Genomika hospodářských zvířat

Transkript

1 Genomika hospodářských zvířat

2 QTL pro rezistenci a/nebo citlivost vůči leishmanióze a jiným infekcím u myší

3 QTL pro hybridní sterilitu samců u myší White et al. 2011, Genetics

4 Jemné genetické mapování Abychom v genetickém mapování pomocí BC1 či F2 generace získali rozlišovací schopnost cca 1 cm, je třeba analyzovat velké množství jedinců (~ 100) za použití jemné genetické mapy (~ 1 marker/1cm) - to je příliš! Obvykle se genetické mapování provádí ve dvou krocích. V prvním kroku analyzujeme menší množství jedinců (cca 30) za použití hrubé genetické mapy (~ 1 marker/10cm). - nízká rozlišovací schopnost desítky cm. V druhém kroku analyzujeme větší množství jedinců, genotypujeme však pouze markery v kandidátní oblasti. - zúžení kandidátníoblasti na zhruba 1cM. - umožňuje přechod z genetického mapování (cm) na fyzikální mapování (bp). Součástí jemného genetického mapování je často vytvoření kongenního kmene. - umožňuje funkční analýzu hledaného genu.

5 Fyzické mapování Sekvenování kritické oblasti vymezené genetickým mapováním. Klonování DNA do vektorů (BAC, YAC). Sestavování získaných sekvencí do kontigů. Anotace získané sekvence. Určení pozice markerů na fyzikální mapě. V dnešní době už většinou netřeba. Fyzická mapa u organismů s přečteným genomem je známá.

6 Ověřování kandidátních genů Vytvoření seznamu kandidátních genů v kritické oblasti Hledání polymorfismů korelujících se sledovaným genotypem - nesynonymní mutace v kódujících oblastech - změny genové exprese Testování vlivu jednotlivých genů či SNP na fenotyp pomocí transgeneze či knock-out

7 Další metody vazebné analýzy pomocí Konsomické kmeny (Chromosomálně substituční kmeny) laboratorního křížení 10 generací zpětného křížení za současné selekce přenášeného chromosomu

8 Vazebná analýza pomocí konsomických kmenů Příprava konsomických kmenů zdlouhavá a pracná (10 generací křížení, nutnost genotypovat každou generaci) Jakmile ale kmeny hotové, mapování je rychlé a bez nutnosti genotypování. Nízká rozlišovací schopnost mapování (celý chromosom). Pro jemnější mapování potřeba další křížení. Z konsomického kmene lze snadno vytvořit kongenní kmen.

9 Idiogram genomu potkana

10 Inbrední kmen

11 Konsomický kmen

12 Kongenní kmen

13 Dvojitě kongenní kmen

14 Polydaktylní kmen potkana PD/Cub Vysoce inbrední model (F > 90) model vývoje končetiny a teratogeneze model hypertriglyceridémie, metabolického syndromu Specifický farmakogenetický a nutrigenetický profil Model vývojové plasticity metabolického syndromu

15 Mapování znaků pomocí panelu konsomických kmenů myší odvozených od kmenů B6 a MSM Takada et al. 2008, Genome Research

16 Rekombinantně inbrední linie opakované křížení F1 bratr-sestra (alespoň 20 generací)

17 Rekombinantně inbrední linie samoopylení (alespoň 20 generací)

18 Vazebná analýza pomocí rekombinantně inbredních linií Příprava sice zdlouhavá (20 generací křížení), ale nemusí se během ní genotypovat. Genotypuje se až konečná generace. Jakmile hotové, rychlé mapování bez genotypování. Vysoká rozlišovací schopnost až 1cM (záleží na počtu vytvořených RIL). Z RIL nelze snadno vytvořit kongenní kmen.

19 Mapování genů podmiňujících bílou korunku u WSB/EiJ

20 Vazebná analýza pomocí rodokmenů Je třeba dostatek rodokmenů, ve kterých segreguje studovaný znak (choroba). Rozlišovací schopnost daná počtem meióz zachycených v rodokmenech. Obvykle nízká (~1-10cM). Vhodné pro mapování znaků s jednoduchou Mendelovskou dědičností, ne však kvantitativních znaků.

21 Identifikace genu odpovědného za cystickou fibrózu pomocí analýzy rodokmenů. Science (1985)

22 Asociační mapování (LD mapování, haplotypové mapování) Mapování v přírodních populacích na základě vazebné nerovnováhy (linkage disequilibrium, LD) ke genetickým markerům. Je potřeba velmi vysoký počet markerů (~ 1 mil). Přesný počet markerů závisí na míře LD v genomu (čím větší LD tím míně je potřeba markerů). - LD nepřímo úměrně závisí na míře rekombinace a efektivní velikosti populace - LD je větší kolem nedávno vzniklých výhodných mutací Míra LD se mění podél genomu a tomu by mělo odpovídat rozložení markerů.

