Stanovení biologicky aktivních látek metodou sekvenční injekční analýzy s chemiluminiscenční detekcí

Diplomová práce Stanovení biologicky aktivních látek metodou sekvenční injekční analýzy s chemiluminiscenční detekcí Bc. Lucie Štěpánková Katedra analytické chemie Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Univerzita Karlova v Praze 2009

Poděkování školiteli Doc. RNDr. Miroslavu Poláškovi, CSc. za trpělivost a vstřícnost při konzultacích a za cenné připomínky při psaní této práce. Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem samostatně vypracovala. Literatura a další zdroje, ze kterých jsem čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury. 1

1 OBSAH 1 OBSAH... 2 2 SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK... 4 3 SEZNAM ZKRATEK... 6 4 ÚVOD... 7 4.1 Úvod a cíl práce... 8 5 TEORETICKÁ ČÁST... 9 5.1 Sekvenční injekční analýza (SIA)... 10 5.1.1 Princip FIA a SIA... 10 5.1.2 Porovnání SIA a FIA... 12 5.1.3 Přístrojové vybavení... 12 5.2 Chemiluminiscence... 14 5.2.1 Mechanismus chemiluminiscence... 14 5.2.2 Poţadavky na CL reakci... 15 5.2.3 Faktory ovlivňující chemiluminiscenci... 15 5.2.4 Základní instrumentace... 16 5.3 Norepinefrin (norepinefrin bitartrát)... 17 5.3.1 Farmakologické vlastnosti... 17 5.3.1.1 Farmakodynamické vlastnosti... 18 5.3.1.2 Farmakokinetické vlastnosti... 19 5.3.2 Chemické vlastnosti... 19 5.4 Metody stanovení... 21 5.4.1 Lékopisná metoda... 21 5.4.2 Elektrochemické metody... 21 5.4.3 Separační metody... 22 5.4.3.1 Chromatografické metody... 22 5.4.3.2 Elektroforetické metody... 23 5.4.4 Průtokové metody FIA... 23 5.4.5 Spektrofluorimetrická metoda... 23 6 PRAKTICKÁ ČÁST... 24 6.1 Pouţité přístroje... 25 6.2 Pouţité chemikálie... 25 6.3 Příprava roztoků... 25 2

6.3.1 Zásobní roztoky... 25 6.3.2 Pracovní roztoky... 26 6.4 Optimalizace metody... 28 6.4.1 Optimalizace koncentrací činidel... 28 6.4.1.1 Koncentrace manganistanu draselného... 29 6.4.1.2 Koncentrace kyseliny sírové... 30 6.4.1.3 Koncentrace polyfosfátu sodného... 31 6.4.2 Vliv obsahu methanolu a ethanolu na intenzitu CL... 32 6.4.3 Optimalizace objemů a průtokových rychlostí... 33 6.4.4 Optimalizace napětí... 35 6.5 Kalibrační závislosti... 36 6.6 Opakovatelnost metody... 38 6.7 LOD, LOQ... 39 6.8 Vliv rušících látek... 39 6.8.1 Vliv Chelatonu 3... 39 6.8.2 Vliv disiřičitanu sodného... 40 6.8.3 Odstranění vlivu disiřičitanu sodného... 41 6.9 Stanovení norepinefrin bitartrátu... 41 6.9.1 Kalibrace... 41 6.9.2 Stanovení norepinefrin bitartrátu v injekcích... 42 6.9.3 Kalibrace... 45 6.9.4 Stanovení norepinefrin bitartrátu metodou standardního přídavku a určení výtěţnosti... 46 6.9.5 Srovnávací stanovení norepinefrin bitartrátu metodou HPLC... 48 6.9.6 Porovnání výsledků... 49 7 ZÁVĚR... 50 7.1 Souhrn... 51 7.2 Abstrakt... 52 8 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY... 53 3

2 SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK Obr. 1: Schéma jednoduché FIA techniky [3]... 10 Obr. 2: Princip FIA techniky [3]... 11 Obr. 3: Princip SIA techniky [3]... 11 Obr. 4: Schéma SIA analyzátoru [3]... 13 Obr. 5: Mechanismus chemiluminiscence [4]... 14 Obr. 6: Závislost intenzity CL na reakčním čase a koncentraci analytu [4]... 16 Obr. 7: Biosyntéza noradrenalinu [6]... 17 Obr. 9: Vzorec norepinefrin bitartrátu [8]... 20 Obr. 10: Závislost intenzity CL na koncentraci manganistanu draselného... 29 Obr. 11: Závislost intenzity CL na koncentraci kyseliny sírové... 30 Obr. 12: Závislost intenzity CL na koncentraci polyfosfátu sodného... 31 Obr. 13: Vliv methanolu a ethanolu na intenzitu CL... 33 Obr. 14: Závislost intenzity CL na objemu vzorku... 35 Obr. 15: Kalibrační závislost norepinefrinu... 37 Obr. 16: Kalibrační závislost norepinefrinu... 42 Obr. 17: Kalibrační závislost norepinefrinu... 45 Obr. 18: Metoda standardního přídavku... 47 Tab. 1: Charakteristika adrenergních receptorů [6]... 18 Tab. 2: Elektroforetické metody... 21 Tab. 3: Kapalinová chromatografie... 22 Tab. 4: Plynová chromatografie... 22 Tab. 5: Elektroforetické metody... 23 Tab. 6: Průtokové metody FIA... 23 Tab. 7: Spektrofluorimetrická metoda... 23 Tab. 9: Měřící cyklus... 28 Tab. 10: Závislost intenzity CL na koncentraci manganistanu draselného... 29 Tab. 11: Závislost intenzity CL na koncentraci manganistanu draselného... 29 Tab. 12: Závislost intenzity CL na koncentraci kyseliny sírové... 30 Tab. 13: Závislost intenzity CL na koncentraci kyseliny sírové... 30 Tab. 14: Závislost intenzity CL na koncentraci polyfosfátu sodného... 31 4

Tab. 15: Závislost intenzity CL na koncentraci polyfosfátu sodného... 31 Tab. 16: Vliv obsahu methanolu na intenzitu CL... 32 Tab. 17: Vliv obsahu ethanolu na intenzitu CL... 32 Tab. 18: Vliv obsahu ethanolu na intenzitu CL slepý pokus... 32 Tab. 19: Vliv obsahu ethanolu na intenzitu CL výsledné hodnoty... 32 Tab. 20: Hodnoty získané pomocí metody SIMPLEX... 34 Tab. 21: Závislost intenzity CL na objemu vzorku... 34 Tab. 22: Závislost intenzity CL na objemu vzorku... 34 Tab. 23: Závislost intenzity CL na napětí... 36 Tab. 24: Kalibrační závislost norepinefrinu... 37 Tab. 25: Kalibrační závislost norepinefrinu... 37 Tab. 26: Opakovatelnost metody při koncentraci norepinefrin bitartrátu 4,75 μmol/l... 38 Tab. 27: Opakovatelnost metody při koncentraci norepinefrin bitartrátu 18,98 μmol/l... 38 Tab. 28: Vliv Chelatonu 3 na stanovení norepinefrinu... 40 Tab. 29: Vliv disiřičitanu sodného na stanovení norepinefrinu... 40 Tab. 30: Kalibrační závislost norepinefrinu... 41 Tab. 31: Analýza injekcí (100 μl), výpočet na základě kalibrační křivky... 43 Tab. 32: Analýza injekcí (100 μl), výpočet na základě porovnání se standardem... 43 Tab. 33: Analýza injekcí (150 μl), výpočet na základě kalibrační křivky... 43 Tab. 34: Analýza injekcí (150 μl), výpočet na základě porovnání se standardem... 44 Tab. 35: Analýza injekcí (200 μl), výpočet na základě kalibrační křivky... 44 Tab. 36: Analýza injekcí (200 μl), výpočet na základě porovnání se standardem... 44 Tab. 37: Analýza injekcí... 46 Tab. 38: Analýza injekcí se standardním přídavkem... 46 Tab. 39: Stanovení standardního přídavku... 47 Tab. 40: Výtěţnost vypočítaná z intenzity CL... 47 Tab. 41: Obsah norpeinefrin bitartrátu v injekcích odečtený z grafu... 47 Tab. 42: Obsah norpeinefrin bitartrátu v injekcích (HPLC)... 48 Tab. 43: Porovnání výsledků všech analýz... 49 5

