BCRP v placentě exprese, lokalizace, funkce

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie BCRP v placentě exprese, lokalizace, funkce (diplomová práce) Vedoucí diplomové práce: Doc. PharmDr. František Štaud, Ph.D. Hradec Králové 2008 Ivana Šobáňová 1

Tímto bych chtěla poděkovat Doc. PharmDr. Františku Štaudovi, Ph.D a Mgr. Lence Cygalové za všestrannou pomoc při vzniku této diplomové práce. 2

Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. 3

Obsah Obsah... 4 Seznam zkratek... 6 Cíl práce... 9 1. Úvod... 10 2. Struktura placenty... 12 2.1 Polarita placentárního syncytiotrofoblastu a její vztah k transplacentárnímu přenosu fyziologických substancí a xenobiotik... 13 2.2 Mechanismus transportu léčiv přes placentu; vliv efluxních transportérů léčiv. 14 3. ABC efluxní transportéry léčiv... 17 3.1 Struktura ABC transportérů léčiv... 17 3.2 Exprese ABC transportérů ve tkáních... 20 3.3 Funkce ABC transportérů ve tkáních... 22 3.4 Substráty a inhibitory... 25 3.4.1 P-glykoprotein... 25 3.4.2 MRP transportéry... 27 3.5 Podrodina G ABC transportérů... 28 4. Breast cancer resistance protein... 29 4.1 Struktura BCRP... 30 4.2 Tkáňová distribuce BCRP... 31 4.3 Funkce BCRP... 36 4.4 Substráty BCRP... 40 4.4.1 Glybenklamid... 41 4.4.2 Nitrofurantoin... 41 4.4.3 Konjugáty... 42 4.4.4 Estrogeny... 42 4.4.5 Nukleosidová analoga... 43 4.4.6 Anthraceny... 43 4.4.7 Deriváty kamptotecinu... 44 4.5 Inhibitory BCRP... 47 4.5.1 Fumitremorgin C a analoga... 48 4.5.2 GF120918... 49 4

4.5.3 Rostlinné polyfenoly... 49 4.5.4 Inhibitory HIV proteázy... 49 4.5.5 Jiné molekuly... 50 4.6 BCRP a těhotenství... 53 4.6.1 Exprese a lokalizace BCRP v placentě... 53 4.6.2 Exprese BCRP v placentě v průběhu gestace... 54 4.6.3 Regulace exprese BCRP... 55 4.7 Získané mutace a jednoduchý nukleotidový polymorfismus (SNP)... 57 4.7.1 Substrátová specifita a SNP... 58 4.7.2 SNP v populacích... 60 5. Závěr... 62 Abstract... 64 Abstrakt... 65 Pouţitá literatura... 66 5

Seznam zkratek ABC adenosine-triphosphate binding cassette (adenosintrifosfát váţící kazeta) ABCB1 ABCCx ABCG2 ABCGx ABCP synonymum pro P-gp podrodina C ABC transportérů synonymum pro BCRP podrodina G ABC transportérů placental specific ABC transporter (placentárně specifický ABC transportér; synonymum pro BCRP) ATP AZT BCRP Bcrp1/Bcrp BXP-21, BXP-34 cdna adenosintrifosfát zidovudin breast cancer resistance protein myší/potkaní analog BCRP monoklonální protilátky proti BCRP complementary DNA (komplementární DNA) CFTR CYP1A CYP2E1 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (transmembránový regulátor vodivosti cystické fibrózy) aktivní isoforma cytochromu P450 aktivní isoforma cytochromu P450 6

DHEAS DNA E 1 S E 2 17βG EGF dehydroepiandrosteron deoxyribonukleová kyselina estrogen-3-sulfát 17β-estradiol-17-(β-D-glukuronid) epidermal growth factor (epidermální růstový faktor) ER ERE estrogenovým receptor estrogen response element (úsek rozpoznávající estrogen) FGR fetal growth restriction (syndrom restrikce fetálního růstu) GSH GIT hcc HEB glutathion gastrointestinální trakt lidský choriokarcinom hematoencefalické bariéra HIF1 hypoxia inducible factor 1 HIV Human Immunodeficiency Virus (virus způsobující ztrátu obranyschopnosti u člověka) IGF-II insulin-like growth factor-ii LTC 4 leukotrien C 4 MCF7 buněčná linie prsního nádoru rezistentní k doxorubicinu, mitoxantronu a daunorubicinu 7

MDR multidrug resistance (mnohočetná léková rezistence) MRPx multidrug resistance protein (protein mnohočetné lékové rezistence) MSD membrane-spanning domain (membránu prostupující doména) mrna MXR mediátorová RNA mitoxantrone resistance protein (synonymum pro BCRP) NBD nucleotide binding domaine (nukleotid-vazebná doména) P-gp P-glykoprotein Rh 123 rhodamin 123 RT-PCR SNP reverzně transkripční polymerázová řetězcová reakce single nukleotid polymorphism (jednobodový nukleotidový polymorfismus) SP TMD TNF TS 3TC wt side population transmembránová doména tumor nekrotický faktor transmembránový segment lamivudin wild type (nejhojněji se vyskutující alela genu BCRP) 8

Cíl práce Cílem této práce je shrnutí aktuálních informací o struktuře, lokalizaci a funkcích breast cancer resistance proteinu (BCRP, ABCG2, MXR, ABCP), významného členu podrodiny G ABC transportérů léčiv, zejména pak jeho lokalizace a role v placentě. Tato práce se zabývá také BCRP substráty a inhibitory, zejména těmi, které jsou výuţitelné pro terapii těhotných ţen a jejich plodů. 9

1. Úvod V průběhu těhotenství je plod vystavován mnoha xenobiotickým agens, včetně léčiv. Farmakoterapie během těhotenství je však často nezbytná především díky potřebě léčit chronická onemocnění matky (např. epilepsie, astma, diabetes, hypertenze), akutní onemocnění (infekce, záchvaty, gastrointestinální potíţe) nebo různé závaţné stavy, jako např. tumory (Garcia-Bournissen et al., 2003). Navíc můţe být plod ohroţován mnoha jinými škodlivými xenobiotiky přítomnými v mateřské krvi, např. návykovými látkami (Rayburn and Bogenschutz, 2004). Na druhé straně je někdy potřeba léčit plodu podáváním léčiv matce, např. při tachykardii plodu nebo pro předcházení přenosu HIV z matky na plod. Placenta je orgán slouţící jako primární spojení mezi matkou a plodem, nezbytný pro růst a vývoj plodu (Thadani et al., 2004). Mezi nejdůleţitější funkce placenty patří mimo jiné přenos ţivin z matky do plodu a odstraňování metabolických odpadních produktů plodu. Tyto funkce jsou usnadněny rozličnými transportéry, které jsou exprimovány jak na membráně kartáčového lemu, tak na bazální membráně syncytiotrofoblastu (Ganapathy et al., 2000). Specifita těchto transportérů není omezena jen na fyziologické substráty. Taktéţ xenobiotika (terapeutická agens, polutanty a toxiny ţivotního prostředí a návykové látky), která se svou strukturou podobají fyziologickým substrátům, jsou těmito transportéry rozpoznávána. Distribuce látek přes placentární bariéru je proto značně ovlivněna transportéry, které jsou v placentě exprimovány. Mnoho z těchto organismu cizích sloučenin má pravděpodobně silný vliv na placentu a plod díky své schopnosti interagovat se specifickými enzymy, receptory, transportéry a jinými regulatorními proteiny. Navíc, díky kompetici s fyziologickými substráty placentárních transportérů, jsou tyto sloučeniny pravděpodobně schopny zasahovat do transplacentárního přenosu ţivin z matky do plodu a tedy ovlivňovat jeho růst a vývoj (Ganapathy et al., 2000). Detailní pochopení mechanismu transportu léčiv přes placentu je nezbytné pro optimalizaci farmakoterapie během těhotenství. Farmakokinetické, farmakodynamické i bezpečnostní údaje v průběhu gestace pro většinu léčiv z etických důvodů chybí, coţ má za následek jejich limitované vyuţití pro terapii těhotných ţen. Objev efluxních transportérů léčiv jako aktivních komponent placentární bariéry 10

přinesl důleţité poznatky o transplacentární charakteristice mnoha látek (Ceckova- Novotna et al., 2006). 11

