IDK DAO ELISA. Pro in vitro stanovení DAO v krevním séru. Platné od

IDK DAO ELISA Pro in vitro stanovení DAO v krevním séru Platné od 2015-07-22

Obsah 1. Použití...3 2. Úvod...3 3. Dodávaný materiál...4 4. Další potřebný materiál, nedodávaný v soupravě...5 5. Příprava a skladování reagentů...5 6. Odběr, skladování a příprava vzorků...6 7. Pracovní postup...6 8. Výsledky...8 9. Omezení...9 10. Kontrola kvality...9 11. Charakteristiky testu... 11 12. Opatření... 12 13. Technické pokyny... 13 14. Všeobecné informace o testu a o postupu práce... 13 15. Literatura... 14 16. Použité symboly... 15 2

1. Použití IDK DAO ELISA je určena pro kvantitativní stanovení diaminooxidázy (DAO) v krevním séru. Jen pro in vitro diagnostické použití. 2. Úvod Diaminooxidáza (DAO) je tělu vlastní enzym, který metabolizuje histamin. Ačkoliv, se DAO vyskytuje téměř v celém lidském těle, nejdůležitějším místem jejího působení je tenké střevo. Enzymatická aktivita DAO určuje rychlost odbourávání histaminu. V případě nedostatku DAO nebo inhibice její činnosti se objeví příznaky intolerance histaminu, protože přijatý nebo endogenní histamin nemůže být dostatečně rychle degradován. Milióny lidí trpí po konzumaci některých živin gastrointestinálními problémy, migrénami, podrážděním nosní sliznice a jinými příznaky, které jsou podobné alergické reakci. Všechny tyto příznaky může způsobovat příliš vysoká hladina histaminu v těle. Stanovení koncentrace DAO v krevním séru (K8500) v kombinaci se stanovením aktivity DAO (K8220 DAO REA) je vhodným ukazatelem pro stanovení diagnózy intolerance histaminu a s tím spojených symptomů. IDK DAO ELISA je test určený pro in vitro stanovení koncentrace diaminooxidázy (DAO) v krevním séru. Indikace Časté bolesti hlavy a migrény Rýma, která se objeví po konzumaci látek s obsahem histaminu Otok tkání Otok očních víček Zčervenání kůže Bolesti končetin Gastrointestinální problémy Monitoring při dietě bez histaminu 3

3. Dodávaný materiál Kat. číslo Obsah Komponenty soupravy Množství K 8500 PLATE Držák s potaženými stripy 12 x 8 jamek K 8500 WASHBUF ELISA promývací pufr, 5x koncentrovaný 4 x 100 ml K 8500 STD Standardy, lyofilizované (viz specifikace pro koncentrační rozpětí) K8500 CTRL Kontrola, lyofilizovaná (viz specifikace pro koncentrační rozpětí) K8500 CTRL Kontrola, lyofilizovaná (viz specifikace pro koncentrační rozpětí) K 8500 AB Detekční protilátka (biotinylovaná), koncentrát K 8500 CONJ konjugát (Streptavidin, značený peroxidázou) koncentrát K 8500 ABBUF Ředící pufr pro AB a CONJ, připravený k použití K 8500 SAMPLEBUF Ředící pufr vzorků, připravený k použití K8500 SUB TMB substrát (tetramethylbenzidin), připravený k použití K 8500 STOP ELISA zastavovací roztok, připravený k použití 4 x 5 lahviček 4 x 1 lahvička 4 x 1 lahvička 1 x 200 μl 1 x 200 μl 1 x 50 ml 1 x 50 ml 1 x 15 ml 1 x 15 ml Pro doobjednání jednotlivých komponent soupravy použijte katalogové číslo označené jako číslo produktu. 4

