MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2014 VERONIKA VLKOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Alergeny v potravinách Bakalářská práce Vedoucí práce: prof. MVDr. Ing. Tomáš Komprda, CSc. Vypracovala: Veronika Vlková Brno 2014

Zadání bakalářské práce

ČESTNÉ PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem práci Alergeny v potravinách vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.... podpis

PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala prof. MVDr. Ing. Tomáši Komprdovi, CSc. za metodické vedení, rady, cenné připomínky a hlavně čas, který mi vždy s ochotou věnoval při zpracování mé bakalářské práce. Současně bych chtěla poděkovat své rodině a všem svým blízkým za podporu při studiu.

ABSTRAKT Tato bakalářská práce se zaměřuje na hlavní alergeny v potravinách, které jsou nebezpečné pro alergické jedince. V současné době je známo osm hlavních alergenních potravin, ale stále k nim přibývají další. Práce popisuje charakteristiku těchto alergenů, včetně jejich struktury a stability vůči různým vlivům. Je zmíněn i alergenní potenciál přídatných látek. Zahrnuje také informace o základních funkcích imunitního systému a jeho složek. Vysvětluje klasifikaci nepříznivých reakcí na potraviny a jejich základní mechanismy. Jedna kapitola je věnována projevům potravinové alergie, které se objeví po požití potravin obsahující alergeny. Dále uvádí problematiku zkřížené reakce a hlavní metody detekce potravinových alergenů. Vzhledem k závažnosti potravinových alergenů se vědci snaží o harmonizaci v oblasti detekce těchto alergenů po celém světě. Na závěr práce poskytuje informace o označování alergenů v potravinách. Klíčová slova: potravinové alergeny, detekce alergenů v potravinách, stabilita potravinových alergenů, označování alergenů v potravinách, imunitní systém, nepříznivé reakce na potraviny, potravinová alergie, přídatné látky, zkřížená reakce ABSTRACT This thesis focuses on the major allergens in food that are dangerous for allergic individuals. Currently eight major allergenic foods are known but still new allergenic foods are added to the list. The thesis describes characteristic of these allergens including the structure and stability to various factors. Allergenic potential of the additives is mentioned. The thesis also includes information about essential functions of the immune system and its components. It explains the classification of negative reactions to food and their basic mechanisms. One chapter is devoted to food allergy symptoms, which appear after consumption of food containing allergens. It also presents the topic of crossreaction and the major food allergens detection methods. Due to the importance of food allergens, scientists try to harmonization of detection of these allergens all over the world. In conclusion, the thesis provides information about labeling of food allergens. Key words: food allergens, detection of allergens in food, stability of food allergens, labeling of food allergens, immune system, negative reactions to foods, food allergies, additives, cross-reactions

OBSAH 1 ÚVOD... 8 2 CÍL PRÁCE... 9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 10 3.1 Imunitní systém člověka... 10 3.2 Nepříznivé reakce na potravinu... 12 3.2.1 Netoxické reakce... 13 3.2.1.1 Pravá potravinová alergie... 13 3.2.1.2 Pravá potravinová intolerance... 15 3.2.2 Toxické reakce... 16 3.3 Projevy potravinové alergie... 16 3.4 Potravinové alergeny... 18 3.4.1 Seznam alergenů v potravinách... 19 3.4.2 Nejčastěji vyskytující se alergeny v potravinách... 20 3.4.2.1 Kravské mléko... 20 3.4.2.2 Vejce... 23 3.4.2.3 Obiloviny... 25 3.4.2.4 Sója... 27 3.4.2.5 Podzemnice olejná... 29 3.4.2.6 Ořechy... 31 3.4.2.7 Ryby... 33 3.4.2.8 Korýši a měkkýši... 35 3.4.3 Přídatné látky... 38 3.5 Detekce alergenů v potravinách... 40 3.5.1 Zkřížená reakce... 40 3.5.2 Analytické metody... 42 3.5.2.1 Důkaz alergenních bílkovin... 42 3.5.2.2 PCR... 44 3.5.2.3 Hmotnostní spektrometrie... 45 3.5.2.4 Biosenzory a další metody... 46 3.6 Vlivy působící na alergenicitu potravinových alergenů... 47 3.7 Označování alergenů v potravinách... 50 4 ZÁVĚR... 52 5 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 53

1 ÚVOD Alergeny v potravinách jsou velmi nebezpečné pro alergické jedince. Tito jedinci trpí potravinovou alergií nebo intolerancí. Potravinová alergie může být zprostředkovaná IgE protilátkami nebo nezprostředkovaná IgE protilátkami. V prvním případě dochází k produkci protilátek a to v okamžiku, kdy byl organismus vystaven antigenu (alergenu). V druhém případě se jedná o reakci mezi buňkami a chemickými mediátory, nikoliv protilátkami. Potravinová intolerance neboli nesnášenlivost není imunologicky podmíněná, nejčastěji se jedná o laktózovou intoleranci. Po požití potravin obsahující alergeny se u alergických osob objevují různé příznaky od kopřivky až po nejzávažnější anafylaktický šok. Jediným způsobem, jak zabránit těmto reakcím, je vyhýbání se alergenním potravinám a dodržování diety. Mezi hlavní alergenní potraviny patří mléko, vejce, ryby, korýši, burské oříšky, sója, ořechy a pšenice. Čerstvé ovoce a zelenina obsahují také alergeny, ale zpracováním a tepelnou úpravou se většinou ničí. Potravinové alergeny jsou převážně proteiny s různou molekulovou hmotností, odlišnou strukturou a stabilitou během zpracování. Některé alergeny vyvolávají u alergiků přecitlivělé reakce převážně v dětství a následně alergie odeznívá a na některé alergeny se objeví přecitlivělost až v dospělosti. Velkým problémem je pak zkřížená reakce mezi jednotlivými potravinovými alergeny a mezi potravinovými alergeny a jinými alergeny, například pyly břízy. Tato zkřížená reaktivita může zásadním způsobem ovlivnit výsledky při zjišťování přítomnosti alergenů v potravinách a vážně ohrozit citlivého spotřebitele. Využívají se různé metody pro detekci těchto alergenů. Vždy se musí dbát na čistotu testovaného vzorku, aby nedošlo ke kontaminaci jiným alergenem. Z hlediska ochrany alergického spotřebitele hraje důležitou roli označování těchto alergenů na etiketách potravin. U balených potravin je vždy uveden seznam přítomných alergenů a lidé tak získají informace o daném produktu. Horší situace pak nastává u nebalených potravin, například u produktů ze stánkového prodeje, kdy spotřebitel není vůbec nebo je jen málo informován o složení určité potraviny. Alergičtí jedinci musí být velice ostražití a měli by si dávat pozor na to, co konzumují. 8

2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce je seznámit se s hlavními alergeny v potravinách a zaměřit se na jejich základní charakteristiku. V úvodu práce je objasněna funkce imunitního systému a klasifikace nepříznivých reakcí na potraviny a jejich mechanismy. Popisuji zde i různé projevy potravinové alergie. Dalším cílem je zmínit se o možné zkřížené reakci, uvést běžné metody detekce potravinových alergenů, stabilitu alergenů při zpracování a zdůraznit problematiku jejich označování. Měla jsem za úkol shrnout veškeré poznatky získané z nastudovaných materiálů do jednotlivých kapitol a zajistit, aby byla práce objektivní. Čerpala jsem z ověřených zdrojů. K vypracování bakalářské práce jsem použila metodiku studia odborné literatury. 9

