Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Fakulta biologických a lékařských věd Imunohematologická vyšetření a zajištění transfuzních přípravků pro pacienty s diagnózou AIHA Bakalářská práce PRAHA 2011 Autor: Vendula Šustková Vedoucí práce: MUDr. Renata Brudňáková Garant: MUDr. Řeháček Vít
Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci na téma Imunohematologická vyšetření a zajištění transfuzních přípravků pro pacienty s diagnózou AIHA vypracovala samostatně jako literární rešerši pouze za pomoci uvedených zdrojů a pod vedením MUDr. Renaty Brudňákové ve FNKV v Praze a prim. MUDr. Víta Řeháčka na Fakultě biologických a lékařských věd Farmaceutické fakulty UK v Hradci Králové. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Praze dne: podpis: Šustková Vendula 2
Poděkování Děkuji MUDr. Renatě Brudňákové, vedoucí mé bakalářské práce, za cenné rady, připomínky a podporu při zpracování daného tématu. Dále bych chtěla poděkovat prim. MUDr. Vítovi Řeháčkovi z Transfuzního oddělení Fakultní nemocnice v Hradci Králové za cenné informace a čas, který mi poskytl. 3
OBSAH 1. Úvod a zadání práce... 6 2. Základní vyšetření v imunohematologické laboratoři... 8 2.1. Antigeny... 8 2.2. Protilátky... 8 2.3. Aglutinační reakce... 9 2.5. Vyšetření Rh systému... 12 2.6. Další vyšetření používaná v imunohematologii... 13 2.6.2. Druhy testů podle použitého prostředí... 14 3. Speciální vyšetření u pacientů s diagnózou AIHA... 18 3.1. Další systémy antigenů erytrocytární membrány... 18 3.1.1. MNSs systém... 18 3.1.2. Duffy systém... 18 3.1.3. Kidd systém... 18 3.1.4. Lewis systém... 19 3.1.5. Lutheran systém... 20 3.1.6. P systém... 21 3.2. Přímý antiglobulinový test... 22 3.2.1. Rozlišovací PAT... 22 3.2.2. PAT IgG Diluční... 22 3.2.3. Určení podtříd IgG... 22 4. Zajištění erytrocytárních transfuzních přípravků u různých typů AIHA... 24 4.1. Vysycení autoprotilátek ze séra pacienta... 24 4.2. Zajištění kompatibilních erytrocytárních přípravků... 25 4.2.1. Zajištění kompatibilních erytrocytárních přípravků u pacientů s diagnózou AIHA... 25 4.2.2. Zajištění kompatibilních erytrocytárních přípravků u pacientů s chladovými autoprotilátkami... 26 5. Zajištění ostatních transfuzních přípravků pro pacienty s diagnózou AIHA... 27 5.1. Trombocytové transfuzní přípravky... 27 5.2. Plazma... 27 6. Metodika... 28 6.1. Vyšetření AB0 systému, antigenu D a antigenu Kell... 28 6.2. Vyšetření antigenů Rh systému... 28 6.3. Vyšetření autoprotilátek, enzymatického, antiglobulinového testu a testu ve fyziologickém roztoku... 29 6.4. Vyšetření jednotlivých antigenů... 29 6.5. Rozlišovací PAT... 30 6.6. PAT IgG- Diluční... 30 6.7. Určení podtříd IgG... 31 6.8. Vysycení autoprotilátek... 32 7. Výsledky... 33 8. Závěr... 37 9. Seznam použité literatury... 40 4
ABSTRAKT Tato bakalářská práce popisuje jednotlivá vyšetření používaná v imunohematologické laboratoři a zaměřuje se na jejich využití pro zajištění kompatibilních erytrocytárních přípravků u pacientů s diagnózou autoimunitní hemolytická anémie. První kapitola vysvětluje pojem autoimunitní hemolytická anémie, další kapitoly se věnují jednotlivým testům. Poslední kapitola uvádí výsledky daných vyšetření v celkovém vzorku 33 pacientů. Klíčová slova: antigeny, imunoglobulíny, autoimunitní hemolytická anémie, krevně skupinové systémy, PAT a NAT. ABSTRACT This bachelor thesis describes the various serological tests used in immunohematological laboratory and focuses on their use to ensure compatible red blood cell products in patients diagnosed with autoimmune hemolytic anemia. The first chapter explains the concept of autoimmune hemolytic anemia, other chapters focus on specific tests. The last chapter presents the results of these tests in a total sample of 33 patients. Keywords: antigens, immunoglobulins, autoimmune hemolytic anemia, blood systems, DAT and IAT. 5
1. Úvod a zadání práce Autoimunitní hemolytická anémie je onemocnění, u něhož zvýšenou hemolýzu erytrocytů tj. zkrácené přežívání erytrocytů způsobují autoprotilátky proti antigenům vlastních erytrocytů. Základní rozdělení: 1. autoimunitní idiopatická hemolytická anémie (primární), u které vyvolávající příčina není známa, kdy mechanismus vzniku protilátek není přesně objasněn, ale uvažuje se o třech různých mechanismech. U jedince se zvýšenou pohotovostí k tvorbě protilátek dojde vlivem zevního činitele ke změně antigenu erytrocytu, který indukuje tvorbu protilátek. Druhou možností je zkřížená reakce antigenů, původně namířených proti jinému činiteli, s vlastními erytrocyty. Třetí možností je porušený mechanismus tvorby protilátek se ztrátou imunologické tolerance a vzniku protilátek proti normálním antigenům erytrocytů. (Klener et al. 2003) 2. autoimunitní hemolytická anémie symptomatická (sekundární), která se často vyskytuje sekundárně u nemocných s některými základními chorobami, např. s chronickou lymfatickou leukémií, systémovým lupus erythematodes, cirhózou jaterní apod. 3. poléková autoimunitní hemolytická anémie, při které působí lék jako hapten či tvoří imunokomplexy vážící se na povrch erytrocytů nebo působí jako stimulátor tvorby protilátek proti některým erytrocytárním antigenům. (Pecka 2006) V minulosti 70% případů DIIHA (léky vyvolaná AIHA) souviselo s užíváním metyldopy. 23% případů DIIHA souviselo s užíváním velkých dávek nitrožilně podávaného penicilínu a jen cca 10% případů DIIHA souviselo s jinými léky, např. rifampicinem, hydrochlorothiazidem aj. Metyldopa a vysoké dávky penicilinu se používají k léčbě stále méně a tak se případy DIIHA související s těmito léky již prakticky neobjevují. V současnosti existuje přibližně 100 léků souvisejících s DIIHA, v prvenství nahradily metyldopu a penicilíny cefalosporíny. Cefotetan sám odpovídá za 83% případů. (G.Garratty 2004) Dle zjištěných diagnóz v našem souboru 33 pacientů (uvedeno v příloze) je nejčastější sekundární AIHA přítomna u 75% pacientů, primární AIHA přítomna u 15% pacientů a poléková AIHA přítomna u 10% pacientů. 6
