 sekundy centrifugovány při 6800 x g. Zamezte vytvoření pěny. Při běhu s více rozbory, ve kterém budou CMV a EBV analyzovány v rámci stejné PCR, se ujistěte, že byla pro purifikační proces použita CMV IC ze soupravy artus CMV QS-RGQ Kit. Použijte CMV IC ze stejné šarže * Přístroje QIAsymphony SP a AS zůstávají během nezávislých operací fyzicky spojeni. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 43

jak pro přípravu vzorku, tak pro nastavení PCR kontrol (krok 13). Nepoužívejte CMV IC s rozdílnými čísly šarží. Eluáty z přípravy vzorku a všechny komponenty soupravy artus CMV QS- RGQ Kit byly v přístrojích prokázány jako stabilní minimálně po běžnou dobu potřebnou pro purifikaci 96 vzorků a pro nastavení testu pro 216 rozborů, včetně doby přenosu z QIAsymphony SP do QIAsymphony AS o délce až 60 minut a doby přenosu z QIAsymphony AS do Rotor-Gene Q o délce až 60 minut. Pracujte rychle a udržujte PCR reagencie před vkládáním na ledu nebo v chladicím bloku. Provedení 1. Vložte odpadní žlábek na špičky. 2. Zlikvidujte odpadní sáček na špičky. 3. Nasaďte prázdný odpadní sáček na špičky. 4. Přepněte na uživatelské rozhraní pro nastavení rozboru stisknutím tlačítka Switch (Přepnout) ve stavovém řádku. 5. Spusťte proces definice rozboru. Pro nezávislou operaci stiskněte New. U integrované operace se objeví hlášení, zda se má stojánek s elučními zkumavkami použít jako stojánek na zkumavky se vzorky. Stiskněte Yes pro potvrzení. Hlášení na dotekové obrazovce provedou uživatele krok po kroku procesem definice rozboru. 6. Zvolením souboru příslušícího stojánku z odpovídajícího běhu na přístroji QIAsymphony SP přiřadíte stojánek se vzorky drážce Sample. Pokud byl stojánek s elučními zkumavkami do QIAsymphony AS přenesen automaticky, přiřadí se soubor příslušící stojánku automaticky a obrazovka Sample Rack(s) (Stojánky se vzorky) v uživatelském rozhraní pro nastavení rozboru bude již vyplněna. 7. Zkontrolujte stojánek se vzorky, EC+ a EC pozice, ID vzorků a objemy. 8. Zvolte sadu parametrů, která má být při běhu použita (viz tabulka 12). 44 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Tabulka 12. Informace o rozboru za užití soupravy artus CMV QS- RGQ Kit Informace pro spuštění Kategorie Sada parametrů Podrobnosti artus QS-RGQ artus CMV QS-RGQ_V1* * V1 nebo vyšší, podle toho, jak je vyžadováno používanou softwarovou verzí. Při běhu s více rozbory, kde budou CMV a EBV analyzovány ve stejném eluátu v rámci stejné PCR, musí být ke vzorkům přiřazeny obě sady parametrů artus EBV QS-RGQ_V1 i artus CMV QS-RGQ_V1 (V1 nebo vyšší). 9. Přiřazení sady parametrů ke vzorkům Sada parametrů definuje parametry nastavení rozboru. Při běhu s více rozbory, kde budou CMV a EBV analyzovány ve stejném eluátu v rámci stejné PCR, musí být ke vzorkům přiřazeny obě sady parametrů artus EBV QS-RGQ_V1 i artus CMV QS-RGQ_V1. 10. Definujte stojánky v rozboru. V této fázi mohou být stojánky vloženy do drážek Assay (viz tabulka 14). 11. Zkontrolujte teplotu na chladicích pozicích. Jsou-li cílové teploty chlazení dosaženy, barva drážek se změní na zelenou. 12. Sdružte všechny zkumavky s CMV RG Master jedné soupravy do jedné zkumavky. S viskózními reagenciemi může být obtížné manipulovat pomocí manuálních pipet. Ujistěte se, že byl do zkumavky převeden celý objem CMV RG Master. 13. Naplňte každou reagenční zkumavku požadovaným množstvím správné reagencie podle informací o vkládání určených softwarem přístroje. Před každým použitím musí být všechny reagencie zcela rozmrazeny, dobře promíchány (opakovaným náběrem pipetou a vypuštěním pipety nebo krátkým vortexem) a minimálně 3 sekundy centrifugovány při 6800 x g. Zamezte vytvoření bublin nebo pěny, které mohou způsobit chyby při detekci. Pracujte rychle a udržujte PCR komponenty před vkládáním na ledu nebo v chladicím bloku. V1 nebo vyšší, podle toho, jak je vyžadováno používanou softwarovou verzí. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 45

