Forenzní mikroskopie Jan Lipov VŠCHT Praha Marek Kotrlý, Lubor Fojtášek, Ivana Turková Kriminalistický ústav Praha jan.lipov@vscht.cz, 22044 4335/5173 2 hodiny týdně zkouška, 3 body
Termíny 1 předtermín před Vánoci - zatím nelze zadávat do SISu, Každý týden zkouškového období 1 termín s kapacitou 20 vždy PÁTEK 9:00 v BIII
Seznam přednášek úvod do mikroskopie optická mikroskopie v procházejícím světle optická mikroskopie v odraženém světle fluorescenční mikroskopie TEM - transmisní elektronová mikroskopie SEM skenovací elektronová mikroskopie rentgenová analýza - EDS/WDS, mikroanalýza analýza povýstřelových zplodin analýza minerálních fází a zemin analýza skel a povýbuchových zplodin analýza vláken a biologických objektů analýza pigmentů možnosti iontové mikroskopie, analýza neznámých vzorků strategie analýzy forenzních fází, využití obrazové analýzy
Historie mikroskopie vidět znamená uvěřit vynález světelného mikroskopu je srovnatelný s objevením Ameriky objevení zcela nových světů světelný mikroskop otevřel mysl, umožnil lidem pochopit nepochopitelné a povzbudil je, aby mysleli na nemyslitelné
Na počátku bylo sklo jednoduchá zvětšovací skla a zapalovací skla jsou zmiňována již v pracích Seneky či Plinia staršího nejstarší nalezené zvětšovací sklo je tzv. Nimrudské sklo, Asýrie, 3000 let staré British Museum website
zač. letopočtu - Seneca mladší a Plinius starší zvětšovací efekt skleněné koule naplněné vodou otec moderní optiky: Abu Ali al-hasan ibn al- Haytham=Alhazen=Ptolemaios druhý, 965-1040, Kniha Optiky 7 svazků - obraz vzniká vniknutím záření do oka, popis záření pomocí jednoduché optické geometrie sklo tlustší uprostřed a tenčí na okrajích čočka (latinsky lentil dle podobnosti se semenem čočky) jednoduchá jednočočková zvětšovací zařízení ( flea glasses )
Public Domain, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=503708 Opticae Thesaurus
1590 Hans + Zaccharias Janssen - první složený mikroskop 1610 - Galileo Galilei teleskop (z řečtiny tele daleko, skopein pozorovat), vylepšil složený mikroskop 1660 - Marcello Malpighi jeden z prvních významných vědců své doby, používající mikroskop (např. objev kapilár)
1665 Robert Hooke kniha Micrographia sledování tenkých řezů korkem autor výrazu CELL (buňka)
Antoni van Leeuwenhoek nesprávně označován za vynálezce mikroskopu používal jen jednočočková zvětšovací skla vlastní výroby přesto až 250x zvětšení (složené mikroskopy té doby dosahovaly maximálně 20-30x) objevitel mikroorganismů, krevních buněk, spermií, některých jednobuněčných organismů
1730 Chester Moore Hall vyřešil chromatickou aberaci spojením konkávní a konvexní čočky achromatická čočka 1827 Giovanni Battista Amici vynález odrazového mikroskopu (broušená zrcadla místo čoček), koncept vodní imerze 1830 Joseph Jackson Lister popis konstrukce achromatických a aplanatických objektivů
1846 Carl Zeiss otvírá v Jeně svůj závod na výrobu mikroskopů a brýlí 1877 Ernst Abbe spolu z Zeissem formulují matematickou teorii vzájemného vztahu vlnové délky a maximálního rozlišení mikroskopu Abbeho zákon definice numerické apertury olejová imerze, umožňující dosažení maximálního rozlišení optických mikroskopů (0,2 mikrometru)
1903 Richard Adolf Zsigmondy vyvinul ultramikroskop, umožňující pozorování objektů menších než vlnová délka světla 1904 August Köhler vývoj metody rovnoměrné iluminace vzorku patentoval mikroskop s fixním okulárem první UV mikroskopie 1932 Frits Zernike vynalezl metodu pozorování využívající fázového kontrastu (Nobelova cena za fyziku 1953) 1938 Ernst Ruska vyvinul elektronový mikroskop (Nobelova cena za fyziku 1986) 1957 Marvin Minsky patentoval první konfokální mikroskop 2006 - Eric Betzig, Stefan W. Hell a William E. Moerner super-resoluční fluorescenční mikroskop (Nobelova cena za chemii 2014)