K autoimunitní hemolýze může dojít dvěma způsoby: Buňkami zprostředkovaná extravaskulární hemolýza Protilátky třídy IgG spolu se složkami komplementu C3b a C4b se váží na bílkovinné antigeny erytrocytové membrány. Fc-fragment IgG vytváří podmínky pro adhezi komplexu IgG-erytrocyt na receptory makrofágů, které erytrocyty buď fagocytují celé nebo z nich odstraní jen část erytrocytové membrány s příslušným množstvím hemoglobinu a vzniklé sférocyty jsou postupně fagocytovány v makrofágo-monocytovém systému sleziny. Většina IgG protilátek reaguje při teplotě 37 ºC, proto se označují jako tepelné protilátky. Komplementem zprostředkovaná intravaskulární hemolýza Protilátky, vetšinou třídy IgM, se váží k polysacharidovým antigenům erytrocytové membrány, aktivují a váží celý komplement. Pokud jsou třídy IgG, mohou způsobit hemolýzu Donathova-Landsteinerova typu, tj. protilátka se naváže na erytrocyty za chladu a lyzuje je při teplotě 37 ºC. Aktivovaný komplement způsobí v obou případech protržení erytrocytové membrány a vyprázdnění hemoglobinu do oběhu. Dochází k intravaskulární hemolýze. Většina těchto protilátek reaguje při teplotě nižší a proto se označují jako chladové protilátky. ( Kozák a kol. 2001) Rozlišujeme tedy autoimunitní hemolytickou anémii s tepelnými protilátkami, autoimunitní hemolytickou anémii s chladovými protilátkami a autoimunitní hemolytickou anémii smíšeného typu, kdy se vyskytují současně chladové i tepelné autoprotilátky. Při autoimunitní hemolytické anémii (dále jen AIHA) je často pro nedostatek erytrocytů v krvi pacienta nutná substituce erytrocytů tzn. podání erytrocytárního transfuzního přípravku. Předtransfuzní vyšetření je v těchto případech pozitivní, vyšetřované erytrocytární přípravky jsou inkompatibilní. Tuto inkompatibilitu způsobují autoprotilátky přítomné v séru pacienta. K zajištění kompatibility transfuzních přípravků je nutné kompletní imunohematologické vyšetření pacienta včetně odstranění (vysycení) autoprotilátek ze séra pacienta. Těmto neobvyklým vyšetřením bych se chtěla ve své práci blíže věnovat. 7
2. Základní vyšetření v imunohematologické laboratoři 2.1. Antigeny Všechny krevní skupinové substance jsou v přesném smyslu definice antigeny, které mohou stimulovat cizí imunitní systém, v závislosti na jeho stupni cizosti a antigenní síle, k tvorbě specifických protilátek. (Eckstein, 1994) Antigeny krevně skupinových systémů jsou někdy označované jako aglutinogeny. Jsou to povrchové molekuly na membránách erytrocytů. Antigeny krevních skupin mohou být glykoproteiny obsahující cukernou a bílkovinou složku, glykolipidy obsahující cukernou a lipidovou složku, poslední skupinou antigenů jsou lipoproteiny obsahující lipidovou a bílkovinou složku. Pro antigeny glykoproteinové a glykolipidové je za antigenní specifitu zodpovědná uhlíková část, u lipoproteinů je to proteinová část. 2.2. Protilátky Protilátky jsou základními molekulami imunitního systému. Patří mezi imunoglobuliny. Existuje 5 tříd imunoglobulinů: IgG, IgM, IgA, IgD a IgE. IgG a IgM jsou typické protilátky kolující v krvi. Tvoří se při specifické imunitní reakci na antigen. Když určitý jedinec přichází do kontaktu s určitým antigenem poprvé, tvoří se protilátky třídy IgM, zatímco při druhém nebo dalším kontaktu vznikají protilátky třídy IgG. Protilátky IgG a IgM jsou součástí celkové (systémové) imunitní reakce. Molekuly všech protilátek mají stejnou základní strukturu, která se skládá ze dvou identických lehkých a dvou identických těžkých polypeptidových řetězců. Lehké řetězce existují ve dvou typech. Těžkých řetězců je pět a podle nich se imunoglobuliny zařazují do tříd. (Ferenčík 2005) Třída IgG se dále dělí na 4 podtřídy, označované IgG1, IgG2, IgG3 a IgG4. Jednotlivé podtřídy IgG se liší schopností vázat komplement a většinou se dobře váží na Fc receptory fagocytů. (Hořejší 2005) Zřídka jsou identifikovány IgA autoprotilátky, které nereagují se standardním Coombsovým sérem, a proto se pro identifikaci používá speciální činidlo. Vyšetření IgA je požadováno, když není PAT schopen zjistit povrchově vázaný IgG a C3 u pacientů, kteří jinak vykazují známky AIHA. (Nathan and Oski s 2009) 8
Tvorba protilátek je přirozený důsledek činnosti specifických imunitních mechanismů. Erytrocyt obsahující antigen je rozeznán BCR-receptorem (jde o membránově vázaný IgM) zralého B-lymfocytu, na který se antigen naváže příčně. Touto vazbou se indukuje signál k úpravě antigenu na peptidové fragmenty, dále signál ke sdružení těchto peptidů s molekulami MHC II a k syntéze receptoru CD40. MHC II se zanořenými antigenními peptidy se vnoří do membrány B-lymfocytu, kde je rozeznán Th2 pomocným lymfocytem. Zde se antigen naváže na receptor TCR a dojde tak k aktivaci syntézy ligandu CD40L. Ten interaguje s receptorem CD40 na B-lymfocytu. To je podnět pro syntézu receptorů pro cytokiny na B-lymfocytu, které jsou produkovány Th2 lymfocytem. Jejich vazbou na receptory vzniká signál k proliferaci a diferenciaci B-lymfocytů na plazmatické a paměťové buňky. Tvorba plazmatických buněk je indukována cytokinem IL-1 (interleukin 1) a CD23. Plazmatické buňky poté produkují protilátky (Rosypal, 1999) Protilátky jsou schopny aglutinovat nejrůznější korpuskulární antigeny (např. antigeny cizí krevní skupiny) a usnadňovat tak jejich fagocytózu. Schopnost protilátek eliminovat antigen je často spjata s mechanismy nespecifické imunity, tím že antigenní materiál opsonizují a tím umožňují jeho fagocytózu. Po navázání protilátky na antigen dochází k aktivaci komplementu, a to klasickou cestou aktivace (Strejček a Lokaj, 1985). 2.3. Aglutinační reakce Všechna vyšetření používaná v imunohematologické laboratoři mají stejný princip, který je založen na aglutinační reakci. Vzájemné působení antigenů (Ag) červených krvinek a jim odpovídajících protilátek (Ab) je snadno detekovatelné pomocí aglutinační reakce. Při těchto reakcích se vazba Ag/Ab uskutečňuje na povrchu částic, např. erytrocytů. Protilátky mají dvě nebo pět vazebných míst pro antigen, závisí na typu těžkého řetězce. Tak se může jedna molekula protilátky navázat na dvě (respektive až pět) částice současně. Poté dochází ke shlukování částic, tedy k jejich aglutinaci. Při aglutinaci dochází ke shlukování částic (erytrocytů) pomocí precipitovaných antigenů a protilátek, které se na antigen dané částice navázaly (viz obr. 1). (Strejček a Lokaj, 1985) 9