2. Struktura placenty Lidská placenta je tvořena jak fetální (choriový plát a choriové klky), tak mateřskou tkání (decidua basalis). Deciduální septa vystupují z decidua basalis a dělí orgán na 20-40 kompartmentů (kotyledonů), které tvoří funkční vaskulární jednotku placenty. Kaţdý kotyledon obsahuje strom choriových klků, skládající se z fetálního kapilárního endotelu, stromatu a trofoblastové vrstvy a je omýván mateřskou krví přítomnou v intravilózním prostoru (Obr. 1). Vnější vrstva kaţdého vilózního stromu je tvořena mnohojaderným syncytiotrofoblastem, který vzniká spojením jednojaderných cytotrofoblastů. Vrstva syncytiotrofoblastu představuje bariéru limitující mnoţství většiny látek transportovaných přes placentu. S postupující dobou těhotenství se tloušťka lidské placenty zmenšuje hlavně v důsledku částečného úbytku cytotrofoblastové vrstvy (Ceckova-Novotna et al., 2006). 12

Obr. 1: Schématická struktura lidské placenty: (A) Příčný řez dělohou na konci těhotenství ukazující spojení plodu a placenty. V detailním schématu je znázorněna struktura kotyledonu, funkční jednotky placenty. Chorion, fetální část placenty, se skládá z choriového plátu a choriových klků, které jsou omývány mateřskou krví. Ta vstupuje do intervilózního prostoru z arterií v decidua basalis. Kyslík a živiny z mateřské krve přestupují trofoblastovou vrstvu choriových klků, vstupují do fetální krve a do plodu jsou přenášeny umbilikální žílou. Odkysličená krev je z plodu odváděna dvěma umbilikálními artériemi. (B) Řez terminálním klkem placenty ve třetím trimestru. (C) Schématická lokalizace ABC transportérů v terminálním klku (převzato z publikace Ceckova-Novotna et al., 2006). Lidská placenta je hemochoriálního typu, coţ znamená, ţe trofoblast je v přímém kontaktu s mateřskou krví. Placenta běţně pouţívaných laboratorních zvířat (myš, potkan, morče, králík) je také hemochoriální, na rozdíl od epi- nebo endotelochoriální placenty některých jiných zvířecích druhů (ovce, prase pes, kočka). Při vyuţívání zvířecích modelů je potřeba brát v úvahu rozdíly ve stavbě placenty, které mohou mít vliv na transplacentární transport látek (Ceckova-Novotna et al., 2006). 2.1 Polarita placentárního syncytiotrofoblastu a její vztah k transplacentárnímu přenosu fyziologických substancí a xenobiotik Trofoblast je tvořen mnohojadernou vrstvou syncytiotrofoblastu, která vzniká fúzí původních kmenových buněk cytotrofoblastu. Toto mnohojaderné soubuní má povahu polarizované vrstvy, ohraničené na jedné straně mikrovilózně zvlněnou apikální membránou, která je v přímém kontaktu s mateřskou krví a bazální membránou, obrácenou směrem ke krevnímu oběhu plodu (Obr. 2). Přechod látek z mateřské krve do cirkulace plodu tak vyţaduje jejich přestup nejprve přes apikální membránu a následně přes bazální membránu syncytiotrofoblastu (van der Aa et al., 1998; Ganapathy et al., 2000). 13

Obr. 2: Schéma placentární bariéry. ST syncytiotrofoblast; CT cytotrofoblast; FC fetální cévy (převzato z publikace Ganapathy et al., 2000, Ceckova-Novotna, 2005 disertační práce). 2.2 Mechanismus transportu léčiv přes placentu; vliv efluxních transportérů léčiv Kaţdá chemická látka podaná matce je do určité míry schopna přecházet přes placentu do plodu (Pacifici and Nottoli, 1995). Základním mechanismem přestupu látek přes placentu je pasivní difúze, která je závislá na liposolubilitě sloučeniny, velikosti molekuly, stupni ionizace a vazbě na plazmatické bílkoviny. Hnací silou je koncentrační rozdíl látky na opačných stranách bariéry. Pasivní difúze se řídí Fickovým zákonem. Facilitovaná difúze je energeticky nezávislý transport zprostředkovaný proteinovým přenašečem ve směru koncentračního spádu. Je inhibována strukturálními analogy substrátu a je saturabilní. Takto jsou transportovány hlavně endogenní sloučeniny a látky, které jim jsou strukturně blízké (van der Aa et al., 1998). 14

Aktivní transport je uskutečňován proti elektrochemickému a koncentračnímu gradientu a tedy vyţaduje dodání energie. Je zprostředkován přes lipofilní komplex přenašeč-léčivo. Tento transport je saturabilní a kompetitivní (van der Aa et al., 1998). Aktivním transportem jsou transportovány endogenní látky a jejich analoga (např. levodopa, -methyldopa), ale také xenobiotika. Transport léčiv je více neţ prostou pasivní difúzí zprostředkováván aktivním a facilitovaným transportem, které jsou závislé na fyzikálně-chemických vlastnostech sloučeniny. Rozlišujeme dvě skupiny aktivních transportérů, uptake transportéry: zajišťují transport do buňky a efluxní transportéry transport z buňky. Transport do buněk prostřednictvím přenašečů se pravděpodobně evolučně vyvinul pro usnadnění celulárního influxu ţivin a vitamínů a reabsorpci endogenně vytvořených sloučenin jako glukózy a dalších malých sacharidů, aminokyselin a malých peptidů, nukleosidů a ţlučových kyselin v tubulárních duktech. Mnoho z transportérů přenášejících substráty do buňky vyuţívá elektrochemický gradient iontů (např. Na + a HCO + 3 ) jako hnací síly umoţňující transport proti koncentračnímu gradientu. Transportéry substátů do buněk jsou transmembránové proteiny s intra- a extracelulárními doménami tvořícími spřaţený iontový kanál pro symport nebo antiport (Cascorbi, 2006). Většina efluxních transportérů, které patří mezi ABC membránové proteiny, mohou ovlivnit intracelulární koncentraci mnoha sloučenin v různých buňkách a tkáních. Tyto transportéry jsou důleţitým obranným mechanismem před penetrací xenobiotik nebo transmembránovým transportem různých endogenních sloučenin. Energie nezbytná pro přenos substrátů přes biomembrány je získávána z hydrolýzy ATP a následné fosforylaci transportérů, které umoţňují aktivní transport substrátů proti koncentračnímu gradientu (Cascorbi, 2006). Méně významnými způsoby transportu jsou fagocytóza pevných látek a pinocytóza kapének, kdy se tvoří vchlípeniny membrány nebo vakuol, do kterých je uzavřen transportovaný obsah (van der Aa et al., 1998). Transcytosolické procesy napomáhají zajistit transport ţivin a imunoglobulinů do plodu během gestace, ale zdá se, ţe pro placentární transfer běţně uţívaných léčiv mají pouze minoritní význam (Ceckova-Novotna et al., 2006). Na materno-fetálním rozhraní jsou zakotveny také metabolické enzymy I. a II. fáze biotransformačních reakcí, které limitují prostup léčiv a xenobiotik do plodu 15

