Bc. Jana Tvrdíková VOLTAMETRICKÉ STANOVENÍ DINITRONAFTALENŮ POMOCÍ KRYSTALOVÉ STŘÍBRNÉ AMALGAMOVÉ ELEKTRODY

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Studijní program: Chemie Studijní obor: Analytická chemie Bc. Jana Tvrdíková VOLTAMETRICKÉ STANOVENÍ DINITRONAFTALENŮ POMOCÍ KRYSTALOVÉ STŘÍBRNÉ AMALGAMOVÉ ELEKTRODY Voltammetric Determination of Dinitronaphthalenes Using Single Crystal Silver Amalgam Electrode Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: Prof. RNDr. Jiří Barek, CSc. Praha 211

Tato diplomová práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky (LC 635, MSM 2162857 a RP 14/63), Grantové agentury Univerzity Karlovy v Praze (projekt 8971/211/B-Ch/PřF) a projektu SVV 211-26324. Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto závěrečnou práci zpracovala samostatně, pod vedením školitele Prof. RNDr. Jiřího Barka, CSc. a konsultanta Mgr. Aleše Daňhela, a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce, ani její podstatná část, nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. Jsem si vědoma toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, mimo Univerzitu Karlovu v Praze je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity. V Praze dne 2. května 211.. podpis 2

Předmětová hesla: nitrované polycyklické aromatické uhlovodíky pevné elektrody stříbrný amalgam voltametrie Klíčová slova: 1,3-dinitronaftalen 1,5-dinitronaftalen 1,8-dinitronaftalen adsorpční rozpouštěcí diferenční pulsní voltametrie cyklická voltametrie DC voltametrie diferenční pulsní voltametrie krystalová stříbrná amalgamová elektroda pitná voda 3

Ráda bych tímto poděkovala svému školiteli Prof. RNDr. Jiřímu Barkovi, CSc. a konzultantovi Mgr. Alešovi Daňhelovi za odborné vedení, jejich pomoc a cenné připomínky. Dále bych ráda poděkovala svým rodičům za umožnění studia na vysoké škole a celé rodině a přátelům za jejich podporu při studiu. 4

V této práci byly vyvinuty metody voltametrického stanovení 1,3-dinitronaftalenu (1,3-DNN), 1,5-dinitronaftalenu (1,5-DNN) a 1,8-dinitronaftalenu (1,8-DNN) pomocí DC voltametrie (DCV) a diferenční pulsní voltametrie (DPV) na nově testované krystalové stříbrné amalgamové elektrodě (CAgAE). Vyvinutými metodami je možno stanovit 1,3-DNN v koncentračním rozmezí 2 1 μmol.l -1 s LoQ 2 μmol.l -1 pomocí DCV a 1 1 μmol.l -1 s LoQ 1 μmol.l -1 metodou DPV; 1,5-DNN v koncentračním rozmezí 2 1 μmol.l -1 s LoQ 2 μmol.l -1 pomocí DCV a 1 1 μmol.l -1 s LoQ 1 μmol.l -1 metodou DPV a 1,8-DNN v koncentračním rozmezí 2 1 μmol.l -1 s LoQ 2 μmol.l -1 pomocí DCV a,3 1 μmol.l -1 s LoQ,3 μmol.l -1 metodou DPV. Pokus o další snížení LoQ pomocí adsorpční rozpouštěcí diferenční pulsní voltametrie nebyl úspěšný. Průběh děje elektrochemické redukce dinitronaftalenů na pracovní elektrodě byl rovněž studován pomocí cyklické voltametrie. Předkládaná práce ověřila možnost použití CAgAE jako alternativy rtuťových elektrod pro stanovení elektrochemicky redukovatelných organických látek ve vodně-methanolickém prostředí. Její hlavní výhodou jsou malé rozměry vytvářející předpoklad pro její využítí při voltametrické analýze malých objemů vzorků a amperometrické detekci v průtokových systémech. 5

Voltammetric methods for determination of 1,3-dinitronaphthalene (1,3-DNN), 1,5-dinitronaphthalene (1,5-DNN) and 1,8-dinitronaphthalene (1,8-DNN) using DC voltammetry (DCV) and differential pulse voltammetry (DPV) at novel single crystal silver amalgam electrode (CAgAE) were developed in this work. Developed methods may be used for determination of 1,3-DNN within a concentration range 2 1 μmol.l -1 with LoQ 2 μmol.l -1 using DCV and 1 1 μmol.l -1 with LoQ 1 μmol.l -1 by DPV; 1,5-DNN wihin a concentration range 2 1 μmol.l -1 with LoQ 2 μmol.l -1 using DCV and 1 1 μmol.l -1 with LoQ 1 μmol.l -1 by DPV and 1,8-DNN within a concentration range 2 1 μmol.l -1 with LoQ 2 μmol.l -1 using DCV and,3 1 μmol.l -1 with LoQ,3 μmol.l -1 by DPV. An attepmt to decrease LoQ by adsorptive stripping differential pulse voltammetry was not successful. Process of electrochemical reduction of selected dinitronaphthalenes on the working electrode was also studied by cyclic voltammetry. This work verified the use of CAgAE as alternative electrode material to mercury electrodes for determination of electrochemically reducible organic compounds in aqueous-methanolic media. Small dimensions of the CAgAE are the main advantages which predetermine its use in voltammetric microvolume batch analysis and amperometric detection in flow systems. 6

Obsah Seznam zkratek a použitých symbolů...9 1 Úvod...11 1.1 Cíl práce...11 1.2 Stanovované látky...12 1.2.1 Obecné vlastnosti...12 1.2.2 Výskyt, vlastnosti a použití...13 1.2.3 Metody stanovení 1,3-, 1,5- a 1,8-dinitronaftalenu...14 1.3 Krystalová stříbrná amalgamová elektroda...15 2 Experimentální část...17 2.1 Reagencie...17 2.2 Aparatura...17 2.3 Pracovní postupy...18 3 Voltametrické stanovení 1,3-, 1,5- a 1,8-dinitronaftalenu pomocí krystalové stříbrné amalgamové elektrody...19 3.1 Voltametrické stanovení 1,3-dinitronaftalenu...19 3.1.1 DC voltametrie...19 3.1.1.1 Vliv ph...19 3.1.1.2 Stabilita signálu...21 3.1.1.3 Kalibrační závislost...23 3.1.2 Diferenční pulsní voltametrie...27 3.1.2.1 Vliv ph...27 3.1.2.2 Stabilita signálu...28 3.1.2.3 Kalibrační závislost...31 3.1.3 Adsorpční rozpouštěcí diferenční pulsní voltametrie...34 3.1.4 Cyklická voltametrie...35 7

3.2 Voltametrické stanovení 1,5-dinitronaftalenu...38 3.2.1 DC voltametrie...38 3.2.1.1 Vliv ph...38 3.2.1.2 Stabilita signálu...39 3.2.1.3 Kalibrační závislost...41 3.2.2 Diferenční pulsní voltametrie...45 3.2.2.1 Vliv ph...45 3.2.2.2 Stabilita signálu...46 3.2.2.3 Kalibrační závislost...48 3.2.3 Adsorpční rozpouštěcí diferenční pulsní voltametrie...52 3.2.4 Cyklická voltametrie...53 3.3 Voltametrické stanovení 1,8-dinitronaftalenu...56 3.3.1 DC voltametrie...56 3.3.1.1 Vliv ph...56 3.3.1.2 Stabilita signálu...58 3.3.1.3 Kalibrační závislost...6 3.3.2 Diferenční pulsní voltametrie...64 3.3.2.1 Vliv ph...64 3.3.2.2 Stabilita signálu...65 3.3.2.3 Kalibrační závislost...67 3.3.3 Adsorpční rozpouštěcí diferenční pulsní voltametrie...72 3.3.4 Cyklická voltametrie...73 4 Přímé voltametrické stanovení dinitronaftalenů v pitné vodě jako modelové matrici...75 4.1 DC voltametrie...75 4.2 Diferenční pulsní voltametrie...79 5 Shrnutí a závěry...84 6 Použitá literatura...87 8