3 SEZNAM ZKRATEK SIA sekvenční injekční analýza FIA průtoková injekční analýza UV ultrafialové záření VIS viditelné záření IR infračervené záření CL chemiluminiscence I CL (I) intenzita chemiluminiscence NE norepinefrin bitartrát DOPA dihydroxyfenylalanin TK tlak krve GIT gastrointestinální trakt CAS registrační číslo MAO monoaminooxidáza COMT katechol o-methyltransferáza GCE elektroda ze skelného uhlíku modif. modifikována HPLC kapalinová chromatografie SPE extrakce pevnou fází ESI ionizace elektrosprayem MS hmotnostní spektrometrie LLE extrakce v systému kapalina/kapalina GC plynová chromatografie FID plamenově ionizační detektor LOD limit detekce LOQ limit kvantifikace % DO % deklarovaného obsahu 6

4 ÚVOD 7

4.1 Úvod a cíl práce Cílem této práce je vývoj a optimalizace metody pro stanovení norepinefrinu pomocí sekvenční injekční analýzy s chemiluminiscenční detekcí. Sekvenční injekční analýza je moderní technika umoţňující rychlou a automatizovanou analýzu řady látek. V posledních letech byla publikována celá řada prací zabývající se stanovením látek pomocí sekvenční injekční analýzy s chemiluminiscenční detekcí. V těchto pracích byla velice často pro detekci uţívána oxidace manganistanem draselným. Tento princip stanovení byl pouţit i v této práci. 8

5 TEORETICKÁ ČÁST 9

5.1 Sekvenční injekční analýza (SIA) Sekvenční injekční analýza (Sequential Injection Analysis, SIA) patří mezi průtokové analytické metody. Představuje moderní metodu umoţňující automatizaci práce při analýze velkých sérií vzorků a tím i její urychlení. Tato technika byla vyvinuta při odstraňování nevýhod a nedokonalostí průtokové injekční analýzy (Flow Injection Analysis, FIA). První informace o metodě SIA byly publikovány v roce 1991 Růţičkou a Marshallem. [1] 5.1.1 Princip FIA a SIA Základním principem obou metod je chemická reakce vzorku a činidel v průtokovém systému, která vede ke vzniku detekovatelného produktu o určitých vlastnostech. Tyto vlastnosti pak můţeme zaznamenat pouţitím vhodného detektoru. [1] První zmínky o metodě FIA pochází z roku 1975 a byly publikovány Růţičkou a Hansenem. U jednoduchých FIA technik (obr. 1) je nosný proud obsahující činidlo pomocí peristaltické pumpy přiváděn do systému kontinuálně. Do tohoto nosného proudu je pomocí dávkovacího ventilu se smyčkou nastříknut vzorek, přičemţ délka této smyčky určí objem injikovaného vzorku. Nosný proud pak unáší vzorek do reakční cívky, kde dochází k reakci mezi vzorkem a činidlem a vzniká detekovatelný produkt, jehoţ určitá vlastnost je zaznamenávána detektorem (obr.2) ve formě píku. Pro sestrojení kalibrační křivky se uţívá závislost výšky píku, plochy píku nebo šířky píku na koncentraci analytu ve vzorku. [2] U sloţitějších FIA technik bývá nosným proudem obvykle voda nebo pufr a činidla jsou dávkována pomocí dávkovacích ventilů. [1] Obr. 1: Schéma jednoduché FIA techniky [3] 10

Obr. 2: Princip FIA techniky [3] Na rozdíl od toho SIA technika pouţívá místo injekčního ventilu vícecestný selekční ventil, který umoţňuje dávkování vzorku a různých činidel v definovaných objemech. Dalším rozdílem je pouţití pístové pumpy namísto peristaltické. [2] U SIA technik je nejprve pístovou pumpou do systému nasát nosný proud, obvykle voda nebo pufr. Postupným přepínáním pozic selekčního ventilu jsou do mísící cívky nasáta činidla a vzorek. Na rozhraní mezi vzorkem a činidly dochází ke vzniku produktu. Aby promísení všech zón bylo dostatečné, následuje obrácení toku pomocí pístového čerpadla a promísení jednotlivých zón. Poté je selekční ventil přepnut do pozice k detektoru. V detektoru je zaznamenávána opět určitá vlastnost produktu (obr. 3). Vyhodnocení se provádí stejně jako u FIA techniky. Celý proces je řízen počítačem dle nastaveného programu. [2] Průtokové rychlosti v SIA se pohybují většinou kolem 1 ml/min a doba trvání jednoho měřícího cyklu většinou nepřesahuje 30 s. V tomto ohledu je ve většině případů srovnatelná s technikou FIA. [1] Obr. 3: Princip SIA techniky [3] 11

5.1.2 Porovnání SIA a FIA Výhody systému SIA: jednodušší přístrojové vybavení neţ u FIA - jedno čerpadlo, jeden selekční ventil účelnější vyuţití činidel a výrazné sníţení jejich spotřeby lepší promíchání reagencií díky obracení toku nosného proudu vyuţití selekčního ventilu namísto injekčního ventilu (můţeme například zavádět kalibrační standardy) [2] flexibilita, která je dána snadnou změnou parametrů pomocí počítače. [1] Nevýhody SIA: sníţená frekvence dávkování vzorku sloţitá počítačová technika a software [1] 5.1.3 Přístrojové vybavení SIA systém můţeme rozčlenit na několik základních částí (obr. 4): Čerpadlo Čerpadlo zajišťuje průtok kapalin celým systémem a to v obou směrech. Tok těchto kapalin by měl být přesně definovaný a reprodukovatelný. Čerpadlo by mělo zajistit práci s malými objemy. Velice důleţité je, aby funkce čerpadla byla řízena počítačem. Nejčastěji je pouţívána pístová pumpa. [2] Selekční ventil Selekční ventil umoţňuje nasávání roztoků ze zvolených pozic. Důleţitými rysy ventilu jsou malý mrtvý objem a nulové znečištění mezi jednotlivými porty. V praxi se pouţívají selekční ventily které mají 6 aţ 12 portů. [2] Mísící cívka Mísící cívka slouţí k dokonalému promíchání nasátých roztoků. [2] 12

Detektor Základním poţadavkem je přítomnost měřící průtokové cely. Lze vyuţít poměrně širokou řadu detektorů ( UV, VIS a IR fotometrické, fluorescenční a chemiluminiscenční detektory, potenciometrické detektory s iontově selektivními elektrodami, konduktometrické a elektrochemické detektory ) [2] Jednotlivé části systému jsou pospojovány většinou plastovými hadičkami o vnitřním průměru 0,7 0,8 mm. [1] Obr. 4: Schéma SIA analyzátoru [3] 13

5.2 Chemiluminiscence Chemiluminiscence (CL) patří mezi luminiscenční jevy a je definována jako emise elektromagnetického záření produkovaného chemickou reakcí. K emisi dochází při přechodu látky z elektronově excitovaného stavu do stavu základního, kdy je energie vyzářena ve formě fotonů. Míra emise je závislá na koncentraci látek schopných chemiluminiscence, proto se tohoto jevu vyuţívá pro analytické účely. [4] 5.2.1 Mechanismus chemiluminiscence Existují dva typy mechanismů: 1) u přímé reakce spolu reagují přímo substrát a oxidační činidlo v přítomnosti kofaktorů, případně katalyzátoru za vzniku meziproduktu nebo produktu v elektronově excitovaném stavu. Tato látka pak při přechodu do základního stavu vyzáří energii ve formě fotonu. 2) u nepřímé reakce dochází k přenosu energie z excitované látky na fluorofor, který pak při přechodu do základního stavu vyzáří foton. Této reakce se vyuţívá u těch látek, které nejsou schopné přímé CL reakce. Jako katalyzátory se pouţívají enzymy nebo kovové ionty, které sniţují aktivační energii a tím poskytují adekvátní prostředí pro reakci. Kofaktory jsou látky, které reagují se substrátem a tím umoţňují reakci a interakci s katalyzátorem. [4] chemiluminiscenční prekurzor + oxidant + (kofaktor) katalýza meziprodukt nebo produkt v exit. stavu (P*) fluorofor (F) PŘÍMÁ CHEMILUMINISCENCE P + hυ NEPŘÍMÁ CHEMILUMINISCENCE P + F* F + hυ Obr. 5: Mechanismus chemiluminiscence [4] 14

