VOŠZ a SZŠ Praha 1, Alšovo nábřeží 6 ABSOLVENTSKÁ PRÁCE Praha 2013 Martin Vanta
Vliv suplementace PUFA n-3 na profil mastných kyselin v lipoproteinech Absolventská práce Martin Vanta Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant Vedoucí práce: Mgr. Barbora Staňková Datum odevzdání práce: 19. 4. 2013 Datum obhajoby: 17. - 19. 6. 2013 Praha 2013
Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracoval samostatně pod odborným vedením vedoucího absolventské práce a všechny použité zdroje jsem uvedl v seznamu literatury. Praha 19. dubna 2013 Podpis:
Děkuji Mgr. Barboře Staňkové za cenné rady a odborné vedení absolventské práce, RNDr. Evě Tvrzické, CSc. za účinnou pomoc a paní Trávníčkové za pomoc při zpracování biologického materiálu.
Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována ve Středisku vědeckých informací Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo nábřeží 6. Podpis:
ABSTRAKT Vanta Martin Vliv suplementace PUFA n-3 na profil mastných kyselin v lipoproteinech Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: Mgr. Barbora Staňková Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2013, 70 stran V současné době se stále větší množství experimentálních prací zabývá možností příznivého ovlivnění kardiovaskulárních onemocnění, které jsou jednou z nejčastějších příčin úmrtnosti. Jedním z rizikových faktorů těchto onemocnění jsou dyslipidemie. K jejich prevenci i léčbě patří především úprava životního stylu. Její nedílnou součástí je změna dietních návyků, kde jsou často využívány i tzv. funkční potraviny. Mezi ně patří i koncentráty esenciálních mastných kyselin. Cílem předkládané práce bylo prostudovat vliv dietní suplementace vícenenasycenými mastnými kyselinami řady n-3 (PUFA n-3) na profil mastných kyselin v triacylglycerolech, fosfolipidech a esterech cholesterolu lipoproteinů krevní plazmy. Studie proběhla u skupiny šesti osob (3 muži a 3 ženy), které byl podáván preparát MaxiCor v dávce 1,5 g/den po dobu 35 dnů. Po extrakci lipidů z krevní plazmy byly jednotlivé lipidové třídy separovány preparativní tenkovrstevnou chromatografií a profil mastných kyselin byl stanoven kapilární plynovou chromatografií. Podávání preparátu vedlo ke zvýšení obsahu kyselin eikosapentaenové a dokosahexaenové ve všech lipidových třídách již během prvního dne. Toto zvýšení bylo kompenzováno poklesem obsahu nasycených mastných kyselin. Snížil se i aterogenní a trombogenní index. Po vysazení preparátu se hladiny jednotlivých mastných kyselin vrátily k původním hodnotám přibližně po dvou týdnech. Charakter změn byl u všech osob obdobný, kvantitativně se změny lišily v závislosti na pohlaví a bazálních koncentracích PUFA n-3. Tento nález zřejmě souvisí s ostatními biochemickými i genetickými faktory, ale i dietními návyky. Klíčová slova: lipidy, lipoproteiny, vícenenasycené mastné kyseliny řady n-3, plynová chromatografie, suplementace
ABSTRACT Vanta Martin Vliv suplementace PUFA n-3 na profil mastných kyselin v lipoproteinech The Effect of Supplementation PUFA n-3 on The Fatty Acid Profile in Lipoproteins Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: Mgr. Barbora Staňková Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2013, 70 stran Nowadays a growing number of experimental studies deals with the possibility of positive influence of cardiovascular diseases, which are the ones of the most common causes of mortality. One of the risk factors of these diseases is dyslipidemia. Its prevention and treatment includes a change of lifestyle. An integral part is the change of eating habits, where functional foods are often used as well. This includes concentrates of essential fatty acids. The aim of this thesis was to study the effect of dietary supplementation with polyunsaturated fatty acids n-3 family on a profile of fatty acids in triacylglycerols, phospholipids and cholesteryl esters of blood plasma lipoproteins. The study was conducted for a group of six people (3 men and 3 women), who took the drug MaxiCor in a doze 1.5 g/day for a period of 35 days. After extraction of lipids from the blood plasma each lipid class was separated by preparative layer thin chromatography and the profile of fatty acids was determined by capillary gas chromatography. Supplementation of these capsules led to an increase of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acid content in all lipid classes already during the first day. This increase was compensated by a decrease of saturated fatty acids. Even the atherogenic and thrombogenic index decreased. After stopping supplementation, levels of individual fatty acids returned to their original values in approximately two weeks. Changes had similar character in all persons tested; quantitative differences were dependent on sex as well as on basal PUFA n-3 concentrations. These findings are probably connected not only with biochemical and genetic factors, but also with dietary habit. Key words: lipids, lipoproteins, polyunsaturated fatty acids n-3 series, gas chromatography, supplementation
Obsah 1 Úvod... 8 2 Literární přehled... 9 2.1 Lipidy... 9 2.1.1 Struktura, rozdělení a funkce lipidů... 9 2.1.2 Klasifikace a biologické funkce mastných kyselin... 10 2.1.3 Fyziologie mastných kyselin... 14 2.2 Lipoproteiny... 14 2.2.1 Struktura lipoproteinů... 14 2.3 Dyslipidémie... 17 2.4 Ateroskleróza a koncepce rizikových faktorů... 18 2.5 Mechanizmus působení n-3 PUFA... 18 3 Experimentální část... 20 3.1 Použité chemikálie... 20 3.2 Složení preparátu MaxiCor... 21 3.3 Odběrový protokol... 23 3.4 Stanovení biochemických parametrů séra... 24 3.5 Extrakce a stanovení lipidové frakce... 24 3.6 Frakcionace lipidových tříd pomocí tenkovrstvé chromatografie... 25 3.7 Příprava methylesterů mastných kyselin transmethylací... 26 3.8 Analýza methylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií... 27 3.9 Statistické zpracování výsledků... 28 4 Výsledky... 29 4.1 Biochemické vyšetření séra... 29 4.2 Stanovení mastných kyselin v plazmatických lipidech... 29 5 Diskuze... 55 6 Závěr... 58 7 Seznam obrázků a tabulek... 59 8 Použité zkratky... 61 9 Seznam použité literatury a zdrojů informací... 63 10 Přílohy... 65
1 Úvod Podle celosvětových studií mají kardiovaskulární onemocnění stoupající tendenci a jsou v posledních několika desetiletích nejčastější příčinou úmrtí a jsou také důvodem dlouhodobé pracovní neschopnosti. Výdaje na jejich léčbu představují značnou zátěž pro zdravotnictví. Mezi nejfrekventovanější projevy patří ischemická choroba srdeční, cévní mozková příhoda a ischemická choroba dolních končetin. Výskyt a rozvoj kardiovaskulárních onemocnění úzce souvisí s přítomností rizikových faktorů, mezi které zahrnujeme věk, pohlaví, genetickou zátěž, dietní návyky, kouření, stres, obezitu, diabetes, klimakterium, hypertenzi, hyperlipoproteinémii a poruchy koagulace krve. Základním předpokladem pro prevenci a léčbu kardiovaskulárních onemocnění je snížení či vyloučení vlivu výše zmíněných rizikových faktorů. Nezbytným prvním krokem v preventivní péči je úprava životního stylu, založená na různých dietních opatřeních, zvýšení pohybové aktivity, eliminaci kouření, omezení stresu a dostatečná osvěta. Teprve pokud se touto cestou nedosáhne příznivých výsledků, je nutná léková intervence. V případě hyperlipoproteinémie, která je důsledkem poruchy metabolizmu lipidů, je cílem terapie snížit hodnoty plazmatického cholesterolu a triacylglycerolů. V současné době se stále větší množství experimentálních prací zabývá možností příznivého ovlivnění poklesu výskytu kardiovaskulárních onemocnění souvisejících se vznikem aterosklerotických lézí na různém stupni rozvoje, případně navození regrese aterosklerotického procesu. Výsledky těchto prací ukazují, že aterosklerotický proces alespoň v počátečních stádiích nemusí být ireversibilní a že je možno uvažovat o léčbě aterosklerózy a jejich komplikací. Cílem této práce bylo sledovat vliv dietní suplementace polynenasycenými mastnými kyselinami řady n-3 na složení mastných kyselin v triacylglycerolech, fosfolipidech a esterech cholesterolu lipoproteinů krevní plazmy a rychlost jejich inkorporace do jednotlivých lipidových tříd. 8