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Imunitní systém člověka Imunitní systém je tvořen buňkami a tkáněmi, které společně rozpoznávají a eliminují útočící mikroorganismy, parazity a nádorové buňky (DAVIES, 1997). Je to jeden ze základních homeostatických mechanismů našeho organismu. Udržuje celistvost organismu tak, že dokáže rozpoznat škodlivé od neškodného. Funguje jako obrana organismu proti škodlivým činitelům vnitřního a vnějšího původu. Tato činnost imunitního systému se projevuje jako obranyschopnost, autotolerance a imunitní dohled. Obranyschopnost je schopnost rozeznávat zevní škodliviny a chránit organismus proti patogenním mikroorganismům a jejich toxickým metabolitům. Autotolerance se definuje jako funkce imunitního systému rozpoznat a tolerovat vlastní tkáně organismu. Prostřednictvím imunitního dohledu imunitní systém rozeznává vnitřní škodliviny a odstraňuje tak poškozené, staré a mutované buňky. Mechanismy imunitního sytému se rozdělují do dvou skupin, a to na nespecifické a antigenně specifické. Nespecifické, neadaptivní neboli vrozené mechanismy se opírají o funkci molekul a buněk, které jsou v organismu připraveny předem. Jsou namířeny proti patogenům a reagují na jejich společné strukturní nebo funkční rysy. Nespecifické mechanismy mohou být buněčné nebo humorální. Mezi buněčné složky patří fagocytující buňky a přirozeně cytotoxické buňky (NK buňky natural killers). Mezi humorální složky řadíme komplementový systém, interferony, lektiny a jiné sérové proteiny. Specifické, adaptivní neboli získané mechanismy působí proti všem cizorodým látkám pomocí vysoce specifických molekul a k jejich aktivaci dochází až po styku s určitým antigenem. Typickým rysem reakcí tohoto mechanismu je imunologická paměť. Specifické mechanismy mohou být také humorální nebo buněčné. Humorální systém je zprostředkován protilátkami a buněčný především T-lymfocyty (HOŘEJŠÍ, BARTŮŇKO- VÁ, 2005). Komplementový systém se skládá z přibližně 40 výkonných a regulačních glykoproteinů. Vyskytují se v krevním séru nebo na povrchu buněk. Může působit prospěšně nebo škodlivě. Chrání organismus proti patogenním mikroorganismům a cizorodým buňkám, účastní se zánětlivých reakcí a usnadňuje fagocytózu. Naopak může poškozovat vlastní buňky a tkáně při některých imunokomplexových a autoimunitních chorobách. 10

Fagocytóza je jeden z nejstarších obranných mechanismů, který slouží pro usmrcení pohlcených bakterií. Probíhá uvnitř fagolysozomu, jehož prostředí působí toxicky pro různé bakterie. Fagocytózou nelze usmrtit všechny druhy bakterií, ale NK-buňky tyto odolné bakterie následně usmrtí. NK-buňky jsou třetí hlavní skupinou lymfocytů a na svém povrchu mají Fc-receptory. Jejich cytoplazma obsahuje zřetelné lysozomy. NKbuňky mají dva typy receptorů, a to inhibiční receptory, které rozpoznávají HLAantigeny I. třídy a aktivační receptory vyvolávající smrtonosnou aktivitu těchto buněk, zatímco inhibiční receptory tuto aktivitu inhibují (FERENČÍK, 2005). Imunitní systém se skládá z několika lymfatických orgánů, které jsou klasifikovány běžně jako primární neboli centrální a sekundární neboli periferní orgány. Primárními orgány jsou brzlík a kostní dřeň. Mezi sekundární orgány patří slezina, lymfatické uzliny a jejich shluky v dýchacím, gastrointestinálním a urogenitálním ústrojí. V primárních orgánech se z kmenových buněk diferencují lymfocyty (SHETTY, 2005). Nejdůležitější buňky imunitního systému jsou bílé krvinky neboli leukocyty, které jsou důležité pro imunitní odpověď. Vznikají ze speciálních buněk, tzv. kmenových buněk nacházející se v kostní dřeni. Tyto buňky se nazývají nediferencované buňky, mohou z nich vznikat různé typy buněk. Další nepostradatelné buňky jsou červené krvinky neboli erytrocyty důležité k transportu kyslíku a oxidu uhličitého v těle. Z kmenových buněk kostní dřeně se diferencují i buňky lymfoidní linie. V závislosti na tom, kde v těle tyto buňky dozrávají, se tvoří dva typy buněk. Pokud lymfoidní buňky zrají v kostní dřeni, vznikají B-lymfocyty (buňky B). Buňky B jsou hlavní buňky pro výrobu protilátek. Když lymfoidní buňky migrují do brzlíku, stávají se z nich T-lymfocyty (buňky T). Buňky T zprostředkovávají proces známý jako buňkami zprostředkovanou imunitu. Jsou také důležité při regulaci intenzity imunitní reakce. Existují tři hlavní typy buněk T: cytotoxické (buňky Tc), pomocné (buňky Th) a supresorové (buňky Ts; STEWART, 2004). Mezi základní molekuly imunitního systému patří antigenně specifické receptory na povrchu T a B-lymfocytů. Jedná se o TCR a BCR receptory. K základním molekulám se řadí dále MHC (major histocompatibility complex) glykoproteiny I. a II. třídy a pokud se nachází v lidském organismu, nesou označení HLA (human leucocyte antigens) molekuly (HOŘEJŠÍ, BARTŮŇKOVÁ, 2005). T-lymfocyty jsou aktivátory imunitní odpovědi. Vytváří vazbu s již dříve rozloženými antigeny na malé peptidy, které byly navázány na molekuly MHC na povrchu 11

buňky nabízející antigen nebo na povrchu buňky cílové. Prostřednictvím komplexu MHC imunitní systém rozeznává cizí od vlastního neboli antigeny, proti kterým by byla imunitní odpověď užitečná nebo naopak, proti kterým by působila škodlivě (KVASNIČKOVÁ, 1998). Na základě distribuce a struktury tkání byly antigeny MHC rozděleny do dvou tříd (SHETTY, 2005). B-lymfocyty vytváří na svém povrchu imunoglobuliny (protilátky). Řadí se do pěti tříd: IgG, IgM, IgA, IgE a IgD. Imunoglobuliny (Ig) jsou odpovědné za navázání antigenu, za následující aktivaci buněk a za sekreci imunoglobulinu do séra a tkání. Mají schopnost navázat antigen přímo oproti receptorům T-lymfocytů. Po setkání imunoglobulinu s antigenem dochází k aktivaci B-lymfocytů, které následně zrají v plazmatické buňky zodpovědné za tvorbu a vylučování velkého množství Ig. Některé B-lymfocyty mohou přežívat několik let a označují se jako paměťové buňky B. Vykonávají rychlou odpověď po styku s antigenem, kterého imunitní systém už dříve rozpoznal. Imunoglobuliny jsou glykoproteiny. Jejich strukturu tvoří dvě podjednotky těžkých řetězců označované jako řetězce H (heavy), které navzájem spojuje disulfidový můstek. Na stavbě se podílí také lehký řetězec neboli řetězec L (light). Podjednotky těžkého a lehkého řetězec jsou spolu svázány meziřetězcovou disulfidovou vazbou a následně se tak tvoří komplex čtyř molekul (KVASNIČKOVÁ, 1998). 3.2 Nepříznivé reakce na potravinu Nepříznivé reakce na potraviny se mohou objevit u každého jedince nebo se vyskytují pouze u citlivých jedinců. Reakce, které se vyskytují pouze u citlivých jedinců, jsou výsledkem skutečné fyzické přecitlivělosti na složky potravin nebo jsou podmíněné psychicky (JACKSON, 2003). Nežádoucí reakce na potraviny se rozdělují do dvou skupin: netoxické a toxické reakce. Rozdělení můžeme vidět na obrázku č. 1 (FERENČÍK, 2005). 12