U přímé chemiluminiscence je velice často jako oxidační činidlo pouţíván manganistan draselný. Při reakci manganistanu se substrátem pravděpodobně vzniká Mn (II) v excitovaném stavu a při jeho přechodu do základního stavu dochází k emisi fotonu. Vhodné prostředí velice často vytváří kyselina sírová a polyfosforečná. Pouţití kyseliny sírové zajišťuje kyselé prostředí a zlepšuje reprodukovatelnost metody. Kyselina polyfosforečná zajišťuje opět kyselé prostředí a zřejmě také stabilizuje meziprodukty. Podobnou roli jako kyselina polyfosforečná má i polyfosfát. [5] 5.2.2 Požadavky na CL reakci 1) reakce musí být exotermické, to znamená, ţe při přechodu do základního stavu musí produkovat dostatek energie 2) při přechodu do základního stavu musí být energie vyzářena ve formě fotonu 3) u nepřímé reakce je důleţitá moţnost přenosu energie na vhodný fluorofor [4] 5.2.3 Faktory ovlivňující chemiluminiscenci Intenzita CL reakce je závislá na různých parametrech, které ovlivňují mnoţství výtěţku a rychlost reakce: chemická struktura CL prekurzorů, nejen centrální část obsahující elektronově excitovanou skupinu, ale také postranní řetězec povaha a koncentrace ostatních substrátů ovlivňujících CL reakci a podporující další nezářivé konkurenční procesy vybraný katalyzátor přítomnost kovových iontů, zvláště iontů prvků vedlejších skupin periodického systému zapojených do redoxních procesů teplota ph a iontová síla dielektrické vlastnosti rozpouštědla a sloţení roztoku přítomnost fluoroforů. [4] 15

5.2.4 Základní instrumentace Přístroj, který se pouţívá pro měření mnoţství emitovaného světla, se nazývá luminometr. Jedná se o velice jednoduchý přístroj, jehoţ hlavními součástmi jsou: zařízení pro zavádění a mísení reagencií, reakční cela, detektor emitovaného světla, systém pro získávání a zpracování signálu. Celý systém musí být zabezpečen tak, aby nedocházelo k vniknutí okolního světla a tedy ovlivnění výsledku. Detektor je navíc vybaven zrcadly, čočkami a dalším zařízením pro zvýšení účinnosti detekce. Obvykle není poţadován ţádný monochromátor, protoţe emise pochází z jedné látky a další látky tuto emisi ovlivní jen zřídka. Mnoţství emitovaného světla (I max ) je přímo úměrné koncentraci reagujících látek, proto s poklesem koncentrace reagujících sloţek klesá intenzita CL (I CL ) (obr. 6). CL emise má tedy přechodný charakter. Časový průběh emise světelného záření závisí na konkrétní CL reakci, můţe mít charakter od krátkého záblesku aţ po déle (několik minut) trvající záření. [4] Obr. 6: Závislost intenzity CL na reakčním čase a koncentraci analytu [4] 16

5.3 Norepinefrin (norepinefrin bitartrát) 5.3.1 Farmakologické vlastnosti Norepinefrin (noradrenalin, NE) je katecholaminový neurotransmiter, který zprostředkovává přenos informace na sympatické synapse. Jeho syntéza probíhá v presynaptické části, výchozí látkou je tyroxin, který je přes DOPU a dopamin přeměňován na noradrenalin. Po podráţdění sympatiku je pak spolu s ostatními mediátory uvolněn do synaptické štěrbiny a můţe ovlivnit receptory na postsynaptické membráně. [6] Obr. 7: Biosyntéza noradrenalinu [6] Obr. 8: Adrenergní synapse [6] Tyto takzvané adrenergní receptory rozdělujeme do dvou skupin α a β, které se dále člení na α 1, α 2 a β 1, β 2 a β 3. Norepinefrin ovlivňuje všechny tyto receptory v závislosti na dávce, nejvyšší afinitu má k α a β 1 receptorům. [6] 17

Tab. 1: Charakteristika adrenergních receptorů [6] Receptor Orgán/tkáň Účinek α 1 α 2 β 1 β 2 hladké svaly cév (arterioly) kontrakce (zvýšení TK) bronchy bronchodilatace GIT uvolnění GIT (sfingtery) kontrakce detrusor uvolnění sfinkter močového měchýře kontrakce děloha kontrakce muskulus dilatátor pupillae kontrakce aktivní mydriáza játra glykogenolýza presynaptické zakončení inhibice uvolnění mediátoru trombocyty stimulace agregace destiček srdce zvýšení frekvence, síly stahu, automaticity, zrychlení vodivosti juxtaglomerulární aparát uvolnění reninu β buňky pankreatu sekrece inzulinu hladké svalstvo cév příčně pruhovaných uvolnění (pokles diastolického svalů TK) hladké svalstvo bronchů uvolnění (bronchodilatace) děloha uvolnění (uterorelaxace) příčně pruhovaný sval třes β 3 lipocyty lipolýza 5.3.1.1 Farmakodynamické vlastnosti Norepinefrin bitartrát patří do skupiny sympatomimetik. Sympatomimetika jsou látky napodobující částečně nebo úplně funkci adrenalinu a noradrenalinu při podráţdění sympatického nervového systému. Tyto látky jsou také označovány jako adrenergní. Obecně se sympatomimetika rozdělují na alfa a beta podle typu ovlivňovaného receptoru. 18

Norepinefrin bitartrát stimuluje alfa- i beta-adrenergní receptory v závislosti na podané dávce. Díky tomu, ţe ovlivňuje receptory přímo, patří mezi sympatomimetika působící přímo. [7] Po podání niţších dávek do 2 mg/min dochází ke zvýšenému vychytávání draslíku v buňkách kosterních svalů, dále je aktivována glykogenolýza v játrech a také se zvyšuje frekvence a síla srdečních stahů. [7] Při dávkách 4 10 mg/min se kromě účinku na kosterní svaly, aktivace glykogenolýzy a účinku na hladkou svalovinu dělohy a respirační trakt zvyšují účinky na srdce a také se objevují slabé účinky na cévní hladkou a pilomotorickou svalovinu (vazokonstrikce, mydriáza apod.) Při dávkách nad 10 mg/min dochází k výraznému zvýšení účinku na veškerou cévní a pilomotorickou hladkou svalovinu, dále vzrůstá celkový periferní odpor, dochází také k agregaci trombocytů a inhibici lipolýzy v lipocytech. [7] Norepinefrin bitartrát se pouţívá pro prevenci nebo terapii akutní hypotenze. Někdy se také můţe pouţívat pro terapii šokových stavů, kdy pacient nereaguje na doplnění objemu tekutin například při infarktu myokardu, traumatu, sepsi, selhání ledvin, srdečních operacích, anafylaktické reakci apod. [7] 5.3.1.2 Farmakokinetické vlastnosti Norepinefrin bitartrát je podáván intravenózně. Tato látka je velice rychle enzymaticky inaktivována pomocí MAO a to v plazmě, játrech a ledvinách a pomocí COMT. Biologický poločas této látky je pouze asi 1 minuta. Norepinefrin bitartrát můţe procházet placentou, ale ne hematoencefalickou bariérou. Vylučuje se močí asi z 95% ve formě metabolitů. [7] 5.3.2 Chemické vlastnosti Norepinefrin hydrogen-tartrát monohydrát Je to monohydrát (1R)-2-amino-1-(3,4-dihydroxyfenyl)ethan-1-ol-hydrogen-(2R,3R)-2,3- dihydroxybutandioátu. [8] 19

Obr. 9: Vzorec norepinefrin bitartrátu [8] Číslo CAS je 69815-49-2. Molekulová hmotnost je M r = 337,28 g/mol, u bezvodého je M r = 319,27 g/mol. Jedná se o bílou nebo téměř bílou krystalickou látku, bez zápachu, snadno rozpustnou ve vodě, těţce rozpustnou v 96% etanolu a prakticky nerozpustnou v diethyletheru. [8] Teplota tání se pohybuje mezi 158 159 C. Působením vzdušného kyslíku na světle a zvláště v alkalickém prostředí se oxiduje na deriváty adrenochromu. [9] 20