Seznam zkratek a použitých symbolů 1,3-DNN 1,3-dinitronaftalen 1,5-DNN 1,5-dinitronaftalen 1,8-DNN 1,8-dinitronaftalen AdSDPV adsorpční rozpouštěcí diferenční pulsní voltametrie (adsorptive stripping differential pulse voltammetry) Ag AgCl argentchloridová referentní elektroda AgSA-PE stříbrná tuhá amalgamová pastová elektroda AV ČR Akademie věd České republiky BR pufr Brittonův-Robinsonův pufr c molární koncentrace CAgAE krystalová stříbrná amalgamová elektroda CAS Chemical Abstract Services CV cyklická voltametrie DCV DC voltametrie (direct current voltammetry) DNN dinitronaftalen DPV diferenční pulsní voltametrie (differential pulse voltammetry) E potenciál E acc E fin E in potenciál akumulace při adsorpční rozpouštěcí voltametrii konečný potenciál potenciálového okna při -1 μa měřeno DCV počáteční potenciál potenciálového okna při 1 μa měřeno DCV EM-MS hmotnostní spektrometrie s elektronovým monochomátorem (electron monochromator-mass spectrometry) EI-MS hmotnostní spektrometrie s elektronovou ionizací (electron FIA GC HMDE HPLC I I a ionization-mass spectrometry) průtoková injekční analýza (flow injection analysis) plynová chromatografie (gas chromatography) visící rtuťová kapková elektroda vysokoúčinná kapalinová chromatografie (hight performance liquid chromatography) proud výška anodického píku (resp. vlny) 9

I k I p LoD LoQ m-agsae MS n NICI-MS NPAH PAH ph ph f r 2 RSD t acc UV-VIS v v 1/2 V/V w/w x α výška katodického píku (resp. vlny) výška píku (resp. vlny) mez detekce (limit of detection) mez stanovitelnosti (limit of quantification) meniskem modifikovaná stříbrná tuhá amalgamová elektroda hmotnostní spektrometrie (mass spectrometry) počet měření hmotnostní spektrometrie s chemickou ionizaci negativními ionty (negative-ion chemical ionization-mass spectrometry) nitrované polycyklické aromatické uhlovodíky polycyklické aromatické uhlovodíky záporný dekadický logaritmus koncentrace oxoniových iontů ph směsi methanolu a vodné složky měřené pomocí skleněné elektrody kalibrované na standardní vodné roztoky pufrů druhá mocnina korelačního koeficientu relativní směrodatná odchylka doba akumulace při adsorpční rozpouštěcí voltametrii ultra fialová/viditelná oblast (ultra violet/visible) rychlost polarizace pracovní elektrody odmocnina rychlosti polarizace pracovní elektrody objem/objem (objemový poměr) hmotnost/hmotnost (hmotnostní poměr) aritmetický průměr hladina významnosti Deanova-Dixonova testu odlehlosti 1

1 Úvod S rostoucím negativním vlivem společnosti a průmyslu na životní prostředí narůstá znečištění životního prostředí toxickými látkami. Proto je nutné sledování těchto škodlivých látek a tedy i žádoucí vývoj nových a citlivějších analytických metod jejich stanovení, kde vedle spektrometrických a separačních metod je kladen velký důraz i na moderní elektroanalytické metody. V této práci jsou pro stanovení vybraných genotoxických látek použity moderní elektroanalytické metody využívající krystal stříbrného amalgamu, jako zcela nový elektrodový materiál představující alternativu za toxickou rtuť. 1.1 Cíl práce Tato práce navazuje na bakalářskou práci 1, jež se zabývala stanovením 1,3-dinitronaftalenu (1,3-DNN), 1,5-dinitronaftalenu (1,5-DNN) a 1,8-dinitronaftalenu (1,8-DNN) pomocí stříbrné pevné amalgamové pastové elektrody (AgSA-PE). Cílem této diplomové práce bylo vyvinout metody voltametrického stanovení stopového množství vybraných dinitronaftalenů pomocí DC voltametrie (DCV), diferenční pulsní voltametrie (DPV) a adsorpční rozpouštěcí diferenční pulsní voltamatrie (AdSDPV) na nově testované krystalové stříbrné amalgamové elektrodě (CAgAE) a ověřit tak její použití pro stanovení nitrovaných organických sloučenin ve vodně-methanolickém prostředí. Dále byl na tomto novém elektrodovém materiálu studován průběh elektrochemické redukce dinitronaftalenů (DNN) probíhající na pracovní elektrodě pomocí cyklické voltametrie (CV) a na základě již studovaných mechanismů redukce zkoumaných analytů na rtuťových a amalgamových elektrodách byl navržen mechanismus jejich redukce. Vyvinuté metody stanovení vybraných DNN pomocí DCV a DPV na CAgAE byly následně použity k přímému stanovení DNN v pitné vodě jako modelové matrici. 11

1.2 Stanovované látky 1.2.1 Obecné vlastnosti 1,3-dinitronaftalen CAS Name: 1,3-dinitronaphthalene NO 2 CAS Registry Number: 66-37-1 Molekulová hmotnost: 218,18 g.mol -1 Sumární vzorec: C 1 H 6 N 2 O 4 NO 2 Bod tání: 146 C 148 C (cit.2) 1,5-dinitronaftalen NO 2 CAS Name: 1,5-dinitronaphthalene CAS Register Number: 65-71- Molekulová hmotnost: 218,18 g.mol -1 Sumární vzorec: C 1 H 6 N 2 O 4 Bod tání: 217 C 218 C (cit.2) NO 2 1,8-dinitronaftalen CAS Name: 1,8-dinitronaphthalene CAS Register Number: 62-38- Molekulová hmotnost: 218,18 g.mol -1 NO 2 NO 2 Sumární vzorec: C 1 H 6 N 2 O 4 Bod tání: 172 C 173,5 C (cit.2) 12

1.2.2 Výskyt, vlastnosti a použití Nitrované polycyklické aromatické uhlovodíky (NPAH) patří mezi deriváty polycyklických aromatických uhlovodíků (PAH), které obsahují dvě a více sloučených aromatických uhlovodíkových jader. 3 PAH jsou všudypřítomné kontaminanty životního prostředí, kam pronikají z přírodních i antropogeních zdrojů kvůli jejich značné pohyblivosti a možnosti dálkového atmosférického transportu. 4 Mezi přírodní zdroje PAH patří lesní a stepní požáry a vulkanická činnost. 4, 5 Větší mírou však tyto látky vznikají antropogenní činností a to především nedokonalým spalováním uhlí, ropy, nafty a dřeva. NPAH vznikají rovněž nedokonalým spalováním fosilních paliv a dále radikálově iniciovanou fotochemickou reakcí mateřských PAH s oxidy dusíku (NO x ) přitomných ve znečištěném ovzduší. 4-8 Tyto látky byly dále nalezeny vcigaretovém kouři, sazích, popílku a tonerech kopírovacích 9, 1 strojů. NPAH vykazují mnohem větší mutagenní a karcinogenní účinky než jejich mateřské PAH a mohou působit přímo bez metabolické aktivace. 1-12 Do skupiny genotoxických NPAH se řadí také studované látky 1,3-DNN, 1,5-DNN a 1,8-DNN, které patří mezi polohové izomery dinitronaftalenu. Z elektrochemického hlediska to jsou molekuly se shodnou matečnou strukturou uhlovodíku, obsahující dvě elektrochemicky redukovatelné nitroskupiny, které jsou v konjugaci s násobnými vazbami naftalenu a vyvolávají trvalý posun elektronů. Schopnost odčerpávat elektrony z konjungovaného systému sice poněkud zvyšuje elektronovou hustotu na těchto skupinách ale i tak jsou snadno elektrochemicky redukovatelné. Vyšší elektronová hustota na nitroskupině má mimo jiné, ve srovnání s nepolárním naftalenem, za následek vyšší polaritu 1,8-DNN a 1,3-DNN. 1,5-DNN je díky symetrickému rozložení nitroskupin na aromatickém jádru nejméně polární a tedy i méně rozpustný v polárních rozpouštědlech. 13 Pozice nitro skupin DNN na aromatickém kruhu má také vliv na mutagenitu a orgánovou specificitu jednotlivých DNN. Zatímco 1,8-DNN je inaktivní, 1,5-DNN vykazuje vyšší mutagenní aktivitu. 14, 15 Mutagenita těchto DNN byla testována pomocí Salmonella typhimurium 16-21 a Drosophila melanogaster 22, 23. Jelikož jsou všechny DNN podezřelé z karcinogenity a u 1,8-DNN byla potvrzena karcinogenita na zvířatech, je pravděpodobná jejich karcinogenita také u lidí. 2, 24, 25 Všechny tyto DNN dráždí při styku pokožku, oči a dýchací i trávící trakt. 2 Všechny tyto DNN jsou nažloutlé krystalické látky, které se používají jako 2, 26 meziprodukty při výrobě barviv, především sirných, a výbušnin. 13