(Pasanen, 1999). V placentě byly nalezeny aktivní izoformy cytochromu P450 (CYP1A a CYP2E1), a aktivní enzymy fáze II (např. sulfotransferázy, glutathion-s-transferázy, uridindifosfát-glukuronosyltransferázy nebo N-acetyltransferázy). Avšak u ţádného z těchto enzymů nebyla prokázána významnější role v detoxikaci xenobiotik. Placentární metabolismus léčiv a xenobiotik se proto zdá mít minoritní význam pro limitování přestupu léčiv přes placentu v porovnání s efluxnímu transportéry (Syme et al., 2004). 16

3. ABC efluxní transportéry léčiv Skupina ABC (adenosine-triphosphate binding cassette) transportérů je dosud nejpočetnější identifikovanou rodinou efluxních transmembránových proteinů, které jsou hojně rozšířeny ve všech organismech od bakterií po savce (Cervenak et al., 2006). Energie nezbytná pro transport rozmanitých substrátů přes biomembrány je získávána z hydrolýzy ATP (Cascorbi, 2006). Rodina ABC transportérů je u savců široká a funkčně velmi rozmanitá. Ovlivňují distribuci léčiv in vivo a často jsou spjaty s vznikem rezistence tumorů na léčiva (Cooray et al., 2004). Mezi ABC transportéry s dobře definovanou rolí v transportu klinicky významných léčiv patří P-glykoprotein (ABCB1, MDR1), multidrug resistance associated protein 1 (MRP1, ABCC1) a breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2, MXR, ABCP). Tyto proteiny jsou nejvíce spjaty se vznikem mnohočetné lékové rezistence jak v lidských tak hlodavčích buňkách (Schinkel and Jonker, 2003). 3.1 Struktura ABC transportérů léčiv Typickými strukturami většiny savčích ABC transportérů jsou dva typy domén. Hydrofóbní membránu-prostupující doména (MSD) se skládá z několika transmembránových α-helixů (TS), nejčastěji šesti, které několikrát prostupují membránu. Druhým typem je hydrofilní intracelulární nukleotid-vazebná doména (NBD) (Mao and Unadkat, 2005). Tyto domény mohou být umístěny na jednom polypeptidovém řetězci, pak se jedná o plné transportéry, nebo rozděleny do dvou proteinů, tedy polotransportéry. Ve druhém případě je pro správnou funkci transportéru potřeba jeho dimerizace. Za transport molekul těmito transportéry jsou pravděpodobně zodpovědny konformační změny MSD (Sarkadi et al., 2004). Většina savčích ABC transporérů má čtyřdoménovou strukturu (Mao and Unadkat, 2005). 17

Obr. 3: Předpokládané sekundární struktury efluxních transportérů léčiv z ABC rodiny. Jsou rozděleny do čtyř skupin podle jejich předpokládané struktury a sekvenční homologie aminokyselin. (1) P-glykoprotein se skládá ze dvou transmembránových domén (MSD), z nichž každá se skládá z šesti transmembránových segmentů (TS) a dvou nukleotid-vazebných domén (NBD). Je N-glykosylován na první extracelulární kličce. (2) MRP1, MRP2 a MRP3 mají navíc na NH 2 -konci prodloužení tvořené pěti (TS), které je N- glykosylováno. Druhá glykosylace je na šesté (TS). (3) MRP4 a MRP5 nemají aminokyselinové prodloužení a N-glykosylaci mají na čtvrté extracelulární kličce. (4) BCRP je polotransportér. Skládá se z jedné NBD a šesti (TS) a nejpravděpodobněji je N-glykosylován na třetí extracelulární kličce. Na rozdíl od ostatních transportérů, kde je NBD lokalizována na COOH-konci řetězce, je NBD BCRP na NH 2 -konci řetězce. pozn.: IN cytoplazma, OUT extracelulární prostor (převzato z publikace Schinkel and Jonker, 2003). 18

Na základě jejich předpokládané dvourozměrné membránové struktury mohou být efluxní transportéry rozděleny do 4 tříd (viz. Obr. 3): 1. P-glykoprotein (P-gp, MDR1), první objevený ABC transportér, se skládá ze dvou velmi podobných polovin, kaţdá je pravděpodobně sloţená ze šesti transmembránových segmentů (TS) a intracelulární ATP-váţící části. První extracelulární klička je u P-gp silně N-glykosylována (Schinkel and Jonker, 2003). 2. Multidrug Resistance Protein 4 a 5 (MRP4 a MRP5) mají obdobnou strukturu jako P-gp, ale N-glykosylace se tady nachází nejpravděpodobněji na čtvrté extracelulární kličce (Schinkel and Jonker, 2003). 3. MRP1, MRP2 a MRP3 mají stejnou základní strukturu jako MRP4 a MRP5, ale mají navíc N-terminální prodlouţení skládající se patrně z pěti TS. N- konec těchto proteinů je umístěn extracelulárně a u MRP 1 je navíc glykosylován (Schinkel and Jonker, 2003). 4. Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) je na rozdíl od předchozích skupin polotransportér skládající se jen z jedné intracelulární N-koncové strany váţící ATP následované šesti TS. Poslední extracelulární klička je N-glykosylována. Na základě porovnání se savčími ABC transportéry, bakteriálními polotransportéry, jako jsou LmrA a MsbA, a biochemickými daty se zdá, ţe BCRP pravděpodobně funguje jako homodimer (Schinkel and Jonker, 2003). Všechny tyto transportéry mají více či méně N-glykosylované extracelulární větvení. Na základě in vitro studií P-gp se soudí, ţe pro základní transportní funkci efluxních transportérů není tato N-glykosylace nezbytná. Její úlohou je pravděpodobně pomoc při zakotvení a stabilizaci v plasmatické membráně (Schinkel and Jonker, 2003). 19