5.4 Metody stanovení 5.4.1 Lékopisná metoda Je popsána metoda stanovení obsahu substance norepinefrin-hydrogen-tartrátu monohydrátu, acidimetrickou titrací v bezvodé kyselině octové. Odměrným roztokem je kyselina chloristá o koncentraci 0,1 mol/l v bezvodé kyselině octové. Jako indikátor se pouţívá krystalová violeť. 1 ml kyseliny chloristé 0,1 mol/l odpovídá 31,93 mg C 12 H 17 NO 9. [8] 5.4.2 Elektrochemické metody Tab. 2: Elektroforetické metody metoda matrice elektroda / elektrolyt / E p rozsah limit odkaz kalibrace detekce Voltametrie injekce, vzorky GCE modif. polykalconkarboxylovou kyselinou / 10 moči fosfátový pufr (ph=6) Cyklická voltametrie, GCE modif.uracilem 11 diferenční pulsní voltametrie Diferenční pulsní injekce GCE modif. polykalconkarboxylovou kyselinou / 160mV 10 300 12 voltametrie μmol/l Diferenční pulsní injekce a různé GCE modif. poly(eriochromovou černí T) / 150 mv 0,5 100 0,2 μmol/l 13 voltametrie vzorky μmol/l Amperometrie GCE modif. uhlíkovými nanovlákny rozptýlenými 14 v polyethyleniminu Cyklická voltametrie GCE v přítomnosti micel cetyltrimethylammonium 15 bromidu a dodecylsíranu sodného Voltametrie GCE modif. osmiem nebo poly(osmiumoxid ruthenium kyanidem) 1 1000 μmol/l 16 GCE elektroda ze skelného uhlíku 21

5.4.3 Separační metody 5.4.3.1 Chromatografické metody Tab. 3: Kapalinová chromatografie metoda matrice úprava před analýzou kolona / MF detekce rozsah kalibrace limit detekce HPLC vzorky SPE (práškový oxid hlinitý) slabý katex / acetonitril /voda ESI MS 5 500 0,45 plazmy krys 10:90 v/v a kyselina octová ng/ml ng/ml 0,1% v/v HPLC vzorky LLE MS 0,1 lidské moči ng/ml HPLC vzorky SPE elektrochemická 15 500 HPLC lidské moči vzorky lidského séra HPLC 5% dextrosové injekce C-18 kolona / 0,01 mol/l hydrogenftalát draselný a methanolu (92 : 8, v/v) nederivatizovaný silikagel (22 ± 1 C) / 5 mm fosfátový pufr (ph=3) a acetonitril (50:50 v/v) CL reakce luminolu s hexakyanoţelezitamen μg/l 5 1000 ng/ml 280 nm 1-128 μg/ml odkaz 17 18 19 1 ng/ml 20 26 ng/ml 21 Tab. 4: Plynová chromatografie metoda matrice kolona / nosný plyn GC injekce 30 m x 0.32 mm i.d. HP-5 s teplotním gradientem od 100 C (po1 min) aţ 250 C v 10 min / dusík ( 4ml/min) vnitřní standard fenyl hydrazin (10:1 v/v) detekce rozsah kalibrace FID 4 60 ng/μl injekce limit detekce 1,3 4 ng/μl injekce odkaz 22 22

5.4.3.2 Elektroforetické metody Tab. 5: Elektroforetické metody metoda matrice detekce rozsah kalibrace Kapilární injekce CL reakce N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminolu s elektrochromatografie hexakyanoţelezitanem v alkalickém prostředí Kapilární vzorky lidské nepřímá elektroluminiscence vyuţívající tris(2,2'- elektroforéza moči bipyridyl)ruthenium(ii)/tripropylaminový systém Mikročipová nádor dřeně fluorescenční systém s Hg lampou jako excitační zdroj a čítač elektroforéza nadledvin u krys fotonů jako detektor limit detekce (S/N = 3) 0,08 μmol/l (S/N = 3) 2,6 x 10-8 mol/l (S/N = 3) 0,49 fmol odkaz 23 24 25 5.4.4 Průtokové metody FIA Tab. 6: Průtokové metody FIA matrice detekce frekvence dávkování rozsah kalibrace limit detekce odkaz Farmaceutické CL reakce luminolu s jódem v alkalickém prostředí 1,1 20 μg/l 0,34 μg/l 26 přípravky Farmaceutické přípravky piezoelektrická s pouţitím dodecyl fenyl sulfátu sodného 120 vzorků/hod 0,01 1,20 mg/ml 5μg/ml 27 5.4.5 Spektrofluorimetrická metoda Tab. 7: Spektrofluorimetrická metoda matrice činidlo exitační / emisní vlnová délka rozsah kalibrace Vzorky moči, oxidace norepinefrinu dusičnanem rtuťnatým, tento produkt pak 420 / 507 nm 0,01 14 injekce kondenzuje s ethylendiaminem. (aceton jako zesilovač) μmol/l limit odkaz detekce 2,5 nmol/l 28 23

6 PRAKTICKÁ ČÁST 24

6.1 Použité přístroje Pro váţení byly pouţity analytické váhy Sartorius analytic A200S. Měření bylo provedeno v SIA systému, který se skládal z pístového čerpadla CAVRO XL 3000 o objemu 2,5 ml (Cavro Scientific Instruments Inc., USA), selekčního ventilu s 10 porty Vici-Valco (Valco Instruments Co., Inc., USA), průtokového fluorescenčního detektoru model FS 970 Schoeffel Instrument Corp. (USA) s vypnutou UV lampou, vybavený spirálovitou CL jednotkou vyrobenou na FAF. 6.2 Použité chemikálie Norepinephrine L-bitartrate hydrate 99% Aldrich Chem. Co. Manganistan draselný p. a. Balex Pardubice-Rosice n. L. Polyfosfát sodný p. a. 96% Aldrich Kyselina sírová 96% p. a. Lachema Neratovice Chelaton 3 čistý Lachema Neratovice Pyrosiřičitan sodný čistý Lachema Neratovice Methanol Aldrich Ethanol Aldrich ultračistá voda vyrobená v zařízení Millipore Milli-Q RG injekce Noradrenalin léčiva, šarţe 20 10 108 Zentiva 6.3 Příprava roztoků 6.3.1 Zásobní roztoky zásobní roztok norepinefrin bitartrátu (Mr = 337,26 g/mol) o koncentraci 0,949 mmol/l naváţka 0,0160 g byla převedena do 50 ml odměrné baňky a rozpuštěna v methanolu zásobní roztok manganistanu draselného (Mr = 158,04 g/mol) o koncentraci 10 mmol/l naváţka 0,1580 g byla převedena do 100 ml odměrné baňky a rozpuštěna v ultračisté vodě 25

zásobní roztok polyfosfátu sodného 1 (Mr = 1285,54 g/mol) o koncentraci 50 mmol/l naváţka 6,4277 g byla převedena do 100 ml odměrné baňky a rozpuštěna v ultračisté vodě zásobní roztok polyfosfátu sodného 2 (Mr = 1285,54 g/mol) o koncentraci 200 mmol/l naváţka 25,7108 g byla převedena do 100 ml odměrné baňky a rozpuštěna v ultračisté vodě zásobní roztok kyseliny sírové (Mr = 98, 07 g/mol, ρ = 18337 g/cm 3 ) o koncentraci 2 mol/l 10,7 ml 96% kyseliny sírové bylo převedeno do 100 ml odměrné baňky a doplněno ultračistou vodou 6.3.2 Pracovní roztoky pracovní roztok norepinefrin bitartrátu o koncentraci 1,098.10-5 mol/l 1 ml zásobního roztoku o koncentraci 0,949.10-3 mol/l byl převeden do 50 ml odměrné baňky a doplněn ultračistou vodou pracovní roztoky manganistanu draselného v rozsahu koncentrací 0,2.10-3 10.10-3 mol/l byly připraveny naředěním zásobního roztoku ultračistou vodou do 10 ml odměrných baněk pracovní roztoky polyfosfátu sodného v rozsahu koncentrací 1.10-3 100.10-3 mol/l byly připraveny naředěním zásobních roztoků ultračistou vodou do 10 ml odměrných baněk pracovní roztoky kyseliny sírové v rozsahu koncentrací 0,01 2 mol/l byly připraveny naředěním zásobního roztoku ultračistou vodou do 10 ml odměrných baněk pracovní roztoky norepinefrin bitartrátu o koncentraci 1,098.10-5 mol/l v methanolu byly připraveny převedením 200 μl zásobního roztoku do 10 ml odměrné baňky, přidáním příslušného mnoţství methanolu a doplněním ultračistou vodou 26

pracovní roztoky norepinefrin bitartrátu o koncentraci 1,098.10-5 mol/l v ethanolu byly připraveny převedením 200 μl zásobního roztoku do 10 ml odměrné baňky, přidáním příslušného mnoţství ethanolu a doplněním ultračistou vodou 27