Mikroskopie dle povahy: světelná (optická), využívá viditelné části spektra nebo přilehlé UV a IR oblasti lupa (zvětšení 20x-40x) světelný mikroskop (zvětšení 2 000x) elektronová, využívá proudu urychlených elektronů, elektromagnetické čočky (zvětšení 1 000 000x) 400-750 nm http://www.lbl.gov/microworlds/alstool/emspec/emspec2.html
Světlo vlna nebo částice? 1905 Albert Einstein postuloval myšlenku DUALITY světla můžeme ho popisovat jako vlnění spojitého elektromagnetického pole a současně jako proud fotonů částicová povaha elektromagnetického záření se projevuje především v krátkovlnných oblastech (tzn. při vysokých energiích fotonů), vlnová povaha v oblasti dlouhovlnné pro světelnou mikroskopii v procházejícím světle vystačíme s geometrickou optikou, speciální obory mikroskopie vyžadují vlnový (fázový kontrast, interferenční mikroskopie) nebo kvantový a vlnový (elektronová mikroskopie) výklad světla http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/mod1.html http://sciencecity.oupchina.com.hk/npaw/student/glossary/youngs_double_slit.htm
Světlo jako vlna vlnění světla lze znázornit sinusoidou s parametry: frekvence f počet kmitů za jednotku času, nezávislá na optické hustotě prostředí; udává barvu světla vlnová délka λ vzdálenost mezi dvěma odpovídajícími si body sinusoidy (λ=c/f) amplituda A nejvyšší odchylka sinusoidy od nulové hodnoty, na její hodnotě závisí intenzita světla fáze φ popisuje, v jaké části vlny se vlnění v daném časovém okamžiku nachází Kotrba et al., Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006
Geometrická optika paprsek nekonečně tenký kužel světla, tj. přímka, podle které se pohybuje světelná energie světelné paprsky se šíří v izotropním prostředí přímočaře narazí-li paprsek konstantní vlnové délky na rozhraní dvou prostředí o různých optických hustotách, dochází k lomu a odrazu paprsku; tyto jevy závisí na povaze rozhraní a na optických vlastnostech obou prostředí, platí pro ně tyto zákony: paprsek dopadající a paprsek odražený nebo lomený leží v rovině úhel odrazu je roven úhlu dopadu prochází-li paprsek z prostředí opticky řidšího do prostředí opticky hustšího, láme se ke kolmici lomu, v opačném případě od kolmice lomu platí princip záměny chodu paprsků relativní index lomu (n či R.I.) : je-li α úhel dopadu a β úhel lomu, pak n=n1/n2=sin α/sin β Kotrba et al., Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006 vzduch 1,0003 voda 1,333 křemenné sklo 1,520 olovnaté sklo 1,656 diamant 2,4217 imerzní olej 1,515 glycerol 1,473
Definice Absorpce - pohlcení a zeslabení záření při jeho šíření určitým prostředím; pohlcená energie může být opět vyzářena nebo přeměněna na kinetickou energii Selektivní absorpce - Při selektivní absorpci dochází k pohlcování pouze určité části spektra. Mohou být pohlcovány pouze určité části spektra, širší pásy, nebo celé obory spektra. Většina látek absorbuje světlo selektivně. Spektrum světla je tedy po absorpci ochuzeno o některé vlnové délky nebo celé části původního spektra. Ve výsledném spektru se tedy vyskytují pouze určité vlnové délky (tzn. určité barvy). V důsledku absorpce se nám předměty jeví jako barevné Odraz a lom - změna směru paprsku procházejícího z prostředí o jedné optické hustotě do prostředí o jiné optické hustotě Index lomu optického prostředí n je dána poměrem rychlosti světla ve vakuu (c) a rychlosti světla (v) v daném prostředí (n=c/v) Světla různých frekvencí se v daném prostředí šíří různou rychlostí, proto mají různé indexy lomu. Monofrekvenční světla se při vstupu do prostředí různě lámou, tento jev se nazývá disperze, viditelné např. na trojbokém hranolu. Interference - skládání vlnění dvou elektromagnetických vln, které zároveň dospějí do určitého místa. REFRAKCE