3.2 Exprese ABC transportérů ve tkáních ABC transportéry jsou exprimovány jak v normálních tak i neoplastických buněčných typech (Fetsch et al., 2006). P-glykoprotein P-gp, protein o velikosti 170 kda, byl objeven v roce 1976 Julianem a Lingem jako fosfoglykoprotein exprimovaný v buňkách vaječníků morčete (Juliano and Ling, 1976). P-gp se hlavně (pokud ne výhradně) nachází na apikální membráně epiteliálních buněk. Transport substrátů přes P-gp je uskutečňován ve směru bazolaterálněapikálním. Je exprimován v mnoha fyziologických tkáních, např. na apikální membráně epitelu tlustého a tenkého střeva, v endoteliálních buňkách kapilár v mozku a varlatech, v syncytiotrofoblastu placenty, na membráně ţlučových kanalikulů jaterních hepatocytů, na apikální membráně proximálních tubulů ledvin a mnoha dalších tkáních, které jsou zahrnuty ve farmakokinetických procesech (Thiebaut et al., 1987). P-gp je vysoce exprimován v některých typech tumorů včetně ledvin, jater a tlustého střeva (Huang and Sadee, 2006). U leukémie, lymfomu a mnohočetného myelomu byla zjištěna zpočátku nízká exprese tohoto transportéru, která se ale po chemoterapii a relapsu zvyšuje a je tedy spjata se špatnou prognózou (Ambudkar et al., 2003). MRP transportéry MRP1 se nachází v plazmatické membráně mnoţství nepolarizovaných buněk, zatímco MRP2 a MRP3 specificky na membráně buněk polarizovaných. V hepatocytech a proximálních tubulech ledvin se MRP2 nachází na apikální membráně. Isoforma MRP3 se naopak nachází na bazolaterální membráně hepatocytů (Keppler et al., 2000). MRP2 byl pomocí Northern blottingu detekován i v duodenu a ileu (Konig et al., 1999). MRP transportéry se nachází i v plicní tkáni. MRP4 a MRP 5, na rozdíl od MRP2, byly detekovány na bazolaterální membráně pneumocytů (Torky et al., 2005). V mozku byly MRP1, MRP4 a MRP5 nalezeny v luminálních endoteliálních buňkách kapilár, zatímco MRP2 a MRP3 v mozku detekovány nebyly. MRP4 a MRP5 20

jsou dále exprimovány v astrocytech podkorové bílé hmoty a MRP5 i v pyramidálních neuronech (Nies et al., 2004). Exprese většiny členů MRP byla detekována v lidské a potkaní placentární tkáni. Na proteinové úrovni byl MRP1 nalezen na bazální membráně lidského placentárního trofoblastu, na rozdíl od lokalizace MRP2, který se nachází na apikální membráně syncytiotrofoblastu. Spolu s MRP3 je MRP1 také přítomen v endotelu cév plodu. V lidské placentě byly pozorovány změny exprese MRP5 v závislosti na gestaci. Ačkoliv se účast MRP transportérů na ochraně plodu předpokládá, jejich role v placentě není ještě úplně objasněna (Ceckova-Novotna et al., 2006). BCRP Určité mnoţství mrna BCRP bylo detekováno ve všech testovaných tkáních, coţ je pravděpodobně způsobeno jeho lokalizací v endotelu vén a kapilár (Maliepaard et al., 2001a). Tento transportér se nachází ve všech důleţitých distribučních bariérách organismu hematoencefalické, placentární i hematotestikulární bariéře. BCRP se nachází na bazolaterární membráně polarizovaných buněk. Exprese tohoto transportéru byla nalezena i v nádorové tkáni, kde je povaţován za jednu z příčin lékové rezistence. Vysoká exprese BCRP v placentě byla poprvé doloţena skupinou Allikmets a kol. (1998), který pojmenoval transportér jako placentárně specifický ABC transportér (ABCP). BCRP byl později lokalizován v trofoblastové vrstvě placentárních choriových klků (Ceckova-Novotna et al., 2006). Funkce BCRP byla demonstrována na mikroklkové membráně vezikul preparovaných z lidské placenty. To naznačuje, ţe placentární BCRP, stejně jako P-gp, můţe přispívat k protektivní funkci placenty tím, ţe transportuje cytotoxická léčiva a toxická xenobiotika z plodu do mateřské cirkulace (Ceckova-Novotna et al., 2006). Navíc se exprese BCRP v lidské placentě ukázala být více neţ desetkrát vyšší neţ exprese P-gp (Staud et al., 2006). 21

3.3 Funkce ABC transportérů ve tkáních U lidí je dnes známo přinejmenším 49 členů ABC rodiny rozdělených do 7 podrodin (Cascorbi, 2006). Mnoho ABC genů, respektive jejich defekty, hrají roli v dědičných chorobách u lidí. Patří mezi ně například cystická fibróza způsobená defektem transmembránového kanálu CFTR/ABCC7 (Sarkadi et al., 2004). ABC transportéry v závislosti na místech své exprese značně ovlivňují farmakologické vlastnosti, jako jsou absorpce, distribuce, metabolismus nebo exkrece látek a jejich metabolitů či konjugátů (Schinkel and Jonker, 2003). Aby mohlo léčivo správně účinkovat, musí v těle vstupovat do různých kompartmentů, např. přes hematoencefalickou bariéru do mozku. Vlivem transportérů, které se na bariérách nacházejí, můţe docházet k ovlivnění účinnosti terapie či neočekávané toxicitě léčiv (Sarkadi et al., 2004; Albermann et al., 2005). Endoteliální buňky kapilár v mozku jsou spojeny prostřednictvím tzv. tight junctions. Všechny molekuly, které nejsou dostatečně malé, aby mohly difundovat mezi buňkami, musí prostupovat přes endoteliální buňky z krve do mozkové tkáně. ABC transportéry, které se nachází v luminární membráně kapilár, pumpují z buněk substráty zpět do krve a chrání tak tkáně před toxiny z krve. Důsledkem toho je, ţe penetrace léčiv a dalších sloučenin do tkáně můţe být dramaticky sníţena. Při absenci P-gp v HEB se můţe penetrace jeho substrátových léčiv do mozku zvýšit 10-100krát, coţ můţe mít dramatické důsledky pro klinickou pouţitelnost a toxicitu sloučenin. Tato funkce ABC transportérů je shodná na všech distribučních bariérách v organismu (Schinkel and Jonker, 2003). ABC transportéry jsou hojně exprimovány v membráně ţlučových kanalikulů hepatocytů a v epiteliální membráně tenkého a tlustého střeva. Jednou z předpokládaných funkcí v těchto místech je eflux léčiv a jiných sloučenin z jaterních hepatocytů do ţluče a ze střevního epitelu do střevního lumen. Efluxované substráty nakonec opustí tělo cestou fekálií. Celkově tedy mají tyto transportéry za následek plasmatické očisťovaní a detoxikaci. Pro mnoţství intravenózně podaných léčiv to také znamená zvýšení jejich clearance (Schinkel and Jonker, 2003). Hojná exprese ABC transportérů ve střevním epitelu přispívá ke sníţení biodostupnosti mnoha perorálně podaných léčiv. Má-li léčivo nízkou perorální 22