Pevnost spojení buněk s protilátkami je dána vzájemným poměrem jejich koncentrací a dalšími fyzikálními podmínkami jako je teplota, ph prostředí, iontová síla prostředí a inkubační doba. Aglutinace protilátkami třídy IgM, které tvoří kompletní protilátky, probíhá ve fyziologickém roztoku a spíše při nižších teplotách. Protilátky třídy IgG, představující převážnou část inkompletních protilátek, reagují spíše při 37 ºC a pro shlukování erytrocytů vyžadují médium. (Smetana a kol. 1992) Médium by mělo obsahovat bílkovinu např. AB sérum, koňský albumin nebo makromolekulární roztoky jako je dextran, želatina a roztoky o nízké iontové síle. Výše uvedená média snižují zeta potenciál erytrocytů a tak umožňují větší vzájemné přiblížení erytrocytů. V současné době se téměř výhradně používají roztoky nízké iontové síly. (Eckstein 1994) Obrázek 1: Aglutinace erytrocytů. (zdroj : www.bmb.leeds.ac.uk) 10
2.4. Vyšetření AB0 systému, Rh a Kell systému AB0 antigeny jsou sacharidové struktury. Oligosacharidové řetězce jsou obecně spojeny s polypeptidy do formy glykoproteinů (volný antigen) nebo s ceramidy do formy glykosfingolipidů (vázaný antigen). Oligosacharidy jsou syntetizováy kaskádovým způsobem, připojení každého monosacharidu je katalyzováno specifickou glykosyltransferázou. Nejméně 100 glykosyltransferáz se podílí na syntéze známých lidských sacharidů. Geny produkující mnohé z nich jsou klonovány a sekvenovány, včetně těch pro krevní systém AB0 a pro sekreci H antigenu (Daniels, 2002). H antigen je prekursor pro ostatní typy AB0 antigenů. Pokud je v buňce přítomen gen pro glykosyltransferázu A, je přeměněn na A antigen. Pokud je zde glykosyltransferáza B, je přeměněn na B antigen. Dvě hlavní třídy sacharidových řetězců AB0 antigenů jsou N- glykany (velice rozvětvené struktury navázané na asparagin N-acetylglukosaminem) a O-glykany (samostatné nebo komplexní struktury navázané na serin nebo threonin N-acetylgalaktosaminem). Glykosfingolipidy obsahují sacharidové řetězce navázané na ceramid (Daniels, 2002). Na základě antigenů rozlišujeme krevní skupiny či krevní příslušnosti. Vedle základních čtyř skupin A, B, 0 a AB, rozlišujeme ještě mnohé podskupiny, především skupiny A a méně pak B. Hlavními podskupinami skupiny A jsou A 1 a A 2. Mezi těmito podskupinami je rozdíl pouze v tom, že u A 1 většinou nenalezneme žádný H antigen, zato u A 2 je vždy přítomen. Jednotlivé krevní skupiny AB0 systému jsou charakterizovány přítomností antigenů na erytrocytech a protilátek v séru. Antigeny Rh systému a Kell systému se přirozeně vyskytují na erytrocytech. Při výskytu antigenu D na erytrocytech mluvíme o RhD pozitivním jedinci. Při výskytu antigenu K na erytrocytech mluvíme o Kell pozitivním jedinci. Antigeny Rh systému a Kell systému jsou silnými antigeny. Protilátky proti nim se v séru přirozeně nevyskytují. Vznikají jako následek imunizace jedince. Kell systém je složitý a obsahuje mnoho antigenů, které jsou vysoce imunogenní. Obsahuje 25 antigenů. Existují dva hlavní kodominantní alelické geny, které produkují dva důležité antigeny: K a k. Většina polulace má fenotyp kk. Klinicky nejvýznamnějším je antigen K. Tvoří se proti němu protilátky třídy IgG, 11
které neváží komplement a způsobují extravaskulární hemolýzu erytrocytů. (Laura Dean 2005) Každý krevní systém potřebuje ke svému určení specifická diagnostická séra. Výroba těchto sér je dnes záležitostí firemní. Podstata reakce spočívá v tom, že erytrocyty s určitým antigenem na povrchu jsou aglutinovány protilátkou krevního séra jiné krevní skupiny než je antigen. Na základě aglutinací vyšetřované krve pak zjistíme její krevně skupinovou charakteristiku.(malaska, 1957). Tabulka 1: AB0 systém ( podle Human blood group, Daniels, 2002 ) Krevní skupina Antigen na erytrocytech Protilátka v séru Genotyp 0 žádný Anti-A, anti-b 0/0 A A Anti-B A/0 nebo A/A B B Anti-A B/0 nebo B/B AB A,B žádná A/B U pacientů s diagnózou AIHA může dojít při výskytu silné autoprotilátky k nejasnostem při vyšetření daných krevních systémů. Zvláště u pacientů s diagnózou AIHA chladového typu, kdy jsou v séru přítomny autoprotilátky chladového typu. Tyto autoprotilátky se za chladu rychle navazují na vlastní erytrocyty a znemožňují určení daných krevních systémů. V těchto případech je nezbytné provést veškerou manipulaci s krevním vzorkem za tepla (od odběru až po vlastní vyšetření). Při přetrvávání nejasností je nutné takto připravený krevní vzorek vyšetřit metodou ve zkumavce. 2.5. Vyšetření Rh systému Složitost krevně skupinového systému Rh začíná polymorfními geny, které kódují antigeny Rh systému. K dispozici jsou dva geny RHD a RHCE, které jsou úzce spojeny. Četná genetická přeskupení mezi nimi vytvořila hybridní Rh geny, které kódují nesčetné množství různých antigenů Rh. Dnes je známo 49 Rh 12
antigenů. Gen RHD určuje přítomnost/ nepřítomnost antigenu D a gen RHCE určuje antigeny C/c a E/e. Význam krevně skupinového systému Rh spočívá v tom, že jeho antigeny jsou výrazně imunogenní. Nejvýznamnějšími antigeny systému Rh jsou D,C,c,E,e. Na jejich podnět se tvoří protilátky třídy IgG někdy IgM. Zřídka aktivují komplement, ale způsobují extravaskulární hemolýzu erytrocytů. (Laura Dean 2005) Antigen D je tak silným antigenem, že po transfuzi RhD pozitivní krve RhD negativnímu příjemci se musí počítat s tvorbou anti-d protilátky. Proto je nutné provádět transfuze z hlediska antigenu D kompatibilně. Výjimky jsou přípustné pouze v případě, kdy pacient nemá anti-d protilátku a substituce erytrocytů je nezbytná z vitální indikace. Obrázek 2 : Druhy fenotypů ( podle www. faculty.matcmadison.com ) Přítomné antigeny Haplotyp C,D,e R1 c,d,e R2 C,D,E Rz c,d,e Ro C,d,e r' c,d,e r" C,d,E Ry c,d,e r U pacientů s diagnózou AIHA se dodržuje při transfuzi jejich vyšetřený Rh fenotyp. Zabraňuje se tím tvorbě aloprotilátek, které by mohly být problémem při budoucích transfuzích. Tito pacienti jsou polytransfundováni a riziko vzniku aloprotilátek je velké. 2.6. Další vyšetření používaná v imunohematologii 2.6.1. Identifikace protilátek Screening protilátek je test základní, sestává se z kombinace tří nebo čtyř diagnostických erytrocytů s antigenní skladbou, která dokáže zachytit nejrůznější typy i kombinace protilátek. 13