6.4 Optimalizace metody Cílem optimalizace bylo zajistit co nejlepší podmínky pro stanovení norepinefrin bitartrátu. Optimalizace se týkala koncentrací a objemů jednotlivých činidel, průtokových rychlostí, napětí a také příslušného prostředí pro stanovení norepinefrin bitartrátu. Během měření byla zaznamenávána odezva na detektoru, jako výška jednotlivých píků, která pak byla přepočítávána na intenzitu chemiluminiscence I (na). Optimalizačním kritériem bylo dosaţení co největší intenzity CL. Intenzitu chemiluminiscence I (na) vypočítáme jako: průrůměrná _ výška_ píku I rozsah( na) [29] 1,25 Číselné hodnoty uvedené v tabulkách kurzívou jsou výšky píků odečtené při daném rozsahu citlivosti detektoru programem FaFSIA. Pro optimalizaci byl navrţen v programu FaFSIA následující měřící cyklus: Tab. 9: Měřící cyklus Syringe pump valve positron IN Syringe pump set flow rate (μl/s) 100 Syringe pump aspirate (μl) 500 Syringe pump valve positron OUT Multi-port valve set valve position 1 polyfosfát sodný Syringe pump aspirate (μl) 30 Multi-port valve set valve position 2 norepinefrin bitartrát Syringe pump aspirate (μl) 30 Multi-port valve set valve position 3 kyselina sírová Syringe pump aspirate (μl) 30 Multi-port valve set valve position 4 manganistan draselný Syringe pump aspirate (μl) 20 Multi-port valve set valve position 8 detektor Syringe pump set flow rate (μl/s) 100 Syringe pump empty siringe 6.4.1 Optimalizace koncentrací činidel Vliv koncentrace činidel na intenzitu CL byl sledován v následujících rozsazích: polyfosfát sodný 1 100 mm kyselina sírová 0,01 2 M manganistan draselný 0,2 10 mm 28

intenzita CL (n intenzita CL (na) 6.4.1.1 Koncentrace manganistanu draselného Pouţité podmínky: napětí 450 V rozsah c polyfosfátu c H 2 SO 4 c NE 500 na 20 mm 0,2 M 18,98 μm Tab. 10: Závislost intenzity CL na koncentraci manganistanu draselného c KMnO 4 (mm) 0,2 0,4 0,5 0,6 1 2 1. 0,820 0,749 0,748 0,779 0,886 0,655 2. 0,843 0,747 0,709 0,774 0,851 0,675 3. 0,676 0,749 0,745 0,805 0,845 0,677 průměr 0,780 0,748 0,734 0,786 0,861 0,669 I (na) 311,87 299,33 293,60 314,40 344,27 267,60 Tab. 11: Závislost intenzity CL na koncentraci manganistanu draselného c KMnO 4 (mm) 3 4 5 6 8 10 1. 0,611 0,566 0,479 0,459 0,390 0,329 2. 0,560 0,554 0,481 0,440 0,395 0,335 3. 0,581 0,526 0,484 0,461 0,369 0,346 průměr 0,584 0,549 0,481 0,453 0,385 0,337 I (na) 233,60 219,47 192,53 181,33 153,87 134,67 350 300 250 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8 10 c KMnO 4 (mm) c KMnO4 (mm) Obr. 10: Závislost intenzity CL na koncentraci manganistanu draselného Z výše uvedené závislosti vyplývá, ţe optimální koncentrace manganistanu draselného byla 1 mm. 29

intenzita CL (na) intenzita CL (na 6.4.1.2 Koncentrace kyseliny sírové Pouţité podmínky: napětí 450 V rozsah c polyfosfátu c KMnO 4 c NE 500 na 20 mm 1 mm 18,98 μm Tab. 12: Závislost intenzity CL na koncentraci kyseliny sírové c H 2 SO 4 (M) 0,01 0,05 0,08 0,09 0,1 0,2 1. 0,297 0,882 0,880 0,919 0,935 0,775 2. 0,272 0,826 0,888 0,873 0,896 0,749 3. 0,296 0,863 0,862 0,897 0,906 0,775 průměr 0,288 0,857 0,877 0,896 0,912 0,766 I (na) 115,33 342,80 350,67 358,53 364,93 306,53 Tab. 13: Závislost intenzity CL na koncentraci kyseliny sírové c H 2 SO 4 (M) 0,4 0,6 0,8 1 2 1. 0,645 0,534 0,464 0,423 0,274 2. 0,622 0,507 0,466 0,421 0,285 3. 0,613 0,528 0,455 0,406 0,285 průměr 0,627 0,523 0,462 0,417 0,281 I (na) 250,67 209,20 184,67 166,67 112,53 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 c H 2 SO 4 (M) c H2SO4 (M) Obr. 11: Závislost intenzity CL na koncentraci kyseliny sírové Z výše uvedené závislosti vyplývá, ţe optimální koncentrace kyseliny sírové byla 0,1 M. 30

intenzita CL (na) 6.4.1.3 Koncentrace polyfosfátu sodného Pouţité podmínky: napětí 450 V rozsah c H 2 SO 4 c KMnO 4 c NE 500 na 0,1 M 1 mm 18,98 μm Tab. 14: Závislost intenzity CL na koncentraci polyfosfátu sodného c polyfosfátu (mm) 1 5 10 15 20 25 30 35 1. 0,327 0,609 0,79 0,822 0,833 0,876 0,882 0,877 2. 0,319 0,602 0,766 0,803 0,799 0,891 0,844 0,846 3. 0,334 0,604 0,768 0,803 0,846 0,885 0,881 0,853 průměr 0,327 0,605 0,775 0,809 0,826 0,884 0,869 0,859 I (na) 130,67 242,00 309,87 323,73 330,40 353,60 347,60 343,47 Tab. 15: Závislost intenzity CL na koncentraci polyfosfátu sodného c polyfosfátu (mm) 40 50 60 70 80 90 100 1. 0,863 0,83 0,713 0,691 0,596 0,532 0,484 2. 0,846 0,785 0,686 0,636 0,563 0,532 0,486 3. 0,853 0,792 0,699 0,636 0,61 0,538 0,517 průměr 0,854 0,802 0,699 0,654 0,590 0,534 0,496 I (na) 341,60 320,93 279,73 261,73 235,87 213,60 198,27 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 c polyfosfátu sodného (mm) c polyfosfátu (mm) Obr. 12: Závislost intenzity CL na koncentraci polyfosfátu sodného Z výše uvedené závislosti vyplývá, ţe optimální koncentrace polyfosfátu sodného byla 25 mm. 31

6.4.2 Vliv obsahu methanolu a ethanolu na intenzitu CL Stanovení norepinefrin bitartrátu bylo zkoumáno v prostředí methanolu a ethanolu v rozsazích: methanol 12 82% ethanol 10 80% Pouţité podmínky: napětí 450 V rozsah c polyfosfátu c NE c H 2 SO 4 c KMnO 4 500 na 25 mm 18,98 μm 0,1 M 1 mm Tab. 16: Vliv obsahu methanolu na intenzitu CL c MeOH (%) v/v 12 22 32 42 52 62 72 82 1. 0,827 0,964 0,991 0,944 0,961 1,084 0,927 0,688 2. 0,834 0,913 0,973 0,944 0,919 1,041 0,894 0,691 3. 0,825 0,905 0,956 0,925 0,94 1,025 0,982 0,648 průměr 0,829 0,927 0,973 0,938 0,940 1,050 0,934 0,676 I (na) 331,47 370,93 389,33 375,07 376,00 420,00 373,73 270,27 Tab. 17: Vliv obsahu ethanolu na intenzitu CL c EtOH (%) v/v 10 20 30 40 50 60 70 80 1. 1,202 1,428 1,508 1,587 1,637 1,748 1,826 1,854 2. 1,201 1,445 1,534 1,598 1,637 1,776 1,855 1,907 3. 1,226 1,479 1,526 1,607 1,718 1,762 1,830 1,884 průměr 1,210 1,451 1,523 1,597 1,664 1,762 1,837 1,882 I (na) 483,87 580,27 609,07 638,93 665,60 704,80 734,80 752,67 Tab. 18: Vliv obsahu ethanolu na intenzitu CL slepý pokus c EtOH (%) slepák 10 20 30 40 50 60 70 80 1. 0,478 0,633 0,707 0,775 0,833 0,912 0,973 1,004 2. 0,498 0,645 0,716 0,77 0,856 0,887 0,963 1,013 3. 0,504 0,628 0,690 0,762 0,842 0,882 0,945 0,986 průměr 0,493 0,635 0,704 0,769 0,844 0,894 0,960 1,001 I (na) 197,33 254,13 281,73 307,60 337,47 357,47 384,13 400,40 Tab. 19: Vliv obsahu ethanolu na intenzitu CL výsledné hodnoty EtOH (%) - slepák 0,716 0,815 0,818 0,828 0,820 0,868 0,877 0,881 I (na) 286,53 326,13 327,33 331,33 328,13 347,33 350,67 352,27 32