4. Další potřebný materiál, nedodávaný v soupravě Standardní laboratorní reakční nádoby (1,5 ml) Standardní laboratorní reakční nádoby (15 ml) Fólie na přikrytí mikrotitrační destičky Horizontální třepačka pro mikrotitrační destičku Vortex Ultra čistá voda* Třepačkový inkubátor při 37 ºC Reader pro mikrotitrační destičku (požadované filtry viz kapitola 7) *Immundiagnostik AG doporučuje používat ultra čistou vodu - ultra pure water (Typ vody č.1, ISO 3696),která neobsahuje nerozpustné a koloidní ionty a organické molekuly (bez částic > 0,2 μm) s vodivostí < 0,055μS/cm při 25 C ( 18,2MΩ cm). 5. Příprava a skladování reagentů Pro opakované použití testu je potřeba zajistit, aby byly reagenty skladovány podle podmínek uvedených na etiketě. Je nezbytné připravit si pouze potřebné množství pro každý jeden test. Testovací souprava může být použita až čtyřikrát po dobu exspirace vyznačené na obalu. Reagenty s objemem menším než 100 μl by se měli před použitím centrifugovat, aby se zabránilo ztrátě objemu. Příprava promývacího pufru: Koncentrát promývacího pufru (WASHBUF) před použitím nařeďte velmi čistou vodou ( ultra pure water) v poměru 1:5 (200 ml WASHBUF + 800 ml velmi čisté vody (ultra pure water) a dobře promíchejte. V důsledku vysoké koncentrace solí v zásobních roztocích může dojít k tvorbě krystalů. Před použitím pufru (před ředěním) musí být krystaly rozpuštěné při 37 C ve vodní lázni. Promývací pufr WASHBUF je stabilní při teplotě 2-8 C po dobu exspirace uvedené na obalu. Promývací pufr (1:5 zředěný WASHBUF ) by měl být skladován v uzavřené lahvi při teplotě 2-8 C po dobu jednoho měsíce. Upozornění: Tento promývací pufr je určený pouze pro testovací soupravu IDK DAO-ELISA. Krystaly v koncentrátu promývacího pufru musí být před použitím úplně rozpuštěné! Lyofilizované standardy (STD) a kontroly (CTRL) jsou stabilní při teplotě 2-8 C po dobu exspirace uvedené na obalu. Lyofilizované standardy (STD) a kontroly (CTRL) musí být rekonstituovány 500 μl SAMPLEBUF (pufrem na ředění vzorků). Obsah lahvičky nechejte rozpouštět po dobu 10 minut a důkladně promíchejte jemný převracením, dokud se obsah úplně nerozpustí. Takto rozpuštěné standardy nejsou stabilní a nesmí se uskladňovat. 5

Příprava konjugátu a detekčních protilátek: Koncentrát Konjugátu (CONJ) a koncentrát detekční protilátky (AB) musí být naředěny v dilučním pufru v poměru 1:101 (100 μl CONJ + 10 ml ABBUF) (100 μl AB + 10 ml ABBUF). Nezředěné protilátky (AB) a koncentrát konjugátu (CONJ) jsou stabilní při teplotě 2-8 C po dobu exspirace uvedené na obalu. Konjugát (1:101 naředěný CONJ) a detekční protilátky (1:101 naředěné AB) nejsou stabilní a nemohou být skladovány. Všechny ostatní reagencie jsou připravené k použití. Testovací reagencie jsou stabilní po dobu exspirace uvedené na obalu, pokud jsou skladovány při teplotě 2-8 C. 6. Odběr, skladování a příprava vzorků Stabilita vzorku Uskladnění při teplotě místnosti (15 30) C: Uskladnění při 2-8 C: Uskladnění při 20 C: 4 dny 9 dní 6 měsíců Příprava vzorků Napipetujte 50 μl vzorku do 1,5 ml reakční lahvičky, přidejte 200 μl SAMPLEBUF (pufr na ředění vzorku) a dobře promíchejte (odpovídá ředění v poměru 1:5) 7. Pracovní postup Princip testu Tento test využívá sendvičovou metodu se dvěma polyklonálními protilátkami proti rekombinantní DAO. Standardy, kontroly a naředěné vzorky určené pro testování IDK DAO ELISA, jsou přidávány přímo do jamek mikrotitrační destičky potažené polyklonální králičí anti-dao protilátkou. Po dobu prvního inkubačního kroku je DAO vázána na primární protilátky navrstvené na mikrotitrační destičce. Potom jsou přidávány biotynilované polyklonální anti-dao protilátky. V dalším kroku je přidáván streptavidin peroxidázový konjugát a následně se vytváří sendvič: 1. protilátka-dao biotynilovaná protilátka streptavidín peroxidázový konjugát. Tetramethylbenzidin (TMB) je používán jako peroxidázový substrát. Nakonec se pro ukončení reakce přidává zastavovací roztok. To vyvolá barevnou změnu z modré na žlutou. Intenzita žluté barvy je přímo úměrná koncentraci DAO. Ze získaných hodnot absorbancí (optická denzita, OD při 450 nm) a koncentrací standardů lze získat kalibrační křivku. 6