biodostupnost, plasmatické hladiny léčiva nemusí dosáhnout dostatečně vysokých terapeutických hladin. Proto je potřeba ověřit, zda je zkoumané léčivo substrátem některého z ABC transportérů, protoţe to můţe znamenat, ţe není vhodné pro perorální podání. V závislosti na terapeutické kategorii léčiva to můţe zabránit jeho konečnému klinickému uţití (Schinkel and Jonker, 2003). V placentární bariéře (Obr. 4) se efluxní transportéry nejhojněji nacházejí v syncytiotrofoblastové vrstvě, která tvoří funkční bariéru mezi mateřskou a plodovou krevní cirkulací a je nezbytná pro výměnu ţivin a odpadních produktů, ale taky pro ochranu fetální cirkulace. Funkce ABC transportérů se zde zdá být analogická s tou v HEB: chrání vysoce citlivý vyvíjející se plod před xenotoxiny a léčivy přítomnými v mateřské cirkulaci aktivním zpětným transportem. Pro většinu terapeutických účelů je samozřejmě nízká penetrace léčiv do plodu vysoce ţádoucí, ale v případě léčby HIV je výhodná mírná penetrace léčiv do plodu krátce před porodem, coţ můţe sníţit frekvenci vertikálního přenosu infekce HIV (Schinkel and Jonker, 2003). Aktivita ABC transportérů je velmi variabilní a můţe být během hodin změněna inhibitory a v průběhu několika dní induktory. Transportní aktivita můţe být ovlivněna také geneticky nebo endogenními faktory, jako např. pohlavními hormony nebo cholesterolem (Albermann et al., 2005). Jejich aktivita se liší jak mezi zvířecími druhy, tak individuálně mezi jedinci. Transkripce těchto transportérů je spjata s fyziologickými procesy, mimo jiné s hormonálním statusem, faktory ţivotního prostředí a potravou, která můţe obsahovat inhibitory (Haritova et al., 2007). P-gp a MRP1 transportují širokou škálu strukturně různorodých hydrofobních cytotoxických léčiv. Substráty MRP1 jsou také anionická léčiva a anionické konjugáty. BCRP má substrátovou specifitu velmi podobnou P-gp a částečně se kryjící s MRP podrodinou transportérů. Tyto tři skupiny transportérů tvoří jedinečnou obranou síť proti mnohým chemoterapeutickým agens a buněčným toxinům (Bram et al., 2007). Hrají důleţitou roli v různých fyziologických procesech jako transport léčiv (xenobiotik), mnoha xenotoxinů, (pre)karcinogenů a endogenních sloučenin nebo konjugátů a exkrece endogenních metabolitů nebo fyziologických substrátů (Schinkel and Jonker, 2003). 23

Obr. 4: Transport přes placentární bariéru. Transport látek z matky do plodu je uskutečňován třemi způsoby: (1) volné, rozpuštěné v plazmě, (2) navázané na přenašečové proteiny nebo (3) navázané na červené krvinky. Molekuly přecházející z mateřské do plodové krve musí prostupovat syncytiotrofoblastem buď přes cytoplasmu trofoblastu, nebo pomocí sítě transportérů. Transport molekuly přes placentu tak zahrnuje pohyb mezi třemi kompartmenty mateřskou krví, cytoplazmou cytotrofoblastu a fetální krví. Koeficient rozpustnosti v každém z těchto kompartmentů tak hraje klíčovou roli určující množství látky, které bude transportováno přes placentu a ve velké míře je také závislé na iniciální absorpci léčiva do mateřské krve (převzato z publikace Gedeon and Koren, 2006). 24

3.4 Substráty a inhibitory 3.4.1 P-glykoprotein Substráty P-glykoprotein je pravděpodobně nejprozkoumanějším ABC efluxním transportérem léčiv. Jeho substráty jsou různorodé, včetně mnoţství léčiv pouţívaných pro různé terapeutické aplikace, např. mnohá cytostatika. P-gp byl identifikován právě na základě exprese v buněčných liniích, kterým uděloval rezistenci k těmto léčivům (Schinkel and Jonker, 2003). Jediným společným doposud identifikovaným jmenovatelem pro všechny P-gp substráty je jejich amfipatický charakter. To můţe souviset s mechanismem transportu: intracelulární substrát P-gp je nejprve vsunut do vnitřní vrstvy bimolekulárního filmu buněčné membrány a poté překlopen do vnější vrstvy filmu nebo vytěsněn přímo do extracelulární tekutiny (Higgins and Gottesman, 1992). Pouze amfipatické molekuly mají správné vlastnosti pro zasunutí do membrány. Jak P-gp (MDR1), tak úzce příbuzný MDR3, mohou transportovat vnitřní (amfipatické) membránové součásti jako jsou fosfatidylcholin a jeho analoga, coţ podporuje názor, ţe substráty jsou zachycovány přímo z vnitřní vrstvy bimolekulárního filmu (Schinkel and Jonker, 2003). Společné vlastnosti substrátů P-gp: - Obvykle to jsou organické molekuly o velikosti v rozmezí od 200 Da do téměř 19000 Da. - Mnohé z nich obsahují aromatické skupiny, ale alifatické nebo cyklické molekuly jsou transportovány také. 25

- Většina z transportovaných léčiv je bez náboje, (slabě) zásadité povahy, ale některé kyselé sloučeniny (např. methotrexát, fenytoin) mohou být v menší míře také transportovány (Schinkel and Jonker, 2003). Jelikoţ jsou substráty P-gp relativně hydrofóbní, mohou pasivně difundovat přes biologické membrány. To znamená, ţe při absenci aktivního transportu mohou procházet membránami a (in vivo) penetrovat do tkání a farmakologických kompartmentů (Schinkel and Jonker, 2003). Inhibitory Transport cytotoxických a jiných substrátů P-gp můţe být inhibován sloučeninami, tzv. reverzními agens neboli blokátory P-gp. Jsou-li tyto inhibitory samy také substráty P-gp, jako např. blokátor kalciových kanálů verapamil nebo imunosupresivum cyklosporin A, mohou se chovat jako kompetitivní inhibitory. Jiné inhibitory, pro které je nevýznamný transport pomocí P-gp, mají pravděpodobně odlišný funkční mechanismus. Ale je moţné, ţe některé sloučeniny tak rychle difundují přes membrány, ţe transport prostřednictvím tohoto transportéru není zaznamenatelný (Schinkel and Jonker, 2003). Původní klinické aplikace inhibitorů P-gp byly zaměřeny na potlačení mnohočetné lékové rezistence v chemoterapeuticky rezistentních nádorových buňkách obsahujících značné mnoţství P-gp. Později se ukázalo, ţe tyto inhibitory mohou být také uţitečné pro modifikování farmakologického chování léčiv v těle. Mezi P-gp inhibitory druhé a třetí generace, které byly speciálně vybrány pro jejich vysokou schopnost inhibovat P-gp a pro nedostatek farmakodynamických efektů, patří: PSC 833 (Valspodar), GF120918, LY335979, XR9576 nebo OC144-093 (Schinkel and Jonker, 2003). 26

3.4.2 MRP transportéry Podrodina MRP transportérů má devět členů, kteří se účastní transportu velkého okruhu látek včetně organických, anionických léčiv, glutathion-, glukuronid- a sulfátkonjugátů, nukleotidů a jejich analogů (Haimeur et al., 2004). Všechny MRP transportéry jsou anionické pumpy, které mají schopnost vyvinout rezistenci na protirakovinná léčiva. Tyto transportéry mohou být děleny na základě třetí transmembránové domény a NH 2 -konce, který se nachází u MRP1, 2, 3, 6 a 7, ale ne u MRP4, 5, 8 a 9 (Kruh and Belinsky, 2003). Tento rys úzce souvisí s vlastnostmi těchto proteinů. Zatímco všechny MRP transportéry jsou schopny transportovat glutathionové konjugáty a jiné organické anionty, pouze MRP4, 5 a 8 jsou schopny transportovat nukleosidové léčiva, jako např. purinová analoga, a tím k nim vyvíjet rezistenci (Guo et al., 2003). MRP1 byl poprvé identifikován v buněčné linii vykazující vysokou rezistenci na cytotoxické léčivo doxorubicin a následující analýzy ukázaly, ţe MRP1 způsobuje rezistenci na širokou škálu protirakovinných léčiv (např. Vinca alkaloidy, antracykliny, epipodophylotoxiny, mitoxantron a methotrexát) (Cole et al., 1992). Na rozdíl od P-gp nezpůsobuje rezistenci buněk k paklitaxelu nebo bisantrenu (Schinkel and Jonker, 2003) a je lokalizován na bazolaterální membráně epiteliálních buněčných vrstev (Evers et al., 1996). Dalším rozdílem oproti P-gp je funkce MRP1 hlavně jako (ko-)transportéru amfipatických organických anionů. Můţe transportovat hydrofóbní léčiva nebo jiné sloučeniny (např. mediátor zánětu leukotrien C4 (LTC 4 )), které jsou konjugovány nebo vázány v komplexu s anionickým tripeptidem glutathionem (GSH), glukuronovou kyselinou nebo sulfátem. Účinný export několika neanionických protirakovinných léčiv MRP1 je závislý na normálním buněčném zásobování GSH (a je pravděpodobné, ţe MRP1 exportuje léčiva jako vinkristin a etoposid prostřednictvím ko-transportu s redukovaným GSH) (Schinkel and Jonker, 2003). Také anorganické oxyanionty těţkých kovů jako arsenitany a trivalentní antimon jsou transportovány MRP1, pravděpodobně všechny v komplexu s GSH (Zaman et al., 1995). Najít vhodnou malou molekulu inhibitoru MRP1 se ukázalo být sloţitějším neţ v případě P-gp. Pravděpodobně to souvisí s MRP1 preferencí anionických sloučenin jako inhibitorů i substrátů. A jelikoţ většina anionických sloučenin vstupuje do buněk 27