2 Literární přehled 2.1 Lipidy Lipidy jsou různorodá skupina heterogenních látek, jejichž základní společnou vlastností je úplná nebo částečná nerozpustnost ve vodě, ale rozpustnost v organických rozpouštědlech, například v benzenu či chloroformu. Tuto vlastnost podmiňuje přítomnost hydrofobních uhlovodíkových struktur v molekule [1]. 2.1.1 Struktura, rozdělení a funkce lipidů Mastné kyseliny Mastné kyseliny (fatty acids, FA) jsou látky, které společně se sacharidy a bílkovinami tvoří základní složky živé hmoty. Obecně jsou mastné kyseliny karboxylové kyseliny; délka jejich uhlovodíkového řetězce se pohybuje od 2 do 36 atomů. U savců má většina FA sudý počet atomů uhlíku, protože se syntetizují z dvouuhlíkatých jednotek. Nenasycené vazby jsou převážně v konfiguraci cis. Mastné kyseliny jako součást fosfolipidů tvoří strukturu všech buněčných membrán. V triacylglycerolech představují významný zdroj energie a v tukové tkáni slouží jako zásobárna energie i tepelná izolace [1]. Klasifikace a biologické funkce FA jsou uvedeny v kapitole 2.1.2. Cholesterol Cholesterol je jednou ze základních složek buněčných membrán. Tvoří jednu třetinu všech lipidů a je důležitým prekurzorem žlučových kyselin a steroidních hormonů, jejichž struktura je odvozena od steranu, základního kamene cholesterolu a všech steroidních hormonů [1]. Estery cholesterolu Estery cholesterolu jsou zásobní a transportní formou cholesterolu. Jednou z jejich fyzikálně chemických vlastností, která je výhodná pro jejich funkci transport a uskladnění, je tvorba tekutých krystalů, pokud obsahují nenasycené FA [1]. 9
Triacylglyceroly Triacylgylceroly jsou triestery glycerolu a mastných kyselin. Jsou hlavním dodavatelem energie v organismu. Fosfolipidy Fosfolipidy jsou estery glycerolu s kyselinou fosforečnou, která je dále esterifikována aminoalkoholem, hydroxyaminokyselinou nebo inositolem. Nejdůležitější dva fosfolipidy jsou např. fosfatidylcholin a sfingomyelin. Fosfatidylcholin, podle staršího názvosloví lecitin (1-2-diacyl-3- glycerolfosforylcholin), je nejrozšířenější fosfolipid. Tvoří přibližně 50% všech fosfolipidů. Fosfatidylcholin má význačnou funkci ve struktuře biologických membrán, včetně membrán lipoproteinů, snižuje totiž jejich rigiditu. Mezi další funkce lecitinu řadíme schopnost přísunu mastných kyselin pro esterifikaci plazmatického cholesterolu [2]. Sfingomyelin je ester dusíkatého alkoholu sfingosinu s mastnou kyselinou a fosforylcholinem. V plazmě tvoří zhruba čtvrtinu až třetinu molárního poměru vůči fosfatidylcholinu. Vyšší zastoupení má v myelinových pochvách mozku a periferního nervstva. Jeho zvýšenou koncentraci detekujeme ve stěně cévní při patologických stavech organismu [2]. 2.1.2 Klasifikace a biologické funkce mastných kyselin Mastné kyseliny třídíme do několika skupin na základě jejich struktury, fyziologické úlohy a biologických účinků. Na struktuře FA se podílí přítomnost dvojných vazeb a jejich uspořádání. Značení a názvy důležitých FA jsou přehledně znázorněny v tabulce 1. 10
Tabulka 1 Důležité mastné kyseliny Vzorec* Systematický název Triviální název Zkratka 12:0 dodekanová laurová 14:0 tetradekanová myristová 16:0 hexadekanová palmitová PA 16:1n-7 cis-9-hexadecenová palmitolejová POA 18:0 oktadekanová stearová SA 18:1n-9 cis-9-oktadecenová olejová OA 18:1n-7 cis,cis-11-oktadecenová vakcenová 18:2n-6 cis,cis-9,12-oktadekadienová linolová LA 18:3n-6 cis,cis,cis-6,9,12- oktadekatrienová γ-linolenová GLA 18:3n-3 cis,cis,cis-9,12,15- oktadekatrienová α-linolenová ALA 20:3n-6 cis,cis,cis-8,11,14-eikosatrienová dihomo-γlinolenová DHGLA 20:4n-6 cis,cis,cis,cis-5,8,11,14- eikosatetraenová arachidonová AA 20:5n-3 22:5n-3 22:6n-3 cis,cis,cis,cis,cis-5,8,11,14,17- eikosapentaenová cis,cis,cis,cis,cis-7,10,13,16,19- dokosapentaenová cis,cis,cis,cis,cis,cis- 4,7,10,13,16,19- dokosahexaenová timnodonová klupadovová EPA DPA DHA */ číslo před dvojtečkou udává počet atomů uhlíku, za dvojtečkou počet dvojných vazeb; číslo za n značí umístění první dvojné vazby na atomu uhlíku počítaného od methylového (omega) konce mastné kyseliny. 2.1.2.1 Nasycené mastné kyseliny Nasycené mastné kyseliny dělíme do podskupin podle délky uhlíkového řetězce: Mastné kyseliny s krátkým řetězcem Mastné kyseliny s krátkým řetězcem (short chain fatty acids, SCFA) mají délku uhlíkového řetězce 2-4 atomy a vznikají během fermentace vlákniny v proximální části 11
tlustého střeva. Jsou rychle absorbovány, octová a z části i propionová kyselina jsou resorbovány a portálním oběhem transportovány do jater, kde se metabolizují na glukózu (kyselina propionová) a mastné kyseliny (kyselina octová). Tento proces pokrývá přibližně 10-20% klidového energetického výdeje. Kyseliny s krátkým řetězcem se ve střevě podílejí na stimulaci absorpce chloridů, sodíku, bikarbonátů a vody, zvyšují krevní průtok a produkci gastrointestinálních hormonů, snižují aciditu obsahu tlustého střeva a tím omezují růst saprofytických bakterií i hnilobný rozklad [3,4]. Mastné kyseliny se středním řetězcem Mastné kyseliny o délce uhlíkového řetězce 6-10 atomů, tzv. mastné kyseliny se středním řetězcem (MCFA) jsou přímo resorbovány a transportovány vénou portae. Tukové emulze obsahující triacylglyceroly s těmito kyselinami jsou využívány jako nutriční podpora a jsou vhodné pro redukční dietní režim při léčbě obezity [3,4]. Mastné kyseliny s dlouhým řetězcem Významný aterogenní a trombogenní potenciál mají mastné kyseliny s délkou uhlíkového řetězce 12-18 atomů (LCFA). Tyto kyseliny představují 80-90% celkových SFA přijímaných potravou [3]. Živočišným zdrojem těchto FA je máslo, hovězí lůj a vepřové sádlo. Rostlinným zdrojem LCFA je například kakaové máslo, bambucký tuk a olej z palmového jádra či kokosového ořechu. Pravidelná konzumace LCFA zvyšuje hladinu cholesterolu, zejména cholesterolu v lipoproteinu o nízké hustotě (LDL-C), který má významný aterogenní potenciál. Za antiaterogenní účinek považujeme zvýšenou koncentraci HDL-C, na čemž se podílí kyselina stearová. Její trombogenní účinek je naproti tomu považován za nejvyšší [4]. Kvantitativně to můžeme vyjádřit pomocí tzv. aterogenního (AI) a trombogenního (TI) indexu: AI = (12:0+4x 14:0 + 16:0)x(PUFA n-3+mufa) -1 TI=(14:0+16:0+18:0)x(0,5xMUFA+0,5xPUFAn-6+3xPUFAn-3+PUFAn-3/PUFAn-6) -1 12