intenzita CL (na) intenzita CL (na 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 c MeOH, EtOH (%) c MeOH/EtOH (%) MeOH EtOH Obr. 13: Vliv methanolu a ethanolu na intenzitu CL Z výše uvedeného grafu vyplývá, ţe vliv ethanolu na stanovení rostl se stoupající koncentrací jen nepatrně a v případě methanolu u vysokých koncentrací klesal. Protoţe se hodnoty intenzit CL obou prostředí příliš nelišily od hodnot ve vodném prostředí, byla následující měření prováděna ve vodném prostředí. 6.4.3 Optimalizace objemů a průtokových rychlostí Pro optimalizaci těchto parametrů byl pouţit program OPTIMSIA s metodou SIMPLEX, přičemţ byla zachována struktura měřícího cyklu. Jednotlivé parametry byly testovány v následujících rozmezích: objem polyfosfátu sodného 1 60 μl výchozí 30 μl objem norepinefrin bitartrátu 1 80 μl výchozí 30 μl objem kyseliny sírové 1 60 μl výchozí 30 μl objem manganistanu draselného 1 60 μl výchozí 30 μl průtoková rychlost 10 150 μl/s výchozí 100 μl/s Pouţité podmínky: napětí 450 V rozsah 500 na c polyfosfátu 25 mm c NE 18,98 μm c H 2 SO 4 0,1 M c KMnO 4 1 mm 33

Tab. 20: Hodnoty získané pomocí metody SIMPLEX Pořadové číslo polyfosfát (μl) vzorek (μl) H 2 SO 4 (μl) KMnO 4 (μl) rychlost (μl/s) I (na) 16 46 70 16 19 94 633,404 17 37 73 24 23 97 649,225 18 37 80 23 23 97 679,649 19 40 80 20 24 88 694,454 20 40 80 20 24 88 696,839 21 44 80 24 21 91 703,629 22 44 80 24 21 91 725,705 23 44 80 21 25 92 712,773 24 42 80 20 22 92 704,077 25 41 80 22 23 92 694,921 26 47 80 20 23 85 705,886 Pomocí metody SIMPLEX jsme získali výše uvedené hodnoty objemů a průtokové rychlosti, tyto parametry byly pouţity ve všech následujících měřeních. Pro kontrolu byl ještě optimalizován objem vzorku bez pouţití programu OPTIMSIA. Podmínky byly ponechány stejné a byly pouţity optimalizované hodnoty objemů a průtokové rychlosti. Tab. 21: Závislost intenzity CL na objemu vzorku vzorek (μl) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1. 0 0,306 0,472 0,636 0,797 0,922 1,028 1,153 1,241 1,327 2. 0 0,310 0,466 0,649 0,781 0,918 1,046 1,147 1,229 1,320 3. 0 0,307 0,452 0,648 0,788 0,920 1,046 1,159 1,232 1,330 průměr 0,00 0 0,308 0,463 0,644 0,789 0,920 1,040 1,153 1,234 1,326 I (na) 0,00 123,0 7 185,3 3 257,7 3 315,4 7 368,0 0 416,0 0 461,2 0 493,6 0 530,2 7 Tab. 22: Závislost intenzity CL na objemu vzorku vzorek (μl) 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 1. 1,380 1,440 1,495 1,498 1,583 1,561 1,510 1,517 1,537 1,503 2. 1,387 1,465 1,475 1,492 1,506 1,528 1,542 1,565 1,554 1,513 3. 1,411 1,457 1,474 1,503 1,553 1,557 1,533 1,535 1,529 1,483 průměr 1,393 1,454 1,481 1,498 1,547 1,549 1,528 1,539 1,540 1,500 I (na) 557,0 7 581,6 0 592,5 3 599,0 7 618,9 3 619,4 7 611,3 3 615,6 0 616,0 0 599,8 7 34

intenzita CL (na) intenzita CL (na 700 600 500 400 300 200 100 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 vzorek (μl) vzorek (μl) Obr. 14: Závislost intenzity CL na objemu vzorku Z grafu vyplývá, ţe optimální objem norepinefrin bitartrátu byl 80 μl a výsledek se shodoval s výše uvedeným. 6.4.4 Optimalizace napětí Byla zjišťována optimální hodnota napětí. Tato hodnota byla sledována v závislosti na intenzitě chemiluminiscence a bylo přihlíţeno i k velikosti šumu. Napětí bylo zkoumáno v rozsahu: 350 450 V. Pouţité podmínky: c polyfosfátu 25 mm c NE 18,98 μm c H 2 SO 4 0,1 M c KMnO 4 1 mm 35

Tab. 23: Závislost intenzity CL na napětí napětí (V) 350 400 450 1. 0,258 0,262 0,267 1,089 1,100 1,089 1,757 1,740 1,717 2. 0,253 0,259 0,257 1,081 1,072 1,070 1,737 1,760 1,750 3. 0,255 0,261 0,264 1,109 1,094 1,073 1,768 1,757 1,745 průměr 0,255 0,261 0,263 1,093 1,089 1,077 1,754 1,752 1,737 rozsah (na) 200 200 200 200 200 200 500 500 500 I (na) 40,85 41,71 42,03 174,88 174,19 172,37 701,60 700,93 694,93 šum 0,027 0,030 0,030 0,036 0,029 0,029 0,044 0,033 0,033 šum (na) 4,32 4,72 4,72 5,71 4,58 4,58 17,76 13,32 13,32 I / šum (na) 9,46 8,84 8,90 30,62 38,07 37,67 39,50 52,62 52,17 Po porovnání velikosti signálu a šumu bylo jako optimální napětí zvoleno 450 V. 6.5 Kalibrační závislosti Pro sestavení kalibrační závislosti byly připraveny roztoky norepinefrin bitartrátu v rozsahu koncentrací 4,7.10-7 0,949.10-4 mol/l. Kalibrační křivka pak představovala závislost intenzity CL na koncentraci norepinefrin bitartrátu. Poté byla statisticky vyhodnocena. Příprava kalibračních roztoků Kalibrační roztoky o koncentracích 4,7.10-7 1,898.10-5 mol/l byly připraveny naředěním pracovního roztoku ultračistou vodou do 10 ml odměrných baněk Kalibrační roztoky o koncentracích 2,373.10-5 0,949.10-4 mol/l byly připraveny naředěním zásobního roztoku ultračistou vodou do 10 ml odměrných baněk Podmínky kalibrace: napětí 450 V c polyfosfátu 25 mm 44 μl NE 80 μl c H 2 SO 4 0,1 M 24 μl c KMnO 4 1 mm 21 μl průtoková rychlost 91 μl/s 36

intenzita intenzita CL (na) C Tab. 24: Kalibrační závislost norepinefrinu c NE (μmol/l) 0,47 0,95 1,90 4,75 6,64 9,49 13,29 15,18 1. 0,351 0,390 0,585 1,239 1,576 0,889 1,219 1,374 2. 0,340 0,381 0,585 1,231 1,577 0,887 1,235 1,383 3. 0,309 0,384 0,589 1,224 1,591 0,891 1,232 1,382 průměr 0,333 0,385 0,586 1,231 1,581 0,889 1,229 1,380 rozsah (na) 100 200 200 200 200 500 500 500 I (na) 26,67 61,60 93,81 197,01 253,01 355,60 491,47 551,87 Tab. 25: Kalibrační závislost norepinefrinu c NE (μmol/l) 18,98 23,73 28,47 33,22 27,96 42,71 47,45 94,90 1. 1,739 1,069 1,259 1,438 1,636 1,668 1,718 1,797 2. 1,749 1,054 1,261 1,426 1,654 1,678 1,767 1,823 3. 1,728 1,064 1,261 1,404 1,666 1,742 1,740 1,817 průměr 1,739 1,062 1,260 1,423 1,652 1,696 1,742 1,812 rozsah (na) 500 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 I (na) 695,47 849,87 1008,27 1138,13 1321,60 1356,80 1393,33 1449,87 1400 1200 y = 33,923x + 34,839 R 2 = 0,9994 1000 800 600 400 200 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 c (μmol/l) c Obr. 15: Kalibrační závislost norepinefrinu Pro sestavení kalibrační křivky byla 1,044.10-6 4,176.10-5 mol/l. zvolena lineární oblast v rozmezí koncentrací 37

