Genomika hospodářských zvířat

Genomika hospodářských zvířat 1

Mapování QTL pomocí vazbové nerovnováhy Linkage Disequilibrium (LD) 3

Mapování QTL pomocí vazbové nerovnováhy založeno na existenci LD mezi QTL a markerem v náhodně se pářící populaci. Z efektu testovaného markeru na fenotypový znak usuzujeme na přítomnost a efekt QTL. 4

Faktory ovlivňující vznik a degradaci LD v populaci IBD, Identity By Descends Úsek chromozómu se shodnými alelami (haplotyp), jaké měl předek, u kterého vznikla příčinná mutace ovlivňující variabilitu užitkového znaku. Je potomkům předáván bez rekombinace. 5

LD je kontinuálně erodována rekombinací Úplná LD Mapová vzdálenost Není LD 7

Faktory ovlivňující velikost a rozsah LD v populaci DŮLEŽITÉ Náhodný posun (random drift) U populací s relativně malým počtem jedinců ovlivňuje frekvence alel a holotypů. Čím je menší Ne populace tím větší je efekt driftu (viz výše). 8

Faktory ovlivňující velikost a rozsah LD v populaci DŮLEŽITÉ Selekce Vliv selekce na LD závisí na směru, intenzitě a délce trvání selekce. Selekce redukuje genetickou variabilitu v následující generaci a produkuje negativní LD mezi lokusy. Když je selekce aplikovaná na určitý lokus, sousední lokusy, které jsou s tímto lokusem v LD budou mít zvýšenou LD. Tzv. hitchhiking efekt. 9

Faktory ovlivňující velikost a rozsah LD v populaci DŮLEŽITÉ Křížení Tvoří nové falešné LD mezi lokusy, které dříve nebyly v LD v původních populacích a mění rozsah LD pro lokusy které byly v LD v původních populacích. Tyto falešné LD se rychle ztrácejí v následujících generacích. 10

Hlavní faktory ovlivňující LD u hospodářských zvířat DŮLEŽITÉ V populacích hospodářských zvířat je pro LD rozhodující velikost populace. Efektivní velikost populace je u většiny hospodářských zvířat malá, a proto je rozsah LD velký!!! 11

Efektivní velikost populace N e je počet jedinců, který zapříčiní stejný přírůstek inbreedingu, jako kdyby se rozmnožovali jako ideální populace. Jinak: máme velkou populaci, která není ideální, např. je v ní větší počet samců. V ní je přírůstek inbreedingu stejný, jako v menší populaci, která je ideální. stejný počet samců a samic N e = 1 2 F N e N nestejný počet samců a samic N e = 4 N m N f N m + N f Tato metoda je založena na analýze poměru pohlaví, existuje více metod. 12

Run of Homozygosity ROH DŮLEŽITÉ Inbreeding koeficient F je pravděpodobnost, že na náhodně vybraném lokusu v populaci je pár alel identic by descent, IBD. F se obvykle počítá z rodokmenu, pravděpodobnost že pár alel je IBD je odhadována statisticky. S použitím high-density SNP analýzy může být míra inbreedingu pro populaci určena, i když není rodokmen k dispozici. Skutečná hodnota inbreedingu pro jedince může být vypočtena z celogenomové sekvence. Dva postupy: 1/ testování markerů identických by state IBS 2/ runs of homozygosity ROH 13

Run of Homozygosity ROH ROH jsou úseky DNA s nepřerušenými úseky lokusů, které jsou homozygotní u jedince, ale polymorfní v populaci. Samozřejmě, to nemusí znamenat, že každý takový úsek zdědil jedinec od společného předka bez rekombinace. Nicméně, i když ROH může vzniknout z různých důvodů, předpokládá se, že hlavním důvodem je inbreeding. Pro jedince platí, že koeficient inbreedingu je podíl genomu, který je identical by descent, IBD, což lze určit z analýzy run of homozygosity, ROH. 14

Inbrední deprese Studie z poslední doby ukazují následující. Nebyl zjištěn efekt druhu, ale populace (plemene). Tj. deprese závisí více na frekvencích alel segregujících uvnitř plemen, než na fyziologických specifikách druhů. U hosp. zvířat jakákoliv selektovaná vlastnost může být postižena inbrední depresí. 16