málo, můţe tedy být obtíţné získat dostatečnou intracelulární koncentraci inhibitoru pro účinnou inhibici (Schinkel and Jonker, 2003). 3.5 Podrodina G ABC transportérů Do podrodiny G ABC transportérů patří několik proteinů s jedinečnou doménovou strukturou: ABCG1 (lidský homolog Drosophila white genu ABCG1) (Klucken et al., 2000), ABCG2, myší ABCG3 (Mao and Unadkat, 2005), ABCG4 (Oldfield et al., 2002), ABCG5, ABCG6, ABCG7 a ABCG8 (Mao and Unadkat, 2005). Srovnání sekvence ABCG proteinů s P-gp a MRP1 ukázalo, ţe na rozdíl od P-gp a MRP1, které se skládají ze dvou opakujících se polovin, všechny ABCG proteiny jsou polotransportéry sloţené z jedné nukleotid-vazebné domény (NBD) následované jednou membránu-prostupující doménou (MSD). Druhým jedinečným rysem je konfigurace ABCG proteinů, ve které NBD předchází MSD, zatímco u P-gp nebo MRP1 je postavení domén opačné. Takováto jedinečná organizace domén byla pozorována jen u ABCG transportérů a vede tedy k závěru, ţe transportní mechanismus ABCG proteinů můţe být odlišný od jiných skupin ABC transportérů (Mao and Unadkat, 2005). Základním členem ABCG podrodiny je ABCG1, lidský homolog Drosophila white genu. BCRP je druhým členem této podrodiny a je tedy označován ABCG2 (Klucken et al., 2000). ABCG1 podmiňuje regulaci homeostázy lipidů buněk v makrofázích facilitovaným efluxem buněčných lipidů včetně cholesterolu a fosfolipidů. Další členové ABCG podrodiny, ABCG5 a ABCG8, jsou transportéry cholesterolu a rostlinných sterolů. Oba jsou vysoce exprimovány v apikální membráně tenkého střeva a kanalikulární membráně jater. Tyto lipidové transportéry regulují plazmatické hladiny sterolů potravy tím, ţe limitují absorpci a zvyšují intestinální a hepatobiliární eliminaci rostlinných sterolů (Mao and Unadkat, 2005). ABCG1, ABCG5 a ABCG8 se stávají funkčními aţ po vzniku homodimeru nebo heterodimeru s dosud neznámým ABC transportérem (Klucken et al., 2000; Albrecht et al., 2002). Další transportéry této podrodiny ABCG4, ABCG6 a ABCG7 byly identifikovány u lidí, ale jejich funkce zůstává zatím neobjasněna (Mao and Unadkat, 2005). 28

4. Breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2, MXR, ABCP) BCRP je teprve nedávno objeveným lékovým efluxním transportérem s širokou substrátovou specifitou. Díky své struktuře a velikosti, která je oproti jiným ABC transportérům poloviční, je řazen do ABCG podrodiny, která zahrnuje i další transportní proteiny (viz výše). BCRP byl poprvé popsán jako protein kódovaný 663 aminokyselinami v prsní nádorové buněčné linii MCF7 vysoce rezistentní k doxorubicinu, mitoxantronu a daunorubicinu (Doyle et al., 1998). Protoţe byl gen izolován z buněčné linie rakoviny prsu, byl nazván Breast cancer resistance protein (BCRP). Jeho exprese však není specifická pro buňky rakoviny prsu, ani nehraje podstatnou roli v rezistenci na chemoterapii rakoviny prsu (Schinkel and Jonker, 2003). Paralelně bylo jinou výzkumnou skupinou zjištěno, ţe tento transportér způsobuje rezistenci nádorových buněk k mitoxantronu a proto byl pojmenován mitoxantrone resistance protein (MXR) (Miyake et al., 1999). Vysoká exprese transportéru se stejnou strukturou byla v téţe době nalezena v placentě a dala tomuto proteinu název placentárně specifický ABC transportér (ABCP) (Allikmets et al., 1998). BCRP je peptid schopný odstraňovat různorodé chemické sloučeniny z buněk. Dnes je povaţován za jeden ze tří hlavních transportérů způsobujících rezistenci na léčiva v buňkách savců. Je také rozšířen v epitelech orgánů, jako je placenta, játra a střeva. BCRP je navíc zodpovědný za tzv. side population fenotyp kmenových buněk a zdá se, ţe hraje podstatnou roli v ochraně před hypoxii (Schinkel and Jonker, 2003). Vysoká aktivita ATP byla zaznamenána u membrán izolovaných z buněk hmyzu, bakterií a kvasinek exprimujících BCRP. Pokusy se značeným BCRP (8-azido[α- 32 P]) naznačují, ţe je opravdu schopen hydrolyzovat ATP. Tedy ţe funkce efluxního transportéru BCRP jako energeticky závislé pumpy je poháněna hydrolýzou ATP. Studie různých laboratoří ukázaly, ţe některé substráty jako mitoxantron, E 1 S a topotekan buď inhibují, nebo nemají ţádný vliv na aktivitu ATPázy wild type (wt - nejhojněji se vyskutující alela genu BCRP ) BCRP. Na rozdíl od toho se u bakterií exprimujících BCRP ukázalo, ţe tyto substráty ATP aktivitu stimulují. Tudíţ jak přesně 29

je hydrolýza ATP spjata s aktuálním transportním procesem BCRP je zatím nejasné. Ačkoliv jsou strukturální a funkční analýzy BCRP stále na začátku, podstatným pokrokem je funkční charakterizace BCRP s ohledem na jeho substrátovou specifitu, vazbu a hydrolýzu ATP a analýzu mutantů (Mao and Unadkat, 2005). 4.1 Struktura BCRP BCRP gen, který se skládá z 16 exonů a 15 intronů (Nakagawa et al., 2006), je lokalizován na čtvrtém chromozomu (Rao et al., 2005) a kóduje 655 aminokyselin tvořící protein o velikosti 72,1 kda. Strukturně patří BCRP ke genové podrodině ABCG. Na rozdíl od většiny jiných ABC transportérů obsahuje BCRP jen jednu NH 2 -terminální cytozolickou nukleotidvazebnou doménu (NBD), coţ je úsek slouţící pro navázání a hydrolýzu ATP. Šest transmembránových segmentů (TS) tvořících transmembránovou doménu (TMD) se podílí na vazbě léčiva a jeho následném efluxu (Obr. 5) (Staud and Pavek, 2005). OUT IN Obr. 5: Modely domnělé trojrozměrné a dvourozměrné struktury BCRP. BCRP je polotransportér, který se skládá se z jedné NH 2 -terminální nukleotid-vazebné domény následované šesti transmembránovými segmenty. Je N-glykosylován na třetí 30