Při běhu s více rozbory, ve kterém budou CMV a EBV analyzovány v rámci stejné PCR, se ujistěte, že byla v purifikačním procesu použita CMV IC ze soupravy artus CMV QS-RGQ Kit. Použijte CMV IC ze stejné šarže jak pro přípravu vzorku, tak pro nastavení PCR kontrol. Nepoužívejte CMV IC s rozdílnými čísly šarží. 14. Umístěte reagenční zkumavky bez víček do správných pozic v předem vychlazených adaptérech pro reagencie (viz tabulka 13). Tabulka 13. Spotřební materiál Spotřební materiál Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) 2 ml kónické zkumavky Qsym AS (500)* 5 ml kónické zkumavky Qsym AS (500)* 30 ml reagenční lahvičky Qsym AS (50)* Eluční mikrozkumavky CL (24 x 96) Název na dotekové obrazovce QIA#981103 *StripTubes 0.1 QIA#997102 *T2.0 ScrewSkirt QIA#997104 *T5.0 ScrewSkirt QIA#997108 *Bottle 30ml QIA#19588 * EMTR Pro použití s adaptérem/držákem na reagencie RG Strip Tubes 72 QS Držák na reagencie 1 QS Držák na reagencie 2 QS Držák na reagencie 1 QS Držák na reagencie 2 QS Držák na reagencie 2 QS Stojánek na eluční mikrozkumavky QS * Pro komponenty master mixu, systémem připravený master mix, standardy a kontroly. Alternativně lze použít zkumavky Sarstedt uvedené na straně 24. Přípona (m) na dotekové obrazovce ukazuje, že výpočet hladiny tekutiny u příslušné zkumavky byl optimalizován pro reagencie tvořící konkávní meniskus. 46 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

15. Otevřete zásuvky Eluate and Reagents a Assays. 16. Vložte připravené adaptéry pro reagencie do správných drážek. Zadejte čárový kód diagnostické soupravy pomocí List view (Seznam) na obrazovce Loading Reagents (Vkládání reagencií). 17. Umístěte stripy se zkumavkami do předem vychlazeného adaptéru RG Strip Tubes 72 QS (viz tabulka 14) - pokud tak již nebylo učiněno - a vložte je do příslušných drážek. Tabulka 14. Adaptéry a držáky na reagencie Stojánek/držák na reagencie Stojánek pro vzorky Název Stojánek na eluční mikrozkumavky QS Požadovaný počet* Držáky na reagencie Držák na reagencie 1 QS 1 Stojánky pro rozbor RG Strip Tubes 72 QS 1 * Vypočítáno pro rozbor se 72 reakcemi. 1 18. Pokud ještě nebyl stojánek s elučními zkumavkami do QIAsymphony AS přenesen (viz krok 12 purifikačního protokolu, strana 42), vložte eluční mikrozkumavky CL do předem vychlazeného adaptéru pro stojánek s elučními mikrozkumavkami QS (viz tabulka 14) a umístěte připravený adaptér do určené drážky. Pro nezávislou operaci vyjměte stojánek s elučními zkumavkami z drážky pomocí dotekové obrazovky a poté otevřete zásuvku Eluate přístroje QIAsymphony SP a manuálně vyjměte stojánek s elučními zkumavkami. 19. Vložte jednorázové špičky s filtrem do zásuvek Eluate and Reagents a Assays v souladu s požadovaným počtem pro každý typ špičky (viz tabulky 15 a 16). Vložte stojánky na špičky počínaje drážkami 1, 2 a 3 do zásuvky Eluate and Reagents a poté vložte držáky na špičky do drážek 7, 8 a 9 v zásuvce Assays. Tabulka 15. Špičky s filtrem Spotřební materiál Název na dotekové obrazovce Filter-Tips, 1500 µl (1024) 1500 µl Filter-Tips, 200 µl (1024) 200 µl Filter-Tips, 50 µl (1024) 50 µl artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 47