Při pozitivitě screenigu protilátek se přistupuje k identifikaci protilátek, kdy se určuje specifita klinicky významných aloprotilátek přítomných v séru pacienta. Diagnostické červené krvinky panelů, které se používají k identifikaci protilátek, vykazují nejvýznamnější antigenní determinanty ve většině systémů krevních skupin. Tyto červené krvinky lišící se ve své antigenní konfiguraci jsou vybrány tak, aby umožnily identifikaci všech nejčastěji se vyskytujících klinicky významných protilátek. Nejčastěji se vyskytují protilátky proti antigenům Rh a Kell systému. U pacientů s plně rozvinutou AIHA bývají všechny testy pozitivní. V těchto případech se musí nejdříve provést eliminace autoprotilátek v séru pacienta, tzv. vysycení autoprotilátek (viz kapitola 4.1.), a teprve poté provést případnou identifikaci aloprotilátek. 2.6.2. Druhy testů podle použitého prostředí Protilátka musí být schopna přemostit 2 erytrocyty. Vzdálenost mezi erytrocyty (20-30 nm) je ovlivněna povrchovým nábojem krvinek. Erytrocyty mají na základě jejich negativního náboje na své membráně dvojitou iontovou vrstvu. Vnitřní, tvořená pozitivními ionty, je pevně vázána na negativní vrstvu povrchu erytrocytu. Potenciál mezi těmito vrstvami tzv. zeta-potenciál způsobuje, že se erytrocyty vzájemně odpuzují a za normálních okolností zachovávají fyziologickou vzdálenost, která je určena právě jejich iontovými vrstvami. Tato vzdálenost může být překlenuta na základě velikosti molekul protilátek (Eckstein, 1994). 14
Obrázek 3: Pentamer IgM (převzato z Janeway s Immunobiology ( Murphy et al.,2007 ) Molekula IgM je pentamer, a proto aglutinuje erytrocyty přímo. IgG protilátky samy o sobě nejsou schopny přemostit vzdálenost mezi dvěma erytrocyty a způsobit aglutinaci, jsou pouze monomery. Z toho důvodu se používají různá prostředí usnadňující aglutinaci krvinek. A. Test s fyziologickým roztokem Neobsahuje žádnou z pomocných látek. Prokazují se jím pouze kompletní protilátky třídy IgM, které mají dostatečnou velikost k přemostění vzdálenosti mezi dvěma erytrocyty. Jsou chladové povahy a proto se inkubace provádí při chladničkové teplotě. B. Enzymatický test Pomocnou látkou je zde proteolytický enzym (papain, bromelin, ficin), který redukuje elektronegativní náboje na povrchu červených krvinek. Dochází ke snížení vzdálenosti mezi krvinkami, což umožní reakci mezi antigeny a protilátkami. Antigeny některých krevních systémů (Duffy, MNSs) jsou působením enzymů poškozeny, proto nemohou být příslušné protilátky v tomto prostředí detekovány. Protilátky jiných systémů, zejména Rh, Lewis a Kidd, jsou detekovány v tomto prostředí mnohem dříve a síla reakce bývá vyšší. Inkubace se provádí při teplotě 37 ºC. (www.onkologickecentrum.cz) 15
C. Antiglobulinový test Používá polyspecifický lidský antiglobulin AGH sérum (směs anti-igg polyklonálních protilátek králičího původu a monoklonálních IgM anti-c3d protilátek myšího původu), který umožňuje detekci červených krvinek, pokrytých imunoglobuliny nebo složkami komplementu. Tvoří můstky mezi IgG molekulami navázanými na erytrocyty a zapřičiňuje tak aglutinaci. Nepřímý Coombsův test (NAT) umožňuje detekci antierytrocytárních protilátek přítomných v pacientově séru či plazmě z důvodu in vitro senzibilizace červených krvinek. Prokazuje tedy přítomnost protilátek, které se vyskytují volně v séru. Přímý Coombsův test (PAT) slouží k průkazu imunních antierytrocytárních protilátek a C3 složky komplementu. Senzibilizované erytrocyty (protilátkou nebo C3b/C3d složkou komplementu) jsou aglutinovány AGH sérem. Prokazuje tedy přítomnost protilátek, které jsou již navázány na erytrocyty. D. Vyšetření autoprotilátek U pacientů s diagnózou AIHA se prokazuje přítomnost protilátek proti vlastním erytrocytům, tzv. autoprotilátky. Ty jsou navázány na erytrocyty pacienta. Často jsou také přítomné volně v séru pacienta. Podle tepelného optima reakce se rozlišují autoprotilátky chladové a tepelné. Chladové autoprotilátky reagují při 4 C. K jejich průkazu se používá test ve fyziologickém roztoku a inkubace při chladničkové teplotě. Často jsou specifity anti-i. Tepelné autoprotilátky reagují při 37 C. K jejich průkazu se používá nepřímý antiglobulinový test. Často jsou specifity anti-e, anti-c nebo proti jinému Rh antigenu. Velmi často není prokázána žádná specifita. U většiny pacientů s tepelnými autoprotilátkami je při určení specifity nalezena reaktivita se všemi diagnostickými erytrocyty. Tato nespecifická reaktivita naznačuje, že autoprotilátky jsou vázány k povrchu antigenových struktur běžných pro všechny lidské erytrocyty. (Nathan and Oski s 2009) U pacientů s diagnózou AIHA bývá prokazována nejen pozitivita v přímém antiglobulinovém testu ale i při vyšetření screeningu protilátek, identifikace 16
protilátek a autoprotilátek. Pozitivitu zde způsobují autoprotilátky navázané na erytrocyty. Vlivem velikosti tohoto komplexu nemohou projít molekulovým sítem až na dno mikrozkumavek. Proto se provádí u pacientů s diagnózou AIHA vysycení autoprotilátek. Kontrola vysycení autoprotilátek se provádí screeningovým testem, který by měl být negativní. Tito pacienti však bývají polytransfundovaní, a proto screeningové vyšetření někdy vykazuje pozitivitu i po vysycení autoprotilátek. Pozitivita je však daná přítomností aloprotilátky, která se vysycením autoprotilátek neeliminuje a musí se identifikovat. K transfuzi se pak používají erytrocytární přípravky, které neobsahují antigen, proti kterému je specifická aloprotilátka namířena. Tímto se zamezuje další imunizaci pacienta a případným potransfuzním reakcím. Obrázek 4 : Karta enzymatického testu firmy Diamed ( www.diamed.ch ). 17
3. Speciální vyšetření u pacientů s diagnózou AIHA 3.1. Další systémy antigenů erytrocytární membrány 3.1.1. MNSs systém Je to jednoduchý systém komplexu genů. Oba velmi blízké lokusy pro geny jsou lokalizovány na chromozómu 4. Jimi kódované znaky jsou mezi sebou kodominantní. Protilátky anti-m jsou většinou chladové povahy a častěji třídy IgM než IgG. Jen vzácně jsou klinicky významné a to v případech, kdy reagují při teplotě 37 C. Anti-N jsou vzácnější, skoro výhradně chladové, třídy IgM a pro transfuze bez významu. Znaky S a s jsou slabými antigeny a tvorbu protilátek vyvolávají jen vzácně. Protilátky jsou vždy imunní třídy IgG a vyžadují identické transfuze. Enzymatické testy nelze k průkazu protilátek užít 3.1.2. Duffy systém Geny Duffy systému jsou lokalizovány na chromozómu 1. Existují 4 alely Fy a, Fy b, Fy x, Fy (prekurzor pro tvorbu Fy a, Fy b ), které se mohou vzájemně zastupovat na lokusu pro geny. Kódované antigeny Fy a, Fy b, jsou mezi sebou kodominantní a dominantní nad antigenem Fy. 98,60% středoevropské populace jsou nosiči genu Fy a nebo Fy b. Anti-Fy jsou protilátky imunní, typu IgG a vázají komplement. Anti-Fy a jsou časté, anti-fy b jsou vzácnější. Obě jsou nebezpečné. Prokazují se nepřímým antiglobulinovým testem. Enzymatickými testy jsou všechny antigeny Duffy systému ničeny. Při přítomnosti těchto protilátek v séru pacienta musí být tito pacienti transfundováni shodnými erytrocyty. 3.1.3. Kidd systém Základ tvoří tři alely Jk a, Jk b a němá alela Jk. Kódované znaky Jk a a Jk b jsou kodominantní a dominantní nad znakem Jk. Alely Jk a a Jk b dávají vznik třem běžným fenotypům. Geny jsou lokalizovány na 18. chromozómu. Skoro 100% středoevropské populace jsou nosiči alely Jk a nebo Jk b. Protilátky anti-jk a a anti-jk b jsou komplement vázající imunní protilátky třídy IgG prokazatelné nepřímým antiglobulinovým testem i testy enzymatickými. Pokud jsou přítomny, vyžadují vždy identickou transfuzi. 18