1.2.3 Metody stanovení 1,3-, 1,5- a 1,8-dinitronaftalenu Nejčastěji se 1,3-, 1,5- a 1,8-DNN stanovují pomocí separačních metod (GC resp. HPLC) se spektrometrickou detekcí. Shrnutí vybraných stanovení pomocí těchto technik je uvedeno v práci Kumarana Shanmugana. 15 Novější metody stanovení vybraných DNN pomocí separačních, polarografických a voltametrických metod jsou shrnuty v bakalářské práci. 1 Další metody stanovení těchto DNN rozšiřující tato shrnutí jsou uvedeny v Tabulce I. Tabulka I Metody stanovení 1,3-, 1,5- a 1,8-DNN Metoda Detekce Látky LoD Citace Fluorescence 1,5-DNN,16 μg.l -1 27 1,8-DNN 1,25 μg.l -1 HPLC 1,3-DNN,75 ng (m/z 126) a EI-MS 1,5-DNN,5 ng (m/z 114) a 28 1,8-DNN,25 ng (m/z 114) a FIA NICI-MS 1,5-DNN 1,8-DNN,3 ng,3 ng 29 GC MS 1,3-DNN 1,5-DNN,57 pg,23 pg 3 EM-MS 1,3-DNN,87 ng b 31 a... charakteristické ionty o daném m/z b... stanoveno ve vzorku Fischer-Tropsch dieselu 14

1.3 Krystalová stříbrná amalgamová elektroda Moderní elektroanalytické metody mohou poskytovat neocenitelné služby při sledování biologicky aktivních organických sloučenin. Hlavními výhodami těchto metod oproti separačním a spektrometrickým metodám jsou nízké pořizovací a provozní náklady, vysoká citlivost a snadná přenosnost lehkých analytických přístrojů umožňující jejich použití v terénu 32, 33 při sledování znečištění životního prostředí. Rtuť je zřejmě doposud nejvhodnější elektrodový materiál pro voltametrické a polarografické stanovení redukovatelných organických sloučenin vzhledem k širokému potenciálovému oknu v katodické oblasti, snadné obnovitelnosti povrchu a dobré reprodukovatelnosti výsledků měření. 33-35 Avšak práce se rtutí je s ohledem na její toxicitu omezena legislativou Evropské unie 36, a proto je podporován vývoj nových netoxických elektrodových materiálů, které by mohly rtuť nahradit. Požadavkům alternativního elektrodového materiálu do značné míry odpovídají kovové amalgamy, které jsou tvořeny z kovu elektrochemicky méně aktivního (např. Ag, Au, Ir) nebo elektrochemicky aktivnějšího (např. Cu, Bi, Cd) než rtuť. 34 Amalgamy mohou být kapalné, v podobě pasty, či pevné v závislosti na poměru obsahu rtuti a příslušného kovu. 37 Pevné a pastové amalgamové elektrody vyvinuté na Ústavu fyzikální chemie J. Heyrovského 38, 39 AV ČR a jejich možnosti přípravy, modifikace a použití byly přehledně shrnuty v publikacích 34, 37, 4. Pevné amalgamové elektrody mají celou řadu předností, mezi které patří jednoduchá manipulovatelnost, široké negativní potenciálové okno srovnatelné s visící rtuťovou kapkovou elektrodou (HMDE), snadná příprava a také robustnost, která umožňuje jejich aplikaci v průtokových systémech (FIA, HPLC). 4-43 Hlavní nevýhodou pevných amalgamových elektrod a pevných elektrod obecně je především jejich pasivace způsobená znečištěním elektrodového povrchu složkami analyzovaného roztoku či produkty elektrodové reakce. Tento problém je řešen předúpravou pracovní elektrody pravidelným mechanickým 37, 44-46 a elektrochemickým čištěním elektrodového povrchu. Novým typem amalgamových elektrod je v této práci použitá krystalová stříbrná amalgamová elektroda (CAgAE), která představuje novou alternativu pro stanovení elektrochemicky redukovatelných organických látek pomocí moderních voltametrických metod. Výhodnou vlastností tohoto elektrodového materiálu jsou především rozměry vypěstovaných krystalů (délka < 2 mm, průměr < 1 μm), hladký povrch krystalu a vysoký poměr signálu k šumu při jeho použití ve voltametrii. Nevýhodou CAgAE je její křehkost a poměrně krátká životnost. Stříbrný amalgamový krystal je možné připravit 15

postupným přidáváním,5 mol.l -1 dusičnanu stříbrného do deionizované vody, obsahující stříbrný drát umístěný vamalgamové pastě obsahující 1 % (w/w) stříbra. Dobře vyvinutý krystal stříbrného amalgamu s minimem defektů je při přípravě CAgAE umístěn do 2 μl špičky automatické pipety, kde je kontakt mezi krystalem a platinovým drátkem zajištěn stříbrnou amalgamovou pastou, obsahující 15 % (w/w) stříbra. Krystal vyčnívající ze zužené části pipety je poté izolován filmem rozpuštěného polystyrenu v dichlorethanu (2 mg/1 ml). Tímto postupem je možno připravit cylindrickou pracovní elektrodu vhodnou pro voltametrická měření ve vsádkovém uspořádání. Krystaly stříbrného amalgamu dále nabízí nové možnosti konstrukce detekčních cel využitelných pro mikroobjemovou analýzu pomocí voltametrických metod a průtokových cel pro amperometrickou detekci v kombinaci s metodami HPLC či FIA 47-5, jež jsou předmětem dalšího zkoumání. 16

2 Experimentální část 2.1 Reagencie Zásobní roztoky studovaných DNN o koncentraci 1.1-3 mol.l -1 byly připraveny rozpuštěním,2183 g příslušného DNN (97 %; Sigma-Aldrich, Německo) ve 1 ml methanolu (MeOH, 99,9 %, Merck, Německo). Roztoky o nižších koncentracích byly připravovány přesným ředěním zásobního roztoku uvedeným rozpouštědlem. Roztoky byly uchovávány ve skleněných nádobách v lednici. UV-VIS spektrofotometrií bylo zjištěno, že tyto zásobní roztoky jsou stálé po dobu 4 měsíců (1,3-DNN), 6 měsíců (1,5-DNN) a 8 měsíců (1,8-DNN). 15 Další použité chemikálie: kyselina boritá, kyselina octová (99,8 %), kyselina fosforečná (85 %) a hydroxid sodný byly čistoty p.a. (Lach Ner s.r.o., ČR). Brittonovy-Robinsonovy (BR) tlumivé roztoky o příslušném ph byly připraveny smísením směsi kyseliny borité, fosforečné a octové, každé o koncentraci,4 mol.l -1 s roztokem,2 mol.l -1 NaOH. Pro přípravu BR pufru byla používána deionizovaná voda (Milli-Q plus systém, Millipore, USA). Na přípravu stříbrného amalgamového krystalu byla použita rtuť (99,999 %, Polarografie, Praha), práškové stříbro (2-3,5 μm; 99,9 %; Sigma-Aldrich, Německo) a dusičnan stříbrný (p.a.; Safina Vestec ČR). Kyslík byl z roztoku odstraněn probubláním dusíkem čistoty 4. (Linde, Praha, ČR). 2.2 Aparatura Pro voltametrická měření byla použita aparatura Eco-Tribo Polarograph ovládaná softwarem PolarPro verze 5.1 (Polaro-Sensors, Praha, ČR) pracující pod operačním systémem Windows XP (Microsoft Corporation, USA) s použitím technik: DC voltametrie (DCV), diferenční pulsní voltametrie (DPV) s výškou pulsu -5 mv a jeho šířkou 1 ms, cyklická voltametrie (CV) a adsorpční rozpouštěcí diferenční pulsní voltametrie (AdSDPV) všechny s rychlostí polarizace 2 mv.s -1 pokud není uvedeno jinak. Jednotlivá měření byla prováděna v tříelektrodovém zapojení s referentní argentchloridovou elektrodou (Ag AgCl, 3 mol.l -1 KCl) a pomocnou platinovou drátkovou elektrodou (obě Monokrystaly, Turnov, ČR). Krystalová stříbrná amalgamová elektroda (CAgAE) byla použita jako pracovní elektroda. 17