Inbrední deprese Drůbež Produkční systémy jsou založeny téměř výhradně na křížení. Inbreedingová deprese může být z ekonomického hlediska pominuta. Mléčný skot Vět. čistokrevná plemena. Proto deprese musí být pod kontrolou. U ostatních druhů je situace intermediární. 17

Inbrední deprese U produkce mléka se odhaduje pokles 0,37% na 1% inbreedingu. U holštýna je roční přírůstek inbreedingu ca 0,12%, tj. za generaci 0,6% při generačním intervalu 5 let. Potom, je-li roční genetický zisk u holštýna ca 100 kg mléka na laktaci, tj. 1% současného fenotypového průměru 10 tis. kg. Inbrední deprese za rok potom odpovídá 0,044% fenotypového průměru, to je 4,4% genetického zisku. To sice není mnoho pro jednu vlastnost, ale počítáme-li s depresí i u ostatních vlastností, je ekonomický význam nepochybný. 18

DNA chips, DNA microarrays 20

Získání DNA Kontrola kvality Celogenomová amplifikace Fragmentace Hybridisace Scan Softwarová analýza Data 21

Funguje na principu alelově specifické hybridizace T C T C C 23

Řada aplikací. Nás zajímá zvl. identifikace alel SNP. Následné využití při genotypizaci, forenzní analýze, odhadu predispozice k chorobám, identifikaci mutací v zárodečných liniích, somatických mutací v nádorech. Pro naše účely je důležitá genotypizace alel SNP a následná analýza vazbové nerovnováhy. 24

Často se používají čipy fy Illumina (říjen 2016): Bovinní SNP čipy: BovineLD Genotyping BeadChip: 7 931 SNPs BovineSNP50 v3 DNA Analysis BeadChip: 53 714 SNPs BovineHD DNA Analysis Kit: 777 962 SNPs Sekvenační technologie: TruSeq Bovine Parentage Sequencing: panel 200 ISAGem doporučených SNPs pro parentitu plus 66 SNP asociovaných s recesivními dědičnými chorobami Prase: PorcineSNP60 DNA Analysis Kit v2: 64 232 SNP 25

Genomová selekce 27

Cíl šlechtění Genetický zisk = ekonomický zisk Výběr jedinců dle genetického, nikoli dle fenotypového založení

Fenotyp = genotyp + prostředí Chovatel Výživa Užitkovost Genetika (5-40 %) Prostředí Náhodné vlivy

Plemenná hodnota Odhad genetického založení jedince pro odchylku v užitkové vlastnosti od průměru vrstevníků Aditivní účinek genů Zohlednění příbuznosti všech jedinců vstupujících do modelu RPH PH převedeny na průměr

Plemenná hodnota otec matka polosourozenci polosourozenci činitele chovatelského prostředí genetické založení jedince naměřená hodnota potomci

Genomová selekce Pracuje na základě rozdělení celého genomu do chromozómových úseků definovaných sousedními markery a následného sledování efektů těchto chromozómových úseků. 32

Genomová selekce Využívá předpokladu, že efekty chromozómových úseků budou shodné v celé populaci, protože markery jsou v LD s QTL mezi markery (mají stejnou vazbovou fázi). GS předpokládá, že všechny markery mohou být ve vazbě ke genu ovlivňujícím vlastnost. Proto hustota markerů musí být dostatečná, aby zajistila, že všechny QTL jsou v dostatečném LD s markery nebo haplotypy markerů. To umožňují SNP. 33

Praktické použití genomové selekce 1. Odhad efektů chromozómových segmentů v referenční populaci. Zvířata referenční populace tedy musí mít stanoveny genotypy markerů a mít záznamy o užitkovosti. 2. Předpověď GPH pro zvířata mimo referenční populaci, pro mladé býčky, jalovice, kanečky atd. Tito kandidáti mají k dispozici pouze genotypy markerů, ale nemají k dispozici údaje o vlastní užitkovosti nebo užitkovosti potomstva. Formální kvantitativní genetika počítá s tím, že potomek zdědí polovinu vlastností od každého z rodičů. Ve skutečnosti 34 to tak docela neplatí.