Obr. 1 Přehled nepříznivých (škodlivých) reakcí na potraviny (FERENČÍK, 2005) 3.2.1 Netoxické reakce Netoxické reakce se nevyskytují u zdravých jedinců. Odvíjí se od vrozených dispozic a individuální přecitlivělosti na jednotlivé potraviny. Existují dva typy netoxických reakcí, a to potravinová alergie a potravinová intolerance (GABROVSKÁ, HANÁK, RY- SOVÁ, 2010). 3.2.1.1 Pravá potravinová alergie Přecitlivělá reakce na určitý typ alergenu se nazývá alergie. Imunitní systém reaguje na přítomnost jednoho alergenu nebo jejich skupin a vyvolává zánět nebo disfunkci jednotlivých orgánů. Imunitní odpověď organismu na přítomnost alergenu se označuje jako senzibilizace. Alergen reaguje se specifickou protilátkou nebo senzibilizovaným efektorovým lymfocytem (KVASNIČKOVÁ, 1998). Část molekuly protilátky, která je ve styku s antigenem se nazývá paratop. Úsek molekuly antigenu v kontaktu s paratopem se označuje jako epitop. Antigeny jsou proteiny, v přírodě se vyskytují ve složené trojrozměrné struktuře (SHETTY, 2005). Studie odhadují, že přecitlivělost na potraviny se vyskytuje asi u 2 % dospělých lidí po celém světě a 1 % z toho jsou skutečné potravinové alergie. Výskyt u dětí je vyšší, potravinovou přecitlivělostí trpí 5 8 % dětí a 1 2,5 % mají potravinové alergie (JACKSON, 2003, str. 6). U dospělých je až 60 % všech potravinových alergických reakcí způsobeno křížovými reakcemi mezi potraviny a inhalačními alergeny. Jednotlivé faktory vyvolávající alergie mají velký význam v diagnostice potravinové alergie (WERFEL, 2008). 13

Většina případů potravinové alergie zahrnuje produkci IgE protilátek. Tento typ alergické reakce se označuje jako alergie zprostředkovaná IgE protilátkami a nastává okamžitě po požití potraviny obsahující alergen. Její nejzávažnější formou je anafylaxe. Další mechanismus potravinové alergie je buňkami zprostředkovaná alergie. Rozvíjí se několik hodin až několik dnů po požití potraviny a nazývá se alergie nezprostředkovaná IgE protilátkami. Klíčovým mechanismem je zde interakce buněk a chemických mediátorů, nikoli protilátek. Tyto opožděné reakce se mnohem obtížněji zjišťují a diagnostikují než okamžité reakce (JACKSON, 2003). Coombs a Gell klasifikovali reakce přecitlivělosti do čtyř typů: Typ I: Časná neboli IgE protilátkami zprostředkovaná přecitlivělost Typ II: Cytotoxická reakce Typ III: Přecitlivělost zprostředkovaná imunokoplexy Typ IV: Pozdní neboli buňkami zprostředkovaná přecitlivělost (SHETTY, 2005) Potravinové alergie patří většinou mezi reakce I. typu. Tuto reakci zahájí vznik vazby mezi antigenem a specifickou předem vytvořenou IgE protilátkou navázanou na povrch žírných buněk v tkáních nebo na povrchu bazofilů v krvi (KVASNIČKOVÁ, 1998). Pokud je pacient vystaven alergenu, B-lymfocyty začnou produkovat IgE a proudí po celém těle. Antigen-specifické konce molekuly IgE mají afinitu ke specifické části molekuly antigenu. Druhý neboli receptor-specifický konec molekuly IgE má afinitu k povrchu imunitních buněk včetně žírných buněk. Následně dochází k okamžité IgE zprostředkované alergické reakci. Alergen vytvoří most mezi dvěma přilehlými IgE molekulami na jejich buněčném povrchu. Tím se uvolní hotové chemické mediátory (histamin, cytokiny atd.). Tyto látky a jejich uvolnění způsobí okamžitou zánětlivou reakci, během které se zvyšuje přítok krve do této oblasti a jsou přitahovány další bílé krvinky a komponenty imunitního systému. V důsledku reakce vzniká otok a dochází k zarudnutí doprovázené svěděním. Několik dalších buněk hrají také velmi důležitou roli v okamžité alergické reakci, a to žírné buňky a T-lymfocyty, které uvolňují mediátory stimulující B-lymfocyty k produkci IgE protilátek (JACKSON, 2003). Alergen musí být dostatečně velký a musí mít minimálně dvě vazebná místa pro IgE, aby se mezi ním a alergen-specifickým místem IgE protilátky mohla vytvořit vazba (KVASNIČ- KOVÁ, 1998). 14

Opožděná hypersenzitivita má stejný mechanismus jako buňkami zprostředkovaná imunita. Reakce se objeví po několika hodinách a může trvat až 48 hodin. T-lymfocyty rozpoznávají antigen spolu s molekulami MHC II. třídy a jsou aktivovány, což vede k proliferaci a uvolňování lymfokinů. T8-lymfocyty citlivé na antigen se diferencují na cytotoxické T-lymfocyty, zatímco pomocné T4-lymfocyty se stávají citlivé na antigen a produkují cytokiny. Pokud během reakce nedojde k odstranění antigenu a dále přetrvává, tento přetrvávající antigen vyvolává chronické buňkami zprostředkované reakce přecitlivělosti (SHETTY, 2005). Potravinová alergie je rostoucí problém především v západních zemích. V posledních letech bylo vynaloženo mnoho úsilí, aby došlo k lepšímu pochopení humorálních a buněčných mechanismů potravinové alergie a k lepší strategii pro diagnostiku a léčbu (GOMEZ a kol., 2013). Nedostatek schválených léčeb vedl k přísnému vyloučení alergenních potravin ze stravy jako jediný způsob ochrany alergických osob. V současné době se provádí podrobný výzkum k vyhodnocení možného využití alergen-specifické imunoterapie (SIT) jako účinnou léčebnou možnost pro potravinové alergie (KOSTA- DINOVA a kol., 2013). 3.2.1.2 Pravá potravinová intolerance Potravinová intolerance (nesnášenlivost) patří mezi nežádoucí reakce, které nejsou imunologicky podmíněné. Projevy intolerance jsou různé. Její příčinou bývá obvykle enzymový defekt charakteristický změnou schopnosti organismu normálně metabolizovat některé složky potravin. Potravinovou intoleranci mohou vyvolat i některé dráždivé nebo farmakologicky účinné látky (např. histamin, tyramin, fenyletylamin, serotonin, kofein, theobromin; FERENČÍK, 2005). Nejčastějším příkladem potravinové nesnášenlivosti je intolerance laktózy. Patří mezi metabolické poruchy a je způsobena nedostatkem enzymu laktázy. Enzym laktáza umožňuje trávení mléčného cukru (KVASNIČKOVÁ, 1998). Laktáza štěpí laktózu na glukózu a galaktózu, které jsou absorbovány do krevního řečiště. Pokud se vyskytne deficit laktázy, laktóza zůstává v tlustém střevu, kde je fermentovaná střevními bakteriemi, které produkují plyny včetně oxidu uhličitého a metanu. Jedinci pak trpí nevolnostmi, křečemi v břiše, nadýmáním a průjmy. Přítomnost a závažnost symptomů závisí na množství konzumovaného mléčného cukru a individuálním stupni nedostatku laktázy (JACKSON, 2003). 15