Tabulka 16. Spotřeba spotřebního materiálu* Počet pro 24 Počet pro 72 reakcí Spotřební materiál reakcí Špičky s filtrem, 1500 µl 4 6 Špičky s filtrem, 200 µl 10 9 Špičky s filtrem, 50 µl 25 73 Odpadní sáček na špičky 1 1 * Tato tabulka poskytuje příklad spotřeby spotřebního materiálu pro běh rozboru s následujícími specifikacemi: 19 nebo 67 templátů, 4 standardy, jedna beztemplátová kontrola (NTC), vzorky s interní kontrolou (IC), master mix připravený přístrojem. Spotřeba špiček s filtrem může být ovlivněna některými procesy na přístroji QIAsymphony AS (např. detekce hladiny tekutin). Vyšší počet špiček je požadován pro běh s více rozbory, ve kterém jsou CMV a EBV analyzovány ve stejné PCR. 20. Zavřete zásuvky Eluate and Reagents a Assays. 21. Při zavírání každé zásuvky stiskněte Yes pro spuštění kontroly vloženého obsahu u každé zásuvky. Kontrola vloženého obsahu zkontroluje drážky, adaptéry, špičky s filtrem a odpadní žlábek na špičky. Je-li vyžadováno, opravte případné chyby. 22. Stiskněte Queue. Začíná kontrola chlazení. 23. Vyčkejte, dokud nejsou dosaženy cílové teploty chlazení. Jsou-li cílové teploty chlazení dosaženy, barva drážek se změní na zelenou. 24. Stiskněte tlačítko Run pro spuštění běhu. 25. Po skončení běhu stiskněte Remove na obrazovce Overview (Přehled) z nastavení rozboru. Otevřete zásuvku Assays a vyjměte stojánky. 26. Stáhněte si soubory s výsledky a soubor cykléru. 27. Pokračujte s Protokol: PCR a analýza dat na přístroji Rotor-Gene Q, strana 49. 28. Proveďte pravidelnou údržbu přístroje QIAsymphony AS během běhu na přístroji Rotor-Gene Q nebo později. Při integrované operaci vyčistěte všechny přístroje na konci celého procesu. Postupujte podle pokynů k údržbě v manuálu QIAsymphony SP/AS User Manual General Description. Zajistěte pravidelnou údržbu, aby se minimalizovalo riziko křížových kontaminací. 48 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Protokol: PCR a analýza dat na přístroji Rotor-Gene Q Důležité pokyny před začátkem Před začátkem procesu si přečtěte "Důležitá upozornění, strany 25 34. Před začátkem protokolu se dobře seznamte s přístrojem Rotor-Gene Q. Prostudujte si uživatelský manuál přístroje. Dbejte na to, aby byly v každém běhu PCR zahrnuty všechny 4 kvantifikační standardy a alespoň jedna negativní kontrola (Water, PCR grade). Pro vytvoření standardní křivky použijte u každého běhu PCR všechny 4 kvantifikační standardy (CMV QS 1 4) dodávané spolu s produktem. Provedení 1. Zavřete PCR zkumavky a umístěte je do 72 jamkového rotoru přístroje Rotor-Gene Q. Ujistěte se, že jsou 4-stripy Rotor-Gene Q zkumavek umístěny ve správném směru tak, aby si ukazatelé pozic chladicího adaptéru a rotoru odpovídaly. Ujistěte se, že byl na rotor nasazen Locking Ring (příslušenství přístroje Rotor-Gene) jako prevence nechtěného otevření zkumavek během běhu. 2. Přeneste soubor cykléru z přístroje QIAsymphony AS do Rotor- Gene Q počítače. 3. Po detekci CMV DNA vytvořte teplotní profil podle následujících kroků: Nastavení obecných parametrů Obrázky 9 11 Počáteční aktivace Hot Start enzymu Obrázek 12 Amplifikace DNA (touchdown PCR) Obrázek 13 Nastavení senzitivity fluorescenčních kanálů Obrázky 14-20 Spuštění běhu Obrázek 21 Veškeré údaje se vztahují na Rotor-Gene Q software verzi 2.02. Podrobnosti k programování přístroje Rotor-Gene Q naleznete v uživatelském manuálu přístroje. Na obrázcích jsou tato nastavení zvýrazněna černými rámečky. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 49

4. Nejdříve otevřete okno New Run Wizard (obrázek 9). Zaškrtněte rámeček Locking Ring Attached a klikněte na Next. Obrázek 9. Okno New Run Wizard. 5. Zvolte 50 jako objem PCR reakce a klikněte na Next (obrázek 10). Obrázek 10. Nastavení obecných parametrů. 50 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

6. Klikněte na tlačítko Edit Profile v dalším okně New Run Wizard (obrázek 11) a naprogramujte teplotní profil podle obrázků 11 13. Obrázek 11. Úprava profilu. Obrázek 12. Počáteční aktivace Hot Start enzymu. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 51

Obrázek 13. Amplifikace DNA. Ujistěte se, že je Touchdown-funkce u Annealing - kroku aktivována pro 10 cyklů. 52 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

7. Měřící rozsah fluorescenčních kanálů je třeba určit podle fluorescenční intenzity v PCR zkumavkách. Klikněte na Gain Optimisation v okně menu New Run Wizard (viz obrázek 11) pro otevření okna Auto-Gain Optimisation Setup. Nastavte kalibrační teplotu na 65, aby odpovídala reasociační (annealing) teplotě amplifikačního programu (obrázek 14). 1 2 Obrázek 14. Nastavení senzitivity fluorescenčních kanálů. 8. Pokud provádíte nastavení pro jeden rozbor, klikněte na Start (obrázek 14) a pokračujte přímo ke kroku 16, strana 57. Pro běh s více rozbory, ve kterém jsou CMV a EBV analyzovány ve stejné PCR, pokračujte ke kroku 9 pro manuální nastavení intenzit fluorescenčních kanálů. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 53

9. Klikněte na Edit (obrázek 15) pro úpravu fluorescenčních kanálů. 1 Obrázek 15. Manuální úprava intenzity fluorescenčních kanálů pro každý fluorescenční kanál na různých pozicích zkumavek pro rozdílné rozbory (CMV a EBV). 10. Nastavte pozici zkumavek pro zkumavky pro první artus rozbor (např. CMV). Nastavte pozici zkumavek pro všechny fluorescenční kanály a stiskněte OK (obrázek 16). 1 2 Obrázek 16. Nastavení pozic zkumavek. 54 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

