ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH ZPRÁVA O UKONČENÍ PROJEKTU Projekt Název projektu: Molekulární aspekty mezidruhové hybridizace jeseterovitých ryb ve vztahu k polyploidii a in situ konzervaci Průběh řešení projektu : K 31.7.2010 bylo odebráno celkem 382 vzorků (ploutevních ústřižků) od experimentálních kříženců získaných z křížení v letech 2008, 2009 a 2010 na rybí líhni Genetického rybářského centra VÚRH. Z počátku řešení projektu bylo vyšetřeno celkem 74 jedinců pomocí průtokové cytometrie. U těchto vzorků byla provedena analýza mtdna, a to konkrétně fragmentu kódujícího cytochrom b a také kontrolní oblast (D-LOOP). Pomocí této analýzy byla sledována možnost mezidruhové hybridizace po materiální linii vedoucí k abnormální ploidní úrovni. Následně bylo analyzováno 24 experimentálních hybridů vzniklých křížením jesetera malého (A. ruthenus) a jesetera sibiřského (Acipenser baerii). Dále 24 hybridů z křížení jesetera ruského (A. gueldenstaedtii) s jeseterem malým (A. ruthenus). Všichni rodiče použití ke křížení byli genotypováni pro mikrosatelitní lokusy LS 19 LS 34, LS 39, LS 68 (May et al. 1997), AOX 45 (King et al. 2001) a SPL 101, SPL 105 (McQuown et al. 2000) stejně jako všech 48 analyzovaných potomků tohoto křížení. U každého lokusu byl sledován přenos jednotlivých alel z rodičů na potomky s cílem nalézt druhově specifickou alelu, která by umožnila detekovat mezidruhové křížence bez ohledu na znalost genotypu rodičů. King T.L. Lubinski B.A. & Spidle A.P. 2001: Microsatellite DNA variation in Atlantic sturgeon (Acipenser oxyrinchus oxyrinchus) and cross-species amplification in the Acipenseridae. Conserv. Genet. 2: 103 119. May B., Krueger C.C. & Kincaid H.L. 1997: Genetic variation at microsatellite loci in sturgeon: primer sequence homology in Acipenser and Scaphirhynchus. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 54: 1542 1547. McQuown E.C., Sloss B.L., Sheehan R.J., Rodzen J., Tranah G.J. & May B. 2000: Microsatellite analysis of genetic variation in sturgeon (Acipenseridae): new primer sequences for Scaphirhynchus and Acipenser. Trans. Am. Fish. Soc. 129: 1380 1388.
Dosažené výsledky: 1. Výsledky průtokové cytometrie U prvního souboru vzorků, u kterého nebyli známi rodiče byly pomocí průtokové cytometrie zjištěny nezvyklé ploidní úrovně, které jsou v rozporu s hodnotami pro čisté druhy. Jako standardní zde byla brána hodnota pro jesetera malého (A: ruthenus), který je považován za evolučního tetraploida (Birstein & Vasiľev 1987; Birstein & DeSalle 1998). Výsledné ploidie určené pomocí průtokové cytometrie jsou zhrnuty v Tab 1. Zajímavé je, že tyto výsledky odhalily u některých analyzovaných jedinců abnormální sudé, evoluční ploidní úrovně (6n,10n,12n) a u některých jedinců liché evoluční ploidní úrovně (5n, 7n, a 9n). Sudé abnormální úrovně ploidie mohou pravděpodobně vznikat mezidruhovou hybridizací evolučně tetraploidních a oktaploidních jedinců, či spontální triploidizací evolučně tetraploidních respektive oktaploidních jedniců, což může naznačovat na pokračující evoluci genomu těchto ancestrálních druhů. Vysvětlení vzniku lichých abnormálních ploidií je dodnes velice nejasné a nejsou zde dostupné žádné litetrární zdroje, které by hlouběji diskutovaly tento problém. Na závěr této části je nutné podotknout, že průtoková cytometrie má v dnešní době expanze molekulární biologie spíše orientační význam a její výsledky by měly být vždy doplněny i o výsledky dalších modernějších metod. Birstein V.J. & Vasil ev V.P. 1987: Tetraploid-octoploid relationships and karyological evolution in the order Acipenseriformes (Pishes): karyotypes, nucleoli, and nucleolus-organizer regions in four acipenserid species. Genetica 73: 3 12. Birstein V.J. & DeSalle R. 1998: Molecular phylogeny of Acipenserinae. Mol. Phylog. Evol. 9: 141 155 2. Analýza mitochondriální DNA (mtdna) Analýza mtdna zahrnovala izolaci celogenomové DNA pomocí extrakčního kitu, dále PCR amplifikaci kódujícího fragmentu pro cytochrom b a kontrolní oblasti mtdna. Pro stanovení pořadí nukleotidů v řetězci bylo využito sekvenačního servisu společnosti Macrogen Inc. Výsledné sekvence byly zpracovány pomocí programu BioEdit (Hall 1999) a porovnány s databází nukleotidových sekvencí pomocí BLAST algoritmu. Pomocí této analýzy se nepodařilo prokázat přítomnost genotypu jiného druhu na úrovni mtdna a to i přesto, že byly využity dva fragmenty. Jedinou výjimkou byl jedinec označený FG86, který byl morfologicky určen jako jeseter sibiřský (A. baerii),
ale nesl haplotyp jesetera ruského (A. gueldenstaedtii), a to v obou studovaných fragmentech a dále jedinec G347 B, morfologicky určený jako jeseter ruský (A. gueldenstaedtii), který nesl v obou studovaných fragmentech haplotyp jasetera sibiřského (A. baerii). Výsledky analýzy mtdna jsou zahrnuty v Tab.1. Analýza mtdna byla některými autory (DeSalle & Birstein 1996 Campton et al. 2000; Ludwig 2008) označena jako vhodná metoda pro identifikaci mezidruhových hybridů, stejně jako pro ověřování čistoty kaviáru. Identifikace mezidruhových hybridů je naprosto nezbytná především v programech zabývajících se reintrodukcí ohrožených druhů jeseterovitých ryb. Avšak všichni tito výše zmínění autoři poukazují na jistou slabinu této metody, kterou je bezesporu maternální dědičnost mtdna. Tento fakt patrně zapříčinil i to, že se nepodařilo prokázat mezidruhovou hybridizaci u studovaných jedninců s nezvyklou ploidií pomocí této analýzy.již Fonatna et al. 2001 nevrhl možné řešení tohoto problému pomocí analýzy mikrosatelitních lokusů. Tab.1 Výsledky průtokové cytometrie a výsledky porovnání nukleotidových sekvencí cytochromu b a kontrolní oblasti (D-loop)mtDNA pomocí BLAST algoritmu. BLAST Vzorek Druh Ex.pl Ob.pl D-loop Cytochrom R 72 B A.ruthenus 4n 5n ruthenus 99% ruthenus 99% R 245 B A.ruthenus 4n 5n ruthenus 99% ruthenus 99% R 295 B A.ruthenus 4n 5n ruthenus 99% ruthenus 99% R 299 B A.ruthenus 4n 5n ruthenus 97% ruthenus 99% R 304 B A.ruthenus 4n 6n ruthenus 99% ruthenus 99% R 310 B A.ruthenus 4n 5n ruthenus 99% ruthenus 99% R 315 B A.ruthenus 4n 6n ruthenus 97% ruthenus 99% R 383 B A.ruthenus 4n 7n ruthenus 99% ruthenus 99% R 109 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 97% ruthenus 99% R 121 A A.ruthenus 4n 5n ruthenus 99% R 124 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 99% ruthenus 99% R 149 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 97% ruthenus 99% R 160 A A.ruthenus 4n 5n ruthenus 97% ruthenus 99% R 165 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 98% ruthenus 99% R 170 A A.ruthenus 4n 8n ruthenus 99% ruthenus 99% R 171 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 97% ruthenus 99% R 172 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 97% ruthenus 99% R 178 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 99% ruthenus 99% R 184 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 99% ruthenus 99% R 185 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 99% ruthenus 99% R 190 A A.ruthenus 4n 5n ruthenus 99% ruthenus 99% R 222 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 97% ruthenus 99% R 251 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 97% ruthenus 99% R 265 A A.ruthenus 4n 8n ruthenus 