3.2.2 Toxické reakce Příčinou toxických reakcí mohou být látky anorganického nebo organického původu přítomné v potravinách. V případě anorganických látek se jedná o jedy a v případě látek organického původu o toxiny. Tyto látky způsobují otravy neboli intoxikace (FEREN- ČÍK, 2005). Toxické reakce se vyskytují u všech jedinců, kteří přijmou určitou dávku toxické látky (GABROVSKÁ, HANÁK, RYSOVÁ, 2010). Mezi toxické reakce se řadí otravy histaminem. Příčinou otravy jsou většinou zkažené ryby, které patří do čeledi makrelovitých, proto se jí občas říká otrava makrelovitými rybami. Proteolytické bakterie způsobující kažení ryb přeměňují histidin nacházející se v rybí tkáni na histamin. Pokud jedinec přijme velkou dávku histaminu v potravině, projeví se u něj příznaky alergií jako bolest hlavy, křeče v břiše, zarudnutí obličeje atd. (KVASNIČKOVÁ, 1998). 3.3 Projevy potravinové alergie Okamžitou reakci na jednotlivé potraviny lze snadno identifikovat, ale diagnóza nežádoucích účinků objevující se po požití alergenní potraviny je komplikovaná z hlediska možného zapojení mnoha různých potravin a možností zpožděné reakce. Potravinová alergie ovlivňuje mnoho oblastí organismu, zejména gastrointestinální trakt (ústa a střeva), respirační ústrojí (plíce, nosní, krční) a kůži. Příznaky způsobené abnormálními reakcemi na potraviny se řadí do čtyř skupin: příznaky způsobené alergií na potraviny příznaky spojené s potravinovou alergií příznaky, u kterých má potravinová alergie pochybný význam příznaky způsobené nealergickou přecitlivělostí na potraviny (JACKSON, 2003) Potravinová alergie se může projevovat mnoha způsoby. Mezi nejčastější projevy patří kopřivka, svědění kůže, otok, ekzém, alergická rýma nebo astma. Příznaky se mohou objevit i v oblasti očí, kdy oči slzí, otékají víčka nebo dochází k překrvení očí. Alergičtí jedinci po požití alergenní potraviny trpí také průjmy, bolestmi břicha, zvracením nebo dokonce migrénou. Může nastat i situace, kdy se všechny tyto projevy spojí dohromady a nastává nejzávažnější stav, který se nazývá alergický nebo anafylaktický šok. Jedná se o těžkou celkovou reakci organismu, jejíž průběh je velmi rychlý a během několika málo minut může být jedinec i v ohrožení života (DROBNÍK, ŠPIČÁK, 2002). 16

Anafylaktické reakce jsou naštěstí vzácné, ale mají rychlý nástup a mohou být smrtelné jak pro dospělé, tak i pro děti všech věkových kategorií, pokud nejsou ošetření během několika minut. Příznaky zahrnují zúžení dýchacích cest, otok horních cest dýchacích a úst (otok hrtanu, hltanu, jazyk a rty), pokles krevního tlaku a akutní otoky kůže a hlubších tkání (kopřivka a angioedém). Anafylaktický šok doprovází gastrointestinální příznaky včetně nevolnosti, zvracení, průjmu a bolesti břicha. Může dojít také k poruchám močového měchýře a nervového systému. Neposkytnutí rychlého ošetření vede k vážnému poklesu okysličování krve, nepravidelnosti tepu, poškození srdečních svalů a nakonec kardiovaskulární kolaps a smrt. Riziko úmrtí v důsledku těchto reakcí je vyšší u jedinců s astmatem. Ve vyspělých zemích je příčinou anafylaxe nejčastěji alergie na arašídy (JACKSON, 2003). U jedinců s alergií na ovoce a zeleninu se nejčastěji objevuje syndrom orální alergie. Je to alergická reakce na vdechované pyly stromů, trav, plevelů a ambrosie. Jakmile osoba pozře čerstvé ovoce nebo zeleninu, ústa přichází do styku s alergenem a začínají se objevovat symptomy. Jedinec má nepříjemný pocit mravenčení nebo svědění v ústech (rty, jazyk, sliznice). Často také otékají rty. Bez zásahu lékaře příznaky odeznívají během hodiny a půl. Pro gastrointestinální reakce je charakteristické svědění a otok partií okolo úst, nevolnost, zvracení, průjem, snížení vstřebávání a únik krve a proteinu stolicí (KVAS- NIČKOVÁ, 1998). Akutní záchvaty kopřivky a otok tkání pod kůží neboli angioedém se může objevit jako bezprostřední alergická reakce na přijímané potraviny obvykle v kombinaci s gastrointestinálními nebo respiračními příznaky anebo jako součást anafylaktické reakce. Mezi stavy spojené s alergií na potraviny patří celiakie. V tomto případě je tenké střevo poškozeno působením lepku. Lepek je hlavní bílkovina pšenice a strukturně podobné proteiny s podobnými účinky se nacházejí také v žitu, ječmeni a možná i v ovsu. Pacienti musí dodržovat bezlepkovou dietu. Mezi další stavy spojené s alergií se řadí také eozinofilní gastroenteritida (zanícení střevních stěn), rinitida a jiné respirační onemocnění. Příznaky, u kterých význam potravinové alergie není zcela objasněn, jsou syndrom dráždivého tračníku, migréna a občas poruchy chování v dětství (JACKSON, 2003). 17

Potravinová alergie není statický stav. Někdy se rozvíjí v pozdějších letech života nebo může přirozeně odeznít v průběhu času. V mnoha případech je to však stav celoživotní (HENGEL, 2011). Alergii na mléko, vejce, pšenici a sóju u dětí většinou odeznívá, alergie na arašídy, ořechy, ryby, měkkýše a korýše jsou často celoživotní (SZÉP- FALUSI, EIWEGGER, 2009). Reaktivita vůči alergenním potravinám se liší v závislosti na pacientovi. V současné době je jediná osvědčená léčba potravinové alergie striktní dieta. Lidé trpící potravinovou alergií potřebují vědět, zda potraviny, které koupí, neobsahují složky vyvolávající alergické reakce (HENGEL, 2011). 3.4 Potravinové alergeny Nyní je známo téměř 1500 alergenních struktur. Přestože je číslo známých alergenů vysoké, informativní analýzy ukazují, že patří pouze mezi malou menšinu známých proteinových skupin. Alergenní potraviny mohou být kontaminovány mnoha rozlišnými alergeny, které občas patří do rozdílných proteinových skupin. V důsledku toho bylo podle legislativy nařízeno zavedení povinného uvedení nejdůležitějších alergenních složek na etiketě potravin. V roce 1993 Codex Alimentarius Commission přijalo doporučení vytvořené Codex Committee o označování potravin (HENGEL, 2011). Alergeny se vyznačují svými fyzikálně chemickými skladbami, antigenními vlastnostmi a biologickým účinkem. Průběh senzibilizace ovlivňuje množství alergenu působící na jedince, cesta, kterou alergen vstupuje do organismu a délka působení antigenu. Rozlišujeme alergeny hlavní a vedlejší (ŠPIČÁK, VONDRA, 1988). Alergeny se označují na základě latinského názvu rodu, ze kterého pochází. Název je složen z prvních třech písmen rodu, následuje první písmeno druhu a končí arabskou číslicí, např. Ara h 1 je alergen rostliny Arachis hypogea (podzemnice olejná). Čísla určují pořadí, ve kterém byly alergeny identifikovány a jsou společné pro všechny homologické alergeny (isoalergeny) příbuzných druhů. Bylo zjištěno, že u potravinových alergenů rostlinného původu převládají tři hlavní rodiny proteinů: prolaminy, kupiny a Bet v 1, které spolu s profiliny představují více než 65 % všech potravinových alergenů rostlinného původu. Tropomyosiny, parvalbuminy a kaseiny jsou dominantní proteiny potravinových alergenů živočišného původu (MILLS a kol., 2009). 18