11. Klikněte na Start pro spuštění optimalizace výsledků pro první artus rozbor (obrázek 17). 1 Obrázek 17. Spuštění optimalizace výsledků. 12. Objeví se nové okno Running Auto-Gain Optimisation. Vyčkejte dokud se v tomto okně neobjeví Completed (obrázek 18). Zapište si zvolené hodnoty výsledků pro oba kanály a klikněte na Close (obrázek 18). artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 55

2 1 3 Obrázek 18. Dokončená optimalizace výsledků. Zapište si hodnoty výsledků (v tomto příkladu 1.33 pro oba fluorescenční kanály). 13. Zopakujte kroky 9 12 pro pozice zkumavek pro zkumavky u druhého artus rozbor (např. EBV). 14. Klikněte na Edit Gain pro manuální úpravu hodnot výsledků (obrázek 19). 1 Obrázek 19. Manuální úprava hodnot výsledků. 56 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

15. Zvolte nejnižší hodnotu výsledku pro Cycling Green zapsanou u kroku 12 a zadejte tuto hodnotu manuálně do okna Gain for Green (obrázek 20). Zvolte nejnižší hodnotu výsledku pro Cycling Yellow zapsanou u kroku 12 a zadejte tuto hodnotu manuálně do okna Gain for Yellow. 1 2 Obrázek 20. Manuální zadání nejnižší hodnoty výsledku. 16. Hodnoty výsledků determinované kalibrací kanálů (nebo manuálně přiřazené) se automaticky uloží a jsou uvedené v seznamu v posledním okně programovací procedury (obrázek 21). Stiskněte Start Run. Obrázek 21. Spuštění běhu. 17. Po spuštění běhu importujte informace ze souboru cykléru kliknutím na ( Open ) nebo upravte vzorky manuálně. 18. Po dokončení běhu analyzujte výsledky. Může dojít k následujícím výsledkům (18a, 18b a 18c). Při běhu s více rozbory, ve kterém jsou CMV a EBV analyzovány ve stejné PCR, se ujistěte, že jsou vzorky pro CMV a EBV analyzované artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 57

odděleně s odpovídajícími kvantifikačními standardy. Nedefinujte standardy různých artus PCR systémů zároveň. Viz artus EBV QS-RGQ Kit Handbook pro interpretaci výsledků EBV rozborů. Příklady pozitivních a negativních PCR reakcí jsou uvedeny na obrázcích 22 a 23. 18a. Ve fluorescenčním kanálu Cycling Green je detekován signál. Výsledek analýzy je pozitivní: Vzorek obsahuje CMV DNA. V tomto případě je detekce signálu v kanálu Cycling Yellow podružná, protože vysoké výchozí koncentrace CMV DNA (pozitivní signál v kanálu Cycling Green) mohou vést k redukovanému až chybějícímu fluorescenčnímu signálu interní kontroly v kanálu Cycling Yellow (kompetice). 18b. Ve fluorescenčním kanálu Cycling Green není detekován žádný signál, nýbrž pouze v kanálu Cycling Yellow (signál interní kontroly). Ve vzorku není prokazatelná žádná CMV DNA. Lze jej považovat za negativní. Při negativní CMV PCR vylučuje detekovaný signál interní kontroly možnost PCR inhibice. Pokud je ovšem C T hodnota interní kontroly negativního vzorku po více než 3 cykly vyšší než C T hodnota interní kontroly beztemplátové kontroly (C T IC Sample C T IC NTC >3), měl by být tento vzorek považován za neplatný. Není možné učinit závěr. 18c. Signál není detekován ani v kanálu Cycling Green ani v kanálu Cycling Yellow. Není možné učinit závěr. Pokyny týkající se zdrojů chyb a jejich odstranění jsou uvedeny v kapitole Řešení problémů, strana 60. 58 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Obrázek 22. Průkaz kvantifikačních standardů (CMV QS 1-4) ve fluorescenčním kanálu Cycling Green. NTC: Beztemplátová kontrola (negativní kontrola). Obrázek 23. Průkaz interní kontroly (IC) ve fluorescenčním kanálu Cycling Yellow při současné amplifikaci kvantifikačních standardů (CMV QS 1 4). NTC: Beztemplátová kontrola (negativní kontrola). artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 59