99% ruthenus 99% R 266 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 97% ruthenus 99% R 273 A A.ruthenus 4n 5n ruthenus 99% ruthenus 99% R 292 A A.ruthenus 4n 8n ruthenus 99% ruthenus 99% R 295 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 97% ruthenus 99% R 296 A A.ruthenus 4n 12n ruthenus 97% ruthenus 99% R 298 A A.ruthenus 4n 8n ruthenus 97% ruthenus 99% R 326 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 97% ruthenus 99% R 337 A A.ruthenus 4n 6n ruthenus 98% ruthenus 99% R 1 B A.ruthenus 4n 4n ruthenus 99% ruthenus 99% R 2 B A.ruthenus 4n 4n ruthenus 99% ruthenus 99% R 3 B A.ruthenus 4n 4n ruthenus 99% ruthenus 99% R 4 B A.ruthenus 4n 4n ruthenus 99% ruthenus 99% R 5 B A.ruthenus 4n 4n ruthenus 99% ruthenus 99% R 6 B A.ruthenus 4n 4n ruthenus 99% ruthenus 99% R 7 B A.ruthenus 4n 4n ruthenus 99% ruthenus 99% R 8 B A.ruthenus 4n 4n ruthenus 99% ruthenus 99% B 382 B A.baerii 8n 9n baerii 99% baerii 99%
B 411 B A.baerii 8n 12n baerii 99% baerii 99% B 376 B A.baerii 8n 9n baerii 99% baerii 99% B 420 B A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% B 2112 A A.baerii 8n 10n baerii 99% baerii 99% B 2109 A A.baerii 8n 9n baerii 99% baerii 99% FG 9 A.baerii 8n 6n baerii 97% baerii 97% FG 14 A.baerii 8n 6n baerii 97% baerii 97% FG 23 A.baerii 8n 6n baerii 97% baerii 97% FG 32 A.baerii 8n 6n baerii 97% baerii 97% FG 33 A.baerii 8n 6n baerii 97% baerii 97% FG 34 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 35 A.baerii 8n 6n baerii 97% baerii 97% FG 39 A.baerii 8n 6n baerii 97% baerii 97% FG 40 A.baerii 8n 6n baerii 97% baerii 97% FG 41 A.baerii 8n 6n baerii 97% baerii 97% FG 42 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 45 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 49 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 50 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 53 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 54 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 67 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 70 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 72 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 82 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 86 A.baerii 8n 6n gueldenstaedtii 97% gueldenstaedtii 97% FG 87 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 88 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 123 A.baerii 8n 6n baerii 99% baerii 99% FG 128 A.baerii 8n 10n baerii 99% baerii 99% FG 156 A.baerii 8n 10n baerii 99% baerii 99% G 347 B A.gueldenstaedtii 8n 10n baerii 99% baerii 99% G 355 B A.gueldenstaedtii 8n 12n gueldenstaedtii 97% gueldenstaedtii 97% Campton D.E., Bass A.L., Chapman F.A. & Bowen B.W. 2000: Genetic distinction of pallid, shovelnose, and Alabama sturgeon: emerging species and the US endangered species act. Conserv. Genet. 1: 17 32. DeSalle R. & Birstein V.J. 1996: PCR identification of black caviar. Nature 381: 197 198. Ludwig A. 2008: Identification of Acipenseriformes species in trade. J. Appl. Ichtiol. 24: 2-11 Hall, T.A. 1999: BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98. 3. Analýza mikrosatelitních lokusů 3.1. Křížení jesetera malého (A. ruthenus) s jeseterem sibiřským (A. baerii) U prvního typu křížení (A. ruthenus A. baerii) byly mezi všemi studovanými lokusy nalezeny max. 3 alely na lokus u jesetera sibiřského (A. baerii) a max 2 alely na lokus u jesetera malého (A. ruthenus). Jelikož hybridi získaní křížením těchto dvou jedinců nesli taktéž u všech studovaných lokusů maximálně 3 alely na lokus, lze s vysokou pravděpodobností předpokládat, že jedna či více nalezených alel u A. baerii byly duplikovány. Toto se potvrdilo především pro lokusy LS 68, a SPL 101, které mají podle zjištěných výsledků disomickou dědičnost, což je pro lokus LS 68 ve shodě s Pyatskowit. et al. (2001), kteří předpokládali disomickou dědičnost pro tento lokus u jesetera jezerního (A. fulvescens). Pro lokus SPL 101 nebyly dosud žádné studie zabývající se jeho dědičností publikovány. Pyatskowit el al. (2001) také uvádějí tetrasomickou dědičnost pro lokus LS 19. Toto se pro A.baerii ani A. ruthenus