Existují však i mastné kyseliny s velmi dlouhým řetězcem, tzv. VLCFA, s délkou uhlíkového řetězce 20-30 atomů. V měřitelných koncentracích jsme schopni je nalézt v krevním séru osob trpících kongenitálními metabolickými poruchami, jako např. adrenoleukodystrofie vázaná na X-chromosom, Zellwegerův syndrom, Menkesova či Refsumova choroba [5]. 2.1.2.2 Mononenasycené mastné kyseliny Mononenasycené FA se rozlišují podle konfigurace dvojné vazby a rozdělujeme je dle původu na MFA exogenního a endogenního typu. Mezi MFA exogenního původu řadíme například kyselinu cetolovou, gadolovou a erukovou, kterou najdeme v oleji nekultivované řepky olejné a je považována za kardiotoxickou [5]. Endogenního původu jsou kyseliny v cis konfiguraci, palmitolejová, vakcenová a olejová, která je hojně zastoupena v oleji olivovém, kanolovém, kultivovaném řepkovém, saflorovém, mandlovém a ořechovém. Její předností je antiaterogenní a antitrombogenní účinek. S trans konfigurací dvojné vazby se setkáme u kyselin trans-vakcenová a elaidová, které jsou exogenního původu. Mají vyšší aterogenní účinek a zdrojem těchto FA jsou v případě kyseliny trans-vakcenové másla a v případě kyseliny elaidové to jsou ztužené pokrmové tuky a margaríny, kde byl jejich obsah snížen změnou technologie přípravy [4]. 2.1.2.3 Vícenenasycené mastné kyseliny řady n-3 Vícenenasycené, též polynenasycené mastné kyseliny řady omega 3 (PUFA n-3) mají v molekule dvě a více dvojných vazeb. Při nedostatku esenciálních mastných kyselin syntetizuje organismus endogenní PUFA řady n-9. Esenciální FA jsou pouze exogenního původu a dělíme je na PUFA skupiny n-3 a n-6. Mají jak antitrombotický, tak antiaterogenní účinek. PUFA řady n-6 zahrnují například kyselinu arachidonovou a linolovou a jejich vysoký podíl mají např. pupalkový, slunečnicový a sójový olej, nižší podíl má olej z kukuřice, vlašských ořechů a pšeničných klíčků. PUFA n-3 zahrnují kyselinu eikosapentaenovou (EPA), dokosahexaenovou (DHA) a α-linolenovou, kterou obsahují semena a listy sóji, černého rybízu či lnu. Správnou funkci nervové tkáně a sítnice zajišťuje DHA [6]. 13
2.1.2.4 Další výskyt mastných kyselin V červeném mase a mléčných produktech se vyskytují tzv. konjugované mastné kyseliny. Tyto FA mají konjugovaný systém dvojných vazeb a nejčastěji tvoří izomery LA (CLA). Setkáme se i s FA jako strukturálními komponenty lipidů, což jsou jednoduché lipidy, estery mastných kyselin a alkoholů cholesterolu, glycerolu, sfingosinu a jejich derivátů [4]. 2.1.3 Fyziologie mastných kyselin Mastné kyseliny ve formě TAG jsou jedním ze zdrojů metabolické energie. Hydrofobní charakter TAG je užitečný pro transport a skladování vitamínů A, D, E a K. Tkáně s vysokým obsahem TAG (subkutánní a viscerální tuková vrstva) slouží jako tzv. tepelné a mechanické izolátory. VLCFA jsou strukturálními složkami ceramidů, které snižují propustnost kůže pro vodu a tím udržují vodní bilanci. Izolační lipidy se nacházejí v nervové tkáni, kde obklopují axony a umožňují tak rychlý přenos informace. Čím silnější je myelinová vrstva, tím rychleji postupuje nervový vzruch axonem. Strukturními složkami všech buněčných membrán jsou mastné kyseliny ve formě PL. Jejich složení ovlivňuje sílu i propustnost membrán a tím i aktivitu membránově vázaných proteinů. Pevnost membrány zajišťuje přítomnost molekul cholesterolu a specifických proteinů. Čím vyšší je jejich obsah, tím nižší je propustnost neboli fluidita membrány. Zvýšený počet dvojných vazeb v molekule FA naopak fluiditu membrány zvyšuje [7]. 2.2 Lipoproteiny Lipoproteiny jsou částice, které se skládají z nekovalentně asociovaných lipidů a proteinů. V krevní plazmě působí jako přenašeče triacylglycerolů a cholesterolu [1]. 2.2.1 Struktura lipoproteinů Plazmatické lipoproteiny vytvářejí kulovité částice, které obsahují nepolární jádro z triacylglycerolů a esterů cholesterolu. Toto jádro obklopuje obal tvořený z proteinů, fosfolipidů a cholesterolu. Lipoproteiny rozdělujeme do pěti kategorií na základě jejich funkcí a fyzikálních vlastností [8,9]. 14
Chylomikrony Lipoproteiny o velmi nízké hustotě (VLDL) Lipoproteiny o intermediární hustotě (IDL) Lipoproteiny o nízké hustotě (LDL) Lipoproteiny o vysoké hustotě (HDL) Lipoproteinové částice podléhají neustálým metabolickým změnám, takže mají různé vlastnosti a složení. Hustota lipoproteinů vzrůstá se snižujícím se poloměrem částice, protože hustota jejich vnějšího pláště je větší než hustota vnitřního jádra [1]. Proteinové složky lipoproteinů jsou známy pod názvem apolipoproteiny nebo pouze apoproteiny (Apo). Jsou rozpustné ve vodě, ale ve vodném prostředí mají tendenci se shlukovat [1]. Chylomikrony Jsou to největší lipoproteinové částice, které však díky vysokému obsahu triacylglycerolů a nízkému obsahu proteinů mají nejnižší hustotu. Chylomikrony vznikají v buňkách střevního epitelu, jsou uvolňovány do střevní lymfy (známé jako chylus), která protéká lymfatickými cévami a přes ductus thoracicus se vlévá do krevního oběhu. Chylomikrony adherují na vazebná místa endotelu kapilár kosterního svalstva a tukové tkáně. Po vstupu do krevního řečiště jsou složky chylomikronů triacylglyceroly během několika minut hydrolyzovány působením lipoproteinové lipasy. Uvolněné monoacylglyceroly a produkty hydrolýzy FA jsou pak přijímány tkáněmi. Jak jsou triacylglyceroly chylomikronů hydrolyzovány, chylomikrony se scvrkávají, až se zredukují na chylomikronové zbytky obohacené o cholesterol. Tyto zbytky se oddělují od endotelu kapilár a opět vstupují do periferie, odkud jsou potom odebírány játry. Funkce chylomikronů je dopravit triacylglyceroly z diety do svalu a adipozní tkáně a cholesterol z diety do jater [1,8,9]. Lipoproteiny o velmi nízké hustotě VLDL jsou syntetizovány v játrech ze zbytkových částic chylomikronů a obsahují hydrofobní jádro složené převážně z triacylglycerolů a na jejich povrchu je 15
fosfolipidová struktura. Zbytky VLDL se objevují v oběhu nejdříve jako IDL a pak jako LDL [8,9]. Lipoproteiny o střední hustotě IDL částice vznikají katabolickou přeměnou VLDL částic působením LPL. Ve svém nepolárním jádře mají přibližně ve stejném poměru estery cholesterolu a triacylglyceroly. IDL mohou být vychytávány játry nebo dále přeměněny na LDL [8,9]. Lipoproteiny o nízké hustotě IDL částice ztratí část svých triacylglycerolů a esterů cholesterolu a přemění se tak na LDL. Pohlcování LDL částic vede k ukládání cholesterolu v cytoplazmě buněk mnoha tkání. Zvýšené množství cirkulujících LDL v důsledku genetického poškození receptorů, nebo glykace a jejich následné oxidace vede k nereceptorové pinocytóze LDL makrofágy retikuloendotelového systému. Nahromaděním cholesterolu se makrofágy mění na tzv. pěnové buňky a po jejich rozpadu se tvoří aterosklerotické pláty v intimě cévních stěn [8,9]. Lipoproteiny o vysoké hustotě HDL částice vznikají v játrech i v buňkách střevní sliznice a mají přesně opačnou funkci než LDL: pracují jako odstraňovači cholesterolu. Skládají se převážně z proteinů, fosfolipidů a esterifikovaného cholesterolu. HDL lipoproteiny jsou významné ve zpětném transportu cholesterolu z tkání a snižují tak jeho množství v periferních tkáních navrácením do jater, odkud je cholesterol odváděn v podobě žlučových kyselin. Jsou vychytávány především játry, ale i srdeční tkání a mozkem. HDL hrají protektivní roli při kardiovaskulárních onemocněních [8,9]. 16