Přesné hodnoty ph tlumivých roztoků byly měřeny pomocí digitálního ph-metru Jenway (typ 351) s kombinovanou skleněnou elektrodou. ph metr byl kalibrován standardními vodnými pufry za běžné teploty v laboratoři. 2.3 Pracovní postupy Při sledování vlivu ph na voltamogramy a reprodukovatelnosti signálu pomocí DCV a DPV byly pracovní roztoky připravovány do 1 ml odměrných baněk smísením daného množství zásobního roztoku DNN s odpovídajícím množstvím MeOH do objemu 5 ml a doplněním BR pufrem po rysku. Při měření kalibračních závislostí bylo pracováno pomocí metody standardního přídavku. Při AdSDPV byly pracovní roztoky připravovány do 1 ml odměrných baněk smísením daného množství zásobního roztoku DNN a doplněním daným pufrem po rysku. V případě přímého stanovení DNN v pitné vodě jako modelové matrici byly pracovní roztoky připravovány do 1 ml odměrných baňek smísením 9 ml pitné vody z vodovodního řádu se 1 μl,1 M chelatonu 3 a doplněny daným pufrem o příslušném ph po rysku. Měření bylo prováděno metodou standardního přídavku. Analyzované roztoky byly zbaveny kyslíku 1 min probubláním dusíkem, který byl před vstupem do polarografické nádobky veden promývačkou plynů obsahující v případě DCV a DPV směs MeOH a deionizované vody o stejném poměru jako analyzovaný roztok (t.j. 1:1 (V/V)), v případě AdSDPV a přímého stanovení DNN v pitné vodě jako modelové matrici obsahující pouze deionizovanou vodu. Poté byly provedeny záznamy voltametrických křivek. Všechna měření byla prováděna za běžné teploty v laboratoři. Výšky píků 1,3-DNN a 1,5-DNN byly vyhodnocovány od spojnice minim před prvním a za druhým píkem. Výška píků 1,8-DNN byla stanovena od nalezené spojnice minim před a za měřeným píkem. Výška vln byla stanovena proložením jedné přímky v oblasti lineárního úseku před vzestupem vlny, druhé v lineární části difúzního proudu a hodnoty proudu byly odečteny v inflexním bodě vlny. Mez stanovitelnosti (LoQ) byla vypočítána podle IUPAC pomocí vztahu LoQ = 1σ/a, kde σ je směrodatná odchylka n opakovaných měření při nejnižší naměřené koncentraci a a je směrnice kalibrační závislosti nejnižšího naměřeného koncentračního rozmezí. 18

3 Voltametrické stanovení 1,3-, 1,5- a 1,8-dinitronaftalenu pomocí krystalové stříbrné amalgamové elektrody 3.1 Voltametrické stanovení 1,3-dinitronaftalenu 3.1.1 DC voltametrie 3.1.1.1 Vliv ph Pomocí DC voltametrie (DCV) byla sledována využitelná šířka potenciálového okna pro voltametrická měření na CAgAE v prostředí směsi MeOH a BR pufru o daném ph v objemovém poměru 1:1 o výsledném ph f (Tabulka II). Tabulka II Vliv ph na šířku potenciálového okna CAgAE, měřeno metodou DCV v prostředí MeOH-BR pufr o daném ph (1:1) udávaném jako ph f ph ph f E in [mv] E fin [mv] 2, 2,7 42-115 3, 3,9 37-123 4, 4,6 34-13 5, 5,5 3-137 6, 6,9 26-15 7, 8,2 25-16 8, 8,7 24-16 9, 9,5 2-169 1, 1,5 15-17 11, 11,7 9-177 12, 12,3 3-17 E in... počáteční okraj potenciálového okna při 1 μa E fin... konečný okraj potenciálového okna při -1 μa Metodou DCV bylo dále na CAgAE sledováno elektrochemické chování 1,3-DNN v prostředí směsi MeOH a BR pufru v poměru 1:1 (V/V) o výsledném ph f (Obr. 1 a Obr. 2). 19

1 2 3 4 5 6 3 na -4-8 -12 E [mv] Obr. 1 DC voltamogramy 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) měřené na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr (1:1) s výsledným ph f : (1) 2,7; (2) 4,6; (3) 6,9; (4) 8,7; (5) 1,5; (6) 12,3; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl 1 2 3 4 5 3 na -4-8 -12-16 E [mv] Obr. 2 DC voltamogramy 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) měřené na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr (1:1) s výsledným ph f : (1) 3,9; (2) 5,5; (3) 8,2; (4) 9,5; (5) 11,7; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl 2

Látka poskytuje v rozmezí ph 2 7 dvě vlny odpovídající pravděpodobně čtyřelektronovým redukcím jednotlivých nitroskupin za vzniku dihydroxylaminonaftalenu. V rozmezí ph 8 12 poskytuje látka tři vlny, které pravděpodobně odpovídají dvěma postupným čtyřelektronovým redukcím jednotlivých nitroskupin za vzniku dihydroxylaminonaftalenu, který je dále redukován čtyřmi elektrony vjednom kroku na diaminonaftalen. Prostředí směsi MeOH a BR pufru o ph 7, v poměru 1:1 (V/V), tzn. ph f 8,2, bylo zvoleno jako optimální pro další studie reprodukovatelnosti a citlivosti DCV metody z hlediska dobře vyvinutých a oddělených vln 1,3-DNN. 3.1.1.2 Stabilita signálu Pomocí metody DCV na CAgAE byla sledována závislost stability signálu 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) při deseti opakovaných měření ve zvoleném optimálním prostředí (Obr. 3). Vyhodnocené výšky vln (I p ) jednotlivých měření byly vyneseny do regulačních diagramů (Obr. 4 a Obr. 5) se zobrazením varovných ( x 2 ) a regulačních mezí ( x 3 ), kde x je aritmetický průměr a σ je směrodatná odchylka všech neodlehlých hodnot I p. Odlehlost jednotlivých měření byla testována pomocí Deanova-Dixonova testu odlehlosti na hladině významnosti α,5. 51 Parametry stability signálu jsou shrnuty v Tabulce III. -3 II I -2-1 I -25-5 -75-1 E [mv] Obr. 3 DC voltamogramy deseti následných měření 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1); znázorněna je každá třetí křivka; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl; I - 1. vlna; II - 2. vlna 21

-12-11 x 3 x 2 x -1 I p čx 2 x 3-9 2 4 6 8 1 ísloměřen4 Regulační diagram stability signálu 1,3-DNN íobr. (c = 1.1-4 mol.l-1) pro deset následných měření, vyhodnocení 1. vlny získané pomocí DCV na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1) -54-52 -5-48 x 3 x 2 x x 2 x 3 I p č-46 2 4 6 8 1 ísloměřen5 Regulační diagram stability signálu 1,3-DNN íobr. (c = 1.1-4 mol.l-1) pro deset následných měření, vyhodnocení 2. vlny získané pomocí DCV na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1) 22