Řešení problémů V této kapitole naleznete užitečné informace, které Vám mohou pomoci při řešení případných problémů. Více informací lze získat také na internetové stránce naší technické podpory: www.qiagen.com/faq/faqlist.aspx. Vědci z naší technické podpory vždy rádi zodpoví Vaše otázky ohledně údajů a protokolu v tomto manuálu i obecně k technologiím pro přípravu vzorků a jejich rozbory (možnosti navázání kontaktu viz zadní strana nebo www.qiagen.com). Obecná manipulace Chybová zpráva na dotekové obrazovce Komentáře a návrhy Pokud se objevila chybová zpráva během běhu protokolu, konzultujte uživatelský manuál dodávaný s Vaším přístrojem. Precipitáty ve vaničkách s reagenciemi otevřeného zásobníku soupravy QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit nebo QIAsymphony DNA Mini Kit a) Vypařování pufrů b) Skladování zásobníků s reagenciemi (RC) Rozsáhlé vypařování může vést ke zvýšené koncentraci soli nebo ke snížené koncentraci alkoholu v pufrech. Zlikvidujte zásobník s reagenciemi (RC). Pokud je nepoužíváte při purifikaci, ujistěte se, že jste uzavřeli vaničky s pufry částečně použitých zásobníků s reagenciemi (RC) pomocí opětovně použitelných uzavíracích proužků. Skladování zásobníků s reagenciemi (RC) při teplotách nižších než 15 C může vést k tvorbě precipitátů. V případě potřeby vyjměte vaničky obsahující pufry QSL2 a QSB1 ze zásobníku s reagenciemi (RC) a inkubujte je 30 minut ve vodní lázni* při 37 C za příležitostného třepání, aby se precipitát rozpustil. Ujistěte se, že jsou vaničky znovu umístěny do správných pozic. Pokud je zásobník s reagenciemi (RC) již propíchnut, ujistěte se, že jsou vaničky zapečetěny pomocí opětovně použitelných uzavíracích proužků a inkubujte celý zásobník s reagenciemi (RC) po 30 minut ve vodní lázni* při 37 C za příležitostného třepání. * Ujistěte se, že byly přístroje pravidelně kontrolovány, udržovány a kalibrovány podle doporučení výrobce. 60 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Komentáře a návrhy Nízký výtěžek nukleových kyselin a) Magnetické částice nebyly plně resuspendovány b) Zmrazené vzorky nebyly po rozmrazení důkladně promíchány c) Nebyl přidán nosič RNA (CARRIER) d) Degradace nukleových kyselin e) Neúplná lýza vzorků Před začátkem procedury se ujistěte, že jsou magnetické částice úplně resuspendovány. Před použitím je minimálně 3 minuty vortexujte. Rozmrazte zmrazené vzorky pomocí jemného třepáním, aby se zajistilo důkladné promíchání. Rekonstituujte nosič RNA (CARRIER) v AVE pufru (AVE) a smíchejte se správným množstvím AVE pufru (AVE), jak je popsáno v kapitole "Příprava směsí nosiče RNA (CARRIER) a AVE pufru (AVE) pro vzorky plazmy" počínaje stranou 30. Zopakujte purifikační proceduru s novými vzorky. Vzorky byly nesprávně skladovány nebo podrobeny příliš mnoha rozmrazovacím/zmrazovacím cyklům. Zopakujte purifikační proceduru s novými vzorky. Před použitím zkontrolujte, zda pufry QSL2 a QSB1 neobsahují precipitát. V případě potřeby vyjměte vaničky obsahující pufry QSL2 a QSB1 ze zásobníku s reagenciemi (RC) a inkubujte je po 30 minut při 37 C za příležitostného třepání, aby se precipitát rozpustil. Pokud je zásobník s reagenciemi (RC) již propíchnut, ujistěte se, že jsou vaničky zapečetěny pomocí opětovně použitelných uzavíracích proužků a inkubujte celý zásobník s reagenciemi (RC) po 30 minut ve vodní lázni při 37 C za příležitostného třepání.* * Ujistěte se, že byly přístroje pravidelně kontrolovány, udržovány a kalibrovány podle doporučení výrobce. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 61

f) Ucpávání pipetovacích špiček v důsledku nerozpustného materiálu Komentáře a návrhy Ze vzorků nebyl před začátkem QIAsymphony purifikační procedury vyjmut nerozpustný materiál. Pro vyjmutí nerozpustného materiálu pro virové aplikace centrifugujte vzorek 1 minutu při 3000 x g a přeneste supernatant do nové zkumavky na vzorky. QIAsymphony AS detekuje nedostatek Masteru Do zkumavky nebyl přenesen celý CMV RG Master Sdružte všechny zkumavky s CMV RG Master jedné soupravy do jedné zkumavky. S viskózními reagenciemi může být obtížné manipulovat pomocí manuálních pipet. Ujistěte se, že byl do zkumavky převeden celý objem CMV RG Master. Pokud se u viskózních reagencií používají manuální pipety, doporučujeme nasátí dodatečného objemu o 5% (např. nastavte pipety na 840 µl pro objem o 800 µl). Alternativně, po pomalé dispenzi tekutiny a vyfouknutí pipety na stěnu cílové zkumavky, vyjměte špičku z tekutiny, uvolněte píst pipety a vyčkejte dalších 10 s. Zbylá tekutina steče dolů po špičce a může se vyfouknout druhým stisknutím pístu. Použití špiček s filtrem v kvalitě vhodné pro PCR s označením "nízká retence" může zlepšit výtěžek tekutiny. Žádný signál u pozitivních kontrol (CMV QS 1-4) ve fluorescenčním kanálu Cycling Green a) Fluorescenční kanál zvolený pro analýzu PCR dat neodpovídá protokolu b) Chybné naprogramování teplotního profilu přístroje Rotor-Gene K analýze dat zvolte fluorescenční kanál Cycling Green pro analytickou CMV PCR a fluorescenční kanál Cycling Yellow pro PCR interní kontroly. Porovnejte teplotní profil s údaji protokolu. Viz Protokol: PCR a analýza dat na přístroji Rotor-Gene Q, strana 49. 62 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