2.3 Dyslipidémie Dyslipidémie (dyslipoproteinemie) představují široké spektrum metabolických onemocnění, která jsou charakterizována především odchylkami v profilu a koncentraci lipidů nebo lipoproteinů v plazmě. Důsledkem může být jejich zvýšená syntéza nebo snížený katabolismus. Dyslipidémie skýtají jeden z nejvýznamnějších rizikových faktorů aterosklerózy. Dyslipoproteinemie se klasifikují dle několika kritérií. Největší význam mají hyperlipoproteinemie, onemocnění projevující se nadbytkem cirkulujících lipidů v plazmě nebo séru. To způsobuje nadměrné ukládání lipidů v tkáních a ve stěnách cév, což se projevuje kardiovaskulárními chorobami. Nejznámějšími hyperlipoproteinemiemi jsou: hypercholesterolemie a hypertriacylglycerolemie. Hypercholesterolemie Tato porucha se vyskytuje ve třech formách: polygenní hypercholesterolemie (primární hypercholesterolemie), familiární hypercholesterolemie (FH) a familiární kombinovaná hypercholesterolemie (FCHL). Charakterem všech třech forem je akumulace LDL lipoproteinových částic v séru díky sníženému vstupu LDL do buněk. Hladina cholesterolu v séru překračuje hodnotu 7,8 mmol/l. U některých postižených se setkáme s tzv. xanthomatózními uzlíky na šlachách [8,9]. Pacienti trpící tímto onemocněním mají zvýšené riziko kardiovaskulárního onemocnění. Hypertriacylglycerolemie Porucha tohoto typu je buď dědičná jako autozomálně dominantní postižení nebo je součástí syndromu kombinované familiární hyperlipidemie. Existuje primární a sekundární hypetriacylglycerolemie projevující se v obou případech zvýšenou hladinou VLDL. Primární forma se projevuje zvýšenou produkcí a sníženým odstraňováním VLDL z plazmy, zatímco sekundární typ doprovázejí některé chorobné stavy, jako např. nefrotický syndrom, obezitu či alkoholismus. Charakteristickým obrazem hypertriacylglycerolemie je zvýšená hladina triacylgylcerolů a VLDL v plazmě. Hodnota cholesterolu je normální nebo lehce zvýšená; tento nález je charakteristický především u DM [8,9]. 17
Existuje i kombinace obou chorob projevující se zvýšenou koncentrací cholesterolu i triacylglycerolů v séru, způsobenou neschopností odstraňování lipoproteinů z plazmy či jejich nadprodukcí, jedná se o familiární kombinovanou hyperlipidemii [8,9]. 2.4 Ateroskleróza a koncepce rizikových faktorů Ateroskleróza je jednou z nejčastějších příčin onemocnění a mortality nejen u lidí v naší zemi, ale i ve vyspělých státech světa. Toto závažné progresivní onemocnění je způsobené akumulací lipidů zejména volného a esterifikovaného cholesterolu v buňkách hladkého svalstva ve vnitřní stěně cévních tepen. Většina cholesterolu, který se nachází v plazmě je transportována ve formě LDL částic do arteriální intimy, místa aterogeneze a poté zpět z intimy do periferie na HDL částice. Postižená místa v intimě kapilár akumulují cholesterol ve strukturách označovaných jako cholesterolové pláty (ateromata), ze kterých po odříznutí vytéká pastovitá žlutá hmota složená z téměř čistých esterů cholesterolu. Tyto útvary se přeměňují na fibrózní, vápnité plaky, které zužují a nakonec blokují postižené cévy, což umožňuje hromadění krevních trombů. Sraženiny mohou cévu dokonale ucpat a způsobit infarkt, odumření neprokrvovaných tkání. Vznik ateromů je důsledkem dysfunkce transportu cholesterolu, která je způsobena nerovnováhou mezi vstupem a výstupem lipoproteinových částic do intimy. Tuto nerovnováhu způsobuje nedostatečné odstraňování cholesterolu HDL částicemi [8,9]. Rizikový faktor se definuje jako abnormalita zjištěná u jedinců bez manifestních příznaků aterosklerózy, jejíž přítomnost je asociována s významně vyšším rizikem, že k manifestaci v budoucnu dojde. Mezi rizikové faktory patří jednak abnormality zjištěné při klinickém, biochemickém a psychologickém vyšetření, jednak nepříznivé vlivy prostředí a způsobu života jedince i kolektivu. Cennou metodou pro studium některých rizikových faktorů je porovnání epidemiologických nálezů z různých zemí, různých lokalit, různých sociálních vrstev obyvatelstva apod. 2.5 Mechanizmus působení n-3 PUFA Mezi biologicky nejvíce účinné mastné kyseliny patří n-3 polynenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem (n-3 PUFA), především kyselina eikosapentaenová EPA 18
a kyselina dokosahexaenová DHA. Nejvýznamnějším potravinovým zdrojem těchto kyselin jsou mořské ryby. PUFA řady n-3 zvyšují expresi genů kontrolujících oxidaci mastných kyselin a naopak snižují expresi genů ovládajících lipogenetické pochody. Polyenové mastné kyseliny řady n-3 příznivě ovlivňují také zánětlivý proces spojený s endoteliální dysfunkcí, která je považována za první, funkční stadium rozvoje aterosklerotické léze. Z toho vyplývá, že podávání PUFA n-3 vede k sekundární prevenci ICHS [10,11]. 19
3 Experimentální část 3.1 Použité chemikálie Diethylether, Chromapur G (Chromservis, ČR) Dichlormethan, Chromapur G (Chromservis, ČR) Ethylalkohol 96% ((Chromservis, ČR) Heptan 95+, Chromapur G (Chromservis, ČR) Hexan p.a., Chromapur G (Chromservis, ČR) Kyselina octová p.a. (Lachema, ČR) Methanol p.a. (Chromservis, ČR) Silikagel (Silikagel H + HF 254+366 Merck, 1:1 w/w) Síran sodný bezvodý (Lachema, ČR) Voda (přírodní minerální voda značky DOBRÁ VODA, testovaná na přítomnost FA) Diagnostická souprava pro stanovení ApoB (Beckman-Coulter, ČR) Diagnostická souprava GPO-PAP pro stanovení TAG (LabMark, ČR) Diagnostická souprava CHOD-PAP pro stanovení TC (LabMark, ČR) Diagnostická souprava pro přímé stanovení HDL-C (LabMark, ČR) Dietní suplementy: MaxiCor (SVUS Pharma a.s., ČR) Standardy lipidů: Cholesteryl oleát; triolein (Sigma-Aldrich, ČR) Standardy methylesterů mastných kyselin: 12:0, 14:0, 14:1n-5, 16:0, 16:1n-9, 16:1n-7, 18:0, 18:1n-9, 18:1n-7, 18:2n-6, 18:3n-6, 18:3n-3, 20:0, 20:1n-9, 20:2n-6, 20:3n-6, 20:4n-6, 20:5n-3, 22:4n-6, 22:5n-6, 22:5n-3, 22:6n-3(Sigma-Aldrich, ČR) 20
3.2 Složení preparátu MaxiCor Preparát MaxiCor (směs ethylesterů mastných kyselin, SVUS Pharma a.s., ČR) byl pro účel této práce vybrán záměrně, jelikož kvalitní složení mastných kyselin je nezbytné pro prevenci a smysl pravidelného užívání. Tento suplement splňuje nejvyšší obsah účinných látek mezi produkty s rybím olejem na našem trhu [12]. V jedné tobolce (500 mg) je obsaženo 71 molárních % EPA, 21 molárních % DHA a celkových omega - 3 nenasycených mastných kyselin 93,5 molárních %, tj. min. 450 mg. Důvodem rozdílných hodnot mastných kyselin EPA a DHA v ostatních preparátech je druh ryby, jejíž svalovina je použita jako zdroj pro výrobu rybího oleje. V tabulce č. 2 na následující straně je uvedený seznam dostupných preparátů na českém trhu včetně výrobců a dovozců seřazený sestupně dle obsahu EPA. Sladkovodní ryby mají malý obsah PUFA n-3 a proto by neměly být pro účely výroby preparátu využívány. Za zmínku stojí preparát č. 25 určený pro děti, který je podle zanedbatelného složení omega - 3 mastných kyselin vyráběn z kapra, tudíž zbytečný pro užívání s ohledem na jeho minimální účinnost. Vysoký obsah PUFA n-3 mají především mořské ryby [12]. 21