Praktické použití genomové selekce Všechny SNP efekty jsou simultánně odhadovány v referenční populaci, která je genotypována a fenotypována s použitím statistického modelu (předpokládáme 50 000 SNP): y i = m + X i1 x b 1 + X 2i x b 2 + + X 50000i x b 50000 + e i y i je fenotyp zvířete i; m průměr; X i1 genotyp zvířete i pro marker 1; e i residuální efekt 35

Praktické použití genomové selekce Metoda používá BLUP k odhadu SNP efektů, nazývá se někdy SNP-BLUP. Genomická plemenná hodnota selekčního kandidáta j je předpovídána jako: GEBV j = X 1j x 1 + X 2j x 2 + + X 50000j x 50000 1 je odhad efektu SNP1, X 1j genotyp zvířete j pro SNP 1

Ale: Vlastní výpočet plemenné hodnoty se provádí např. metodou: BLUP-AM RR BLUP G BLUP ssg BLUP Při praktickém použití genomové selekce se používají tyto metody Blending ss G BLUP 37

V tradiční BLUP je PH odhadována s použitím fenotypů a rodokmenových příbuzností. V GBLUP je GPH odhadována s použitím fenotypů a genomových příbuzností, které jsou založeny na celogenomových hustých markerových datech. 38

Genomová příbuznost mezi zvířaty 1 a 2 je počítána jako korelace mezi jejich SNP genotypy X j1 a X j2 přes všechny SNP j. GBLUP je tedy velmi podobná tradiční BLUP, ale rodokmenové příbuznosti jsou nahrazeny genomovými. Mohou být použity tradiční metody výpočtu a software. 39

Rodokmenová příbuznost sourozenců je 0,5 tedy by měli sdílet 50% společných alel. Ve skutečnosti mohou sdílet 40% nebo 60% společných alel. Tato odchylka může být detekována genotypováním markerů. GBLUP je přesnější, protože genomová příbuznost je přesnější, než rodokmenová. 40

Plemenná hodnota BLUP AM Best Linear Unbiased Prediction Animal Model nejlepší lineární nevychýlená předpověď model zvířete Genetické založení jedince pro konkrétní vlastnost Y = X.b + Z.a + e Y vektor naměřených užitkovostí (v. pozorování) X, Z matice plánu pokusu pro systematické chovatelské b a e prostředí (X) a pro náhodné efekty včetně plemenných hodnot (Z) vektor odhadovaných fixních efektů vektor odhadovaných náhodných efektů vektor náhodných vlivů prostředí (v. reziduí)

Plemenná hodnota A je matice příbuznosti b je vektor odhadovaných fixních efektů, a vektor předpovídaných náhodných efektů, plemenná hodnota a je poměr residuálního a aditivně genetického rozptylu, a = s 2 e / s 2 a

Co vstupuje do odhadu Před genomikou Původ, tj. příbuzenské vztahy Kontrola užitkovosti Po zavedení genomiky Původ, tj. příbuzenské + genomické vztahy Kontrola užitkovosti

Vícekroková metoda Nejrozšířenější V praxi od 2010 Předpověď PH pouze pro genotypizovaná zvířata Nevýhody: U malých populací Neschopnost porovnat genotypované a negenotypované jedince

Vícekroková metoda 1. krok pomocí statistických analýz přiřazeny užitkové hodnoty jednotlivých SNP (jakou užitkovost má jaká mutace v genotypu jedince) 2. krok -,,sečteny jednotlivé účinky genů sečteny účinky jednotlivých SNP a sestavena genomická PH (GPH) jedince

Jednokroková metoda Předpověď PH pro celou populaci Neodhaduje účinky jednotlivých SNP Upřesnění příbuzenských vztahů Pro genotypované a negenotypované jedince, tedy porovnání pořadí Místo A -1 je H -1 = (G + A) Přesnější, jednodušší Mírné zvýšení spolehlivosti i pro negenotypované jedince, tedy zpřesnění odhadu PH

Jednokroková metoda ssgblup užitkovost Y = Xb + Zu + e G+A H

Při ssgblup se upravuje matice příbuznosti H, a to spojením genomové matice příbuznosti G s rodokmenovou maticí příbuznosti A

H -1 = A -1 + 0 0 0 G -1 - A 22-1 0 Sloučená matice příbuznosti Rodokmenová matice Genomová příbuznosti matice všech jedinců příbuznosti genotypovaných jedinců Rodokmenová matice příbuznosti pouze genotypovaných jedinců -1 značí inverzi matice

ssgblup 1 H je sloučená matice příbuznosti, spojuje rodokmenovou (A) a genomickou (G) příbuznost.