Tabulka III Parametry stability signálu 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ), měřeno metodou DCV v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1) (ph f 8,2) Vlna Průměrná hodnota Ip RSD n [%] 1. -14 1 3 2. -5 1 2 Metodou DCV byla tedy prokázána stabilita signálu 1,3-DNN, tj. naměřené hodnoty I p s RSD do 3 % pro 1. vlnu a do 2 % pro 2. vlnu pro deset následných měření. 3.1.1.3 Kalibrační závislost V prostředí směsi MeOH a BR pufru o ph 7, v poměru 1:1 (V/V) byly naměřeny DC voltamogramy v závislosti na koncentraci 1,3-DNN (Obr. 6 a Obr. 8) na CAgAE a vyneseny odpovídající kalibrační závislosti (Obr. 7 a Obr. 9). Logaritmickou analýzou kalibračních závislostí byl ověřen lineární dynamický rozsah použité metody (Obr. 1). I -24-16 -8 I II 7 6 5 4 3 2 1-25 -5-75 -1 E [mv] Obr. 6 DC voltamogramy 1,3-DNN na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1); c (1,3-DNN) [μmol.l -1 ]: (1) -základní elektrolyt; (2) 1; (3) 2; (4) 39; (5) 57; (6) 74; (7) 91; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl; I - 1. vlna; II - 2. vlna 23

-12 I -9 I p -6 II -3 2 4 6 8 1 c [ mol.l -1 ] Obr. 7 Kalibrační přímky pro stanovení 1,3-DNN v intervalu 1 1 μmol.l -1, získané pomocí DCV na CAgAE vyhodnocením první (I) a druhé (II) vlny; chybové úsečky jsou tvořeny z průměrné hodnoty a směrodatné odchylky 3 měření jednotlivých koncentrací -7 I -6-5 -4 I II 6 5 4 3 2 1-3 -3-45 -6-75 E [mv] Obr. 8 DC voltamogramy 1,3-DNN na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1); c (1,3-DNN) [μmol.l -1 ]: (1) -základní elektrolyt; (2) 2; (3) 4; (4) 6; (5) 8; (6) 1; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl; I - 1. vlna; II - 2. vlna 24

-8 I -6 I p -4-2 II 2 4 6 8 1 c [ mol.l -1 ] Obr. 9 Kalibrační přímky pro stanovení 1,3-DNN v intervalu 2 1 μmol.l -1, získané pomocí DCV na CAgAE vyhodnocením první (I) a druhé (II) vlny; chybové úsečky jsou tvořeny z průměrné hodnoty a směrodatné odchylky 3 měření jednotlivých koncentrací 2 I II log (-I p ) [log na ] 1,5 1, 1,5 2, log c [log mol.l -1 ] Obr. 1 Logaritmická analýza kalibračních přímek vyhodnocení první (I) a druhé (II) vlny v koncentračním rozmezí 2 1 μmol.l -1 Parametry kalibračních přímek 1,3-DNN v koncentračních rozmezích 2 1 μmol.l -1 a 1 1 μmol.l -1 a parametry logaritmické analýzy jsou shrnuty v Tabulce IV. 25

Tabulka IV Parametry kalibračních přímek 1,3-DNN a logaritmické analýzy, měřeno metodou DCV v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1) (ph f 8,2) Vlna Koncentrace μmol.l -1 ] Směrnice [na.l. mol -1 ] Úsek r 2 LoQ [μmol.l -1 ] 1. 1 1-1,23 7,23,9959-2. 1 1 -,58 3,57,9844-1. 2 1 -,87 1,,994 2 2. 2 1 -,3 -,3,9952 3 1. 2 1 a 1,23 -,37,9987-2. 2 1 a 1,18 -,62,9943 - a... logaritmická analýza Mez stanovitelnosti (LoQ) byla zde i ve všech dalších případech vypočítána podle vztahu: 1 LoQ a... směrodatná odchylka jedenácti po sobě jdoucích měření při nejnižší naměřené koncentraci a směrnice kalibrační závislosti nejnižšího naměřeného koncentračního rozmezí. Logaritmickou analýzou (Obr. 1) byl testován lineární dynamický rozsah obou naměřených koncentračních řádů, který byl na základě odlehlosti směrnic logaritmické analýzy od teoretické hodnoty 1,,2 vyvrácen. Patrné rozdílné hodnoty směrnic kalibračních přímek jednotlivých řádů tento závěr potvrzují a výsledný mírně sigmoidální tvar kalibračních závislostí v celém koncentračním rozsahu 1,3-DNN (2 1 μmol.l -1 ) nasvědčuje rozdílným dějům (např. difúze, adsorbce) uplatňujících se v různé míře při elektrochemické redukci 1,3-DNN na CAgAE při různých koncentracích tohoto analytu. V prostředí směsi MeOH a BR pufru o ph 7, v poměru 1:1 (V/V) lze metodou DCV na CAgAE stanovit 1,3-DNN v koncentračním rozsahu 2 1 μmol.l -1 s mezí stanovitelnosti 2 μmol.l -1. Pro vyšší koncentrace analytu je nutno použít odpovídající kalibrační přímky nebo metodu standardního přídavku. 26

3.1.2 Diferenční pulsní voltametrie 3.1.2.1 Vliv ph Metodou diferenční pulsní voltametrie (DPV) bylo na CAgAE sledováno elektrochemické chování 1,3-DNN v prostředí směsi MeOH a BR pufru v poměru 1:1 (V/V) o výsledném ph f 2 12 (Obr. 11 a Obr. 12). 1 1 na 2 3 4 5 6-4 -8-12 E [mv] Obr. 11 DP voltamogramy 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) měřené na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr (1:1) s výsledným ph f : (1) 2,7; (2) 4,6; (3) 6,9; (4) 8,7; (5) 1,5; (6) 12,3; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl 27

1 1 na 2 3 4 5-4 -8-12 E [mv] Obr. 12 DP voltamogramy 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) měřené na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr (1:1) s výsledným ph f ; (1) 3,9; (2) 5,5; (3) 8,2; (4) 9,5; (5) 11,7; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl Látka poskytuje v celém rozmezí ph tři píky, které pravděpodobně opovídají dvěma postupným čtyřelektronovým redukcím jednotlivých nitroskupin za vzniku dihydroxylaminonaftalenu, který je dále redukován čtyřmi elektorny v jednom kroku na diaminonaftalen. Prostředí směsi MeOH a BR pufru o ph 7, v poměru 1:1 (V/V), tzn. ph f 8,2, poskytovalo nejvyšší, dobře vyvinuté a dobře vyhodnotitelné píky 1,3-DNN, a bylo tedy zvoleno jako optimální ph pro další studie reprodukovatelnosti a citlivosti DPV metody. 3.1.2.2 Stabilita signálu Pomocí metody DPV na CAgAE byla sledována závislost stability signálu 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) při deseti opakovaných měření ve zvoleném optimálním prostředí (Obr. 13). Vyhodnocené výšky píku (I p ) jednotlivých měření byly vyneseny do regulačních diagramů (Obr. 14, Obr. 15 a Obr. 16) se zobrazením varovných ( x 2 ) a regulačních mezí ( x 3 ), kde x je aritmetický průměr a σ je směrodatná odchylka všech neodlehlých hodnot I p. Odlehlost jednotlivých měření byla testována pomocí Deanova-Dixonova testu odlehlosti na hladině významnosti α,5. 51 Parametry stability signálu jsou shrnuty v Tabulce V. 28

-3-2 I II I -1 III -3-6 -9-12 E [mv] Obr. 13 DP voltamogramy deseti následných měření 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph7, (1:1); znázorněna je každá třetí křivka; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl; I - 1. pík; II - 2. pík; III - 3. pík -19 x 3 x 2-18 I p č-17 x x 2 x 3 2 4 6 8 1 ísloměřen14 Regulační diagram stability signálu 1,3-DNN íobr. (c = 1.1-4 mol.l-1) pro deset následných měření, vyhodnocení 1. píku (I) získaného pomocí DPV na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1) 29

-18-17 x 3 x 2 x -16 I p čx 2 x 3-15 2 4 6 8 1 ísloměřen15 Regulační diagram stability signálu 1,3-DNN íobr. (c = 1.1-4 mol.l-1) pro deset následných měření, vyhodnocení 2. píku (II) získaného pomocí DPV na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1) -6-5 -4 x 3 x 2 x x 2 x 3 I p č-3 2 4 6 8 1 ísloměřen16 Regulační diagram stability signálu 1,3-DNN íobr. (c = 1.1-4 mol.l-1) pro deset následných měření, vyhodnocení 3. píku (III) získaného pomocí DPV na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1) 3