3.1.4. Lewis systém Lewis skupinový systém se od ostatních systémů liší tím, že antigeny nejsou přirozenou součástí erytrocytové membrány. Erytrocyty získávají svůj fenotyp naadsorbováním Le substancí z plazmy. Asi 30% se naadsorbuje, zbytek zůstává rozpuštěn v plazmě. Geny jsou lokalizovány na chromozómu 19. Klinicky významné jsou antigeny Le a a Le b. 72% populace jsou nosiči genu Le b a 22% populace genu Le a. Protilátky proti těmto antigenům jsou třídy IgM, výjimečně třídy IgG. Reagují nejlépe v solném prostředí při pokojové teplotě. Mohou vázat komplement a způsobit hemolýzu inkompatibilních erytrocytů in vitro. Jsou prokazatelné enzymatickými testy, které zesilují reakci. Protilátka anti-le a je prokazatelná i nepřímým antiglobulinovým testem. Protilátka anti-le a není vzácná a může být i přirozeného původu. Tvoří ji jedinci s fenotypem Le(a-b-). Je nebezpečná a může být příčinou smrtelných hemolytických potransfuzních reakcí. Anti-Le b protilátky jsou také tvořeny převážně jedinci s fenotypem Le(a-b-), výjimečně je tvoří jedinci Le(a+b-). Jsou méně nebezpečné a k hemolytickým potransfuzním reakcím vedou jen vzácně. Problémem je současný výskyt silné protilátky anti-le a a slabší protilátky Le b, protože jen 6% dárců má fenotyp Le(a-b-). 19
Obrázek 5: Antigeny Lewis systému (www.drpeterjdadamo.com) 3.1.5. Lutheran systém Alela Lutheran systému je v těsné blízkosti genů Le, Se a H na chromozómu 19. Na místě genů pro Lutheran se mohou vzájemně zastupovat tři alely Lu a, Lu b a Lu. Znaky Lu a a Lu b jsou kodominantní a dominantní nad alelou Lu. Němá alela Lu je extrémně vzácná, a proto se v populaci fenotyp Lu(a-b-) prakticky nevyskytuje. Skoro 100% populace jsou nosiči alely Lu b. Protilátka anti-lu a je vzácná, protože znak Lu a je slabým antigenem a pouze 7% populace jsou jeho nosiči. Patří ke třídě IgG, ale reaguje při pokojové teplotě silněji než při 37ºC. V přítomnosti protilátek je třeba použít k transfuzi erytrocyty Lu a negativní. Protilátky anti-lu b jsou ještě vzácnější, patří také spíše do třídy IgG a dávají jak při pokojové teplotě tak při teplotě lidského těla stejně silnou reakci. Zajištění shodné transfuze je velmi obtížné, jen 0,14% populace jsou nosiči fenotypu Lu(a+b-). Stejný problém vzniká i při současném výskytu protilátek anti-lu a a anti-lu b, kdy je procento výskytu fenotypu Lu(a-b-) v populaci menší než 0,01. 20
3.1.6. P systém Genetika P systému není zcela vyjasněná. Znak P1 je dominantní nad znakem P2. Vedle toho je malé procento jedinců, kteří nemají znaky P, mají znak p. Geny P nejsou alelické, ale jsou závislé na dvou sobě nezávislých lokusech pro geny. P1 na chromozómu 22, P2 na chromozómu 6, které ovlivňují jednu společnou prekurzorovou substanci. Protilátky anti-p1 jsou přirozeně se vyskytující chladové protilátky třídy IgM, které tvoří často jedinci P2. Jsou to protilátky bez významu pro transfuziologii. Jen při tělesné teplotě reagující imunní protilátka anti-p1 vyžaduje shodný přípravek. Při běžném určování P příslušnosti erytrocytů se testuje pouze přítomnost či nepřítomnost znaku P1. Obrázek 6: Antigeny P systému (www.ncbi.nlm.nih.gov) 21
3.2. Přímý antiglobulinový test Přímý antiglobulinový test slouží k průkazu vazby molekul imunogobulinu a/nebo komplementu na povrch erytrocytů, která nastala v organismu. Takto senzibilizované erytrocyty mohou být předmětem zrychleného odstraňování fagocytózou a/nebo procesem protilátkově závislé buněčně zprostředkované cytotoxicity (ADCC) vyúsťující v extravaskulární hemolýzu ve slezině nebo v játrech. Při zjištění pozitivního přímého antiglobulinového testu je nutné dále určit typ senzibilizující protilátky. V případě silnější pozitivity protilátky třídy IgG zjišťujeme její titr a podtřídu. 3.2.1. Rozlišovací PAT Rozlišovací PAT umožňuje prokázat jednotlivé třídy imunoglobulinu (IgG, IgM, IgA) a aktivaci C3c a C3d složek komplementu. 3.2.2. PAT IgG Diluční PAT IgG Diluční poskytuje informaci klinického významu při průkazu senzibilizace erytrocytů protilátkou třídy IgG. Zjišťujeme titr protilátky IgG a z toho vyplývající riziko vzniku hemolýzy. Počet molekul IgG připadajících na buňku ovlivňuje zrychlenou destrukci erytrocytů. 3.2.3. Určení podtříd IgG Riziko hemolýzy způsobené AIHA závisí na množství IgG a/nebo komplementu na erytrocytech stejně jako na vyskytujících se podtřídách IgG. Podtřídy IgG1 a IgG3 mohou aktivovat komplement, zatímco IgG2 a IgG4 ho aktivují jen zřídka. K indukci fagocytózy musí být červené krvinky pokryty 1000-4000 molekulami IgG1 nebo 135-500 molekulami IgG3. Kvůli funkčním rozdílům mezi podtřídami je určení podtříd IgG důležité. Z laboratorního pohledu riziko vzniku hemolýzy nastává při průkazu senzibilizace erytrocytů protilátkou typu IgG v titru vyšším než 1:30, při průkazu podtřídy IgG1 a zvláště IgG3 a je potencováno průkazem aktivace složek komplementu. (Návody na vyšetření firmy Diamed) 22
Tabulka 2: Typické výsledky PAT u jednotlivých typů AIHA (D.Petz 2004) Hemolytická anémie Anti - IgG Anti - C3 AIHA ze tepelných autoprotilátek 67% + + 20% + 0 13% 0 + spojená se systémovým lupus antikoagulans + + Syndrom chladových aglutininů 0 + Paroxysmální chladová hemoglobinurie 0 + Poléková imunitní hemolytická anémie na lécích závislé autoprotilátky Penicilíny a první generace cefalosporínů + +/0 Druhá a třetí generace cefalosporínů + + spojená s imunokomplexovým mechanismem + + na lécích nezávislé autoprotilátky + +/0 23