c) Chybné nastavení PCR reakce d) Podmínky skladování jednoho nebo více komponentů soupravy neodpovídají předpisům uvedeným v kapitole Skladování (strana 6) e) Doba použitelnosti soupravy artus CMV QS-RGQ Kit vypršela Komentáře a návrhy Ujistěte se, že bylo nastavení rozboru provedeno správně a že byla použita správná sada parametrů. Popřípadě PCR zopakujte. Viz Protokol: Nastavení rozboru na QIAsymphony AS, strana 43. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte popř. novou soupravu. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte popř. novou soupravu. Slabý nebo chybějící signál interní kontroly negativního vzorku podrobeného izolaci pomocí soupravy QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit nebo QIAsymphony DNA Mini Kit ve fluorescenčním kanálu Cycling Yellow při současné nepřítomnosti signálu v kanálu Cycling Green a) Podmínky PCR neodpovídají protokolu b) Došlo k inhibici PCR c) Během izolace došlo k úbytku DNA Zkontrolujte podmínky PCR (viz výše) a popř. PCR zopakujte s opraveným nastavením. Ujistěte se, že používáte validovanou izolační metodu (viz Protokol: Izolace DNA na QIAsymphony SP, strana 35) a držte se přesně pokynů. Nepřítomnost signálu interní kontroly může znamenat úbytek DNA během izolace. Ujistěte se, že používáte validovanou izolační metodu (viz Protokol: Izolace DNA na QIAsymphony SP, strana 35) a držte se přesně pokynů. Viz také "Nízký výtěžek nukleových kyselin" výše. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 63

d) Podmínky skladování jednoho nebo více komponentů soupravy neodpovídají předpisům uvedeným v kapitole Skladování (strana 6) e) Doba použitelnosti soupravy artus CMV QS-RGQ Kit vypršela Komentáře a návrhy Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte popř. novou soupravu. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte popř. novou soupravu. Signály u negativních kontrol ve fluorescenčním kanálu Cycling Green při analytické PCR a) Během přípravy PCR došlo ke kontaminaci Zopakujte PCR v replikátech s novými reagenciemi. Uzavřete jednotlivé PCR zkumavky pokud možno ihned po vložení zkoumaného vzorku. Ujistěte se, že jsou pracovní plochy a přístroje pravidelně dekontaminovány. b) Během izolace došlo ke kontaminaci Zopakujte izolaci a PCR zkoumaných vzorků za užití nových reagencií. Ujistěte se, že jsou pracovní plochy a přístroje pravidelně dekontaminovány. 64 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Literatura QIAGEN udržuje rozsáhlou aktuální online databázi vědeckých publikací, které hodnotí produkty QIAGEN. Podrobné volby hledání umožňují nalezení potřebných článků, buďto jednoduchým zadáním klíčových slov nebo upřesněním druhu aplikace, oboru výzkumu, názvu etc. Úplný seznam literatury naleznete v databance "QIAGEN Reference Database" na stránce www.qiagen.com/refdb/search.asp nebo kontaktujte technický servis QIAGEN nebo Vašeho místního distributora. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 65