Tabulka V Parametry stability signálu 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ), měřeno metodou DPV v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1) (ph f 8,2) Pík Průměrná hodnota I p RSD n [%] 1. -182 1 2 2. -163 1 2 3. -42,8 1 5 Metodou DPV byla tedy prokázána stabilita signálu 1,3-DNN naměřené hodnoty I p s RSD do 2 % pro 1. a 2. pík a 5 % pro 3. pík pro deset následných měření. 3.1.2.3 Kalibrační závislost V prostředí směsi MeOH a BR pufru o ph 7, v poměru 1:1 (V/V) byly naměřeny DP voltamogramy v závislosti na koncentraci 1,3-DNN (Obr. 17 a Obr. 19) na CAgAE a vyneseny odpovídající kalibrační závislosti (Obr. 18 a Obr. 2). Logaritmickou analýzou kalibračních závislotí byl ověřen lineární dynamický rozsah použité metody (Obr. 21). -24-18 I 7 6 II I -12-6 5 4 3 2 1-3 -6-9 -12 E [mv] III Obr. 17 DP voltamogramy 1,3-DNN na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1); c (1,3-DNN) [μmol.l -1 ]: (1) -základní elektrolyt; (2) 1; (3) 2; (4) 39; (5) 57; (6) 74; (7) 91; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl; I - 1. pík; II - 2. pík; III - 3. pík 31

-2-15 I II I p -1-5 III 2 4 6 8 1 c [ mol.l -1 ] Obr. 18 Kalibrační přímky pro stanovení 1,3-DNN v intervalu 1 1 μmol.l -1, získané pomocí DPV na CAgAE vyhodnocením prvního (I), druhého (II) a třetího (III) píku; chybové úsečky jsou tvořeny z průměrné hodnoty a směrodatné odchylky 3 měření jednotlivých koncentrací -4 I 7 II I -3-2 6 5 4 3 2 1-1 -25-5 -75-1 E [mv] Obr. 19 DP voltamogramy 1,3-DNN na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1); c (1,3-DNN) [μmol.l -1 ]: (1) -základní elektrolyt; (2) 1; (3) 2; (4) 4; (5) 6; (6) 8; (7) 1; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl; I - 1. pík; II - 2. pík 32

-2-15 I II I p -1-5 2 4 6 8 1 c [ mol.l -1 ] Obr. 2 Kalibrační přímky pro stanovení 1,3-DNN v intervalu 1 1 μmol.l -1, získané pomocí DPV na CAgAE vyhodnocením prvního (I) a druhého (II) píku; chybové úsečky jsou tvořeny z průměrné hodnoty a směrodatné odchylky 3 měření jednotlivých koncentrací 3 I log (-I p ) [ log na ] 2 1 II,,5 1, 1,5 2, log c [ mol.l -1 ] Obr. 21 Logaritmická analýza kalibračních přímek vyhodnocení prvního (I) a druhého (II) píku v koncentračním rozmezí 1 1 μmol.l -1 Parametry kalibračních přímek 1,3-DNN v koncentračních rozmezích 1 1 μmol.l -1 a 1 1 μmol.l -1 a parametry logaritmické analýzy jsou shrnuty v Tabulce VI. 33

Tabulka VI Parametry kalibračních přímek 1,3-DNN a logaritmické analýzy, měřeno metodou DPV v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1) (ph f 8,2) Koncentrace Směrnice Úsek Pík μmol.l -1 ] [na.l. mol -1 ] r 2 LoQ [μmol.l -1 ] 1. 1 1-1,99 3,42,999-2. 1 1-1,8 4,6,9994-3. 2-1 -,51 3,14,9956-1. 1 1-1,7 -,4,9968 1 2. 1 1-1,41 -,58,9924 1 1. 1 1 a,99,29,9959-2. 1 1 a,99,23,9925 - a... logaritmická analýza Logaritmickou analýzou (Obr. 21) byl testován lineární dynamický rozsah obou koncentračních řádů (1 1 a 1 1 μmol.l -1 ) a ta potvrdila linearitu v celém koncentračním rozsahu (1 1 μmol.l -1 ). V prostředí směsi MeOH a BR pufru o ph 7, v poměru 1:1 (V/V) lze metodou DPV na CAgAE stanovit 1,3-DNN v koncentračním rozsahu 1 1 μmol.l -1 s mezí stanovitelnosti 1 μmol.l -1. 3.1.3 Adsorpční rozpouštěcí diferenční pulsní voltametrie Vzhledem k výsledkům dosažených metodou DPV bylo pro stanovení 1,3-DNN metodou adsorpční rozpouštěcí diferenční pulsní voltametrie (AdSDPV) na CAgAE zvoleno prostředí o ph 7, při koncentraci 1,3-DNN 4.1-6 mol.l -1. Kvůli rušivému vlivu MeOH na adsorpci 1,3-DNN a zjednodušení složení základního elektrolytu bylo na místo BR pufru pracováno v prostředí,5 mol.l -1 fosfátového pufru (NaH 2 PO 4 ) o ph 7,. Při zvolené době akumulace 6 s byl nejprve proměřen vliv potenciálu akumulace (E acc ) na výšku píku I p v rozmezích E acc až -4 mv. Nejvyššího nárůstu píku 1,3-DNN bylo docíleno při potenciálu akumulace E acc -1 mv, který byl dále použit pro sledování vlivu doby akumulace t acc : 3; 6; 12; 18; 24 a 3 s na výšku píku I p (Obr. 22). Akumulace byla prováděna v míchaném roztoku a po ukončení akumulace byla dodržována doba klidu 1 s před samotným záznamem DP voltamogramu. 34

-9-6 I p -3 1 2 3 t [s] Obr. 22 Závislost výšky 1. píku I p 1,3-DNN (c = 4.1-6 mol.l -1 ) na době akumulace t acc při potenciálu akumulace E acc -1 mv v prostředí,5 mol.l -1 NaH 2 PO 4 o ph 7, Jak je patrné z Obr. 22, pomocí adsorpční rozpouštěcí diferenční pulsní voltametrie nedošlo k výraznému nárůstu signálu 1,3-DNN a není tedy možné touto metodou dosáhnout nižší meze stanovitelnosti než metodou DPV. 3.1.4 Cyklická voltametrie Metodou cyklické voltametrie (CV) byly studovány děje, kterými je řízena elektrochemická redukce 1,3-DNN probíhající na CAgAE. Byly tedy naměřeny cyklické voltamogramy 1,3-DNN při zvolených rychlostech polarizace: 2; 4; 1; 2; 4; 1 a 2 mv.s -1 (Obr. 23 a Obr. 24) a vyneseny závislosti výšek katodického (I k ) a anodického (I a ) signálu na rychlosti polarizace (v), resp. odmocnině rychlosti polarizace (v 1/2 ) (Obr. 25 a Obr. 26). Na základě těchto závislostí lze usuzovat na reverzibilitu (resp. ireverzibilitu) elektrodové reakce a zda se jedná o elektrodový proces řízený difúzí či adsorpcí. 52 35

-2-1 4 3 2 1 I 1 2 3 4 1-4 -8-12 -16 E [mv] Obr. 23 Cyklické voltamogramy 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) na CAgAE při rychlosti polarizace [mv.s -1 ]: (1) 2; (2) 4; (3) 1; (4) 2; v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1); E vs. Ag AgCl -3-15 4 3 1 2 I 3 4 2 1 15-4 -8-12 -16 E [mv] Obr. 24 Cyklické voltamogramy 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) na CAgAE při rychlosti polarizace [mv.s -1 ]: (1) 2; (2) 4; (3) 1; (4) 2; v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1); E vs. Ag AgCl 36