Rovnice regrese y = kx + q, kde y je intenzita CL (na), k je směrnicí přímky, x je koncentrace norepinefrinu (μmol/l) a q absolutní člen je y = 33,923x + 34,839. Korelační koeficient r byl 0,9997. 6.6 Opakovatelnost metody Opakovatelnost metody byla provedena pro dvě rozdílné koncentrace norepinefrin bitartrátu. Přičemţ bylo provedeno 10 po sobě jdoucích měření ve třech sériích. Poté byly vypočteny směrodatné odchylky s s 1 n n i 1 ( x i x) 2 a relativní směrodatné odchylky s r % kde n je počet měření, průměru [29]. s 100 s r x x i x absolutní odchylka jednotlivých výsledků od aritmetického Pouţité podmínky: napětí 450 V rozsah 500 na c polyfosfátu 25 mm 44 μl NE 80 μl c H 2 SO 4 0,1 M 24 μl c KMnO 4 1 mm 21 μl průtoková rychlost 91 μl/s Tab. 26: Opakovatelnost metody při koncentraci norepinefrin bitartrátu 4,75 μmol/l číslo měření průměr I (na) s s r (%) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 0,492 0,459 0,488 0,484 0,484 0,472 0,464 0,462 0,451 0,466 0,472 188,88 0,0132 2,80 0,468 0,471 0,447 0,462 0,487 0,449 0,478 0,470 0,456 0,476 0,466 186,56 0,0122 2,62 0,476 0,466 0,461 0,465 0,437 0,478 0,474 0,449 0,464 0,442 0,459 183,68 0,0169 2,92 2,78 Tab. 27: Opakovatelnost metody při koncentraci norepinefrin bitartrátu 18,98 μmol/l číslo měření průměr I (na) s s r (%) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 1,746 1,771 1,759 1,718 1,713 1,752 1,764 1,746 1,720 1,718 1,741 696,28 0,0205 1,18 1,806 1,799 1,769 1,762 1,796 1,776 1,771 1,787 1,781 1,770 1,782 712,68 0,0140 0,79 1,774 1,773 1,766 1,791 1,707 1,790 1,726 1,792 1,744 1,781 1,764 705,76 0,0278 1,58 1,18 38

Průměrné relativní směrodatné odchylky se pohybovaly v rozmezí 1,18 2,78 % a proto můţeme říci, ţe metoda poskytovala opakovatelné výsledky. 6.7 LOD, LOQ Pro výpočet hodnot limitu detekce (LOD) a limitu kvantifikace (LOQ) byla pouţita průměrná hodnota šumu naměřená při napětí 450 V (tab. 23). Pro výpočet limitu detekce jsme pouţili trojnásobek šumu dosazený do rovnice regrese (obr. 15) a pro výpočet limitu kvantifikace jsme pouţili desetinásobek. Limit detekce byl 0,28 μmol/l a limit kvantifikace byl 3,34 μmol/l. 6.8 Vliv rušících látek Injekce norepinefrin bitartrátu obsahují kromě účinné látky také dihydrát edetanu sodného (Chelaton 3) a disiřičitan sodný (pyrosiřičitan sodný). Byl tedy zjišťován vliv těchto látek na vlastní stanovení. 6.8.1 Vliv Chelatonu 3 zásobní roztok Chelatonu 3 (Mr = 372,24 g/mol) o koncentraci 0,01 mmol/l naváţka 0,3722 g byla převedena do 100 ml odměrné baňky a rozpuštěna v ultračisté vodě. pracovní roztoky Chelatonu 3 byly připraveny naředěním zásobního roztoku ultračistou vodou do 10 ml odměrných baněk Pouţité podmínky: napětí 450 V rozsah 500 na c polyfosfátu 25 mm 44 μl NE 9,49 μm 80 μl c H 2 SO 4 0,1 M 24 μl c KMnO 4 1 mm 21 μl průtoková rychlost 91 μl/s 39

Tab. 28: Vliv Chelatonu 3 na stanovení norepinefrinu c (μmol/l) NE NE+5μmol/l NE+10μmol/l NE+200μmol/l NE+300μmol/l 1. 0,830 0,851 0,831 0,836 0,845 2. 0,849 0,852 0,865 0,841 0,819 3. 0,833 0,828 0,837 0,841 0,845 průměr 0,837 0,844 0,844 0,839 0,836 I (na) 334,93 337,47 337,73 335,73 334,53 Z výše uvedené tabulky vyplývá, ţe Chelaton 3 neměl na stanovení vliv. 6.8.2 Vliv disiřičitanu sodného zásobní roztok disiřičitanu sodného (Mr = 190,11 g/mol) o koncentraci 0,001 mmol/l naváţka 0,0190 g byla převedena do 100 ml odměrné baňky a rozpuštěna v ultračisté vodě. pracovní roztoky disiřičitanu sodného byly připraveny naředěním zásobního roztoku ultračistou vodou do 10 ml odměrných baněk Pouţité podmínky: napětí 450 V rozsah 500 na c polyfosfátu 25 mm 44 μl NE 9,49 μm 80 μl c H 2 SO 4 0,1 M 24 μl c KMnO 4 1 mm 21 μl průtoková rychlost 91 μl/s Tab. 29: Vliv disiřičitanu sodného na stanovení norepinefrinu c (μmol/l) NE NE+2μmol/l NE+5μmol/l NE+10μmol/l NE+200μmol/l 200μmol/l 1. 1,059 0,972 0,861 0,893 1,168 0,074 2. 1,046 0,976 0,856 0,900 1,158 0,067 3. 1,049 0,972 0,833 0,879 1,157 0,070 40

průměr 1,051 0,973 0,850 0,891 1,161 0,070 I (na) 420,53 389,33 340,00 356,27 464,40 28,13 Z výše uvedené tabulky vyplývá, ţe disiřičitan sodný má na stanovení vliv. 6.8.3 Odstranění vlivu disiřičitanu sodného Protoţe disiřičitan sodný měl na stanovení norepinefrinu vliv, byla snaha rozloţit disiřičitan na oxid siřičitý okyselením vzorku kyselinou sírovou a vloţením okyseleného vzorku na ultrazvukovou lázeň. Výsledek tohoto postupu však nebyl uspokojivý. 6.9 Stanovení norepinefrin bitartrátu Norepinefrin bitartrát je součástí injekčního roztoku NORADRENALIN LÉČIVA. Tento přípravek obsahuje 1,8872 mg norepinefrin bitartrátu (= 1,000 mg norepinefrinu). Tato látka je rozpuštěna v 1 ml injekčního roztoku (1:1000). Pomocnými látkami jsou disiřičitan sodný, dihydrát edetanu disodného, voda pro injekci. 6.9.1 Kalibrace Pro kontrolu byla zopakována kalibrace. Podmínky kalibrace: napětí 450 V c polyfosfátu 25 mm 44 μl NE 80 μl c H 2 SO 4 0,1 M 24 μl c KMnO 4 1 mm 21 μl průtoková rychlost 91 μl/s Tab. 30: Kalibrační závislost norepinefrinu c NE (μmol/l) 4,75 9,49 15,18 18,98 23,73 33,22 1. 1,988 1,331 1,917 1,140 1,434 1,916 2. 1,993 1,314 1,959 1,200 1,429 1,907 3. 1,992 1,340 1,939 1,176 1,432 1,913 průměr 1,991 1,328 1,938 1,172 1,432 1,912 rozsah (na) 200 500 500 1000 1000 1000 I (na) 318,56 531,33 775,33 937,60 1145,33 1529,60 41

intenzita intenzita CL (na) C s t a n d a r d 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 y = 42,577x + 125,46 R 2 = 0,9997 0 5 10 15 20 25 30 35 c (μmol/l) c Obr. 16: Kalibrační závislost norepinefrinu Pro sestavení kalibrační křivky byla zvolena lineární oblast v rozmezí koncentrací 4,75.10-6 33,22.10-5 mol/l. Rovnice regrese y = kx + q, kde y je intenzita CL (na), k je směrnicí přímky, x je koncentrace norepinefrin bitartrátu (μmol/l) a q absolutní člen je y = 42,577x + 125,46. Korelační koeficient r byl 0,9998. 6.9.2 Stanovení norepinefrin bitartrátu v injekcích Injekce byly ředěny, tak ţe jsme z ampule odebrali 100 μl injekčního roztoku, převedli jej do 50 ml odměrné baňky a doplnili ultračistou vodou. Další ředění bylo provedeno odebráním 150 a 200 μl injekčního roztoku. Měření bylo provedeno v šesti sériích po třech měřeních. Zjištěná intenzita CL byla přepočítána na hmotnost účinné látky v injekci. A tento výsledek byl porovnán se skutečným mnoţstvím účinné látky v injekci a vyjádřen v procentech. Pro přepočet intenzity CL na hmotnost účinné látky byla pouţita rovnice regrese z výše uvedené kalibrační křivky. Pro porovnání byl pouţit také přepočet intenzity CL pomocí standardu z výše uvedené kalibrace. Za standard byl zvolen pracovní roztok o koncentraci 1,898.10-5 mol/l. 42