Je známo, že převážnou většinu potravinových alergií vyvolává osm hlavních skupin potravin. Jedná se o mléko, vejce, ryby, korýše, burské oříšky, sóju, ořechy a pšenici. Čerstvé ovoce a zelenina obsahují také alergeny, ale zpracováním a tepelnou úpravou se většinou ničí. Hojnost výskytu potravinových alergií je v každé zemi jiná. Odvíjí se od toho, v jaké míře se určitá potravina konzumuje a v jakém věku se začne konzumovat (KVASNIČKOVÁ, 1998). Například ve skandinávských zemích jsou dominantní skupinou vyvolávající alergické reakce ryby (39 %). Ve Spojených státech lidé nejčastěji trpí alergií na mléko (65 %), čokoládu (45 %), arašídy (33 %) atd. Ve Francii má prvenství alergie na vaječný bílek (46,3 %), dále jsou to pak arašídy (40 %), hořčice (20 %) a kravské mléko (7,5 %). V Asii největší počet alergických reakcí vyvolávají některé méně konzumované alergenní potraviny jako je pohanka, kaštany, cizrna a mateří kašička. Také korýši a měkkýši jsou v Asii důležité ve srovnání s jinými běžnými alergenními potravinami. Naopak výskyt alergií na arašídy je zde poměrně nízký (JEDRYCHOWSKI, 2010). U některých jedinců se objeví závažné reakce po vystavení velmi nízkým dávkám alergenu, zatímco jiní mají méně závažné reakce po vystavení mnoha vyšším dávkám. Tato variabilita je obtížná ke stanovení nejnižší dávky alergenu, která pravděpodobně vyvolává nežádoucí účinky. Nejlepší odhady prahových dávek pro alergiky na základě experimentálních výsledků odpovídají u vejce 10 190 mg ovalbuminu, u kravského mléka 1 mg až 6 g bílkovin, u arašídů od 50 do 100 mg proteinu (JACKSON, 2003). 3.4.1 Seznam alergenů v potravinách Vzhledem k nevyhovující situaci se vyvinul tlak ze strany organizací pacientů a odborníků na alergeny na vydání prohlášení a kontrolu obsahu možných alergenních složek v potravinách. Povinné provádění kontrol a označování potravin stanovuje legislativa Evropské unie, a to směrnice Evropského parlamentu a Rady 2000/13/ES a 2003/89/ES a směrnice Evropské komise 2005/26/ES a 2006/142/ES (GABROVSKÁ, HANÁK, RYSOVÁ, 2010). Seznam všech alergenních složek je uveden ve Vyhlášce č. 113/2005 Sb. Vyhláška stanovuje tyto alergenní složky: obiloviny obsahující lepek (pšenice, ječmen, oves, žito, pšenice špalda, kamut nebo jejich hybridní odrůdy) a výrobky z nich korýši a výrobky z nich 19

vejce a výrobky z nich ryby a výrobky z nich jádra podzemnice olejné (arašídy) a výrobky z nich sójové boby (sója) a výrobky z nich s výjimkou zcela rafinovaného sójového oleje a tuku mléko a výrobky z něj (včetně laktózy) suché skořápkové plody, tj. madle, lískové ořechy, vlašské ořechy, kešu ořechy, pekanové ořechy, para ořechy, pistácie, ořechy makadamie a queensland a výrobky z nich celer a výrobky z něj hořčice a výrobky z ní sezamová semena (sezam) a výrobky z nich oxid siřičitý a siřičitany v koncentracích vyšších než 10 mg/kg, vyjádřeno jako SO 2 měkkýši a výrobky z nich vlčí bob (lupina) a výrobky z nich (ANONYM, 2005) 3.4.2 Nejčastěji vyskytující se alergeny v potravinách Klinické studie ve Velké Británii, Evropě a Severní Americe naznačují, že relativně malý počet potravin a potravinářských výrobků jsou zodpovědné za většinu případů potravinové alergie. Přibližné pořadí četnosti alergenních potravin je následující: u dětí: kravské mléko, vejce, sója, arašídy, ořechy, ryby a korýši u dospělých: arašídy, ořechy, korýši, ryby a vejce (JACKSON, 2003) 3.4.2.1 Kravské mléko Na alergeny kravského mléka jsou alergické nejen děti, ale i dospělí lidé. Tyto alergeny vyvolávají akutní alergické reakce včetně anafylaktického šoku a příčinou některých alergenů mléka může být i vznik chronických alergických onemocnění (GABROVSKÁ, HANÁK, RYSOVÁ, 2010). V jedné srovnávací studii bylo zjištěno, že se prevalence u dětí pohybuje mezi 0,8 a 2,8 % a u dospělých mezi 0,3 a 3 %. Nicméně, výskyt alergií na mléko je silně závislá na věku pacientů. Jedním z důvodů, proč je alergie na kravské mléko nejvyšší u dětí, je brzké zavedení mléka do stravy kojenců, kdy kojení již není možné. 20

Kravské mléko obsahuje mnoho proteinů, které jsou považovány za antigenní a způsobují alergické reakce. 3 3,5 % přítomného proteinu v mléce se rozděluje do dvou hlavních skupin: kaseiny (80 %) a syrovátkové bílkoviny (20 %). Mezi hlavní alergické komponenty syrovátkové frakce patří globulární proteiny β-laktoglobulin a α- laktalbumin, následuje menší množství hovězího sérového albuminu, laktoferinu a imunoglobulinu. Již v minulosti studie naznačila, že β-laktoglobulin, α-laktalbumin a kasein byly hlavními alergeny kravského mléka. Mléčné alergeny jsou klasifikovány pomocí následujícího názvosloví: Bos d (Bos domesticus) a číslo, které udává pořadí, ve kterém byl alergen identifikován. Seznam hlavních alergenů je uveden v tabulce č. 1. Bos d 1 3, jako inhalační alergeny, nejsou považovány za alergeny, protože nejsou zapojeny do potravinové alergie (STEINHOFF, PASCHKE-KRATZIN, 2011). Lidské mléko neobsahuje β-laktoglobulin podobně jako velbloudí mléko. Naopak β-laktoglobulin je hlavní syrovátkový protein kravského, buvolího, oslího mléka a mléka ovcí, koz a klisen. Kaseiny vyskytující se v mléce různých druhů se liší pořadím frakce, složením aminokyselin, peptidů a jejich mapováním (EL-AGAMY, 2007). Tab. 1 Alergeny kravského mléka (upraveno dle STEINHOFF, PASCHKE-KRATZIN, 2011) Bílkoviny kravského mléka (100%) Protein Názvosloví α S1 -kasein Bos d 8 α S2 -kasein β-kasein Kaseiny (80%) γ 1 -kasein γ 2 -kasein γ 3 -kasein κ-kasein α-laktalbumin Bos d 4 β-laktoglobulin Bos d 5 Syrovátkové bílkoviny (20%) imunoglobuliny Bos d 7 hovězí sérový albumin Bos d 6 laktoferin α-laktalbumin je monomerní protein složený ze 123 aminokyselinových zbytků a spojený čtyřmi disulfidovými můstky. Jeho molekulární hmotnost je 14,4 kda. β- 21