4. Zajištění erytrocytárních transfuzních přípravků u různých typů AIHA 4.1. Vysycení autoprotilátek ze séra pacienta K vysycení autoprotilátek z pacientova séra je nutno použít erytrocytární přípravek, u kterého je největší shoda antigenů s erytrocytárními antigeny pacienta. Pokud by byla v některém důležitém antigenu neshoda, mohlo by dojít k vysycení klinicky významné aloprotilátky. U pacientů s diagnózou AIHA dochází k poruše vztahu mezi pomocnými a supresorovými T lymfocyty a B lymfocyty, což má za následek poruchu v rozpoznávání organismu vlastních a cizích antigenů. Dochází k nedostatečné supresi tvorby protilátek proti vlastním erytrocytům nebo paradoxně ke stimulaci jejich produkce. Dochází k: - tvorbě protilátek proti vlastním erytrocytům a jejich navázání na povrch erytrocytu, - následné intravaskulární hemolýze aktivací komplementu, - extravaskulárnímu zániku senzibilizovaných erytrocytů v monocytomakrofágovém systému sleziny a v játrech. Typickým sérologickým nálezem bývá pozitivní přímý antiglobulinový test, dokazující senzibilizaci krvinek nemocného autoprotilátkou. V séru se prokáží volné autoprotilátky, proto bývá často pozitivní i nepřímý antiglobulinový test. Situace bývá komplikována současným výskytem specifických aloprotilátek, které se vytvořily po imunizaci předchozími transfuzemi. Určit specifitu aloprotilátky bývá nesnadné, protože její specifické reakce bývají překryty panaglutinačním charakterem autoprotilátek. V tomto případě se provede vysycení autoprotilátek ze séra pacienta, které je nutné k odhalení případné aloprotilátky v séru pacienta a zajištění séra bez autoprotilátek pro potřeby předtransfuzního vyšetření. K vysycení lze použít: - vlastní erytrocyty pacienta (autologní adsorpce). Používáme v případě, kdy pacient nedostal transfuzi a není anemický. - vhodnými dárcovskými erytrocyty (alogenní adsorpce). Používáme v případě, kdy pacientovi byla v poslední době aplikována transfuze nebo je příliš anemický pro odběr potřebného množství krve k vysycení. V případě dárcovských erytrocytů 24
se snažíme najít takové dárcovské erytrocyty, které jsou co nejvíce shodné v erytrocytárních antigenech s antigeny pacienta, minimálně musí být zachována negativita v antigenech systému Rh (včetně Cw), Kell, Kidd, pokud ji prokážeme u pacienta. Z tohoto důvodu je nutné před vysycením provést typování erytrocytárních antigenů v pacientově krvi. (SOP FNKV) Vysycení autoprotilátek vyžaduje naficinování erytrocytů, které potencuje adsorpční účinek použitých erytrocytů. 4.2. Zajištění kompatibilních erytrocytárních přípravků 4.2.1. Zajištění kompatibilních erytrocytárních přípravků u pacientů s diagnózou AIHA V případě pozitivity nepřímého antiglobulinového testu s celým panelem typových erytrocytů je nezbytné provádět testy kompatibility z vysyceného séra pacienta. Z vysyceného séra je poté možno provádět testy kompatibility maximálně 1 týden. Podávají se erytrocytární přípravky kompatibilní v AB0 systému. Dále je u erytrocytárních přípravků nutné dodržet negativitu v antigenech Rh systému (včetně Cw) a Kell systému, pokud jsou u pacienta negativní. Doporučuje se dodržet i případná negativita v antigenech Kidd systému. V případě současného nálezu specifické aloprotilátky se podává erytrocytární přípravek bez antigenu, proti kterému je tato protilátka namířena. Erytrocytární přípravky se doporučují podávat pouze z vitální indikace a za zvýšeného dohledu lékaře. Erytrocytární přípravky je vhodné používat deleukotizované a ozářené, což zabraňuje vzniku febrilních potransfuzních reakcí, vzniku imunizace proti trombocytům a jejich refraktibilitě, vzniku HLA protilátek, vzniku akutního plicního postižení a přenosu cytomegalovirové infekce. (Transfuze dnes 18/96) Erytrocytární přípravky deleukotizované se podávají jako prevence alloimunizace u polytransfundovaných nemocných a u pacientů před a po orgánové transplantaci. (Lakota et al., 2006) 25
Pacienti s diagnózou AIHA jsou polytransfundováni, často je u nich AIHA chorobou sekundární provázející chorobu primární, kterou bývá nádorové onemocnění krvetvorby, u kterého se provádí transplantace kostní dřeně. Indikace k podání ozářených erytrocytárních přípravků se provádí především jako prevence potransfuzní reakce TA GvHD u nemocných s vrozenou nebo získanou poruchou imunity, při orgánových transplantacích. (Buliková, 2006). Vlivem působení ionizujícího záření dochází k inaktivaci T lymfocytů. Minimální dávka záření k úspěšné inaktivaci T lymfocytů je 24 Gy. (Ankar a Bhatti, 2003). 4.2.2. Zajištění kompatibilních erytrocytárních přípravků u pacientů s chladovými autoprotilátkami Při suspektním zvýšení chladových aglutininů, které se vyskytuje u pacientů s diagnózou AIHA z chladových autoprotilátek, je nutná veškerá manipulace se vzorkem pacienta za tepla. V případě nezbytnosti krevního převodu u těchto pacientů se před podáním doporučuje ohřátí erytrocytárních přípravků na 37 ºC. V literatuře se uvádí i vhodnost podání propraných erytrocytů, což znamená, že jsou zbaveny komplementu. 26
5. Zajištění ostatních transfuzních přípravků pro pacienty s diagnózou AIHA 5.1. Trombocytové transfuzní přípravky Trombocytové transfuzní přípravky se podávají k prevenci nebo zastavení krvácení u pacientů se sníženým počtem trombocytů (trombocytopenie) nebo jejich funkční poruchou (trombocytopatie), včetně pacientů s hematoonkologickými chorobami. (Leytin et al., 2004). Získávají se z plné krve dárců nebo aferézou destiček. Uchovávají se za neustálého promíchávání. Doba použitelnosti je 5 dní. U pacientů s diagnózou AIHA se podávají trombocytové transfuzní přípravky ozářené a kompatibilní v AB0 systému. Ozáření trombocytárních transfuzních přípravků má stejnou preventivní funkci jako u erytrocytárních transfuzních přípravků. 5.2. Plazma Připravuje se odsátím od sedimentovaných či zcentrifugovaných erytrocytů nebo pomocí plazmaferézy. Plazma musí být po odběru co nejdříve a nejrychleji zmražena. Tím si zachovají svou funkci i koagulační faktory. Po přípravě je plazma uložena do karanténních skladů. Po šesti měsících je dárce opět vyšetřen na infekční markery (virus hepatitidy B a C, syfilis, HIV). Pokud je výsledek infekčních markerů opět negativní, lze plazmu použít. Doba použitelnosti závisí na teplotě skladování. Rozmrazování se provádí ve vodní lázni při teplotě 37 C a musí se použít do 24 hodin. (Mokáň et al., 2005) Po rozmrazení se nemůže opět zmrazovat. U pacientů s diagnózou AIHA se plazma používá výjimečně. Podává se ozářená a kompatibilní v AB0 systému. 27