Postup testu Všechny reagencie a vzorky temperujte na laboratorní teplotu (15-30 C) a dobře promíchejte. V protokolu označte pozice STD/SAMPLE/CTRL (standardy/vzorek/kontroly). Ze soupravy odeberte tolik mikrotitračních stripů, kolik potřebujete. Nepoužité stripy skladujte v dobře uzavřeném hliníkovém obalu při teplotě 2-8 C. Stripy jsou stabilní do data exspirace uvedeného na obalu. Pro automatické ELISA procesory je pravděpodobně nutné nastavit daný protokol podle specifických funkcí příslušného analyzátoru. Doporučujeme provádět test v duplikátu. 1. Každou mikrotitrační jamku 5x promyjte 250 μl promývacího pufru. Po posledním promytí odstraňte všechny zbytky promývacího pufru silným poklepáním mikrotitrační destičky na papír. 2. Přidejte 100 μl standardu (STD), vzorku (SAMPLE) a kontroly (CTRL) do příslušných mikrotitračních jamek. 3. Pevně přikryjte destičku a inkubujte po dobu 2 hodin při teplotě 37 C na horizontální třepačce. 4. Odstraňte obsah každé jamky a znovu 5x promyjte 250 μl promývacího pufru. Po posledním promytí odstraňte všechny zbytky promývacího pufru silným poklepáním mikrotitrační destičky na papír. 5. Přidejte 100 μl detekční protilátky do každé jamky a jemně promíchejte. 6. Pevně přikryjte destičku a inkubujte po dobu 1 hodiny při teplotě 37 C na horizontální třepačce. 7. Odstraňte obsah každé jamky a znovu 5x promyjte 250 μl promývacího pufru. Po posledním promytí odstraňte všechny zbytky promývacího pufru silným poklepáním mikrotitrační destičky na papír. 8. Přidejte 100 μl konjugátu do každé jamky v mikrotitrační destičce. 9. Pevně přikryjte destičku a inkubujte po dobu 1 hodiny při teplotě 37 C na horizontální třepačce. 10. Odstraňte obsah každé jamky znovu 5x promyjte 250 μl promývacího pufru. Po posledním promytí odstraňte všechny zbytky promývacího pufru silným poklepáním mikrotitrační destičky na papír. 11. Přidejte 100 μl substrátu (SUB) do každé jamky v mikrotitrační destičce. 12. Inkubujte ve tmě po dobu 10 20 minut při laboratorní teplotě (15-30 C). 13. Přidejte 100 μl zastavovacího roztoku (STOP) do každé jamky a dobře promíchejte. 7

14. Změřte ihned absorbanci na ELISA readeru při 450 nm proti 620 nm (nebo 690 nm) jako referenční vlnové délce. Pokud není k dispozici žádná referenční vlnová délka, změřte výsledky pouze při 450 nm. Jakmile extinkce (OD) nejvyššího standardu přesahuje rozpětí fotometru, absorbance musí být změřená ihned při 405 nm proti 620 nm jako referenční vlnové délce. *Pozn. Intenzita barevné změny je citlivá na teplotu. Doporučujeme sledovat barevnou změnu a zastavení reakce pro dobré rozlišení. 8. Výsledky Pro výpočet výsledků mohou být použity tyto následující alternativní algoritmy. Doporučuje se použít 4 parametrový algoritmus. 1. 4 parametrový algoritmus Doporučuje se použít lineární osu pro optickou denzitu a logaritmickou úsečku pro koncentraci. Při použití logaritmické úsečky musí být uveden nulový standard s hodnotou menší jak 1 (např. 0,001). 2. Point to point výpočet Doporučuje se použít lineární osu pro optickou hustotu a lineární úsečku pro koncentraci. 3. Spline algoritmus Doporučuje se použít lineární osu pro optickou hustotu a logaritmickou úsečku pro koncentraci. Před použitím automatického vyhodnocení hodnot duplikátů by měla být ověřena přijatelnost těchto výsledků. Pokud tento postup není možný v používaném programu, hodnoty duplikátů by měly být vyhodnoceny manuálně. Vzorky Získané DAO koncentrace musí být vynásobeny ředícím faktorem 5. V případě, že byl použitý jiný ředící faktor, vynásobte získaný výsledek tímto ředícím faktorem, aby jste získali skutečnou koncentraci. 8