Tabulka 2 Výživové doplňky s rybím olejem a jejich dodavatelé [12] Č Název Výrobce 1 MaxiCor SVUS Pharma a.s., ČR 2 Bioaktivní Marin Plus Pharma Nord ApS, Dánsko 3 ALFA OMEGA3 kapsle s rybím olejem S.P.R.P. GAL. L.P.M.Ł. Marek s.j., Polsko 4 EPA marine rybí olej Walmark, a.s., ČR 5 Rybí olej BIOGAL Pharmaceutical Works Ltd., Maďarsko 6 Rybí olej EPA DHA 1000mg uvedena země původu USA 7 EPA marine rybí olej Walmark, a.s., ČR 8 HEMA RYBÍ TUK Pharmachem A/S, Denmark 9 3-omega 1000 mg Generica s.r.o., SR 10 EPA rybí olej 1000 mg NATURE S BOUNTY INC., U.S.A. 11 3-omega 1000 mg Generica s.r.o., SR 12 GS maxepa Green-Swan Pharmaceuticals CR, a.s., ČR 13 MARIN 1000 uvedena země původu Dánsko 14 OMEGA 3 ProFitness Intl. Inc., Kanada 15 Salmon Oil (Lososový olej) Herb-Pharma AG, Švýcarsko 16 OMEGACORD Laboratoires HOLISTICA, Francie 17 VITAL OMEGA PLUS VITAL HEALTH FOODS (PTY) LTD., JAR 18 SOMA Omega 3 GEORG GEYER GmbH & Co., SRN 19 Cod Liver Oil (Olej z tresčích jater) Herb-Pharma AG, Švýcarsko 20 HEMA SEAL Pharmachem A/S, Denmark 21 Rybí olej Noventis s.r.o., ČR 22 Omega Komplex 3-6-9 s vitamínem E ProFitness Intl. Inc., Kanada 23 Beta-karoten s rybím olejem Noventis s.r.o., ČR 24 epavit PLUS SETUZA a.s., ČR 25 Rybí tuk baby IVAX -CR a.s., ČR + GELKAPS GmbH, SRN 22
3.3 Odběrový protokol Ve studii bylo monitorováno 6 osob (3 muži a 3 ženy) věkového rozmezí 20-42 let. Užívaly doplněk stravy MaxiCor v denní dávce 1500 mg oleje (3 tobolky), tj. 3x 450mg PUFA n-3, po dobu 35-ti dnů. Tabulka 3 Časový harmonogram odběrů Číslo odběru Datum Hodina Suplementace 1 8.10.2012 8:00 ANO 2 8.10.2012 10:00 ANO 3 8.10.2012 12:00 ANO 4 8.10.2012 14:00 ANO 5 8.10.2012 16:00 ANO 6 9.10.2012 8:00 ANO 7 10.10.2012 8:00 ANO 8 11.10.2012 8:00 ANO 9 12.10.2012 8:00 ANO 10 15.10.2012 8:00 ANO 11 22.10.2012 8:00 ANO 12 29.10.2012 8:00 ANO 13 5.11.2012 8:00 ANO 14 12.11.2012 8:00 ANO 15 19.11.2012 8:00 NE 16 26.11.2012 8:00 NE 17 3.12.2012 8:00 NE 18 10.12.2012 8:00 NE 19 17.12.2012 8:00 NE 23
Venózní krev byla odebírána do zkumavky s EDTA pro separaci plazmy podle protokolu uvedeného v tabulce 3. Před započetím suplementace, bezprostředně po jejím skončení a po dalších 5 týdnech bez suplementace byl také u každé osoby odebrán vzorek séra pro stanovení koncentrací lipidů. Odebraná krev byla vytemperována na laboratorní teplotu (cca 30 min) a poté byla plazma (sérum) separována centrifugací (10 minut/2000 RPM, HERAEUS MEGAFUGE 16R, Thermo SCIENTIFIC, Německo). 3.4 Stanovení biochemických parametrů séra Koncentrace triacylglycerolů (TAG), celkového cholesterolu (TC) a HDL-cholesterolu (HDL-C) v séru byly stanoveny na biochemickém automatickém analyzátoru MODULAR (ROCHE, Švýsarsko), koncentrace apolipoproteinu B (ApoB) na proteinovém analyzátoru Immage (Beckman-Coulter, ČR) v laboratořích Ústavu lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1. LF UK Praha. Hladina TAG byla stanovena spektrofotometricky enzymatickým kolorimetrickým testem GPO-PAP, hladina TC byla stanovena enzymatickou metodou CHOD-PAP a koncentrace HDL-C byla stanovena přímou metodou homogenní enzymatickou kolorimetrickou reakcí. Koncentrace ApoB byla stanovena nefelometricky pomocí diagnostického setu. 3.5 Extrakce a stanovení lipidové frakce K extrakci surového lipidu z jednotlivých vzorků plazmy byla použita metoda dle Folche modifikovaná Carlsonem v následující úpravě [13,14]. K 1 ml plazmy bylo přidáno 10 ml extrakční směsi CH 2 Cl 2 : CH 3 OH v objemovém poměru 2:1 v/v; směs byla 20 minut třepána na třepačce MTS 2/4 (IKA, Německo) a poté přefiltrována. Filtr byl promyt 3x2 ml extrakční směsí. K filtrátu byl protřepán s 4 ml otestované vody a centrifugován 5 min při 1500 RPM v centrifuze HERAEUS MEGAFUGE 16R (Thermo 24
SCIENTIFIC, Německo). Spodní (organická) fáze byla přenesena do zkumavky a vysušena pod proudem dusíku při 40 C v kovovém elektrickém bloku TERMOVAP TV 10+ (ECOM, ČR), v digestoři. Izolovaná lipidová frakce byla skladována při teplotě - 20 C. 3.6 Frakcionace lipidových tříd pomocí tenkovrstvé chromatografie Příprava desek: Na odmaštěné skleněné desky (20 x 20 cm) byla nanesena 0,5 mm vrstva silikagelu (Silikagel H + HF 254+366 Merck, 1:1 w/w). Před nanášením vzorku byly desky zaktivovány při 110 C 30 minut v sušárně POL-EKO APARATURA (Chromservis, ČR). Vzorek je třeba nanést v co nejkratší době, aby nedošlo k deaktivaci vzdušnou vlhkostí! Separace neutrálních lipidů (NL): Na start přibližně 2 cm od dolního okraje desky byly naneseny dva vzorky vedle sebe ve formě tenkého pruhu o šířce maximálně 5 mm. Vyvíjení probíhalo ve směsi heptan diethylether kyselina octová (koncentrovaná) v objemovém poměru 85 15 1 (mobilní fáze) až do doběhnutí čela rozpouštědel max. 1 cm pod horní okraj desky. Po usušení desky byly oddělené lipidové třídy detekovány pod UV lampou (λ=366 nm) podle schématu na obrázku 1 na následující straně; frakce fosfolipidů (PL), triacylglycerolů (TAG) a esterů cholesterolu (CE) byly kvantitativně přeneseny do označených zkumavek pro další zpracování. 25
čelo rozpouštědel (uhlovodíky) CE (Rf = 0,68) TAG (Rf = 0,50) FA FC start PL (Rf = 0,01) Obrázek 1 Rozmístění jednotlivých lipidových tříd po vizualizaci UV lampou Jednotlivé lipidové třídy se projeví jako světlé pruhy (použitý silikagel obsahuje fluorescenční indikátor). 3.7 Příprava methylesterů mastných kyselin transmethylací Reagencie: 1 N methanolát sodný (MeONa): 1,15 g sodíku na 100 ml bezvodého methanolu; 0,5N kyselina octová: 29,2 ml ledové kyseliny octové (HAc) doplnit do 1 l testovanou vodou Příprava bezvodého methanolu: 5,0 g hořčíku + 0,5 g jódu + 150 ml methanolu, směs vaříme 30 minut pod zpětným chladičem a poté kolonou přidáme 850 ml methanolu, destilujeme v uzavřené aparatuře. Pro stanovení relativního zastoupení mastných kyselin v jednotlivých lipidových třídách pomocí plynové chromatografie je podmínkou těkavost vzorku. Proto je nutné převést mastné kyseliny na těkavé methylestery transmethylací [15]. Vlastní transmethylace byla provedena následovně: Vzorky izolovaných TAG a PL byly spolu s 1 ml methanolátu sodného 1 minutu probublávány dusíkem a inkubovány 26
60 minut v temnu při laboratorní teplotě, zatímco vzorky izolovaných CE byly 20 minut vařeny (TERMOVAP TV 10+, ECOM, ČR) při 80 C a následně zchlazeny. Ke každému 1 ml methanolátu sodného byly po inkubaci přidány 2 ml 0,5N kyseliny octové a 2 ml hexanu, dále byly protřepány a poté odstředěny (10 minut/2000 RPM, HERAEUS MEGAFUGE 16R, Thermo SCIENTIFIC, Německo). Horní (organická) vrstva byla přes kolonu s bezvodým síranem sodným vpuštěna do chromatografické nádobky. Hexan z extraktů v chromatografických nádobkách byl odpařen proudem dusíku při 40 C na kovovém elektrickém bloku TERMOVAP TV 10+ (ECOM, ČR). 3.8 Analýza methylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií Přístroj: kapilární plynový chromatograf GC 17A spojený s automatickým dávkovačem AOC-20i (Shimadzu) vybavený injektorem typu split/splitless a plamenoionizačním detektorem. Kolona: kapilární kolona s polární zakotvenou fází DB-23 (Agilent Technologies, Inc.), vnitřní průměr 0,25 mm, délka 60 m, síla zakotvené fáze 0,25 um. Nosný plyn: vodík, vstupní tlak 53 kpa Teplota injektoru: 250 C Teplota detektoru: 260 C Teplotní program pro analýzu FA v TAG a PL: 80 C (1) 10 120 (0) - 4 180(0) 1 240(0) 10 250 Počáteční teplota 80 C izotermicky 1 min; gradient 10 C /min do teploty 120 C; další gradient 4 C/min do teploty 180 C; dále gradient 1 C/min do teploty 240 C; závěrečný gradient 10 C za minutu do teploty 250 C. Teplotní program pro analýzu FA v CE: 80 C (1) 10 120 (0) - 4 180(0) 1 240(0) 10 255 (27) 27