6. Metodika 6.1. Vyšetření AB0 systému, antigenu D a antigenu Kell Vyšetření AB0 systému, antigenu D a antigenu Kell se dříve provádělo ve zkumavkách. V současné době se používají různé vyšetřovací metody, nejčastější metodou je sloupcová aglutinace např. v kartách DG Gel AB0 od firmy Grifols, které se používají v imunohematologické laboratoři FNKV. Karty obsahují mikrozkumavky pro vyšetření antigenu A, antigenu B, antigenu D, antigenu Kell, aglutininů A a B a kontrolní mikrozkumavku obsahující kontrolní sérum, která musí být vždy ve výsledku negativní. Karta je tvořena 8 mikrozkumavkami, které obsahují sloupec a reakční/inkubační komůrku. Sloupec obsahuje polymerizované mikročástice dextranu v pufrovaném médiu sloužící jako filtr. Částice dextranu jsou smíchány s reagencíí, která obsahuje specifické protilátky a pufr. Mikrozkumavky pro vyšetření aglutinogenů obsahují v roztoku gelu specifické protilátky. Do těchto mikrozkumavek přidáváme pacientovy erytrocyty, které reagují se specifickými protilátkami a dochází k aglutinaci erytrocytů. (Diagnostic Grifols S.A. Návody na vyšetření) Do mikrozkumavek pro vyšetření aglutininů musíme přidat čerstvé diagnostické erytrocyty A/B a pacientovo sérum. Během centrigugace jsou aglutináty erytrocytů v závislosti na jejich velikosti zachyceny na povrchu nebo uvnitř gelového sloupce. Neaglutinované erytrocyty prochází ke dnu zkumavky. Aglutinované erytrocyty se dle síly pozitivity zachycují v gelu a až na dno mikrozkumavky neprochází. 6.2. Vyšetření antigenů Rh systému Vyšetření antigenů Rh systému se provádí stejným způsobem jako vyšetření antigenů AB0. Používá se metoda sloupcové aglutinace. Karty obsahují mikrozkumavky pro vyšetření antigenu D, C, c, E, e, Cw a kontrolní mikrozkumavku obsahující kontrolní sérum, která musí být ve výsledku negativní. Princip vyšetření je stejný jako u vyšetření antigenů systému AB0. 28
6.3. Vyšetření autoprotilátek, enzymatického, antiglobulinového testu a testu ve fyziologickém roztoku Všechna vyšetření se provádí nejčastěji metodou sloupcové aglutinace v kartách. Karty jsou tvořeny plastovým nosičem, který sestává z 6 nebo 8 mikrozkumavek. Každá mikrozkumavka je tvořena sloupcem a reakční/inkubační komůrkou. Každý sloupec obsahuje polymerizované mikročástice dextranu v pufrovaném médiu, které slouží jako filtr. Pro vyšetření nepřímého antiglobulinového testu je v kartách přítomno AGH sérum. Do každé mikrozkumavky přidáváme diagnostické erytrocyty v případě vyšetření antiglobulinového testu, enzymatického testu a testu ve fyziologickém roztoku, pacientovy erytrocyty v případě vyšetření autoprotilátek. Poté přidáváme pacientovo sérum a u enzymatického testu přidáváme enzym. Během centrifugace jsou aglutináty červených krvinek v závislosti na jejich velikosti zachyceny na povrchu nebo uvnitř gelového sloupce (pozitivní reakce). Neaglutinované červené krvinky procházejí ke dnu mikrozkumavky (negativní reakce). V imunohematologické laboratoři FNKV používáme karty od firmy Diamed a firmy Grifols. 6.4. Vyšetření jednotlivých antigenů Pokud je u pacientů s diagnózou AIHA nutné k zajištění kompatibilních erytrocytárních přípravků provést vysycení autoprotilátek ze séra, je třeba před vlastním vysycením provést určení jednotlivých erytrocytárních antigenů. U pacientů s negativním PAT se toto vyšetření provádí v kartách metodou sloupcové aglutinace. Antigeny se vyšetřují enzymatickým testem nebo nepřímým antiglobulinovým testem metodou sloupcové aglutinace. V imunohematologické laboratoři FNKV používáme karty od firmy Diamed. Princip vyšetření je založen na přítomnosti příslušné inkompletní protilátky třídy IgG v jednotlivých sloupcích. Tyto sloupce současně obsahují AGH sérum, v případě vyšetření antiglobulinovým testem, nebo se do příslušných sloupců přidává enzym bromelin k uskutečnění reakce, v případě enzymatického testu. U pacientů s diagnózou AIHA nelze provést vyšetření jednotlivých erytrocytárních antigenů v kartách, protože u těchto pacientů prokazujeme autoprotilátky navázané na vlastní erytrocyty tj. mají pozitivní PAT a příslušná vyšetření by byla vždy pozitivní. AGH sérum používané při nepřímém antiglobulinovém testu je polyklonální, tzn. že je zaměřené proti různým epitopům antigenu. Z hlediska 29
svých vlastností je AGH sérum heterogenní. Antigeny u pacientů s diagnózou AIHA vyšetřujeme ve zkumavce a používají se monoklonální protilátky převážně třídy IgM, zcela výjimečně třídy IgG. Reakce antigen-protilátka se zde uskutečňuje přímo. Monoklonální protilátky (MoAb) jsou produktem pouze jednoho klonu B-lymfocytů a jsou přísně specifické proti jedinému epitopu antigenu (proti jednomu antigenu tak může existovat několik různých MoAb). Jsou tedy čistě homogenní ve svých vlastnostech. Jedná se o stanovení antigenů systémů Kidd, Lewis, Lutheran, MNSs, P. Pro systém Duffy zatím neexistují monoklonální protilátky. 6.5. Rozlišovací PAT V imunohematologické laboratoři FNKV používáme ID DC screening I firmy Diamed, jsou to karty rozlišovací, monospecifické, které nám umožňují prokázat jednotlivé třídy imunoglobulinu (IgG, IgM, IgA) a aktivaci C3c a C3d složek komplementu. Pro všechna vyšetření PAT se používají pacientovy erytrocyty. 6.6. PAT IgG- Diluční Karta PAT IgG-Diluční, užívaná v imunohematologické laboratoři FNKV, poskytuje informaci klinického významu při průkazu senzibilizace erytrocytů protilátkou třídy IgG. Zjišťujeme titr protilátky IgG a z toho vyplývající riziko vzniku hemolýzy. Počet molekul IgG připadajících na buňku ovlivňuje zrychlenou destrukci erytrocytů. Při pozitivním výsledku aglutinované erytrocyty vytvářejí na povrchu gelu červenou linku nebo jsou v gelu rozptýleny. Při negativním výsledku vzniká kompaktní sediment na dně mikrozkumavky. Tabulka 3: Reakce pro IgG ID-Karty PAT IgG-Diluční Ředění 1:10 1:30 1:100 1:300 1:1000 Kontrola Titr anti-igg 1:30 ++ +- negat. negat. negat. negat. Titr anti-igg 1:300 +++ +++ ++ + negat. negat. Titr anti IgG 1:30 je nerelevantní a stanovení podtříd IgG není nutné. Titr anti IgG 1:300 je klinicky relevantní a stanovení podtříd IgG je nezbytné pro riziko vzniku hemolýzy. (Návody na vyšetření firmy Diamed) 30