Imputace Na základě známých genotypů SNP zvířete je určen jeho haplotyp, protože stejný haplotyp byl pozorován u jiných zvířat. Tedy: chybějící genotyp může být přečten z genotypu jiných zvířat se stejným haplotypem. Software: Beagle, Fimpute, Alphaimpute. 51

Budoucnost ss odhad užívající nelineární statistickou metodu a data ze sekvenace! 52

Faktory ovlivňující přesnost GS Přesnost odhadu GPH závisí na několika parametrech. 1) Rozsah a velikost LD mezi markery a QTL. 2) Počet zvířat s fenotypy a genotypy v referenční populaci, ze které jsou efekty SNP odhadovány. 3) Příbuznost (genetické propojení) mezi referenční populací (která je genotypovaná a fenotypovaná) a populací s kandidátními zvířaty (která je genotypovaná, ale není fenotypovaná). 4) Dědivost (heritabilita - h 2 ) sledovaných znaků. 5) Distribuce QTL efektů. První tři faktory lze ovlivnit, druhé dva ne! 53

První komerční čip v r. 2008 Illumina BovineSNP50 BeadChip. Dostupné pro všechny důležité druhy hosp. zvířat, ovce, prase, kůň, kur, koza, pstruh, losos, atd. Počet SNP v první generaci čipů 50 60 tis. V souč. (2015) je jen pro skot nabízeno 11 komerčních čipů od 3 největších firem, Illumina, Neogen-GeneSeek, Affymetrix. Dále se nabízí tzv. custom čipy. 54

Celogenomové asociační studie GWAS Genome-Wide Association Study 56

Graf znázorňuje několik silně asociovaných podezřelých lokusů. Každý bod představuje SNP, osa X je genomická lokalizace, osa Y úroveň asociace. Příklad ukazuje asociaci pro mikrocirkulaci, body nahoře indikují genetické varianty, častěji nalézané u jedinců konstrikcemi v malých cévách. 57

Asociace 44 280 SNP s odhadnutými plemennými hodnotami pro procento mléčného tuku u 2327 jedinců německého holštýna 58

Ještě pár poznámek 60

Customer chips 61

Softwarové nástroje pro zpracování dat z analýzy SNP PLINK Je považován za určitý standard pro management dat. Atd 63

Do 10 let (?) se bude u hospodářských zvířat provádět sekvenování kompletního genomu. 64

Současný stav genomové selekce 66

Genomová selekce teoreticky popsána 2001. 67

V ČR U holštýnského skotu probíhá ve spolupráci Svazu chovatelů holštýnského skotu, ČMSCH a.s., Plemdat s.r.o. a VÚŽV. Zahájen byl výpočet GPH u mladých býčků a jalovic, jednokroková metoda. Proběhla validace GPH pro znaky produkce v Interbullu. Rutinní výpočet GPH pro znaky produkce a somatické buňky realizuje Plemdat s.r.o. Genotypováno bylo 450 starších krav. Cílem je zpřesnění národního odhadu GPH. 68

V ČR U holštýnského skotu jsou výsledky odhadu GPH pravidelně publikovány na stránkách Svazu chovatelů holštýnského skotu. 69