I k v 1/2 [mv 1/2.s -1/2 ] 2 4 6 4 4 v v 2 v 1/2 v 1/2 2 I k I a -2-4 5 1 15 2 v [mv.s -1 ] -2-4 I a Obr. 25 Závislost výšky prvního katodického I k a anodického I a signálu 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) na rychlosti (v) resp. odmocnině rychlosti (v 1/2 ); v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1) I k v 1/2 [mv 1/2.s -1/2 ] 2 4 6 3 3 v v 15 v 1/2 v 1/2 I a I k 15-15 -15 5 1 15 2 v [mv.s -1 ] Obr. 26 Závislost výšky druhého katodického I k a anodického I a signálu 1,3-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) na rychlosti (v) resp. odmocnině polarizace (v 1/2 ); v prostředí MeOH-BR pufr o ph 7, (1:1) Jelikož závislosti I k a I a na v resp. v 1/2 (Obr. 25 a Obr. 26) nejsou lineární a tedy ani poměr jejich směrnic není roven 1, lze z výše uvedených závislostí usuzovat, že se uplatňuje jak difúze, tak i adsorpce a jedná se o ireverzibilní elektrodovou reakci, což se 37

shoduje se závěry již dříve studovaných mechanismů elektrochemické redukce 1,3-DNN na 13, 15 HMDE a m-agsae. 3.2 Voltametrické stanovení 1,5-dinitronaftalenu 3.2.1 DC voltametrie 3.2.1.1 Vliv ph Metodou DC voltametrie bylo na CAgAE sledováno elektrochemické chování 1,5-DNN v prostředí směsi MeOH a BR pufru v poměru 1:1 (V/V) o výsledném ph f (Obr. 27 a Obr. 28). 1 2 3 4 5 6 2 na -4-8 -12 E [mv] Obr. 27 DC voltamogramy 1,5-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) měřené na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr (1:1) s výsledným ph f : (1) 2,7; (2) 4,6; (3) 6,9; (4) 8,7; (5) 1,5; (6) 12,3; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl 38

1 2 3 4 5 1 na -4-8 -12 E [mv] Obr. 28 DC voltamogramy 1,5-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) měřené na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr (1:1) s výsledným ph f : (1) 3,9; (2) 5,5; (3) 8,2; (4) 9,5; (5) 11,7; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl Látka poskytuje v rozmezí ph 2 9 dvě vlny odpovídající pravděpodobně čtyřelektronovým redukcím nitroskupin za vzniku dihydroxylaminonaftalenu. V rozmezí ph 1 12 poskytuje látka tři vlny, které pravděpodobně odpovídají dvěma postupným čtyřelektronovým redukcím nitroskupin za vzniku dihydroxylaminonaftalenu, který je dále redukován čtyřmi elektrony v jednom kroku na diaminonaftalen. Prostředí směsi MeOH a BR pufru o ph 12, v poměru 1:1 (V/V), tzn. ph f 12,3, bylo zvoleno jako optimální pro další studie reprodukovatelnosti a citlivosti DCV metody z hlediska dobře vyvinutých a oddělených vln 1,5-DNN. 3.2.1.2 Stabilita signálu Pomocí metody DCV na CAgAE byla sledována závislost stability signálu 1,5-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) při deseti opakovaných měření ve zvoleném optimálním prostředí (Obr. 29). Vyhodnocené výšky vln (I p ) jednotlivých měření byly vyneseny do regulačních diagramů (Obr. 3 a Obr. 31) se zobrazením varovných ( x 2 ) a regulačních mezí ( x 3 ), kde x je průměrná hodnota σ je směrodatná odchylka všech neodlehlých hodnot I p. Odlehlost jednotlivých měření byla testována pomocí Deanova-Dixonova testu odlehlosti na hladině významnosti α,5. 51 Parametry stability signálu jsou shrnuty v Tabulce VII. 39

-24-16 I II I -8-4 -6-8 -1 E [mv] Obr. 29 DC voltamogramy deseti následných měření 1,5-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 12, (1:1); znázorněna každá třetí křivka; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl. I - 1. vlna; II - 2. vlna -92-9 -88 I p č-86 x 3 x 2 x x 2 x 3 2 4 6 8 1 ísloměřen3 Regulační diagram stability signálu 1,5-DNN íobr. (c = 1.1-4 mol.l-1) pro deset následných měření, vyhodnocení 1. vlny získané pomocí DCV na CAgAE v prostředí MeOH- BR pufr o ph 12, (1:1) 4

-26-25 -24 x 3 x 2 x x 2 x 3 I p č-23 2 4 6 8 1 ísloměřen31 Regulační diagram stability signálu 1,5-DNN íobr. (c = 1.1-4 mol.l-1) pro deset následných měření, vyhodnocení 2. vlny získané pomocí DCV na CAgAE v prostředí MeOH- BR pufr o ph 12, (1:1) Tabulka VII Parametry stability signálu 1,5-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ), měřeno metodou DCV v prostředí MeOH-BR pufr o ph 12, (1:1) (ph f 12,3) Vlna průměrná hodnota I p RSD n [%] 1. -89 1 1 2. -25 1 1 Metodou DCV byla prokázána stabilita signálu 1,5-DNN naměřené hodnoty I p s RSD do 1 % pro 1. i 2. vlnu pro deset následných měření. 3.2.1.3 Kalibrační závislost V prostředí směsi MeOH a BR pufru o ph 12, v poměru 1:1 (V/V) byly naměřeny DC voltamogramy v závislosti na koncentraci 1,5-DNN (Obr. 32 a Obr. 34) na CAgAE a vyneseny odpovídající kalibrační závislosti (Obr. 33 a Obr. 35). Logaritmickou analýzou kalibračních závislostí byl ověřen lineární dynamický rozsah použité metody (Obr. 36). 41

-18 I II I -12-6 7 6 5 4 3 1 2-4 -8-12 E [mv] Obr. 32 DC voltamogramy 1,5-DNN na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 12, (1:1); c (1,5-DNN) [μmol.l -1 ]: (1) -základní elektrolyt; (2) 1; (3) 2; (4) 39; (5) 57; (6) 74; (7) 91; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl. I - 1. vlna; II - 2. vlna -1-75 I I p -5-25 II 2 4 6 8 1 c [ mol.l -1 ] Obr. 33 Kalibrační přímky pro stanovení 1,5-DNN v intervalu 1 1 μmol.l -1, získané pomocí DCV na CAgAE vyhodnocením první (I) a druhé (II) vlny; chybové úsečky jsou tvořeny z průměrné hodnoty a směrodatné odchylky 3 měření jednotlivých koncentrací 42

I -1-8 -6 I II 6 5 4 2 3 1-4 -25-5 -75-1 E [mv] Obr. 34 DC voltamogramy 1,5-DNN na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 12, (1:1); c (1,5-DNN) [μmol.l -1 ]: (1) -základní elektrolyt; (2) 2; (3) 4; (4) 6; (5) 8; (6) 1; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl. I - 1. vlna; II - 2. vlna. -8-6 I I p -4-2 II 2 4 6 8 1 c [ mol.l -1 ] Obr. 35 Kalibrační přímky pro stanovení 1,5-DNN v intervalu 2 1 μmol.l -1, získané pomocí DCV na CAgAE vyhodnocením první (I) a druhé (II) vlny; chybové úsečky jsou tvořeny z průměrné hodnoty a směrodatné odchylky 3 měření jednotlivých koncentrací 43

2 I log (-I p ) [log na ] 1 II -1,5 1, 1,5 2, log c [log mol.l -1 ] Obr. 36 Logaritmická analýza kalibračních přímek vyhodnocení první (I) a druhé (II) vlny v koncentračním rozmezí 2 1 μmol.l 1 Parametry kalibračních přímek 1,5-DNN v koncentračních rozmezích 2 1 μmol.l -1 a 1 1 μmol.l -1 a parametry logaritmické analýzy jsou shrnuty v Tabulce VIII. Tabulka VIII Parametry kalibračních přímek 1,5-DNN a logaritmické analýzy, měřeno metodou DCV v prostředí MeOH-BR pufr o ph 12, (1:1) (ph f 12,3) Koncentrace Směrnice Úsek Vlna μmol.l -1 ] [na.l. mol -1 ] r 2 LoQ [μmol.l -1 ] 1. 1 1-1,1 6,177,9942-2. 1 1 -,29 1,61,9921-1. 2 1 -,63 -,2,9982 2 2. 2 1 -,24,26,9975 2 1. 2 1 a 1,13 -,29,9983-2. 2 1 a 1,15 -,86,9933 - a... logaritmická analýza 44