extracelulární kličce. Hydrolýza ATP poskytuje energii pro aktivní eflux substrátů. BCRP pravděpodobně funguje jako homodimer. Šipka ukazuje směr transportu z cytoplazmy do extracelulárního prostoru. Pozn.: červeně, respektive oranžově, je znázorněna NBD, žlutě je vyznačena N-glykosylace; IN cytoplazma, OUT extracelulární prostor (převzato z publikace van Herwaarden and Schinkel, 2006). Myší homolog Bcrp1 je vysoce exprimován v myších fibroblastech selektovaných s rezistencí na doxorubicin, mitoxantron nebo topotekan. Bcrp1 kóduje 657 aminokyselin tvořících protein z 81% identický s BCRP. Stejně jako lidský BCRP zprostředkovává rezistenci na energii závislým efluxem substrátových léčiv. U buněčných linií vysoce exprimujících BCRP nebo Bcrp1 byl genový lokus často, ale ne vţdy zmnoţený. To naznačuje, ţe vysoká exprese můţe ústit jak z in situ genové aktivace, tak genové amplifikace (Schinkel and Jonker, 2003). O mechanismu, který řídí expresi BCRP, je toho známo poměrně málo. Zvýšená exprese BCRP můţe být výsledkem buď změny pořadí genů na čtvrtém chromozomu, nebo jejich amplifikace (Rao et al., 2005). Vzhledem k analogii s dalšími ABC efluxními transportéry léčiv se usuzovalo, ţe BCRP můţe fungovat jako homo- nebo heterodimer (Kage et al., 2002). Nyní se předpokládá existence a funkce BCRP v podobě tetrameru spojeného disulfidickými můstky (Xu et al., 2004) či multimeru sloţeného z pěti aţ osmi podjednotek (McDevitt et al., 2006). Dosavadní poznatky týkající se struktury BCRP byly sumarizovány ve studii Xu a kol (2007). 4.2 Tkáňová distribuce BCRP Lokalizace BCRP (Obr. 6, tab. 1) v savčích tkáních byla sledována jak na úrovni mrna, tak proteinu. Pro imunochemickou detekci či Western blotting je v současné době dostupno několik monoklonálních protilátek, např. BXP-21 a BXP-34. Určité mnoţství mrna BCRP bylo detekováno ve všech testovaných tkáních, coţ je pravděpodobně způsobeno tím, ţe transportér je lokalizován v endotelu vén a kapilár. V arteriálním endotelu detekován nebyl (Maliepaard et al., 2001a). 31

Studium lidských tkání prokázalo nejvyšší expresi BCRP v placentě. Za pouţití imunohistochemické detekce byl BCRP lokalizován především ve vrstvě syncytiotrofoblastu (Maliepaard et al., 2001a) a v endotelu fetálních cév placentárních klků (Ceckova et al., 2006). Několik studií zkoumajících expresi analogů BCRP v placentě myši a potkana přineslo rozdílné výsledky. Zatímco Tanaka a kol. (2005) a Jonker a kol. (2000) pozorovali expresi mírnou, Wang a kol. (2006b) demonstrovali expresi Bcrp1 v placentě myši srovnatelně vysokou s expresí v ledvinách. Vysoká míra exprese mrna BCRP u člověka byla zjištěna na apikální membráně epitelu tenkého a tlustého střeva (Gutmann et al., 2005), dále na kanalikulární membráně jater (Mao and Unadkat, 2005), na ostrůvcích a acinárních buňkách pankreatu (Fetsch et al., 2006). a ve slezině (Mao and Unadkat, 2005). Stejně jako MRP2 tak i BCRP se nachází na apikální straně hepatocytů a enterocytů, kde omezuje transport do buněk a systémovou biodostupnost látek včetně léčiv a karcinogenů. Navíc je BCRP významně exprimován v přechodném epitelu močového měchýře, zóně reticularis nadledvinek a korových tubulech ledvin. V malé míře se také nachází v intersticiálních buňkách varlat, epitelu prostaty, endocervikálních buňkách dělohy, dlaţdicových buňkách cervixu a některých dalších tkáních (Mao and Unadkat, 2005; Fetsch et al., 2006). Studium lidských tkání prokázalo nejvyšší expresi BCRP v placentě. Za pouţití imunohistochemické detekce byl BCRP lokalizován především ve vrstvě syncytiotrofoblastu (Maliepaard et al., 2001a) a v endotelu fetálních cév placentárních klků (Ceckova et al., 2006). Dosavadní studie ukázaly, ţe distribuce BCRP ve tkáních je druhově specifická. Zatímco exprese mrna BCRP v lidských ledvinách je nízká, Bcrp1 je v ledvinách myši exprimován hojně (Jonker et al., 2000). U potkana byla značná exprese tohoto transportéru nalezena ve střevě, ledvinách a varlatech (Tanaka et al., 2005). V těchto studiích byla jak v potkaní tak i myší placentě zjištěna poměrně nízká hladina exprese analogů BCRP (Jonker et al., 2000; Tanaka et al., 2005) ve srovnání s velmi vysokými hladinami v placentě lidské (Allikmets et al., 1998; Doyle et al., 1998). Avšak v současné studii Wang a kol. (2006a) byla nalezena exprese Bcrp1 v placentě myši srovnatelná s hladinou v ledvinách. 32

Obr. 6: Schéma lokalizace a funkce BCRP v organismu; inhibitory a substráty wt BCRP (převzato z publikace Staud and Pavek, 2005). Bylo zjištěno, ţe také pohlavní hormony ovlivňují expresi BCRP. Vyšší hladina Bcrp v ledvinách samců potkana neţ ledvinách samic je totiţ způsobena supresivním účinkem samičích steroidních pohlavních hormonů a můţe být důleţitá pro modulaci renální tubulární sekrece substrátů Bcrp, např. sulfátů estrogenů, estradiolu nebo 17 estradiol-17 - D -glukuronidu (Tanaka et al., 2005). Intestinální exprese potkaních a myších analogů BCRP se nezdá být pohlavím ovlivněna (Gutmann et al., 2005; Tanaka et al., 2005). Imunohistochemické studie odhalily vysokou expresi BCRP v mozku (Cooray et al., 2004). Následná mikroskopická analýza lokalizovala BCRP na luminální stranu endotelu krevních cév lidského mozku, coţ se úzce podobá lokalizaci P-gp na hematoencefalické bariéře (Aronica et al., 2005). Další studie prokázaly vyšší expresi BCRP v porovnání s P-gp a MRP1 jak u nemaligní lidské mozkové tkáně, tak 33