Počáteční teplota 80 C izotermicky 1 min; gradient 10 C /min do teploty 120 C; gradient 4 C/min do teploty 180 C; další gradient 1 C/min do teploty 240 C; poslední gradient 10 C/min do teploty 255 C a pak 27 minut izotermicky. Vyhodnocení chromatogramů bylo provedeno pomocí SW Clarity (Data Apex, ČR). 3.9 Statistické zpracování výsledků Hodnoty uvedené v tabulkách představují aritmetický průměr ± výběrová střední chyba průměru s x (Standard Error of Mean, SEM). Výpočet SEM: s - výběrová směrodatná odchylka n počet měření x i jsou hodnoty znaku aritmetický průměr hodnot 28
4 Výsledky Testované osoby byly rozděleny do 3 skupin. Z původních 2 skupin muži-ženy byla ze skupiny žen 1 osoba vyčleněna na základě extrémně nízkých bazálních koncentrací EPA a DHA. Ve výsledcích jsou jednotlivé skupiny označeny: A (1 žena s nízkou bazální koncentrací EPA a DHA), B (muži), C (ženy). 4.1 Biochemické vyšetření séra Koncentrace sérových lipidů v průběhu studie ukazuje tabulka 4. Všechny osoby měly srovnatelné hodnoty lipidových parametrů během celého pokusu. Tabulka 4 Koncentrace lipidů v séru analyt odběr I odběr II odběr III CHOL mmol/l 5,32 ± 0,331 5,04 ± 0,257 5,28 ± 0,249 TAG mmol/l 1,78 ± 0,012 1,07 ± 0,143 1,15 ± 0,151 HDL-C mmol/l 1,87 ± 0,278 1,83 ± 0,249 1,92 ± 0,286 Apo B g/l 1,05 ± 0,029 0,87 ±0,049 0,95 ± 0,008 Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Odběr I před začátkem suplementace; odběr II bezprostředně po ukončení suplementace; odběr III pět týdnů po ukončení suplementace. 4.2 Stanovení mastných kyselin v plazmatických lipidech Profily mastných kyselin v průběhu pokusu ukazují tabulky 5A-7C na stranách 30 až 44 a obrázky 2-19 na stranách 45 až 53. 29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
Obrázek 2 Časový průběh koncentrace kyseliny eikosapentaenové ve fosfolipidech u jednotlivých skupin osob. U skupin B a C jsou hodnoty vyjádřeny jako průměr ± SEM. Obrázek 3 Časový průběh koncentrace kyseliny dokosahexaenové ve fosfolipidech u jednotlivých skupin osob. U skupin B a C jsou hodnoty vyjádřeny jako průměr ± SEM. 45
Obrázek 4 Časový průběh koncentrace kyseliny eikosapentaenové v triacylglycerolech u jednotlivých skupin osob. U skupin B a C jsou hodnoty vyjádřeny jako průměr ± SEM. Obrázek 5 Časový průběh koncentrace kyseliny dokosahexaenové v triacylglycerolech u jednotlivých skupin osob. U skupin B a C jsou hodnoty vyjádřeny jako průměr ± SEM. 46
Obrázek 6 Časový průběh koncentrace kyseliny eikosapentaenové v esterech cholesterolu u jednotlivých skupin osob. U skupin B a C jsou hodnoty vyjádřeny jako průměr ± SEM. Obrázek 7 Časový průběh koncentrace kyseliny dokosahexaenové v esterech cholesterolu u jednotlivých skupin osob. U skupin B a C jsou hodnoty vyjádřeny jako průměr ± SEM. 47
Obrázek 8 Změny v zastoupení mastných kyselin ve fosfolipidech u jednotlivých skupin osob. A 0, B 0, C 0 složení FA na začátku experimentu, A max, B max, C max složení FA při maximální koncentraci PUFA n-3. U skupin B a C jsou hodnoty vyjádřeny jako průměr ± SEM. Obrázek 9 Zvýšení koncentrací EPA a DHA ve fosfolipidech u jednotlivých skupin osob Hodnoty představují maximální dosažené koncentrace EPA a DHA vůči bazálním koncentracím (100%). 48
Obrázek 10 Vzájemný vztah koncentrací DHA a EPA ve fosfolipidech u jednotlivých skupin osob Hodnoty představují podíl koncentrací DHA/EPA. c 0 na začátku experimentu, c max při maximální koncentraci PUFA n-3 Obrázek 11 Aterogenní a trombogenní index ve fosfolipidech u jednotlivých skupin osob A 0, B 0, C 0 hodnoty indexů na začátku experimentu, A max, B max, C max hodnoty indexů při maximální koncentraci PUFA n-3; AI aterogenní index, TI trombogenní index. 49
Obrázek 12 Změny v zastoupení mastných kyselin v triacylglycerolech u jednotlivých skupin osob. A 0, B 0, C 0 složení FA na začátku experimentu, A max, B max, C max složení FA při maximální koncentraci PUFA n-3. U skupin B a C jsou hodnoty vyjádřeny jako průměr ± SEM. Obrázek 13 Zvýšení koncentrací EPA a DHA v triacylglycerolech u jednotlivých skupin osob Hodnoty představují maximální dosažené koncentrace EPA a DHA vůči bazálním koncentracím (100%). 50
Obrázek 14 Vzájemný vztah koncentrací DHA a EPA v triacylglycerolech u jednotlivých skupin osob Hodnoty představují podíl koncentrací DHA/EPA. c 0 na začátku experimentu, c max při maximální koncentraci PUFA n-3 Obrázek 15 Aterogenní a trombogenní index v triacylglycerolech u jednotlivých skupin osob A 0, B 0, C 0 hodnoty indexů na začátku experimentu, A max, B max, C max hodnoty indexů při maximální koncentraci PUFA n-3; AI aterogenní index, TI trombogenní index. 51
Obrázek 16 Změny v zastoupení mastných kyselin v esterech cholesterolu u jednotlivých skupin osob. A 0, B 0, C 0 složení FA na začátku experimentu, A max, B max, C max složení FA při maximální koncentraci PUFA n-3. U skupin B a C jsou hodnoty vyjádřeny jako průměr ± SEM. Obrázek 17 Zvýšení koncentrací EPA a DHA v esterech cholesterolu u jednotlivých skupin osob Hodnoty představují maximální dosažené koncentrace EPA a DHA vůči bazálním koncentracím (100%). 52
Obrázek 18 Vzájemný vztah koncentrací DHA a EPA v esterech cholesterolu u jednotlivých skupin osob Hodnoty představují podíl koncentrací DHA/EPA. c 0 na začátku experimentu, c max při maximální koncentraci PUFA n-3 Obrázek 19 Aterogenní a trombogenní index v esterech cholesterolu u jednotlivých skupin osob A 0, B 0, C 0 hodnoty indexů na začátku experimentu, A max, B max, C max hodnoty indexů při maximální koncentraci PUFA n-3; AI aterogenní index, TI trombogenní index. 53
Zvýšení koncentrací EPA a DHA ve frakci TAG bylo nejvýraznější u osoby s velmi nízkou bazální hladinou EPA (0,04 M%) a DHA (0,11 M%); obsah EPA se zvýšil o 1800%, obsah DHA o 520%. Ve skupině B, kde vstupní hladiny byly pro EPA 0,2 M% a DHA 0,4 M%, se jejich obsah zvýšil o 220, resp. 480%. Ve skupině C, se vstupními hladinami EPA 0,28 M% a DHA 1,1 M%, byl jejich nárůst o 210, resp. 80%. Ve frakci PL u skupiny A, kde vstupní koncentrace EPA a DHA byla 0,8 resp. 2,0 M%, došlo k jejich navýšení o 240, resp. 110%. Ve skupině B, s bazálními koncentracemi EPA a DHA 1,0 a 3,0 M%, se jejich obsah zvýšil o 380, resp. 70%. Ve skupině C, s bazálními koncentracemi EPA a DHA 1,0 a 5,0 M%, se jejich obsah zvýšil o 260, resp. 10%. Ve frakci CE byly koncentrace EPA a DHA pro skupinu A 0,08, resp. 0,01 M%, navýšeny byly o 1700, resp. 4000%. Ve skupině B, s bazálními koncentracemi EPA a DHA 0,2 a 0,05 M%, se jejich obsah zvýšil shodně o 1500%. Ve skupině C, s bazálními koncentracemi EPA a DHA 0,5 a 0,3 M%, se jejich obsah zvýšil o 300, resp. 250%. Poměr koncentrací DHA/EPA na začátku pokusu a po dosažení maximálních hodnot byl různý pro jednotlivé lipidové třídy i pro skupiny. Ve frakci TAG tento poměr reflektoval složení preparátu ve skupinách A a C, tedy jeho hodnota poklesla, ve skupině B se naopak zvýšila. Ve frakci PL byl u všech skupin zaznamenán pokles poměru DHA/EPA. V CE u skupiny A tento poměr vzrostl, u skupiny B se nezměnil, u skupiny pokles. Zastoupení jednotlivých tříd mastných kyselin se rovněž lišilo u jednotlivých lipidových tříd a skupin; srovnány byly hodnoty na počátku pokusu a po dosažení maxima PUFA n-3. Ve frakci PL bylo zvýšení PUFA n-3 u skupiny A kompenzováno poklesem PUFA n-6, došlo i k nárůstu MUFA. U skupin B a C byl nárůst obsahu PUFA n-3 kompenzován poklesem obsahu SFA a PUFA n-6. Ve frakci TAG došlo u všech skupin ke snížení obsahu SFA, u skupiny A došlo k nárůstu MUFA, u skupiny B k nárůstu PUFA n-6. Ve frakci CE došlo u skupiny A ke snížení obsahu SFA a mírnému zvýšení obsahu PUFA n-6, u skupiny B je patrný mírný pokles obsahu PUFA n-6 a MUFA, u skupiny C nárůst MUFA a snížení PUFA n-6. Rozdílnost změn zřejmě souvisí s bazálními koncentracemi PUFA n-3. 54