DCER SB STÁD SB SB DCER EXT STÁD EXT R - EXT DI-KON DI-VEM RÁMEC ŠÍŘKA HRUD. HL. TĚLA HRANATOST SKL. ZADĚ ŠÍŘ. ZÁDĚ PZK - ZEZADU PZK - ZBOKU ÚHEL PAZ PŘ. UPN. VEM. ROZM. PŘ. STR. DÉLKA STR. HLOUBKA VEM. VÝŠKA ZAD. UP. ZÁV. VAZ ROZM. Z. STR. ŠÍŘKA ZAD. UP. KVAL. KOSTI CHODIVOST KONDICE ML. SÍLA POR LIN-REG JMÉNO BÝKA ROK NAROZENÍ ORG DĚD. VADY OTEC JMÉNO OM JMÉNO gsih DCER PROD STÁD PROD R - PROD DI-MLK MLÉKO KG TUK KG TUK % BÍLK KG BÍLK % 1 NEO-437 SUNNYDAY 2013 401 NUMERO UNO ALTAIOTA 150,8 0 0 82 141 305 67 0,74 25 0,26 2 NEO-513 SILVER 2013 170 *TV*TL*TY MOGUL SNOWMAN 150,2 0 0 77 147 2072 78 0,08 51-0,02 3 NXB-120 RASTY 2012 201 *TV*TL SUDAN O MAN 145,2 0 0 79 150 2093 72 0,01 56 0,03 4 NEO-572 ABBADO 2012 121 *TV*TL*TY NUMERO UNO PLANET 145,0 0 0 85 126 388 48 0,45 18 0,12 0 0 100 0 0 61 112 120 108 107 108 102 81 105 100 97 101 109 119 101 109 109 123 119 108 109 113 110 117 0 0 104 0 0 55 118 117 121 113 109 104 98 98 129 98 98 108 108 97 110 127 104 106 133 116 111 97 129 0 0 106 0 0 55 109 103 106 104 104 103 111 106 112 87 94 100 103 88 105 102 90 99 105 101 113 111 104 0 0 109 0 0 56 112 123 106 97 102 109 80 105 108 96 95 119 121 97 119 109 110 120 107 119 118 101 110 72

STAVBA TĚLA KONČETINY VEMENO TYP CELKEM INS-JAL PLODNOST - JAL INS-KR PLODNOST - KR PLODNOST - PL DCER DLV VYŘ R - DLV DLOUHOVĚKOST ID-BYKA 117 115 118 123 0 112 0 106 110 0 0 0 135 CZEM000700787053 116 123 122 131 0 102 0 99 100 0 0 0 106 USAM000072156794 110 112 104 108 4 101 0 106 105 0 0 0 92 CZEM000796586061 121 117 121 125 0 115 0 113 117 0 0 0 147 ITAM017991251571 73

V éře genomiky je fenotyp králem. U všech druhů mají klíčový význam fenotypová data vysoké kvality. 74

U skotu odhalilo sekvenování 1000 býků více než 30 mil. SNP. 75

Zavedena úspěšně u velkých populací, tj. holštýn simentál jersey brown swiss. 76

Mléčný skot GS umožňuje omezit resp. ukončit tzv. star system. Nadměrné použití několika vynikajících plemeníků, kteří jsou využíváni jako otcové býků. To vede k vyššímu inbreedingu. Pozor! V praxi bylo dosud zavedení GS spojeno s vyšším inbreedingem! 77

Mléčný skot Implementace znamenala vyšší genetický zisk, např. v Kanadě se zdvojnásobil. Zároveň se ale zvýšil inbríding. Úkol do budoucna zvýšit zisk a omezit inbríding. Zkrácení odhadu PH u býků z více než 6 let na 3 roky. Stačí menší počet inseminačních stanic. 78

Masný skot GS nebyla dosud uplatněna v takové míře, jako u mléčného: nižší přesnost ekonomické výhody nejsou tak vysoké jako u mléčného skotu 79

Masný skot Přesnost GPH nižší, než u mléčného skotu: Referenční populace má nižší kvalitu. Méně zvířat v ref. populaci pro jedno plemeno, ta nejsou testována podle už. potomstva. Ref. populace a populace v níž se selektuje jsou méně geneticky propojené než u mléč. plemen. 80

Masný skot Holštýn je převažující mléčné plemeno. Jeho N e je méně než 100. Masných plemen je mnoho. Každé má N e větší, než holštýn!!! Každé má své specifické vlastnosti. 81

Prasata 82

Nejdůležitějším krokem v selekci je výběr kanců v nukleových chovech. Výsledky testování kanců přichází většinou před výběrem elitních kanců, takže zlepšení výsledků v důsledku redukce generačního intervalu je limitováno, i když s pomocí GS lze dosáhnout asi 25% redukce generačního intervalu. 83