6.7. Určení podtříd IgG V kartě IgG podtříd jsou přidány ke gelu 2 ředění anti-igg1 a IgG3 pro umožnění diferenciace mezi nízkou a vysokou mírou rizika hemolýzy. Pozitivní reakce u prvního ředění má mez citlivosti přibližně 1000 IgG1 molekul na buňku respektive 125 molekul anti-igg3 na buňku. Pozitivní reakce u druhého ředění indikuje vysokou koncentraci anti-igg1 a/nebo anti-igg3 protilátek Reakce Podtřída IgG1 Podtřída IgG1 Podtřída IgG3 Podtřída IgG3 Tabulka 4: Reakce pro podtřídy anti-igg1/anti-igg3 Anti- Anti-IgG1 Anti- Anti-IgG3 Anti- Kontrola IgG1 1:1 1:100 IgG3 1:1 1:100 IgG 1:10 ++ negat. negat. negat. +++ negat. +++ ++ negat. negat. +++ negat. negat. negat. +++ ++ +++ negat. negat. negat. ++ negat. +++ negat. Podtřída IgG1 v prvním řádku tabulky má nízkou koncentraci, což znamená, že je mírné riziko hemolýzy. Ve druhém řádku tabulky má podtřída IgG1 vysokou koncentraci, tudíž je riziko vzniku hemolýzy vysoké. Podtřída IgG3 má ve třetím řádku tabulky vysokou koncentraci, vysoké je i riziko vzniku hemolýzy. Ve čtvtrtém řádku tabulky má podtřída IgG3 koncentaci nízkou, ale riziko vzniku hemolýzy je střední. (Návody na vyšetření firmy Diamed) Z laboratorního pohledu riziko vzniku hemolýzy tedy nastává při průkazu senzibilizace erytrocytů protilátkou typu IgG v titru vyšším než 1:30, při průkazu podtřídy IgG1 a zvláště IgG3 a je potencováno průkazem aktivace složek komplementu. U AIHA z chladových protilátek nebo bifazických protilátek můžeme prokázat pouze aktivovaný komplement, protože navázané IgM protilátky se v teple z vazby uvolňují. 31
6.8. Vysycení autoprotilátek Příprava ficinovaných erytrocytů: - erytrocyty pacienta nebo vhodné dárcovské erytrocyty odebrané do antikoagulačního roztoku třikrát promyjeme ve fyziologickém roztoku - k 0,5 ml. suchého sedimentu přidáme 4 ml. fyziologického roztoku a 0,5 ml. 1% roztoku ficinu, protřepeme a inkubujeme 15 minut při 37 ºC - následně centrifugujeme 2 minuty při 2000 ot./min - odsajeme supernatant a sediment propereme ve fyziologickém roztoku - supernatant odsajeme k získání maximálně suchých erytrocytů Vlastní vysycování: - k 1 ml. séra pacienta přidáme 1 ml. PEG (polyethylenglykol) a 0,5ml. suchých ficinovaných erytrocytů, protřepeme a inkubujeme 15 minut při 37 ºC následně centrifugujeme 2 minuty při 3400 ot./min - přeneseme supernatant do další zkumavky s 0,5 ml. ficinovaných erytrocytů - postup opakujeme až do vysycení autoprotilátek v séru Kontrolu vysycení provádíme vyšetřením screeningu nepravidelných protilátek v nepřímém antiglobulinovém testu a enzymatickém testu. Počáteční pozitivní výsledek se změní na negativní. V případě přetrvávání pozitivity pouze s některými ze screeningových erytrocytů je nutné provést následné vyšetření séra s panelem diagnostických erytrocytů pro identifikaci případné aloprotilátky v séru. (SOP FNKV) V případě senzibilizace erytrocytů samotnou autoprotilátkou typu IgG zachováváme inkubaci při 37 ºC. V případě senzibilizace erytrocytů autoprotilátkou typu IgG a složkou komplementu se osvědčilo střídání inkubačních teplot 37 ºC a 4 ºC. Vysycení autoprotilátek je časově náročné. Vyžaduje plně soustředěného pracovníka po celou pracovní směnu, ve výjimečných případech i déle (viz graf č.2). 32
7. Výsledky PAT Graf č.1: Podíl imunoglobulínů a složek komplementu na vzniku hemolýzy 12 10 počet pacientů 8 6 4 2 0 IgG1 C3d IgG1/C3d IgG1/IgG3 IgG1/IgG3/C3d IgG1/IgG3/C3d/C3c Vysoké riziko vzniku hemolýzy bylo: 1. z důvodu vysokého titru IgG1 u 4 pacientů 2. z důvodu vysokého titru IgG1/IgG3 u 2 pacientů 3. důvodu aktivace složky C3d komplementu a vysokého titru IgG1 u 10 pacientů 4. z důvodu aktivace složky C3d komplementu u 1 pacienta 5. z důvodu aktivace složky C3d komplementu a vysokého titru IgG1 a IgG3 u 4 pacientů 6. z důvodu aktivace složek C3c a C3d komplementu a vysokého titru IgG1 a IgG3 U jednoho pacienta jsme zaznamenali PAT negativní, ale pozitivní byly volné autoprotilátky v NAT. Tato atypická AIHA se vyskytuje velice sporadicky, což vyšetření daného souboru potvrdilo. 33
Vysycení autoprotilátek Vyloučíme-li odlehlé hodnoty, nejčastěji bylo provedeno kompletní vysycení autoprotilátek po pětinásobném až desetinásobném provedení. Toto potvrzuje, že vysycení autoprotilátek je velice náročné a zdlouhavé. U dvou pacientů bylo provedeno kompletní vysycení po osmnáctinásobném až dvacetinásobném provedení, což vyžadovalo provádět vysycení celé dvě pracovní směny. Graf č.2: Vysycení autoprotilátek 8 7 6 počet pacientů 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 vysycení autoprotilátek provedeno (násobky) 34
Identifikace protilátek Tabulka č.5: Výsledky identifikace protilátek po vysycení autoprotilátek Po vysycení autoprotilátek Nespecifita enzymatického testu Nespecifita NAT Aloprotilátka anti- E Aloprotilátka anti- Cw Autoprotilátka imitující specifitu anti- D Autoprotilátka imitující specifitu anti- E Nalezeno v celkovém vzorku 33 pacientů dvakrát jedenkrát jedenkrát jedenkrát dvakrát jedenkrát Ve vzorku 32 vysycovaných pacientů byly identifikovány protilátky v šesti případech. Dle výsledků se vyhledaly vhodné erytrocytární přípravky, které po negativních testech kompatibility mohly být podány. Určení tříd imunoglobulínů Termální reaktivita autoprotilátek je důležitým parametrem jejich identifikace. U lidí se uplatňují autoprotilátky účinné při teplotě těla tj. při teplotě 37 ºC a nebo účinné při teplotě povrchových kapilár, tj. může být nižší než 30 ºC. Jak jsem již v této práci uvedla, jsou nejčastěji třídy IgG, ale vzácně se vyskytují i tepelné autoprotilátky třídy IgM, což se potvrdilo u třech pacientů z celkového vzorku 33 pacientů (uvedeného v příloze), kdy byla vysoká pozitivita IgM, ale screening nepravidelných protilátek inkubovaný při 4 ºC byl negativní. Chladové autoprotilátky jsou nejčastěji typu IgM a jsou účinné při 4 ºC. Při teplotě lidského těla se tudíž neuplatňují. U jednoho pacienta z celkového vzorku 33 pacientů (uvedeného v příloze) byly chladové autoprotilátky pozitivní, nebyl potvrzen typ IgM ale IgG, což se vyskytuje také zřídka. Zvláštní skupinu tvoří Donathovy - Landsteinerovy chladové autoprotilátky typu IgG, které jsou klinicky významné jako příčina paroxysmální chladové hemoglobinurie. Vzhledem ke své neobvyklé vlastnosti jsou v těchto případech většinou výsledky PAT 35