5 Diskuze Po pětitýdenním podávání preparátu MaxiCor poklesly u všech testovaných osob koncentrace sérových triacylglycerolů, cholesterolu a apo B, koncentrace HDL-C se výrazně nezměnila. Po skončení suplementace se hladiny lipidů vrátily k původním hodnotám přibližně po 1 týdnu. Příznivé účinky suplementace EPA a DHA na krevní lipidy popsala řada autorů. Jacobson a spolupracovníci [16, 17] zpracovali výsledky celkem 22 studií, které sledovaly změny v koncentracích LDL-C, HDL-C, TAG, a non- HDL-C po suplementaci EPA a DHA. Z těchto studií se 6 zabývalo přímým srovnáním účinků EPA a DHA, 12 sledovalo vliv izolované DHA a 4 vliv izolované EPA. Vždy byl zaznamenán pokles koncentrací TAG, pro zvýšení koncentrací HDL-C bylo účinnější podávání DHA než EPA. Zvýšení koncentrací LDL-C bylo pozorováno u studií s izolovanou DHA, nebylo zjištěno u izolované EPA. Toto téma bude zřejmě ještě delší dobu předmětem dalších studií. Zvýšený příjem PUFA n-3 (v preparátu byl poměr EPA/DHA 3,4:1) ovlivnil profil mastných kyselin ve všech lipidových třídách plazmy. Došlo tedy především ke zvýšení koncentrací EPA a DHA, zvýšení bylo pozorováno již po 2 hodinách od aplikace preparátu. Maximálních hodnot během prvního dne bylo dosaženo v CE a PL po 6 hodinách u všech osob, v TAG byly koncentrace nejvyšší rovněž po 6 hodinách, u žen již po 2 hodinách. Po dosažení maxima došlo k poklesu koncentrací EPA i DHA u všech osob ve všech lipidových třídách. Časový průběh koncentrací EPA a DHA v prvním dni byl individuální, a zřejmě ovlivněn další přijatou potravou. V průběhu dalších dní obsah těchto kyselin stoupal, ale časový charakter závislosti se lišil v jednotlivých skupinách i lipidových třídách. Ve skupině bylo dosaženo maximálních hodnot obou kyselin na konci suplementace, a to ve všech lipidových třídách. Týden po skončení suplementace došlo k výraznému poklesu hladin EPA a DHA v PL a TAG, v CE až po 2 týdnech. Jednalo se o osobu s extrémně nízkými vstupními koncentracemi těchto kyselin. Ve skupině B (muži) stoupal obsah EPA a DHA v PL a TAG v průběhu celé suplementace; týden po vysazení preparátu došlo k poklesu. Obsah obou kyselin v CE dosáhl maxima přibližně po dvou týdnech, klesat začal ještě v průběhu suplementace. Ve skupině C (ženy), která měla vysoké vstupní hladiny obou kyselin, dosáhl obsah EPA a DHA v TAG maxima po 2 týdnech, poté klesl na původní hodnoty a udržoval se na stejné úrovni do konce pokusu. Ve frakci PL dosáhla maximální 55
koncentrace EPA po 3 týdnech, k poklesu došlo týden po vysazení preparátu; koncentrace DHA se v průběhu pokusu prakticky neměnila. Ve frakci CE bylo dosaženo maximálních koncentrací obou kyselin již čtvrtý den, hladiny zůstaly během suplementace nezměněné, na původní hodnotu poklesly 2 týdny po vysazení preparátu. Míra a částečně i rychlost inkorporace suplementovaných mastných kyselin byly nepřímo úměrné jejich výchozím koncentracím a zřejmě souvisí s dalšími faktory dietními, biochemickými i genetickými. Podávání PUFA n-3 rovněž ovlivnilo hodnoty aterogenního a trombogenního indexu, vypočteného na základě obsahu mastných kyselin v jednotlivých lipidových třídách. Srovnání vypočtených hodnot AI a TI v bazálním vzorku a vzorku s maximální koncentrací PUFA n-3 ukázalo ve všech lipidových třídách mírný pokles AI a výraznější pokles TI. Tento pokles byl nepřímo úměrný bazální koncentraci PUFA n-3. Ve světové literatuře není mnoho studií, které se zabývají kinetikou inkorporace mastných kyselin do jednotlivých lipidových tříd krevní plazmy (séra). Rusca a spolupracovníci [18] podávali preparát obsahující srovnatelná množství EPA a DHA 48 zdravým osobám v dávce 3 g/den po dobu 28 dní. Sledovali profil mastných kyselin v séru a lyzátu celé krve. Koncentrace obou kyselin se zvýšila a mezi 7. a 28. dnem suplementace zůstala stabilní. U DHA došlo ke zvýšení na dvojnásobek bazální koncentrace, u EPA bylo zvýšení desetinásobné. Autoři vysvětlují tento rozdíl méně efektivní konverzí EPA na DHA v lidském organismu. Arterburn a spolupracovníci [19] sledovali změny v koncentracích EPA a DHA v plazmatických PL a v celkovém lipidu plazmy v závislosti na velikosti dávky izolovaných ethylesterů, která se pohybovala od 0,2 do 6 g/den. Suplementace probíhala 1-6 měsíců. Závislost koncentrace EPA na velikosti dávky byla lineární, závislost DHA logaritmická. Podávání izolované EPA vedlo k jejímu zvýšení o 8%, změna DHA byla minimální, zatímco podávání izolované DHA vedlo k jejímu zvýšení o cca 7% a EPA vzrostla o 1%, pravděpodobně díky k retrokonverzi. V obou případech došlo k poklesu kyseliny arachidonové o 3, resp. 2,5%. Podobné účinky mělo i podávání směsi EPA a DHA. Další autoři [20] podali skupině 50 mladých zdravých mužů jednorázovou dávku 12 g preparátu, který obsahoval EPA a DHA v poměru 1 nebo 1,32, a sledovali profil mastných kyselin v průběhu 24 hodin. Maximální koncentrace EPA bylo dosaženo mezi 6 a 8 hodinou, po 24 hodinách došlo 56
k mírnému poklesu; koncentrace DHA zvolna narůstala po celou dobu. Výsledky předkládané práce se dobře shodují s nálezy ve světovém písemnictví. 57
6 Závěr Podávání preparátu MaxiCor mělo příznivý účinek na hladiny sérových lipidů došlo k poklesu koncentrací celkového cholesterolu a triacylglycerolů, koncentrace HDLcholesterolu zůstala zachována, poklesla však koncentrace apob, majoritního proteinu LDL. V profilech mastných kyselin došlo k poklesu koncentrace aterogenní kyseliny palmitové a jejímu zvýšení u kyselin eikosapentaenové a dokosahexaenové ve všech lipidových třídách. Tyto příznivé změny se projevily i poklesem aterogenního a trombogenního indexu. Zaznamenané změny měly obdobný charakter v jednotlivých sledovaných skupinách, kvantitativně se však lišily v závislosti na pohlaví a bazálních koncentracích PUFA n-3. Rozdílné odezvy ve sledovaných skupinách zřejmě souvisí s ostatními biochemickými i genetickými faktory, ale i dietními návyky. K jakým změnám by vedla delší suplementace u jednotlivých skupin, existují-li pro každého jedince limity v zastoupení mastných kyselin, nelze z této krátkodobé studie určit. Popsat všechny tyto souvislosti zasluhuje další podrobné studium. 58
7 Seznam obrázků a tabulek Obr. 1 Rozmístění jednotlivých lipidových tříd po vizualizaci UV lampou... 26 Obr. 2 Časový průběh koncentrace kyseliny eikosapentaenové ve fosfolipidech u jednotlivých skupin osob... 45 Obr. 3 Časový průběh koncentrace kyseliny dokosahexaenové ve fosfolipidech u jednotlivých skupin osob.... 45 Obr. 4 Časový průběh koncentrace kyseliny eikosapentaenové v triacylglycerolech u jednotlivých skupin osob.... 46 Obr. 5 Časový průběh koncentrace kyseliny dokosahexaenové v triacylglycerolech u jednotlivých skupin osob... 46 Obr. 6 Časový průběh koncentrace kyseliny eikosapentaenové v esterech cholesterolu u jednotlivých skupin osob... 47 Obr. 7 Časový průběh koncentrace kyseliny dokosahexaenové v esterech cholesterolu u jednotlivých skupin osob... 47 Obr. 8 Změny v zastoupení mastných kyselin v PL u jednotlivých skupin osob... 48 Obr. 9 Zvýšení koncentrací EPA a DHA v PL u jednotlivých skupin osob... 48 Obr. 10 Vzájemný vztah koncentrací DHA a EPA ve fosfolipidech u jednotlivých skupin osob... 49 Obr. 11 Aterogenní a trombogenní index ve PL u jednotlivých skupin osob... 49 Obr. 12 Změny v zastoupení mastných kyselin v TAG u jednotlivých skupin osob... 50 Obr. 13 Zvýšení koncentrací EPA a DHA v TAG u jednotlivých skupin osob... 50 Obr. 14 Vzájemný vztah koncentrací DHA a EPA v TAG u jednotlivých sk. osob... 51 Obr. 15 Aterogenní a trombogenní index v TAG u jednotlivých skupin osob... 51 Obr. 16 Změny v zastoupení mastných kyselin v CE u jednotlivých skupin osob... 52 Obr. 17 Zvýšení koncentrací EPA a DHA v CE u jednotlivých skupin osob... 52 Obr. 18 Vzájemný vztah koncentrací DHA a EPA v CE u jednotlivých skupin osob.. 53 Obr. 19 Aterogenní a trombogenní index v CE u jednotlivých skupin osob... 53 59