nepodařilo prokázat, především proto, že tento lokus byl u stdovaných jedinců monomorfní a nesl pouze alelu 134bp. Na lokusech LS 68, SPL 101 bylo možné nalézt diagnostické alely, které by mohly sloužit, pro detekci obou druhů u hybridů, bez znalosti genotypu rodičů. Pro to je však nezbytně nutné tuto studii rozšířit a doplnit o výsledky analýz jak čistých druhů, tak i dalších řízeně vytvořených hybridů. 3.2. Křížení jesetera malého (A. ruthenus) s jeseterem ruským (A. gueldenstaedtii) U tohoto typu křížení (A. ruthenus A. gueldenstaedtii) byly mezi všemi studovanými lokusy nalezeny max. 4 alely na lokus u jesetera ruského (A. gueldenstaedtii) a max 2 alely na lokus u jesetera malého (A. ruthenus).u hybridů z tohoto křížení se podařily nalézt maximálně 3 alely na lokus. U jesetera ruského nesly lokusy LS 68 a SPL 101 čtyři aley a u jesetera malého dvě. Jejich kříženci měli na těchto lokusech vždy 3 alely, z čehož je názorně patrná segregace alel (chromozomů) do gamet u plolyploidních jeseterů. Oba tyto lokusy se dědí disomicky, tudíž gameta od jednice se 4 alelami ponese alely dvě a gameta od jedince s dvěma alelami ponese alelu jednu. Výslední hybridní jedinci zdědí dvě alely od jesetera ruského (nesl 4 alely na lokusu) a jednu od jeserera malého (nesl dvě alely na lokus) a budou mít tedy ve výsledku tři alely na těchto lokusech. I zde se podařily nalézt alely, které by v budoucnu mohly taktéž posloužit jako diagnostické pro určování hybridů jesetera malého s jeseterem ruským. Stejně jako v předchozím případě je i zde nutné studii rozšířit a doplnit. Pyatskowit J.D., Krueger C.C., Kincaid H.L. & May B. 2001: Inheritance of microsatellite loci in the polyploid lake sturgeon (Acipenser fulvescens). Genome 44: 185-191. Stav čerpání finančních prostředků: Využitelnost dosažených výsledků a navazující práce: Mezidruhová hybridizace může být jedním z nejvýznamnějších faktorů, který ohrožuje zbytky volně žijících populací jeseterovitých ryb v přírodě (Ludwig et al. 2009). Může k tomu přispívat i nekontrolovaná produkce těchto hybridů v akvakulturních chovech a jejich použití v repatriačních programech Výsledky této práce by měly přispět k pochopení složitého polyploidního komplexu jeseterovitých ryb a k lepšímu porozumnění jejich mezidruhové hybridizace, která je u těchto ancestrálních druhů ryb velice častým jevem. Detailnější pohled na hybridizaci jeseterů by
měl přispět k pochopení přenosu jednotlivých genů z rodičů na potomky u polyploidních jedinců, stejně jako by měl osvětlit vznik abnormálních ploidních úrovní. Navazující práce budou dále zaměřeny na studium přenosu alel z rodičů na potomky u dalších mezidruhových hybridů, stejně tak jako na rozšíření a doplnění dat z již analyzovaných typů křížení. Další část navazujícího výzkumu bude zaměřena na potvrzení plodnosti triploidních hybridů jeseterovitých ryb pomocí metod molekulární biologie. Ludwig A., Lippold S., Debus L. & Reinartz R. 2009: First evidence of hybridization between endangered starlets (Acipenser ruthenus) and exotic Siberian sturgeons (Acipenser baerii) in the Danube River. Biol Invasions 11: 753-760.