Informace o objednání Produkt Obsah Katalogové čís. artus CMV QS-RGQ Kit (24) Pro 24 reakcí: Master, roztok hořčíku, 4 kvantifikační standardy, interní kontrola, voda (v kvalitě vhodné pro PCR) QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit pro automatizovanou purifikaci virových nukleových kyselin nebo bakteriální DNA z 1 96 vzorků QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (96) Až pro 96 příprav po 1000 µl: Zahrnuje 2 zásobníky s reagenciemi a stojánky s elučními zkumavkami a příslušenství QIAsymphony DNA Mini Kit pro automatizovanou purifikaci DNA z 1 96 vzorků QIAsymphony DNA Mini Kit (192) Systém QIAsymphony RGQ QIAsymphony RGQ, System Až pro 192 příprav po 200 µl: Zahrnuje 2 zásobníky s reagenciemi a stojánky s elučními zkumavkami a příslušenství QIAsymphony SP, QIAsymphony AS, Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM, požadované příslušenství a spotřební materiál, instalace a školení Přístroje QIAsymphony SP/AS a příslušenství QIAsymphony SP QIAsymphony modul pro přípravu vzorků, roční záruka na součástky a servis QIAsymphony AS Sample Prep Cartridges, 8-well (336) 8-Rod Covers (144) QIAsymphony modul pro přípravu vzorků, roční záruka na součástky a servis 8-jamkové zásobníky pro přípravu vzorků pro použití s přístrojem QIAsymphony SP Kryty hrotů (po osmi) pro použití s přístrojem QIAsymphony SP 4503363 937055 931236 9001850 9001297 9001301 997002 997004 66 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Produkt Obsah Katalogové čís. Cooling Adapter, EMT, v2, Qsym Reuse Seal Set (20) Insert, 2.0ml v2, samplecarr. (24), Qsym Elution Microtubes CL (24 x 96) Cooling Adapter, Reagent Holder 1, Qsym Cooling Adapter, Reagent Holder 2, Qsym Cooling Adapter, RG Strip Tubes 72, Qsym Tubes, conical, 2 ml, Qsym AS (500) Chladicí adaptér pro stojánky na eluční zkumavky, pro použití s přístroji QIAsymphony SP/AS (software verze 3.1 nebo vyšší) Opětovně použitelné uzavírací proužky pro uzavření částečně použitých QIAsymphony zásobníků s reagenciemi Sekundární adaptér pro zkumavky (pro 2 ml zkumavky se šroubovacími uzávěry, vložka pro zkumavky 3b) pro použití s QIAsymphony SP nosičem zkumavek Nesterilní polypropylenové zkumavky (maximální kapacita 0,85 ml, méně než 0,7 ml úložné kapacity, 0,4 ml eluční kapacity); 2304 ve stojáncích po 96; včetně stripů s víčky Adaptér pro držení 18 x 2 ml kónických zkumavek a 6 x 5 ml kónických zkumavek; pro použití s přístroji QIAsymphony SP/AS (software verze 3.1 nebo vyšší) Adaptér pro držení 18 x 2 ml kónických zkumavek, 2 x 5 ml kónických zkumavek a 2 x 30 ml reagenčních lahviček; pro použití s přístroji QIAsymphony SP/AS (software verze 3.1 nebo vyšší) Adaptér pro držení 18 stripů se 4 zkumavkami; pro použití s přístroji QIAsymphony SP/AS (software verze 3.1 nebo vyšší) 2 ml kónické zkumavky pro pojmutí reagencií; pro použití s přístrojem QIAsymphony AS 920730 997006 9242083 19588 9018090 9018089 9018092 997102* artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 67

Produkt Obsah Katalogové čís. Tube, conical, 5 ml, Qsym AS (500) Reagent Bottles, 30 ml, Qsym AS (50) Špičky s filtrem, 1500 µl (1024) Špičky s filtrem, 200 µl (1024) Filter-Tips, 50 µl (1024) 5 ml kónické zkumavky pro pojmutí reagencií; pro použití s přístrojem QIAsymphony AS 30 ml reagenční lahvičky s víčky, pro použití s přístrojem QIAsymphony AS Jednorázové špičky s filtrem, seskládané; (8 x 128). Pro použití s přístrojem QIAsymphony SP Jednorázové špičky s filtrem, seskládané; (8 x 128). Pro použití s QIAcube a QIAsymphony SP Jednorázové špičky s filtrem, seskládané (8 x 128). Pro použití s přístrojem QIAsymphony AS Tip Disposal Bags (15) Odpadní sáčky na špičky pro použití s přístroji QIAsymphony SP/AS Rotor-Gene Q a příslušenství Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Real-time PCR cyklér a analyzátor křivek tání s vysokým rozlišením (High Resolution Melt - HRM) s 5 kanály (zelený, žlutý, oranžový, červený, purpurový) plus HRM kanál, notebook počítač, software, příslušenství, roční záruka na součásti a servis Real-time PCR cyklér a analyzátor křivek tání s vysokým rozlišením (High Resolution Melt - HRM) s 5 kanály (zelený, žlutý, oranžový, červený, purpurový) plus HRM kanál, notebook počítač, software, příslušenství, roční záruka na součásti a servis včetně instalace a školení 997104* 997108 997024 990332 997120 9013395 Na požádání Na požádání * Prosím informujte se o dostupnosti. 68 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Produkt Obsah Katalogové čís. Rotor-Gene Q 5plex HRM System Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) Real-time PCR cyklér a analyzátor křivek tání s vysokým rozlišením (High Resolution Melt - HRM) s 5 kanály (zelený, žlutý, oranžový, červený, purpurový) plus HRM kanál, notebook počítač, software, příslušenství, roční záruka na součásti a servis Real-time PCR cyklér a analyzátor křivek tání s vysokým rozlišením (High Resolution Melt - HRM) s 5 kanály (zelený, žlutý, oranžový, červený, purpurový) plus HRM kanál, notebook počítač, software, příslušenství, roční záruka na součásti a servis včetně instalace a školení 250 stripů po 4 zkumavkách s víčky, pro 1000 reakcí 10 x 250 stripů po 4 zkumavkách s víčky, pro 10 000 reakcí 9001650 9001580 981103 981106 Informace o aktuálních licenčních podmínkách a specifických licencích k produktům získáte v odpovídajícím manuálu ke QIAGEN produktu. Manuály k produktům QIAGEN jsou dostupné na www.qiagen.com nebo na požádání u technického servisu QIAGEN nebo lokálního distributora. artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 69

Tato stránka byla úmyslně ponechána prázdnou 70 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Tato stránka byla úmyslně ponechána prázdnou artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 71