Tab. 1 Důležité mastné kyseliny... 11 Tab. 2 Výživové doplňky s rybím olejem a jejich dodavatelé... Chyba! Záložka není definována.2 Tab. 3 Časový harmonogram odběrů... 23 Tab. 4 Koncentrace lipidů v séru... Chyba! Záložka není definována.9 Tab. 5A Profil mastných kyselin ve fosfolipidech u skupiny A... 30 Tab. 5B Profil mastných kyselin ve fosfolipidech u skupiny B... 31 Tab. 5C Profil mastných kyselin ve fosfolipidech u skupiny C... 33 Tab. 6A Profil mastných kyselin v triacylglycerolech u skupiny A... 35 Tab. 6B Profil mastných kyselin v triacylglycerolech u skupiny B... 36 Tab. 6C Profil mastných kyselin v triacylglycerolech u skupiny C... 38 Tab. 7A Profil mastných kyselin v esterech cholesterolu u skupiny A... 40 Tab. 7B Profil mastných kyselin v esterech cholesterolu u skupiny B... 41 Tab. 7C Profil mastných kyselin v esterech cholesterolu u skupiny C... 43 60
8 Použité zkratky AA kyselina arachidonová (arachidonic acid) AI aterogenní index (atherogenic index) ALA kyselina α-linolenová (α-linolenic) Apo apolipoprotein Apo-B apolipoprotein B CE cholesterolestery (cholesteryl esters) CLA konjugovaná kyselina linolová (conjugated linoleic acid) DHA kyselina dokosahexaenová (docosahexaenoic acid) DHGLA kyselina dihomo-γ-linolenová (dihomo-γ-linolenic acid) DPA kyselina dokosapentaenová (docosapentaenoic acid) EPA kyselina eikosapentaenová (eicosapentaenoic acid) FA mastné kyseliny (fatty acids) FFA volné mastné kyseliny (free fatty acids) FH familiární hypercholesterolemie (familial hypercholesterolemia) FCHL familiární kombinovaná hypercholesterolemie (familial combined hypercholesterolemia) GLA kyselina γ-linolenová (γ-linolenic acid) GPO glycerol 3 fosfát oxidáza (glycerol 3 phosphate oxidase) HDL lipoproteiny o vysoké hustotě (high density lipoproteins) HDL-C HDL-cholesterol CHOD cholesterol oxidáza (cholesterol oxidase) CHOL cholesterol IDL lipoproteiny o intermediární hustotě (intermediary density lipoproteins) ICHS ischemická choroba srdeční LDL lipoproteiny o nízké hustotě (low density lipoproteins) LDL-C LDL-cholesterol 61
LA kyselina linolová (linoleic acid) LCFA mastné kyseliny s dlouhým řetězcem (long chain fatty acids) Lp(a) lipoprotein (a) MCFA mastné kyseliny se středně dlouhým řetězcem (medium chain fatty acids) MS metabolický syndrom (metabolic syndrome) MUFA jednonenasycené mastné kyseliny (monounsaturated fatty acid) OA kyselina olejová (oleic acid) PA kyselina palmitová (palmitic acid) PAP fenol + aminofenazon (phenol + aminophenazone) PL fosfolipidy (phospholipids) POA kyselina palmitolejová (palmitoleic acid) PUFA vícenenasycené mastné kyseliny (polyunsaturated fatty acids) SA kyselina stearová (stearic acid) SCFA mastné kyseliny s krátkým řetězcem (short chain fatty acids) TAG triacylglyceroly (triacylglycerols) TC celkový cholesterol (total cholesterol) TI trombogenní index (thrombogenic index) VLCFA mastné kyseliny s velmi dlouhým řetězcem (very long chain fatty acids) VLDL lipoproteiny o velmi nízké hustotě (very low density lipoproteins) 62
9 Seznam použité literatury a zdrojů informací [1] VOET, Donald a Judith G. VOETOVÁ. Biochemie. Praha: Victoria Publishing, 1995. ISBN 80-85605-44-9. [2] METZLER, David E. Biochemistry. 1. díl. 2. vyd. San Diego: Academic Press, 2001. ISBN 0-12-492540-5. [3] MURRAY, R.K. a kol. Harperova biochemie. 3. vyd. Jinočany: Nakladatelství H+H 2002. ISBN 80-7319-013-3. [4] TVRZICKÁ, E. a kol. Mastné kyseliny 1. Výskyt a biologický význam. Časopis lékařů českých, 2009, 148, s. 16-24. ISSN 0008-7335. [5] GOTTO, Antonio M. Contemporary Diagnosis and Management of Lipid Disorders. Newton: Handbooks in Health Care, 2004. ISBN 978-1931981187. [6] SIMOPOULOS, A.P. Omega-3 Fatty Acids in Health and Disease and in Growth and Development. The American Journal of Clinical Nutrition, 2012, vol. 54, p. 438-463. ISSN 1938-3207. [7] TVRZICKÁ, E. a kol. Mastné kyseliny 2. Fyziologický a klinický význam. Časopis lékařů českých, 2009, 148, s. 116-123. ISSN 0008-7335. [8] MASOPUST, Jaroslav. Klinická biochemie, požadování a hodnocení biochemických vyšetření I. Praha: Karolinum, 1998. ISBN 80-7184-648-1. [9] NOVÁK, František. Úvod do klinické biochemie. Praha: Karolinum, 2002. ISBN 80-246-0366-7. [10] METZLER, David E. Biochemistry. 2. díl. 2. vyd. San Diego: Academic Press, 2003. ISBN 0-12-492541-3. [11] MARTINEZ, Marcos et al. Therapeutic Effects of Docosahexaenoic Acid Ethyl Ester in Patients with Generalized Peroxisomal Disorders. The American Journal of Clinical Nutrition, 2000, vol. 71, p. 376-385. ISSN 1938-3207. 63
[12] STAŇKOVÁ, B., E. TVRZICKÁ a A. ŽÁK. Mastné kyseliny v dietních doplňcích s rybím olejem. In: Atherosklerosa 2007: Sborník symposia. Praha: VI. Interní klinika 1. LF UK Praha, 2007, s. 89-91. ISBN 978-80-254-0238-2. [13] FOLCH, J., M. LEES and G.H.S. STANLEY. Isolation of Total Tissue Lipids. The Journal of Biological Chemistry, 1957, vol. 226, p. 497-509. ISSN: 0021-9258. [14] CARLSON, L.A. Extraction of Lipids from Tissues. Clinica Chimica Acta, 1985, vol. 149, p. 89-93. ISSN: 0009-8981. [15] TVRZICKÁ, E. a kol. Analysis of Fatty Acids in Plasma Lipoproteins by Gas Chromatography-flame Ionization Detection: Quantitative Aspects. Analytica Chimica Acta, 2002, vol. 465, p. 337-350. ISSN 0003-2670. [16] JACOBSON, Terry A. et al. Effects of Eicosapentaenoic Acid and Docosahexaenoic Acid on Low-density Lipoprotein Cholesterol and Other Lipids. Journal of Clinical Lipidology 6, 2012, p. 5 18. ISSN 19332874 [17] JACOBSON, Terry A. and Melissa Y. WEY. Effects of Eicosapentaenoic Acid Versus Docosahexaenoic Acid on Serum Lipids: A Systematic Review and Meta- Analysis. Current Atherosclerosis Reports, 2011, vol. 13, p. 474-483. ISSN 1523-3804. [18] RUSCA, Antonio et al. Relative Bioavailability and Pharmacokinetics of Two Oral Formulations of Docosahexaenoic Acid/Eicosapentaenoic Acid After Multiple-dose Administration in Healthy Volunteers. European Journal of Clinical Pharmacology, 2009, vol. 65, issue 5, p. 503-510. ISSN 0031-6970. [19] ARTERBURN, L.M., E.B. HALL and H. OKEN. Distribution, Interconversion and Dose Response of n-3 Fatty Acids in Humans. The American Journal of Clinical Nutrition, 2006, no. 1 4, vol. 83, p. 1467-1476. ISSN 0002-9165. [20] GALLI, C. et al. Bioequivalence of Two Omega-3 Fatty Acid Ethyl Ester Formulations: A Case of Clinical Pharmacology of Dietary Supplements. British Journal of Clinical Pharmacology, 2012, vol. 74, issue 1, p. 60-65. ISSN 1365-2125. 64
10 Přílohy Preparát MaxiCor (směs ethylesterů mastných kyselin, SVUS Pharma a.s., ČR) 65