Definice Difrakce (ohyb) je jev, u kterého se vlnění dostává do oblasti geometrického stínu. Tento proces lze sledovat, když prochází světlo štěrbinou, jejíž šířka je srovnatelná s vlnovou délkou světla. Za štěrbinou se na stínítku objeví difrakční neboli ohybové obrazce, tj. světlé a tmavé proužky různé šířky Polarizace - světlo je postupné příčné elektromagnetické záření. Vektor intenzity elektrického pólu je vždy kolmý na směr šíření světla, ale v případě nepolarizovaného světla mění nahodile svůj směr. V případě lineární polarizovaného světla kmitá vektor neustále v jedné rovině Optický dvojlom - rozdvojení světelného paprsku při lomu do opticky anizotropního prostředí. Oba vzniklé paprsky (řádný a extraordinární) jsou lineárně polarizované a postupují jiným směrem různou rychlostí. Dvojlomem se vyznačují všechny krystaly krom kubické soustavy (NaCl je isotropní krystal). Optickou osou krystalu je přímka, vedená libovolným bodem krystalu ve směru, ve kterém nenastává dvojlom. Podle počtu optických os se krystaly dělí na jednoosé (islandský vápenec) a víceosé. http://www.olympusmicro.com/primer/lightandcolor/polarization.html
Zdroje světla v mikroskopii rané mikroskopy osvětlovány slunečním svitem, svíčkou či olejovou lampou blikání, nerovnoměrný osvit, lesk moderní osvit většinou lampy na bázi wolframu (klasická žárovka, případně halogenová), u fluorescenčních mikroskopů rtuťová výbojka LASER - Light Amplification by the Stimulated Emission of Radiation
Geometrická optika II Optická čočka je optická soustava dvou centrovaných ploch, nejčastěji dvou kulových nebo jedné kulové a jedné rovinné plochy. Optická osa čočky je přímka, procházející středem křivosti kulových ploch a je kolmá k její rovinné ploše. Vzájemně rovnoběžné světelné paprsky dopadající na čočku rovnoběžně s optickou osou se po průchodu čočkou protínají v jednom bodě ohnisku (F). Čočka má ohnisko předmětové na straně optické soustavy, kde je předmět a ohnisko obrazové na druhé straně optické soustavy (spojnicí obou ohnisek je optická osa). Ohnisková vzdálenost (f) je vzdálenost ohniska od optického středu (O). čočky konvergentní i divergentní (positivní a negativní) Ohnisko F a ohnisková vzdálenost f pro spojku, rozptylku a konkávní a konvexní kulové zrcadlo
Pro čočku spojnou platí: paprsek rovnoběžný s optickou osou po průchodu optickou soustavou probíhá obrazovým ohniskem F paprsek procházející středem optické soustavy (O) po průchodu optickou soustavou probíhá stejným směrem a neláme se paprsek procházející předmětovým ohniskem F po průchodu optickou soustavou probíhá rovnoběžně s osou optické soustavy 2 možnosti umístění předmětu vzhledem k optické soustavě: předmět se nalézá mezi ohniskem a dvojnásobnou ohniskovou vzdáleností vzniká obraz převrácený, zvětšený a skutečný (objektiv) předmět se nalézá mezi optickou soustavou a ohniskem vzniká obraz vzpřímený, zvětšený a zdánlivý (okulár, lupa) objekt Kotrba et al., Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006
Vznik obrazu ve složeném mikroskopu (okulár + objektiv) Rozdíl mezi reálným a zdánlivým obrazem - obrazy jsou definovány oblastí, ve které se světelné paprsky a jejich prodloužení protínají v důsledku refrakce čočkou nebo odrazu zrcadlem. Pokud se paprsky protínají na ohnisku, obraz je reálný a může být pozorován na obrazovce, zaznamenán na film nebo projektován na povrch sensoru (CCD). Pokud paprsky divergují, ale jejich virtuální projekce konverguje v ohnisku, vzniklý obraz je virtuální a nemůže být zaznamenán. Díváme-li se na vzorek okulárem, reálný obraz je zobrazen až na naší sítnici, my to ale vnímáme jako virtuální obrázek ve vzdálenosti cca 25 cm před naším okem.