Podmínky: napětí 450 V c polyfosfátu 25 mm 44 μl NE 80 μl c H 2 SO 4 0,1 M 24 μl c KMnO 4 1 mm 21 μl průtoková rychlost 91 μl/s Tab. 31: Analýza injekcí (100 μl), výpočet na základě kalibrační křivky 1. 1,258 1,271 1,277 1,274 1,267 1,270 2. 1,304 1,271 1,282 1,256 1,252 1,255 3. 1,274 1,272 1,258 1,249 1,258 1,231 průměr 1,279 1,271 1,272 1,260 1,259 1,252 rozsah (na) 500 500 500 500 500 500 I (na) 511,47 508,53 508,93 503,87 503,60 500,80 m (mg) 1,4473 1,4363 1,4378 1,4188 1,4178 1,4073 % DO 76,69 76,11 76,19 75,18 75,13 74,57 průměr (%) 75,64 s 0,7345 s r (%) 0,84 Tab. 32: Analýza injekcí (100 μl), výpočet na základě porovnání se standardem 1. 1,258 1,271 1,277 1,274 1,267 1,270 2. 1,304 1,271 1,282 1,256 1,252 1,255 3. 1,274 1,272 1,258 1,249 1,258 1,231 průměr 1,279 1,271 1,272 1,260 1,259 1,252 rozsah (na) 500 500 500 500 500 500 I (na) 511,47 508,53 508,93 503,87 503,60 500,80 m (mg) 1,6528 1,6433 1,6446 1,6283 1,6274 1,6183 % DO 87,58 87,08 87,15 86,28 86,23 85,75 průměr (%) 86,68 s 0,6331 s r (%) 0,72 Tab. 33: Analýza injekcí (150 μl), výpočet na základě kalibrační křivky 1. 1,872 1,913 1,874 1,893 1,903 1,874 2. 1,857 1,892 1,894 1,879 1,925 1,871 3. 1,888 1,886 1,876 1,906 1,904 1,903 průměr 1,872 1,897 1,881 1,893 1,911 1,883 rozsah (na) 500 500 500 500 500 500 I (na) 748,93 758,80 752,53 757,07 764,27 753,07 m (mg) 1,5584 1,5831 1,5674 1,5787 1,5967 1,5687 % DO 82,58 83,88 83,05 83,65 84,61 83,12 průměr (%) 83,48 s 0,6569 s r (%) 0,75 43

Tab. 34: Analýza injekcí (150 μl), výpočet na základě porovnání se standardem 1. 1,872 1,913 1,874 1,893 1,903 1,874 2. 1,857 1,892 1,894 1,879 1,925 1,871 3. 1,888 1,886 1,876 1,906 1,904 1,903 průměr 1,872 1,897 1,881 1,893 1,911 1,883 rozsah (na) 500 500 500 500 500 500 I (na) 748,93 758,80 752,53 757,07 764,27 753,07 m (mg) 1,6135 1,6347 1,6212 1,6310 1,6465 1,6224 % DO 85,49 86,62 85,91 86,42 87,25 85,97 průměr (%) 86,36 s 0,5662 s r (%) 0,65 Tab. 35: Analýza injekcí (200 μl), výpočet na základě kalibrační křivky 1. 1,257 1,265 1,250 1,257 1,259 1,273 2. 1,247 1,248 1,277 1,250 1,263 1,271 3. 1,255 1,264 1,262 1,244 1,242 1,249 průměr 1,253 1,259 1,263 1,250 1,255 1,264 rozsah (na) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 I (na) 1002,40 1007,20 1010,40 1000,27 1003,73 1011,47 m (mg) 1,6440 1,6530 1,6590 1,6400 1,6465 1,6610 % DO 87,11 87,59 87,91 86,90 87,24 88,01 průměr (%) 87,46 s 0,4088 s r (%) 0,47 Tab. 36: Analýza injekcí (200 μl), výpočet na základě porovnání se standardem 1. 1,257 1,265 1,250 1,257 1,259 1,273 2. 1,247 1,248 1,277 1,250 1,263 1,271 3. 1,255 1,264 1,262 1,244 1,242 1,249 průměr 1,253 1,259 1,263 1,250 1,255 1,264 rozsah (na) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 I (na) 1002,40 1007,20 1010,40 1000,27 1003,73 1011,47 m (mg) 1,6196 1,6274 1,6326 1,6162 1,6218 1,6343 % DO 85,82 86,23 86,51 85,64 85,94 86,60 průměr (%) 86,12 s 0,3523 s r (%) 0,40 Při porovnání obsahu norepinefrin bitartrátu vypočítaného pomocí standardu byly výsledky srovnatelné, při pouţití rovnice regrese se výsledky lišily v závislosti na jejich ředění. Odchylky ve výsledcích byly zřejmě způsobeny tím, ţe kalibrační křivka neprocházela počátkem. Zjištěný obsah norepinefrin bitartrátu oproti deklarovanému obsahu byl nízký. Tato stanovení byla zřejmě ovlivněna přítomností disiřičitanu sodného, proto byla pro stanovení zvolena metoda standardního přídavku. 44

intenzita I CL CL (na (na) 6.9.3 Kalibrace Opět byla zopakována kalibrace. Podmínky kalibrace: napětí 450 V c polyfosfátu 25 mm 44 μl NE 80 μl c H 2 SO 4 0,1 M 24 μl c KMnO 4 1 mm 21 μl průtoková rychlost 91 μl/s c NE (μmol/l) 4,75 15,18 23,73 1. 1,979 1,924 1,446 2. 2,019 1,956 1,434 3. 2,023 1,953 1,467 průměr 2,007 1,944 1,449 rozsah (na) 200 500 1000 I (na) 321,12 777,73 1159,20 1400 1200 1000 y = 44,141x + 110,38 R 2 = 1 800 600 400 200 0 0 5 10 15 20 25 c (umol/l) c (μmol/l) Obr. 17: Kalibrační závislost norepinefrinu Pro sestavení kalibrační křivky byla zvolena lineární oblast v rozmezí koncentrací 4,75.10-6 23,73.10-5 mol/l. 45

Rovnice regrese y = kx + q, kde y je intenzita CL (na), k je směrnicí přímky, x je koncentrace norepinefrin bitartrátu (μmol/l) a q absolutní člen je y = 44,141x + 110,38. Korelační koeficient r byl 1. 6.9.4 Stanovení norepinefrin bitartrátu metodou standardního přídavku a určení výtěžnosti Injekce byly ředěny tak, ţe jsme z ampule odebrali 100 μl injekčního roztoku, převedli jej do 50 ml odměrné baňky a doplnili ultračistou vodou. Injekce se standardním přídavkem byly zpracovány tak, ţe jsme z ampule odebrali 100 μl injekčního roztoku, převedli jej do 50 ml odměrné baňky, přidali jsme standardní přídavek a doplnili ultračistou vodou. Jako standardní přídavek jsme přidávali 5 ml pracovního roztoku norepinefrin bitartrátu o koncentraci 1,898.10-5 mol/l. Ze zjištěných intenzit CL byla vypočítána výtěţnost podle vzorce: I injekce s tan dardní_ přřídavek I injekce výtěţnost (%) 100 I s tan dardní_ přřídave Podmínky: napětí 450 V c polyfosfátu 25 mm 44 μl NE 80 μl c H 2 SO 4 0,1 M 24 μl c KMnO 4 1 mm 21 μl průtoková rychlost 91 μl/s Tab. 37: Analýza injekcí 1. 1,325 1,310 1,319 1,327 1,339 1,312 2. 1,319 1,311 1,292 1,320 1,312 1,300 3. 1,315 1,320 1,299 1,325 1,289 1,306 průměr 1,320 1,314 1,303 1,324 1,313 1,306 rozsah (na) 500 500 500 500 500 500 I (na) 527,87 525,47 521,33 529,60 525,33 522,40 Tab. 38: Analýza injekcí se standardním přídavkem 1. 0,863 0,890 0,868 0,882 0,885 0,867 2. 0,883 0,884 0,853 0,866 0,886 0,877 46