Proto je GS orientována zvl. na znaky, kde je získání dat invazivní (jatečná hodnota); maternální znaky u kanců; užitkovost kříženců, která nemůže být hodnocena u čistokrevných zvířat. 84

V komerčním šlechtění prasat je v souč. době nejčastěji používanou aplikací GS jednokrokový odhad, založený na imputovaných genotypech. 85

Cena kance a býka U skotu je býk testován ve vyšším věku (dcery dokončí 1. laktaci), náklady jsou vysoké. Býk musí být chován, musí se shromáždit velký počet dávek, test potomstva je zahájen po dlouhé době. Náklad na genotypizaci i sekvenaci býka je relativně nízký ve srovnání s náklady na konvenční testování. 86

Cena kance a býka U prasat jsou náklady na odchov nižší, selekčními kandidáty jsou všichni testovaní čistokrevní kanečci s rodokmenem. Proto jsou náklady na genotypizaci kance relativně významnější. 87

Další rozvoj u prasat U prasat hraje významnou roli u mnoha znaků heteróze. Je-li GPH je založena na datech o užitkovosti kříženců, je užitečné zařadit do modelu ne-aditivní genetické efekty, které způsobují heterózi. To může zvýšit přesnost GPH a snížit její vychýlení. 88

Drůbež 89

Tradiční šlechtitelské programy již mají krátký generační interval. Vícečetné překrývající se generace za rok se selekcí každých 6 týdnů u brojlerů, nepřekrývající se roční generace u nosných. 90

Velmi vysoký počet selekčních kandidátů a vysoká intenzita selekce. Desetitisíce sel. kand. na linii a generaci, jen 1-3% samců selektováno pro šlechtění. Proto genotypizace musí být levná! 91

U drůbeže je genetický pokrok z čistých linií přenášen křížením pyramidově do velkého počtu brojlerů nebo nosnic. Jedna linie vnáší jen 25%!!! 92

U drůbeže není spolehlivá metoda kryokonzervace, selektovaný samec má jen místní význam. 93

Optimální je sledování haplotypů zpětně k původním liniím a následná selekce čistokrevných linií podle přítomnosti výhodných haplotypů. 94

Hlavní přínos GS u drůbeže je zvýšení přesnosti odhadu PH ve věku puberty u znaků, manifestovaných pohlavně specificky. 95

Koně 96

Hlavní výzvou je limitovaná dostupnost kvalitních fenotypových dat ve srov. s mléčným skotem. GS má enormní potenciál. 97

Koně mají značně různorodé využití. Menší podíl profesionálů mezi chovateli než u ostatních druhů hospodářských zvířat (eufemisticky řečeno)!!! Vysoká cena koní peněžní a citová. Proto je management populace a design šlechtění stále problémem. 98

Generační interval U koní delší, než byl u mléčného skotu před GS. Přesnost odhadu PH nižší. Kůň je ca 9-10 let starý!!! když je známa jeho konvenční PH. Pokud se vůbec zjišťuje!!! 99

U sportovních koní je značná výměna genetického materiálu mezi plemeny a zeměmi. GS poskytuje možnost přístupu k plem. hodnotám pro zahraniční koně. Podm. je gen. propojení mezi populacemi. Odhady pro více znaků, jednokroková metoda. 100

Budoucnost (pro všechny druhy) Často je překážkou cena genotypizace. S jejím poklesem bude použití GS stoupat. To pomůže sestavení větších a aktuálnějších refer. populací. 101

Budoucnost Editace genomu Cílená změna sekvence DNA v buňce. Uměle syntetizované sekvence jsou integrovány do přesně definované pozice. CRISPR/Cas9!! Praktické aplikace jsou na dosah. 102

Budoucnost Editace genomu je slibná u majorgenů, ale podstatně méně u komplexně podmíněných vlastností. Sem ale patří většina ekonomicky důležitých vlastností. Praktický význam editace proto bude omezený. 103

Srovnání s rostlinami Zcela rozdílné. Genetické zlepšení mnoha rostlinných druhů je založeno na klonech a jejich testování v různých podmínkách. Cílem je klon s jasnými přednostmi v resistenci. 104

Srovnání s rostlinami Velkou výhodou práce s klony je, že genomické hodnocení může být velmi důkladné, protože příslušný fenotyp může být využíván velmi dlouho. 105