9. Omezení Vzorky s koncentrací nad rozsahem měřeni (viz definice níže) se musí dále ředit a znovu testovat. Při výpočtu výsledků vezměte prosím toto vyšší ředění v úvahu. Vzorky s koncentrací nižší, než je rozsah měření (viz definice níže), takové výsledky není možné jednoznačně kvantifikovat. Horní hranici rozsahu měření je možné vypočítat jako: nejvyšší koncentrace standardní křivky x použitý ředící faktor vzorku Spodní hranici rozsahu měření je možné vypočítat jako: LoB x použitý ředící faktor vzorku 10. Kontrola kvality Pokud je to možné, Immundiagnostik doporučuje použít externí kontroly pro interní kontrolu kvality. Při každém stanovení by měla být prováděna analýza kontrolních vzorků. Výsledky získané z analýzy vzorků kontrol, by měly být vyhodnoceny z hlediska přijatelnosti použitím vhodných statistických metod. Výsledky vzorků pacientů nemusí být správné, pokud v rámci jednoho testu je jedna nebo více hodnot analyzovaných vzorků mimo hranice přijatelnosti. Referenční rozsah < 3 U/ml: vysoký výskyt HIT (histaminová intolerance) 3-10 U/ml: pravděpodobná HIT > 10 U/ml: nízká incidence HIT Konverzní faktor: 1 U/ml = 1,25 ng/ml Doporučujeme pro každou laboratoř stanovit vlastní referenční rozpětí. 9

Porovnání těhotných žen se zdravými kontrolami Pro klinické hodnocení tohoto testu byly analyzovány vzorky získané od těhotných žen a zdánlivě zdravých kontrol. Pomocí IDK DAO ELISA se zjistilo, že podle potřeb a očekávání, jsou vyšší hodnoty u těhotných žen než u zdánlivě zdravých kontrol. Léčba heparinem U zdánlivě zdravých účastníků studie prudce vzrostla hladina DAO po 30 minutách od podání heparinu. To bylo zdokumentováno v odborné literatuře, že hladina DAO stoupá po podání heparinu. Výsledky léčby před a po podání heparinu IDK DAO-ELISA [U/ml] Před po 30 minutách od podání po 60 minutách od podání podáním heparinu heparinu Pacient č.1 76 219 - Pacient č.2 55 152 - Pacient č.3 2,5 277 622 Pacient č.4 18,9 621 555 Poněvadž pomocí testu IDK DAO ELISA se stanovuje koncentrace DAO zatímco tradičním testem pro histaminovou intoleranci, s putrescinem nebo histaminem jako substráty, se určuje aktivita DAO, korelační koeficient nemusí být r > 0,8. 10

Tento jev se může vysvětlovat tím, že aktivita DAO in vitro i in vivo není závislá na počtu samotných molekul, ale také na kofaktorech jako je vitamín C, vitamín B6, ionty mědi nebo ionty manganu. Proto doporučujeme při diagnostice histaminové intolerance testem stanovujícím aktivitu DAO, ověřit aktivity i zmíněných kofaktorů. Problémem nemusí být nízká hladina DAO, ale nedostatek kofaktoru. Příznaky intolerance histaminu můžou být vyvolané nízkou hladinou DAO, protože výše uvedené kofaktory nejsou dostupné v dostatečné míře. Na základě kvantitativního stanovení kofaktorů můžeme určit, který z nich je potřebné doplnit. Účinky léků Kromě toho, příznaky intolerance histaminu mohou být způsobené nejen nízkou hladinou DAO, ale i léky jako jsou: Myorelaxancia Narkotika Analgetika Lokální anestetika Antihypotonika Antihypertenziva Antiarytmika Diuretika Léky ovlyvňující střevní motilitu Antibiotika Mukolytika Broncholytika H2-receptor-antagomista Cytostatika Antidepresiva Pancuronium, Alcuronium, D-tubokurarin Tiopental Morfium, Petidin, Nesteroidní protizánětlivé léky, Kyselina acetylsalicylová, Metamizol Prilokain Dobutamin Verapamil, Alprenolol, Dihydralazin Propafenon Amilorid Metoklopramid Cefuroxim, Cefotiam, Izoniazid, Pentamidin, Kyselina klavulanová, Chlorochin Acetylcistein, Ambroxol Aminofylin Cimetidin Cyklofosfamid Amitripilin 11. Charakteristiky testu Přesnost a reprodukovatelnost Intra - Assay (n=16) Přesnost (odchylka intra - assay) byla vypočítána z 16 opakovaných stanovení každého ze dvou vzorků. Vzorek DAO [U/ml] Intra assay CV [%] 1 5 1,42 2 5,9 1,72 11