laktoglobulin se přirozeně vyskytuje ve formě dimeru o molekulární hmotnosti 36 kda, přičemž každá podjednotka odpovídá polypeptidu složeného ze 162 aminokyselin se dvěma disulfidovými můstky a jedním volným cysteinem. Na stavbě kaseinu se podílí čtyři různé proteiny, a to α s1 -, α s2 -, β- a κ-kasein v průměrných hodnotách 40 %, 10 %, 40 % a 10 % (STEINHOFF, PASCHKE-KRATZIN, 2011). Kaseiny jako známé fosfoproteiny se dají ze syrového odstředěného mléka vysrážet okyselením na ph 4,6 při teplotě 20 C. Syrovátkové bílkoviny po vysrážení kaseinu zůstávají v séru (KVAS- NIČKOVÁ, 1998). Plasmin, nativní proteáza mléka, štěpí β-kasein a generuje fragmenty γ-kaseinu. Mléko obsahuje pouze stopové množství γ-kaseinů, zatímco proteolytické zrající sýry obsahují hojné množství γ-kaseinů. V některých studiích bylo zjištěno, že β- laktoglobulin je frakce s největším senzibilizačním potenciálem, zatímco frakce α- laktalbumin dává slabší pozitivní reakci. Kasein je nejméně senzibilizující frakcí. Tento názor nebyl zcela potvrzen, jelikož citlivost na jednotlivé mléčné bílkoviny je různá (STEINHOFF, PASCHKE-KRATZIN, 2011). Albuminy jsou hlavní proteiny plazmy. Mohou vázat vodu, kationty, mastné kyseliny, hormony a bilirubin. Jejich hlavní funkcí je schopnost regulovat koloidní osmotický tlak krve. Sérové albuminy mají trojrozměrnou strukturu, každá ze tří homologních domén obsahuje pět nebo šest disulfidových vazeb. Hovězí sérový albumin označovaný také jako Bos d 6, i když je v mléce přítomný jen v malých množstvích, vyvolává až 50 % alergických reakcí (BREITENEDER, 2006). Kasein je stabilnější než syrovátkové proteiny, a to především vůči tepelné úpravě a vlastnímu trávení. Nachází se v živočišných neupravovaných mlécích, sýrech a v dalších mléčných výrobcích, proto se nyní ve výživě využívá mnohem více. Jelikož má jeho molekula lineární charakter, lidé jsou na něj alergičtí celý život (FUCHS, 2007). Reaktivita mezi bílkovinami kravského mléka a bílkovinami jiných druhů mléka závisí na fylogenetických vztazích. Nejvyšší homologie je dokázána mezi bílkovinami mléka krav a jinými zástupci turovitých (např. buvol). Bílkoviny mléka ovcí a koz mají méně výraznou shodnost s bílkovinami kravského mléka. Sójové mléko a mléko klisen byly prohlášeny jako nejlepší alternativa pro pacienty s alergií na kravské mléko (STEINHOFF, PASCHKE-KRATZIN, 2011). Prahová dávka alergenní mléčné bílkoviny ke spuštění sensibilizace není přesně známa. Přecitlivělost na alergeny kravského mléka se může objevit i u kojenců, kteří jsou krmeni mateřským mlékem. Příznaky alergie u některých citlivých jedinců vyvolá- 22

vá již stopové množství mléčné bílkoviny v technologicky zpracovaných potravinách (KVASNIČKOVÁ, 1998). Alergeny kravského mléka mohou způsobovat nevolnost, zvracení, odmítání stravy, plynatost a krev ve stolici. Objevují se také kopřivkovité vyrážky či otoky podkoží. U některých dětí se sledují i poruchy chování (FUCHS, 2007). 3.4.2.2 Vejce Vejce je tvořeno bílkem a žloutkem. Bílek představuje 56 61 % obsahu vejce a žloutek je zastoupen z 27 32 %. Ultrafiltrací lze ze žloutku získat dvě frakce, a to frakci granulí a plazmu. Mezi alergeny vajec patří ovalbumin (Gal d 2), ovomukoid (Gal d 1), ovotransferrin (Gal d 3), apoviteliny, ovomucin, lysozym (Gal d 4), α-livetin (Gal d 5) a fosvitin (KVASNIČKOVÁ, 1998). Zatímco vaječný bílek je považován za hlavní zdroj alergenů, některé alergeny se nachází také ve žloutku. Prahová dávka proteinu vyvolávající nežádoucí reakce u alergických jedinců se pohybuje od 0,2 do 200 mg bílkovin. Příznaky alergie na vejce vykazují velkou rozmanitost a u každého jedince se velmi liší (BAUMGARTNER, SCHUBERT-ULLRICH, 2010). Chemické složení slepičích vajec bylo značně zkoumáno. Alergenicita proteinů bílku je různá. Bylo zjištěno, že nejvíce alergenní protein v syrových a vařených vejcích je ovomukoid. Později však studie dokázala, že hlavními alergeny vajec jsou vaječný albumin a ovotransferrin (STEINHOFF, PASCHKE-KRATZIN, 2011). Ovomukoid působí jako inhibitor serinových proteáz. Jedná se o vysoce glykosylovaný protein s molekulovou hmostností 28 kda obsahující 20 25 % sacharidů. Ovomukoid se skládá ze 186 aminokyselin, které jsou uspořádány ve třech oblastech (DI, DII, DIII). Každá doména je spojena třemi disulfidovými vazbami. Tato struktura může být zodpovědná za větší stabilitu ovomukoidu vůči proteolýze a působení tepla. Třetí doména (DIII) vykazuje podstatně větší IgG a IgE vazebnou aktivitu než první a druhá oblast ovomukoidu. Ovalbumin je hlavní protein vaječného bílku a byl jedním z prvních proteinů, které byly izolovány v čisté formě. Jeho snadná dostupnost vedla k širokému využití ovalbuminu jako standardu při studiu struktury a vlastností proteinů a v experimentálních modelech alergie. I když pravděpodobně patří k nejvíce studovaným antigenům v imunologii, jeho funkce je stále neznámá. Ovalbumin je glykoprotein s relativní molekulovou hmotností 45 kda. Nemá žádnou inhibiční aktivitu vůči proteázám. Aminokyselinová 23