u glioblastového tumoru (glioblastomu). Tato data ukazují, ţe BCRP můţe být protektivní efluxní pumpou hematoencefalické bariéry a jiných oblastí mozku a analogicky s P-gp hrát důleţitou roli v regulaci penetrace xenobiotik do mozku (Zhang et al., 2003). Další studie prokázala, ţe myší Bcrp1 je po mrtvici v hematoencefalické bariéře up-regulován s maximem exprese ve 3 aţ 14 dni. Čtrnáctý den je doba, která se shoduje s upregulací mozkových plasticitních faktorů, vaskulogenezí a behaviorálním zotavením (Dazert et al., 2006). Překvapivě byl BCRP a jeho analoga také identifikován jako hlavní efluxní transportér v mléčné ţláze myši, skotu i člověka na konci gestace a v období laktace, a sice na apikální membráně alveolárních buněk epitelu, tzn. na straně aktivní produkce mléka (Jonker et al., 2000; Jonker et al., 2005; van Herwaarden and Schinkel, 2006). Zatímco v placentární tkáni působí BCRP jako ochranný prvek plodu, v mléčné ţláze je naopak významným faktorem ovlivňujícím sekreci xenobiotik do mléka. Konzumace kontaminovaného mléka kojencem se tudíţ zdá být v přímém rozporu s detoxifikační rolí BCRP v těle matky. Vysoké hladiny exprese BCRP/Bcrp1 mrna byly nalezeny v primitivních hematopoetických buňkách kostní dřeně vykazujících tzv. side population (SP) fenotyp, který je charakterizován nízkou akumulací barviva Hoechst 33342. Jelikoţ Hoechst 33342 je substrátem BCRP, předpokládá se, ţe právě BCRP je molekulární determinantou SP fenotypu, která můţe být pouţita pro selekci kmenových buněk. SP frakce je bohatá na nediferencované kmenové buňky, avšak exprese BCRP/Bcrp1 ve většině diferencovaných hematopoetických liniích je malá nebo úplně chybí (Zhou et al., 2001; Kim et al., 2002; Scharenberg et al., 2002). Exprese BCRP byla dále pozorována v kmenových buňkách celé řady různých tkání, jako jsou intersticiální prostory kosterních svalů savců, humánní pankreatické ostrůvky, lidská játra a vyvíjející se a dospělé srdce (Mao and Unadkat, 2005). Exprese BCRP mrna i proteinu byla detekována u různých typů hematologických malignit i solidních tumorů. Poprvé byla exprese mrna BCRP zjištěna v blastových buňkách pacienta s akutní lymfoblastickou leukemií a 20 pacientů s akutmí myelogenní leukémií pomocí RT-PCR. U sedmi fenotypově rezistentních pacientů (33%) byly nalezeny relativně vysoké hladiny BCRP mrna, ale ne P-gp (Ross et al., 2000). 34

U solidních tumorů byla BCRP exprese detekována se znatelně vyšší frekvencí u karcinomu ţaludku, tlustého střeva, jater, endometria, malobuněčné rakoviny plic a melanomu (Diestra et al., 2002). Závěrem lze říci, ţe díky své lokalizaci v různorodých tkáních BCRP ovlivňuje farmakokinetiku mnoha sloučenin a zároveň přispívá k protektivní roli fyziologických bariér tím, ţe zabraňuje penetraci potenciálně škodlivých látek. Tab. 1: Lokalizace BCRP Pohlavní soustava Syncytiotrofoblast = MFB Děloha (endocervikální buňky) Cervixu (dlaţdicové buňky) Varlata (intersticiální buňky) = HTB Prostata Prso (dukty, lobuly) Cévní soustava Vény (epitel) Kapiláry (epitel) Srdeční sval CNS Mozek = HEB Dýchací soustava Plíce (alveolární pneumocyty) 35

Trávící soustava Tlusté střevo (mukóza, epitel) Tenké střevo (mukóza, epitel) Játra Pankreas (ostrůvky, acinární buňky) Slezina Vylučovací soustava Ledviny (korové tubuly) Nadledvinky (zóna reticularis) Močový měchýř (přechodný epitel) Ostatní Potní ţlázky Mazové ţlázky Kosterní svaly Kmenové buňky Rakovinné buňky 4.3 Funkce BCRP Mezi BCRP a jinými efluxními ABC transportéry léčiv (hlavně P- glykoproteinem) existuje překryv jak v substrátové specifitě, tak ve tkáňové distribuci. Proto se předpokládá obdobná role těchto transportérů ve fyziologii a farmakologii 36

(Staud and Pavek, 2005). BCRP je schopen transportovat některé substráty P-gp, ale je zajímavé, ţe většinou P-gp inhibitorů inhibován není (Boumendjel et al., 2007). BCRP vykazuje lékově-stimulovanou na vanadičnan citlivou ATPázovou aktivitu, která vyţaduje přítomnost iontů Mg 2+. Studie ukázaly, ţe ATPáza BCRP je pravděpodobně aktivována endogenními substráty, další substráty mají pouze minoritní efekt. Podle jiné studie je tato ATPáza v izolovaných membránách savčích buněk silně aktivována různými transportovanými sloučeninami. Studie vyuţívající lidské BCRP v bakteriálním systému prokázaly, ţe ATPáza můţe být aktivována samotným cholesterolem, který je součástí membrán (Ozvegy et al., 2002). Mnoho buněčných typů, které exprimují BCRP, má sekreční funkci. Z toho se usuzuje na dvojí úlohu BCRP v některých tkáních: exkrece toxinů a xenobiotik a potenciálně i role v sekreci endogenních substrátů (Fetsch et al., 2006). BCRP můţe představovat mechanismus rezistence na léčiva u určitých typů solidních tumorů. Přestoţe některé studie neprokázaly podstatné zvýšení exprese BCRP u rezistentních a relaxujících nádorů, jiné potvrdily, ţe exprese P-gp, MRP1, MRP2 a MRP3, na rozdíl od BCRP, nebyla podstatně spjata s odpovědí na chemoterapii nebo přeţitím. Procento pacientů, kteří reagovali na chemoterapii, bylo 44% u BCRPnegativních nádorů, zatímco u BCRP-pozitivních pouze 24%. Navíc BCRP-pozitivní pacienti prokazovali kratší období bez progresivních změn a kratší celkový čas přeţití neţ pacienti BCRP-negativní. Další studie odhalila zodpovědnost BCRP za vznik rezistence k irinotekanu u pacientů s rakovinou tlustého střeva. Tato data naznačují, ţe BCRP můţe být vhodným molekulárním cílem pro překonávání rezistence na chemoterapeutika (viz přehledová studie Mao and Unadkat, 2005) Pro některé tkáně je naopak běţným jevem down-regulace BCRP spjatá s rakovinou. Sníţená exprese BCRP můţe hrát úlohu v kancerogenezi tím, ţe umoţní akumulaci hemotoxinů a nadprodukci oxidu dusíku v nádorových buňkách. BCRP totiţ zajišťuje eflux protoporfyrinů z buněk. Protoporfyriny jsou ve formě HEMu nezbytné pro syntézu oxidu dusíku. Jedna z metod terapie rakoviny je zaloţena na selektivní akumulaci fototoxických protoporfyrinů v rakovinných buňkách s doposud neobjasněným mechanismem. Tato akumulace v rakovinných buňkách po ozáření infračerveným světlem zcitlivuje buňky pro apoptózu (Gupta et al., 2006). BCRP se nachází také na apikální plazmatické membráně buněk epitelu tlustého a tenkého střeva, proximálních tubulů ledvin a v membráně ţlučových kanalikulů 37