Logaritmickou analýzou (Obr. 36) byl testován lineární dynamický rozsah obou naměřených koncentračních řádů, který byl na základě odlehlosti směrnic logaritmické analýzy od teoretické hodnoty 1,,2 vyvrácen. Rozdílné hodnoty směrnic kalibračních přímek jednotlivých řádů tento závěr potvrzují a výsledný sigmoidální tvar kalibračních závislostí v celém koncentračním rozsahu 1,5-DNN (2 1 μmol.l -1 ) nasvědčuje rozdílným dějům (např. difúze, adsorpce) uplatňujících se v rozdílné míře při elektrochemické redukci 1,5-DNN na CAgAE při různých koncentracích tohoto analytu. V prostředí směsi MeOH a BR pufru o ph 12, v poměru 1:1 (V/V) lze metodou DCV na CAgAE stanovit 1,5-DNN v koncentračním rozsahu 2 1 μmol.l -1 s mezí stanovitelnosti 2 μmol.l -1. Pro vyšší koncentrace analytu je nutno použít odpovídající kalibrační přímky nebo metodu standardního přídavku. 3.2.2 Diferenční pulsní voltametrie 3.2.2.1 Vliv ph Metodou diferenční pulsní voltametrie (DPV) bylo na CAgAE sledováno elektrochemické chování 1,5-DNN v prostředí směsi MeOH a BR pufru v poměru 1:1 (V/V) o výsledném ph f (Obr. 37 a Obr. 38). 1 1 na 2 3 4 5 6-4 -8-12 E [mv] Obr. 37 DP voltamogramy 1,5-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) měřené na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr (1:1) s výsledným ph f : (1) 2,7; (2) 4,6; (3) 6,9; (4) 8,7; (5) 1,5; (6) 12,3; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl 45

1 1 na 2 3 4 5-4 -8-12 E [mv] Obr. 38 DP voltamogramy 1,5-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) měřené na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr (1:1) s výsledným ph f : (1) 3,9; (2) 5,5; (3) 8,2; (4) 9,5; (5) 11,7; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl Látka poskytuje v celém rozmezí ph 2 12 tři píky, které odpovídají pravděpodobně čtyřelektronovým redukcím jednotlivých nitroskupin za vzniku dihydroxylaminonaftalenu, který je dále redukován čtyřmi elektrony v jednom kroku na diamononaftalen, jehož pík je méně patrný v porovnání s předchozími. Prostředí MeOH ve směsi s BR pufrem o ph 12, v poměru 1:1 (V/V), tzn. ph f 12,3, poskytovalo nejvyšší, dobře vyvinuté a dobře vyhodnotitelné píky 1,5-DNN, a bylo tedy zvoleno jako optimální ph pro další studie reprodukovatelnosti a citlivosti DPV metody. 3.2.2.2 Stabilita signálu Pomocí metody DPV na CAgAE byla sledována závislost stability signálu 1,5-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) při deseti opakovaných měření ve zvoleném optimálním prostředí (Obr. 39). Vyhodnocené výšky píku (I p ) jednotlivých měření byly vyneseny do regulačních diagramů (Obr. 4 a Obr. 41) se zobrazením varovných ( x 2 ) a regulačních mezí ( x 3 ), kde x je průměrná hodnota a σ je směrodatná odchylka všech neodlehlých hodnot I p. Odlehlost jednotlivých měření byla testována pomocí Deanova-Dixonova testu odlehlosti na hladině významnosti α,5. 51 Parametry stability signálu jsou shrnuty v Tabulce IX. 46

-2-15 I II I -1-5 -4-6 -8-1 E [mv] Obr. 39 DP voltamogramy deseti následných měření 1,5-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ) na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 12, (1:1); znázorněna je každá třetí křivka; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl; I - 1. pík; II - 2. pík -12-1 -98 I p č-96 x 3 x 2 x x 2 x 3 2 4 6 8 1 ísloměřen4 Regulační diagram stability signálu 1,5-DNN íobr. (c = 1.1-4 mol.l-1) pro deset následných měření, vyhodnocení 1. píku získaného pomocí DPV na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 12, (1:1) 47

-66-63 x 3 x 2 x -6 I p čx 2 x 3-57 2 4 6 8 1 ísloměřen41 Regulační diagram stability signálu 1,5-DNN íobr. (c = 1.1-4 mol.l-1) pro deset následných měření, vyhodnocení 2. píku získaného pomocí DPV na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 12, (1:1) Tabulka IX Parametry stability signálu 1,5-DNN (c = 1.1-4 mol.l -1 ), měřeno metodou DPV v prostředí MeOH-BR pufr o ph 12, (1:1) (ph f 12,3) Pík Průměrná hodnota I p RSD n [%] 1. -99 1 1 2. -61 1 2 Metodou DPV byla prokázána stabilita signálu 1,5-DNN naměřené hodnoty I p s RSD do 1 % pro 1. pík a 2 % pro 2. pík pro deset následných měření. 3.2.2.3 Kalibrační závislost V prostředí MeOH-BR pufr o ph 12, v poměru 1:1 (V/V) byly naměřeny DP voltamogramy v závislosti na koncentraci 1,5-DNN (Obr. 42 a Obr. 44) na CAgAE a vyneseny odpovídající kalibrační závislosti (Obr. 43 a Obr. 45). Logaritmickou analýzou kalibračních závislostí byl ověřen lineární dynamický rozsah použité metody (Obr. 46). 48

I -16-12 -8-4 I 7 6 5 4 3 2 1-4 -6-8 -1 E [mv] II Obr. 42 DP voltamogramy 1,5-DNN na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 12, (1:1); c (1,5-DNN) [μmol.l -1 ]: (1) -základní elektrolyt; (2) 1; (3) 2; (4) 39; (5) 57; (6) 74; (7) 91; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl; I - 1. pík; II - 2. pík -12 I -8 I p -4 II 2 4 6 8 1 c [ mol.l -1 ] Obr. 43 Kalibrační přímky pro stanovení 1,5-DNN v intervalu 1 1 μmol.l -1, získané pomocí DPV na CAgAE vyhodnocením prvního (I) a druhého (II) píku; chybové úsečky jsou tvořeny z průměrné hodnoty a směrodatné odchylky 3 měření jednotlivých koncentrací 49

-55-5 I 7 6 II I -45-4 5 4 1 23-35 -4-6 -8-1 E [mv] Obr. 44 DP voltamogramy 1,5-DNN na CAgAE v prostředí MeOH-BR pufr o ph 12, (1:1); c (1,5-DNN) [μmol.l -1 ]: (1) -základní elektrolyt; (2) 1; (3) 2; (4) 4; (5) 6; (6) 8; (7) 1; rychlost polarizace 2 mv.s -1 ; E vs. Ag AgCl; I 1. pík; II - 2. pík -9 I -6 I p -3 II 2 4 6 8 1 c [ mol.l -1 ] Obr. 45 Kalibrační přímky pro stanovení 1,5-DNN v intervalu 1 1 μmol.l -1, získané pomocí DPV na CAgAE vyhodnocením prvního (I) a druhého (II) píku; chybové úsečky jsou tvořeny z průměrné hodnoty a směrodatné odchylky 3 měření jednotlivých koncentrací 5

2 I II log (-I p ) [log na ] 1-1,,5 1, 1,5 2, log c [log mol.l -1 ] Obr. 46 Logaritmická analýza kalibračních přímek vyhodnocení prvního (I) a druhého (II) píku v koncentračním rozmezí 1 1 μmol.l -1 Parametry kalibračních přímek 1,5-DNN v koncentračních rozmezích 1 1 μmol.l -1 a 1 1 μmol.l -1 a parametry logaritmické analýzy jsou shrnuty v Tabulce X. Tabulka X Parametry kalibračních přímek 1,5-DNN a logaritmické analýzy, měřeno metodou DPV v prostředí MeOH-BR pufr o ph 12, (1:1) (ph f 12,3) Koncentrace Směrnice Úsek Pík μmol.l -1 ] [na.l. mol -1 ] r 2 LoQ [μmol.l -1 ] 1. 1 1-1,11 2,97,9996-2. 1 1 -,7 3,54,9967-1. 1 1 -,82,7,9956 1 2. 1 1 -,42,4,9686 5 1. 1 1 a 1,29 -,46,9866-2. 1 1 a 1,29 -,71,9958 - a... logaritmická analýza 51