sekvence obsahuje 386 aminokyselin a amino konec proteinu je acetylovaný. Skladování vajec vede ke konformační změně ovalbuminu na více tepelně stabilní formu tzv. "Sovalbumin" a snižuje se tak jeho výživová hodnota. Ovotransferrin tvoří přibližně 12 13 % bílkovin vaječného bílku a má relativní molekulovou hmotnost 77 kda. Vykazuje nízký obsah sacharidů. Ve srovnání s ovomukoidem a ovalbuminem je jeho alergenicita nižší. Vzhledem ke své schopnosti vázat železo se podílí na transportu železa. Má antimikrobiální a antivirové vlastnosti. Ovotransferrin je relativně stabilní. Lysozym představuje pouze 3,5 % z celkového obsahu bílkovin vaječného bílku. Má relativní molekulovou hmotnost 14 kda. Je méně alergenní v porovnání s ovotrasnferrinem. Lysozym hraje důležitou roli v obraně proti bakteriální infekci vejce. Je dobře známý pro své antibakteriální vlastnosti, ale vykazuje také antivirovou, protinádorovou a imunomodulační aktivitu. Zvýšená stabilita lysozymu, např. proti proteolýze, může snižovat jeho alergenní potenciál. Lysozym se používá pro konzervaci potravin a má využití i ve farmaceutickém průmyslu. Sérový albumin přítomný ve vaječném bílku a α-livetin nacházející se ve vaječném žloutku jsou totožné. Sérový albumin má schopnost vázat vodu, vápník, sodík, draslík, mastné kyseliny, hormony a bilirubin. Je také zodpovědný za regulaci osmotického krevního tlaku. α-livetin má relativní molekulovou hmotnost 70 kda. Protein se skládá ze tří homologních domén, z domény I s 8 183 aminokyselinami, z domény II tvořené 202 375 aminokyselinami a domény III s 394 573 aminokyselinami. α-livetin je považován za nejvýznamnější alergen vyvolávající senzibilizaci inhalační cestou. Existují další dva livetiny, β-livetin s molekulovou hmotností 42 kda a γ-livetin s molekulovou hmotností 150 kda. Tyto dva livetiny hrají zanedbatelnou roli alergii na vejce. Ovomucin je silně glykosylovaný protein s obsahem sacharidů až 33 %. Liší se tím od ostatních vaječných bílkovin, jelikož je jeho molekula velmi velká. Tvoří 3,5 % bílkovin bílku. Obsahuje podstatné množství disulfidových skupin, etheru síranu, velké množství cystinu a 50 % z celkového obsahu kyseliny sialové ve vaječném bílku. Ve vaječném bílku se nachází dvě formy ovomucinu. Pro nerozpustnou formu je charakteristická vysoká viskozita, čímž získává antivirovou aktivitu. Alergenní potenciál ovomucinu je považován za menší v porovnání s hlavními alergeny. Ovomucin nebyl ve většině studií nalezen jako alergen. Může to být způsobeno tím, že mnoho extrakčních 24

postupů pro přípravu proteinů zahrnuje dialýzu a odstřeďování (BAUMGARTNER, SCHUBERT-ULLRICH, 2010). Bílkoviny vajec mohou způsobovat u alergických jedinců i vážné celkové reakce včetně anafylaxe. Pacienti často přehlédnou složení potravin a neuvědomují si závažnost skryté alergie. U alergie na vejce není možné ve výživě nahrazovat drůbeží vejce vejci jiných ptáků. Často se jako možná alternativa nabízí křepelčí vejce, ale ani tato varianta není vhodná. Při pečení můžeme vejce nahradit např. práškem do pečiva, želatinou, droždím, pudinkovým práškem, bramborovým škrobem atd. (FUCHS, 2007). 3.4.2.3 Obiloviny Pšenice, žito, ječmen, oves a rýže mohou vyvolat potravinové alergie po požití nebo vdechování prachu z těchto obilovin. Tyto alergické reakce nejčastěji vyvolává pšenice. Hlavní alergenní proteiny obilovin patří do skupiny prolaminů, která zahrnuje hlavní zásobní proteiny zrna (s výjimkou ovsa a rýže) a několik nízkomolekulárních bílkovin bohatých na cystein. Prostřednictvím další klasifikace se tyto alergeny dělí do dvou skupin, a to na α-amyláza/proteáza inhibitory a obilné prolaminy. α-amylázy se nacházejí ve většině obilovin jako monomery nebo polymery vytvořené z malých podjednotek (12-16 kda). Tetramerní CM16 inhibitory pšenice, homologní CMB inhibitor ječmene a α-amyláza/trypsin inhibitory, Sec c 1, RDAI-1, a RDAI-3 žita jsou některé další reprezentativní alergenní proteiny této rodiny prolaminů. Prolaminy se podílí také na tvorbě glutenu pšeničné mouky (KIZIS, SIRAGAKIS, 2011). Označení CM vzniklo na základě rozpustnosti těchto proteinů ve směsi chloroformu a metanolu (BREITENEDER, 2006). Diagnostika alergií na pšenici je komplikována nízkou rozpustností prolaminů ve zředěných roztocích solí běžně používaných v klinické diagnostice, což může znamenat, že alergie na obiloviny může zůstat nediagnostikována. Prolaminy mohou vyvolat alergii na obiloviny. Způsobují atopickou dermatitidu a vážný anafylaktický šok. Tuto reakci spouštějí α-, γ-, ω-5-gliadiny. Mezi další pšeničné alergeny patří nespecifické proteiny pro přenos lipidů (LTP; MILLS a kol., 2009). LTP jsou monomerní proteiny s nízkou molekulovou hmotností (7 9 kda). Jsou schopny katalyzovat přenos lipidů mezi liposomy a membránami in vitro a přibývají důkazy o tom, že hrají roli v biosyntéze kutinu. LTP se obvykle hromadí ve vnějších epidermálních vrstvách rostlinných orgánů a jsou tvořeny ze svazku čtyř α-šroubovic s lipidovou dutinou ve středu. Mezi jejich vlastnosti patří odolnost vůči změnám ph a 25