Tato stránka byla úmyslně ponechána prázdnou 72 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Tato stránka byla úmyslně ponechána prázdnou artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010 73

Tato stránka byla úmyslně ponechána prázdnou 74 artus CMV QS-RGQ Kit Manuál 12/2010

Koupě tohoto produktu opravňuje kupce k jeho užití k provedení diagnostických služeb pro humánní in vitro diagnostiku. Není poskytnut žádný obecný patent nebo licence jiná než toto specifické právo užití vycházející z koupě. Ochranné známky: QIAGEN, QIAsymphony, artus, Rotor-Gene (QIAGEN Group). artus CMV QS-RGQ Kit je diagnostická souprava označená značkou CE v souladu s evropskou směrnicí 98/79/ES o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro. Produkt není dostupný ve všech zemích. Licenční ujednání Použitím produktu vyjadřuje kupec nebo uživatel soupravy artus CMV QS-RGQ Kit souhlas s následujícími podmínkami: 1. artus CMV QS-RGQ Kit smí být používán výhradně v souladu s Manuálem artus CMV QS-RGQ Kit a pouze s komponenty obsaženými v soupravě. QIAGEN neposkytuje žádnou licenci v rámci kteréhokoliv svého duševního vlastnictví k použití nebo k začlenění přiložených komponent kitu s komponenty, které nejsou zahrnuty v této soupravě, s vyjímkou případů uvedených v Manuálu artus CMV QS-RGQ Kit a dodatečných protokolech dostupných na www.qiagen.com. 2. Mimo výslovně uvedenou licenci QIAGEN neposkytuje žádnou záruku, že tato souprava a/nebo její použití neporušuje práva třetích stran. 3. Tento kit a jeho komponenty jsou licencovány pro jedno použití a nesmí být znovu použity, obnoveny či znovu prodány. 4. QIAGEN zvláště vylučuje odpovědnost za jakékoliv jiné licence, vyjádřené či implikované, než výslovně uvedené. 5. Kupec a uživatel kitu souhlasí s tím, že nepodnikne nebo nikomu neumožní podniknout kroky, které by mohly vést nebo usnadnit zakázané skutky uvedené výše. QIAGEN může zákazy tohoto Licenčního ujednání prosadit u každého soudu a vyžadovat úhradu všech vyšetřovacích a soudních poplatků, inkl. poplatků za advokáta, v rámci jakéhokoliv postupu k prosazení tohoto Licenčního ujednání nebo jakýchkoliv jiných práv duševního vlastnictví vztahujících se na tento kit a/nebo jeho komponenty. Pro aktualizovaná licenční ustanovení viz www.qiagen.com. 2010 QIAGEN, všechna práva vyhrazena.

www.qiagen.com Australia Orders 1-800-243-800 Fax 03-9840-9888 Technical 1-800-243-066 Austria Orders 0800-28-10-10 Fax 0800-28-10-19 Technical 0800-28-10-11 Belgium Orders 0800-79612 Fax 0800-79611 Technical 0800-79556 Brazil Orders 0800-557779 Fax 55-11-5079-4001 Technical 0800-557779 Canada Orders 800-572-9613 Fax 800-713-5951 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) China Orders 86-21-3865-3865 Fax 86-21-3865-3965 Technical 800-988-0325 Denmark Orders 80-885945 Fax 80-885944 Technical 80-885942 Finland Orders 0800-914416 Fax 0800-914415 Technical 0800-914413 France Orders 01-60-920-926 Fax 01-60-920-925 Technical 01-60-920-930 Offers 01-60-920-928 Germany Orders 02103-29-12000 Fax 02103-29-22000 Technical 02103-29-12400 Hong Kong Orders 800 933 965 Fax 800 930 439 Technical 800 930 425 Ireland Orders 1800 555 049 Fax 1800 555 048 Technical 1800 555 061 Italy Orders 800-789-544 Fax 02-334304-826 Technical 800-787980 Japan Telephone 03-6890-7300 Fax 03-5547-0818 Technical 03-6890-7300 Korea (South) Orders 080-000-7146 Fax 02-2626-5703 Technical 080-000-7145 Luxembourg Orders 8002-2076 Fax 8002-2073 Technical 8002-2067 Mexico Orders 01-800-7742-639 Fax 01-800-1122-330 Technical 01-800-7742-436 The Netherlands Orders 0800-0229592 Fax 0800-0229593 Technical 0800-0229602 Norway Orders 800-18859 Fax 800-18817 Technical 800-18712 Singapore Orders 1800-742-4362 Fax 65-6854-8184 Technical 1800-742-4368 Spain Orders 91-630-7050 Fax 91-630-5145 Technical 91-630-7050 Sweden Orders 020-790282 Fax 020-790582 Technical 020-798328 Switzerland Orders 055-254-22-11 Fax 055-254-22-13 Technical 055-254-22-12 UK Orders 01293-422-911 Fax 01293-422-922 Technical 01293-422-999 USA Orders 800-426-8157 Fax 800-718-2056 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) 1060926CS 136262161 Sample & Assay Technologies