Inter - assay (n=8) Celková přesnost (odchylka inter - assay) byla vypočítaná na základě údajů ze dvou vzorků získaných z osmi různých analýz, které byly provedeny různými technikami po dobu třech dní. Ředění vzorků Vzorek DAO [U/ml] Intra assay CV [%] 1 23,27 7,90 2 13,36 10,70 Byly zředěny a testovány vzorky dvou pacientů. Výsledky jsou zobrazeny níže Linearita n= 2 Analytická sensitivita Limit blanku, LoB Limit detekce, LoD Limit kvantifikace, LoQ 0,079 U / ml 0,120 U / ml 0,120 U / ml Vyhodnocení bylo provedeno podle CLSI směrnice EP-17-A2. Specifikovaná přesnost výsledku pro LoQ byla 20% CV. 12. Opatření Všechny reagenty v kitu jsou určeny pouze pro in vitro diagnostické použití. Lidský materiál používaný jako součást testovacích souprav byl testován a vyhodnocen jako negativní na HIV, Hepatitidu B a Hepatitidu C. Avšak, z bezpečnostních důvodů by se mělo se všemi komponentami soupravy zacházet jako s potenciálně infekčním materiálem. Reagenty soupravy obsahují azid sodný nebo ProClin 300 jako baktericidní 12

látky. Azid sodný a ProClin 300 jsou toxické. Substráty pro barevnou enzymatickou reakci jsou považovány za toxické a karcinogenní. Vyhněte se kontaktu s kůží a sliznicí. Zastavovací roztok obsahuje naředěnou kyselinu sírovou, která je velmi silnou kyselinou. Ačkoliv, je tato kyselina naředěná musí se s ní zacházet velmi opatrně. Může zapříčinit poleptání, proto při manipulaci je třeba používat ochranné rukavice, brýle na ochranu očí a vhodné ochranné oblečení. Při jakémkoliv rozlití se kyselina musí okamžitě opláchnut větším proudem vody. Nevdechujte výpary a vyvarujte se jejich inhalování. 13. Technické pokyny Nemíchejte různé šarže a ani žádné součásti testovací soupravy. Nepoužívejte na analýzu ani zbytky volných, nepoužitých mikrotitračních jamek, i kdyby byly stejné šarže! Kontrolní vzorky by měly být analyzovány při každém testování. Reagencie nesmí být používané po uplynutí data exspirace na obalu. Roztok substrátu by se neměl barevně měnit až do použití. Pro dosažení přesných výsledků musí být krycí fólie dostatečně přilnuta k mikrotitrační destičce po dobu celé inkubace. Při míchání reagentů se vyhněte jejich zpěnění. Nezaměňujte zátky a uzávěry z různých reagentů. Analýza by se měla vždy provádět podle přiloženého návodu. 14. Všeobecné informace o testu a o postupu práce Tyto testy jsou vyrobeny a distribuovány v souladu s legislativou platnou pro IVD 98/79/EC. Měly by být dodržovány pokyny pro zdravotnické laboratoře. IDK je obchodní značka Immundiagnostik AG. Inkubační doba, inkubační teplota a pipetované objemy jednotlivých komponent jsou definované výrobcem. Jakékoliv změny v pracovním postupu, které nejsou koordinované výrobcem, mohou ovlivnit výsledek testu. Immundiagnostik AG nepřebírá zodpovědnost za žádné škody vzniklé v důsledku nesprávného použití. Reklamace a stížnosti v souvislosti s nedostatky musí být podány nejpozději do 14 dnů od obdržení zboží. V takovém případě by měla být testovací souprava poslána do společnosti Immundiagnostik AG s písemnou stížností. 13

15. Literatura 14

16. Použité symboly Skladovací teplota Pouze pro in vitro diagnostiku Výrobce Číslo šarže Katalogové číslo Počet testů Datum exspirace 15