Objektiv kvalita získaného obrazu závisí na otvorovém úhlu objektivu (úhel, který svírají dva protilehlé krajní paprsky, vycházející z bodu objektu na optické ose a vstupujícího do objektivu při ostrém vidění) dva hlavní údaje na objektivu zvětšení a numerická apertura numerická apertura NA je dána vztahem NA=η x sinα, kde η je index lomu prostředí mezi preparátem a čelní čočkou objektivu a α je polovina otvorového úhlu objektivu pracovní vzdálenost maximální vzdálenost, na kterou je objektiv schopen zaostřit (d) NA1 NA2 otvorový úhel objektivu s nízkou (NA1) a vysokou (NA2) numerickou aperturou. Pracovní vzdálenost d se zkracuje se zkracující se ohniskovou vzdáleností, tj. s rostoucím zvětšením objektivu
Objektiv Pro každý mikroskop existuje maximální zvětšení, za kterým už obraz vypadá pouze větší, ale už se nezobrazuje více detailů. Toto tzv. prázdné zvětšení nastává nad hodnotou, ve které je nejjemnější detail zobrazitelný daným mikroskopem zvětšen na maximální rozlišovací schopnost našeho oka. S optickým mikroskopem při použití olejové imerze je nejlepší rozlišení cca 200 nm, což odpovídá zhruba zvětšení 1200x. Bez imerze je hranice prázdného zvětšení cca 800x.
Rozlišovací schopnost Rayleighovo kritérium - dva body je možné rozlišit právě tehdy, když centrální maximum (Airyho disk) prvního difrakčního obrazce spadá do prvního minima difrakčního obrazce druhého bodu. Jinak také vzdálenost mezi body musí minimálně odpovídat šířce píku v polovině maxima jeho intenzity. Rozlišovací mez soustavy je nejmenší úhlová nebo lineární vzdálenost 2 bodů, které lze optickou soustavou rozlišit pro lineární vzdálenost platí R = 0,61 x λ/na rozlišovací schopnost se zvyšuje s rostoucí numerickou aperturou rozlišovací schopnost se zvyšuje se snižující se vlnovou délkou použitého světla http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/phyopt/raylei.html
Jak zvýšit rozlišení? R = 0,61 x λ/na použít kratší vlnovou délku (mikroskopie v UV světle, elektronová mikroskopie) zvýšení numerické apertury NA=η x sinα α má praktické limitace (cca 72, sinα cca 0,95) lze měnit index lomu prostředí η, a to použitím vodních či imerzních objektivů ηvzduch= 1 ηimers= 1,512 suché objektivy: NA do 0,85 imerzní objektivy: NA do 1,5 η skla je cca 1,5-1,9, použitím imerzního oleje se přiblížíme optické hustotě skla, paprsky procházejí opticky homogennějším prostředím, nelámou se a neodráží a do objektivu tak vstupuje více paprsků NA
Světelnost objektivu intenzita osvětlení zorného pole je úměrná čtverci numerické apertury Hloubka ostrosti objektivu maximální vzdálenost dvou ostře zobrazených rovin, kolmých na optickou osu přístroje s rostoucí NA se hloubka ostrosti snižuje Užitečné zvětšení objektiv vytvoří obraz sledovaného objektu s mnoha detaily, tento obraz je však malý okulár zvětší obraz tak, aby byly bezpečně rozlišeny všechny detaily zobrazené objektivem užitečné zvětšení = zvětšení objektivu x zvětšení okuláru v praxi leží hodnota užitečného zvětšení v rozmezí 500-1000x NA