tepelné úpravy a po zchlazení mohou znovu vytvořit původní strukturu α-šroubovice. LTP jsou potenciálně závažné alergeny potravin z důvodu jejich vysoké odolnosti vůči trávení pepsinem (BREITENEDER, 2006). Endosperm zrna pšenice obsahuje 8 12 % proteinů. Tyto proteiny jsou rozděleny do dvou skupin: proteiny netvořící lepek (15 20 %) a proteiny lepku, které tvoří asi 80 až 85 % všech proteinů. Proteiny, které nepatří mezi proteiny lepku, jsou považovány za rozpustné ve zředěných roztocích solí. Jedná se o albuminy (rozpustné ve vodě) a globuliny (nerozpustné ve vodě). Lepek se získává vypíráním rozpustných sloučenin a škrobových zrn z pšeničného těsta, které se skládá ze 75 85 % bílkovin, 5 10 % lipidů a sacharidů. Lepek je nebezpečný pro jedince trpící celiakií. U těchto pacientů způsobuje zánětlivé změny sliznice tenkého střeva. Proteiny tvořící lepek jsou nerozpustné v solných roztocích. Jde o gliadiny (Tri a 19) a gluteniny (Tri a 26). Vysoký obsah glutaminu, prolinu a fenylalaninu je charakteristický pro ω-gliadin a tvoří asi 80 % těchto proteinů. Typy ω-1-, ω-2- (tzv. pomalé) a ω-5-gliadiny (tzv. rychlé) se od sebe liší molekulovou hmotností. Kromě několika výjimek obsahují α- a β-gliadiny šest zbytků cysteinu, zatímco γ-gliadin má cysteinových zbytků osm a tvoří tři nebo čtyři intracelulární disulfidové vazby. Gluteniny jsou agregované pšeničné proteiny vázané mezimolekulárními disulfidovými můstky, které vytvářejí polymery o molekulové hmotnosti od 500 do 10 000 kda. Jsou to největší známé proteiny v přírodě. Podjednotky gluteninů byly podle molekulové hmotnosti rozděleny do dvou skupin, a to na gluteniny s nízkou molekulovou hmotnosti (LMW) a s vysokou molekulovou hmotností (HMW). LMW gluteninové podjednotky jsou dominantní frakcí pšeničného proteinu a tvoří asi 20 % všech bílkovin lepku. Z hlediska molekulové hmotnosti, obsahu aminokyselin a struktury gluteninu odpovídají α, β- a γ-gliadinům. Proteinů netvořící lepek je známo téměř 70, ale jen málo z nich je molekulárně charakterizováno (LESZCZYNSKA, 2010). Jako náhrada obilné mouky se využívá amarant laskavec, pohanka, bramborový škrob (vláknina), sójová mouka a jablečná vláknina. Lepkové i nelepkové obiloviny zahrnují také panalergeny. Panalergeny jsou bílkoviny s ubikvitérním výskytem v celé živočišné nebo rostlinné říši. Patří sem Bet v 2 homologní bílkoviny (např. Tri a 12, Sec c 12, Hor v 12, Zea m 12) a již zmiňované tepelně odolné LTP proteiny (např. Tri a LTP, Hor v LTP, Zea m 14, Ory s LTP). Další alergeny obilovin můžeme vidět v tabulce č. 2 (FUCHS, 2007). 26

Tab. 2 Bílkoviny obilovin s enzymatickou aktivitou (FUCHS, 2007) potravina expanziny pektinázy, α- a β-amylázy, ribonukleázy amyláza/trypsin inhibitory pšenice Tri a 1 Tri a 4 Tri a aa/ti žito Sec c 1 Sec c 4, Sec c 5 ječmen Hor v 1 Hor v 4, Hor v 5 Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17 oves Ave s 1 Ave s 4 rýže Ory s 1 Ory s aa/ti kukuřice Zea m 1 Zea m 4 3.4.2.4 Sója Alergie na sóju patří mezi časté potravinové alergie, zejména u kojenců a dětí. Prevalence u dětí se pohybuje okolo 0,4 %. Studie ukazují, že alergie na sóju se obvykle vyskytuje v raném dětství a odeznívá ve věku tří let. Alergické reakce u citlivých jedinců na sóju mají převážně mírný charakter, ale vzácně může dojít i k anafylaxi. Sója se může nacházet i v rostlinných gumách, rostlinném škrobu, v pokrmech asijské kuchyně a zeleninovém vývaru (SAVAGE a kol., 2010). Sója je jedním ze zástupců luštěnin a patří do čeledi Fabaceae. Obsahuje mnoho bílkovin a podstatných stopových prvků. Vzhledem ke své nutriční hodnotě se využívá v lidské stravě ve většině částí světa. Bohužel v převážné většině luštěnin byly identifikovány IgE vazebné proteiny (WERMA a kol., 2013). Sója je také bohatým zdrojem polynenasycených mastných kyselin, ale při její nadměrné konzumaci jsme vystaveni nežádoucímu působení fytátů, fytoestrogenů atd. Mezi vegetariány je sója velice oblíbená, ale alergologové z ní už tolik nadšení nejsou, jelikož má vysoký alergenní potenciál (FUCHS, 2007). Sójové boby se používají pro výrobu stále většího počtu různých výrobků. Mezi typické výrobky patří sójový šrot, sójová mouka, sójové mléko, sójová pasta, sójová omáčka, sójový olej, sójový lecitin, tofu, miso, tempeh, rostlinné bílkoviny pro vegetariánské potraviny, výrobky na bázi sóji pro kojeneckou výživu. Sójové boby mají uplatnění nejen v potravinářském průmyslu. Vyrábí se z nich oleje, mýdla, kosmetické přípravky, pryskyřice, plasty, barvy, pastelky, rozpouštědla a oblečení (FAESTE, 2011). Hlavními bílkovinami sóji jsou globuliny, které se odstřeďováním rozdělují na 2S, 7S, 11S a 15S frakce. Ke studiu těchto proteinů se využívá systém popisující jednotlivé 27

frakce. 2S frakce se liší od sójového trypsinového inhibitoru a nazývá se α-konglycinin. 7S frakce byla izolovaná metodou dle Roberta a Briggse nebo metodou podle Koshiyama a Iguchiho. V prvním případě se jedná o β-konglycinin (vicilin) a v druhém případě o γ-konglycinin. Frakce 11S je označovaná jako glycinin a 15S frakci tvoří především polymery glycininu. Protein sóji obsahuje převážně β-konglycinin a glycinin, a to ze 70 80 % (KVASNIČKOVÁ, 1998). Mezi hlavní alergeny sóji patří Gly m 1 a Gly m 2, profilin Gly m 3 a Gly m 4 označovaný také jako Kunitzův inhibitor trypsinu. Podle testů krve provedených u pacientů trpících alergií na sóju se zjistilo, že citlivost na glycinin a Gly m 1 se pohybuje okolo 90 %, na Kunitz-inhibitor trypsinu 86 %, a na profilin (Gly m 3) bylo citlivých 69 % testovaných jedinců. Gly m Bd 30 K je monomerní nerozpustný glykoprotein sestávající z 257 aminokyselinových zbytků spojených disulfidovými vazbami ve frakci proteinu 7S globulinu. Glykoprotein Gly m Bd 28 K (vicilin) byl původně nalezen jako polypeptid s molekulovou hmotností 28 kd. Dva hlavní zásobní globuliny, β-konglycinin (7S) někdy označovaný jako Gly m Bd 60 K a glycinin (11S) mají stejnou strukturu v podobě β- barelu, která je charakteristická pro proteiny patřící do rodiny kupinů (BAUMGARTNER, SCHU- BERT-ULLRICH, 2010). Termín kupin pochází z latinského slova Cupa neboli sud. Tyto proteiny byly rozděleny do dvou skupin, na kupiny obsahující jednu kupinovou doménu a na kupiny obsahující domény dvě. Mezi kupiny, jejichž strukturu tvoří dvě domény, patří 7S a 11S globulární zásobní bílkoviny (BREITENEDER, 2006). Kromě toho, že 11S a 7S globuliny sóji mají dvě strukturálně odpovídající N- terminální a C-terminální domény, struktura každé domény se skládá z β-barelu a následuje oblast α-šroubovice. Ačkoli jsou si 11S a 7S globuliny velice podobné, jejich trojrozměrné struktury vykazují podobnost kolem 35 45 %. 11S globuliny jsou hexamerní proteiny s molekulovou hmotností 360 kda, přičemž každá podjednotka obsahuje polypeptid o 30 40 kda, který je disulfidem navázaný na základní polypeptid o 20 kda. 7S globuliny jsou obvykle trimerní proteiny a mají molekulovou hmotnost 150 190 kda. Molekulová hmotnost jejich podjednotky se pohybuje v rozmezí od 40 do 80 kda. Na rozdíl od 11S globulinů jsou 7S globuliny často glykosylované (BAUMGARTNER, SCHUBERT-ULLRICH, 2010). Ostatní členové kupin rodiny 28