23 Haplotypová mapa lidského genomu (HapMap projekt) určen genotyp více než 1 mil SNP rozmístěných každých 5 kb v genomu u více než 250 jedinců z několika populací zjištěno, že genom je rozdělen do bloků (haplotypů) s vysokým LD (tzn. uvnitř těchto bloků téměř nejsou rekombinace). Hranice mezi jednotlivými bloky korelují mezi populacemi a odpovídají rekombinačním hotspotům. Výsledky ukazují, že pro asociační mapování je třeba genotypovat ~ 0.5 mil SNP u Evropské populace a 1 mil SNP u Africké populace (tj. kapacita jednoho SNP genotypovacího čipu )

24 Asociační mapování Má vysokou rozlišovací schopnost (~10kb). Vhodné i pro mapování kvantitativních znaků. Třeba analyzovat velký počet jedinců (~ 1000). Důležité mít správnou kontrolní skupinu (pozor na populační strukturu). Málo účinné pouze při mapování alel s velmi nízkou frekvencí v populaci a velmi komplexních fenotypů podmíněných velmi velkým množstvím genů s malými účinky.

25

26

27

28 Asociační studie sedmi chorob v britské populaci The Wellcome Trust Case Control Consortium, Nature 2000

29 Asociační studie sedmi chorob v britské populaci

30 Vazbová analýza - nízký počet genetických markerů (~ 100) - nízká rozlišovací schopnost (~ 10 cm) Asociační mapování - vysoký počet genetických markerů (~ ) - vysoká rozlišovací schopnost (~ 10 kb) Ideální je kombinace obou přístupů 1. vazebná analýza 2. Asociační mapování Hrubé genetické mapování - na úrovni celého genomu Jemné genetické mapování - lze omezit jen na určitou předem vybranou oblast

31 Jak rychle nalézt gen odpovědný za určitý fenotyp bez pozičního klonování Metoda kandidátních genů Vytvoření seznamu genů, které by mohly mít nějakou souvislost s pozorovaným fenotypem. Hledání polymorfismů a jejich korelace s fenotypem. Takto objeveny geny podmiňující některé lidské nemoci (např. geny pro srpkovitou anémii) i některé geny pro adaptivní znaky (např. geny podmiňující různou barvu srsti u hlodavců). Tento přístup lze použít jen u některých fenotypů. Nelze nalézt geny, jejichž funkce je neznámá. Pytlouš skalní, obvykle světlý, na lávových polích černé populace. Černé zbarvení vzniká mutací v genu melanocortin-1-receptor gene (Mc1r), ale jen v některých populacích. V jiných populacích způsobuje černé zbarvení mutace v jiném genu zatím neznámém (Nachman et al. PNAS 2003).

32 ZNAK, VLASTNOST ZDROJ PLEMENO POČET VZORKŮ POČET VÝZNAM. SNPs KONTROLA V NEZÁVISLÉ POPULACI KOMENTÁŘ kongenitální dystonie svalstva I, II, ichthyosis fetalis Charlier et al. (2008) Belgické modré, Chianina CMD 1 (12 pozit., 14 kontrolní), CMD 2 (7 pozit., 24 kontrolní), ICF (3 pozit., 9 kontrolních) - identifikována kauzální mutace byly identifikovány 3 geny nesoucí kauzální mutaci produkce mléka, plodnost, reprodukce, exteriérové vlastnosti a ostatní klíčové ukazatele mléčné užitkovosti Cole at al. (2009) Holštýn 5285 netestováno (viz. komentář) Ne, přesné předpovědi odhadovaných PH mladých býků dojných plemen (Wiggans et al. 2011) všechny SNPs současně produkce mléka, PSB, životnost stáda, servis perioda, ins. Interval Daetwyler et al. (2008) Holštýn 484p 144 Ne použito 9919 SNPs produkce mléka Jiang et al. (2010) Holštýn Ne produkce mléka, PSB, životaschopnost, rychlost dojení, temperament při dojení Bolormaa et al. (2010) Holštýn, Jersey (napříč 19 znaky) Ano Multitrait metoda

33 ZNAK, VLASTNOST ZDROJ PLEMENO POČET VZORKŮ POČET VÝZNAM. SNPs KONTROLA V NEZÁVISLÉ POPULACI KOMENTÁŘ produkce mléka, ukazatele plodnosti Pryce et al. (2010a) Holštýn, Jersey (napříč 6 znaky) Ano, 544 SNPs u Holštýna, 159 u Jersey Testovány jednotlivé SNPs, stejně jako varhap perzistence laktace Pryce et al. (2010b) Holštýn, Jersey , při P<0,005 Ano odolnost vůči tepelnému stresu, schopnost dojit při nízké úrovni krmení Hayes et al. (2010) Holštýn, Jersey Ano produkce mléka, PSM Kolbehdari et al. (2009) Holštýn 28 Ne 1536 SNPs produkce mléka - interakce s úrovní krmení Lillehammer et al. (2009) Holštýn 384 Ne 9918 SNPs

34 ZNAK, VLASTNOST ZDROJ PLEMENO POČET VZORKŮ POČET VÝZNAM. SNPs KONTROLA V NEZÁVISLÉ POPULACI KOMENTÁŘ produkce mléka Mai et al. (2010) Jersey Ne konformace zmasilost, funkční znaky Kolbehdari et al. (2008) Holštýn Ne 1036 SNPs v intronech plodnost, věk při nástupu puberty Fortes et al. (2010) tropická plemena skotu ne Použit nový multivarietní postup plodnost býků Feugang et al. (2009) Holštýn 20 býků vynikající plodnosti 97 Ano, 4 nejvíce signifikantní SNPs se testovaly u 210 býků s mimořádnou plodností, dva signifikantní, související s integrin beta 5 proteinem SNPs plodnost samic Sahana et al. (2010) Holštýn Ne

35 ZNAK, VLASTNOST ZDROJ PLEMENO POČET VZORKŮ POČET VÝZNAM. SNPs KONTROLA V NEZÁVISLÉ POPULACI KOMENTÁŘ plodnost, míra oplození, oplození, blastocysty Huang et al. (2010) Holštýn 27 Ne, ale souhrnné výsledky potvrzeny individuální genotypizací. První využití souhrnné DNA anylýzy pomocí GWAS u skotu mrtvě narozená mláďata, dystokie Olsen et al. (2010) Norská červinka Ano 17,343 SNPs snadnost telení Pausch. et al. (2010) Fleckvieh 1800 Ne dvojče Kim et al. (2009) Holštýn Ano, Birman et al. (2010). 55 SNPs ověřeno v nezávávislém souboru dat 921 holštýnských býků. Poslední set 18 SNPs vysvětluje 34% variabilitu ve výskytu dvojčat. složení mastných kyselin v hovězím mase Uemoto et al. (2010) Japonský černý skot 160 mimořádných zvířat 32 Ne

36 ZNAK, VLASTNOST ZDROJ PLEMENO POČET VZORKŮ POČET VÝZNAM. SNPs KONTROLA V NEZÁVISLÉ POPULACI KOMENTÁŘ odolnost vůči Johnově chorobě (posuzováno dle odolnosti vůči M. aviumpoddr. paratuberculosis - MAP infekce) Zanella et al. (2010) Holštýn 90 plus, 16 pozit., 25 kontrolních 5 SNPs při P<1 * 10 ^(-5) Ne MAP - status Settles et al. (2009) Holštýn regionů při P<1 * 10 ^(-5), 2 při P<1 * 10 ^(-7) Ne MAP - status (ELISA) Pant et al. (2010) Holštýn 232 zvířat se známým MAP statusem 12 genomických úseků signifikantních Ne serologicky pozitivní (či neg.) na MAP (ELISA) Minnozi et al. (2010) Holštýn 483 MAP pozit., 483 negat. (ELISA) jeden úsek signifikantní při P<1 * Ano, menší kohorta ze stejné populace.ověřeno 10 ^(-6) a tři 5 SNPs. signifikantní při P<1 * 10 ^(-5) vnímavost k BSE Murdoch et al. (2010) Holštýn 481 polosourozenců, 149 BSE pozit., 184 kontrolních vzorků 27 SNPs Ne Použito 3072 SNPs

37 ZNAK, VLASTNOST ZDROJ PLEMENO POČET VZORKŮ POČET VÝZNAM. SNPs KONTROLA V NEZÁVISLÉ POPULACI KOMENTÁŘ růst Snelling et. al (2010) Angus, Charolais, Gelbvieh, Hereford, Limousin, Red Angus, Simentál SNPs Ne využití krmiva Barendse et al. (2007) Angus, Brahman, Belmont Red, Hereford, Murray Grey, Santa Gert., Shorthorn 189 mimořádných zvířat 161 SNPs při P<0,01 Ano, testována zvířata ze středu distribuce odkud pocházel panel 198 mimořádných zvířat využití krmiva Sherman et al. (2010) Angus, Charolais, Alberta (hybrid) při P<0,01 Ne Použito 2633 SNPs odolnost k tick burden Turner et al. (2010) Jersey, Holštýn, Aussie Red, Sahiwal, Illawara, Shorthorn 189 mimořádných zvířat 27 při P<0,05 Ne Použito 7397 SNPs. Porto Neto et al. (2010) signifikantní SNPs velmi blízko u Integrin alpha 11 genu v navazující studii.