Vysokoúčinná kapalinová chromatografie High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Kapalinová chromatografie (LC) 1.1. Teorie kapalinové chromatografie Difúzní koeficienty jsou v LC o ~5 řádů menší než v GC (~10-5 oproti ~1 cm 2 /s) V důsledku tohoto faktu je molekulární difúze zanedbatelná a na druhé straně roste význam odporu proti přenosu hmoty v mobilní fázi Viskozita je pro kapaliny asi 100x vyšší než pro plyny Důsledkem je nezbytnost pracovat s vysokými tlaky ~20 MPa pro dosažení rozumné průtokové rychlosti Snaha po zmenšení nežádoucího efektu pomalého přenosu hmoty v mobilní fázi vede ke zmenšování průměru částic sorbentu, to ovšem přináší nutnost užívání vysokých tlaků na koloně

Rozšiřování zóny analytu v průběhu postupu kolonou může být ovlivňováno (stejně jako v GC) dvěmi faktory, termodynamickým a kinetickým Faktor termodynamický se v LC podílí na rozmývání píků často Pokud K D a k jsou nezávislé na koncentraci složky, pak všechny části zóny složky procházejí kolonou stejně rychle a je získán symetrický pík Pokud ale pracujeme v nelineární oblasti adsorpční izotermy, pak v případě obvyklého konvexního průběhu izotermy, obdržíme chvostující píky Retenční(kapacitní) faktor k přitom klesá s rostoucí koncentrací složky v nástřiku Vhodné je pracovat pokud možno v oblasti lineární izotermy sorbentu Kvantitativním parametrem je zatížení sorbentu vyjádřené v gramech dávkovaného vzorku na 1g stacionární fáze Zatížení sorbentu, které vede ke snížení retenčního faktoru o 10% je označováno lineární kapacita sorbentu Lineární oblast bývá do ~10-4 g vzorku na 1 g sorbentu

Při přetížení kolony je vhodné snížit koncentraci (nebo objem) nastřikovaného vzorku V adsorpční chromatografii se stává, že snížení koncentraci nevede k odpovídajícímu zlepšení tvaru píku, je tomu většinou tehdy, když má sorbent nehomogenní povrch, nese centra s různou aktivitou Obvykle je nutno velmi aktivní centra vysytit např. H 2 O, izopropanolem apod.

Faktor kinetický v LC popisuje Giddingsova rovnice respektující vzájemnou závislost vířivé difúze H F a odporu proti přenosu hmoty v mobil. fázi H M : 1 H = + HS (5) 1 1 + H H F M H S je odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi V rozepsaném tvaru je vztah (5) pro kapalinovou rozdělovací chromatografii roven: H 1 2 λ d p 1 D + ω d m 2 p u 2 q df u k + D (k + 1) = (6) S kde l, ω, q jsou konstanty závislé na geometrii náplně kolony, D m a D S jsou difúzní koeficienty dané složky v mobilní a stacionární fázi, d p je průměr částic sorbentu, d f je síla filmu stacionární fáze 2

Pro kapalinovou adsorpční chromatografii a iontově výměnou chromatografii je nutno poslední člen rovnice (6) substituovat výrazem pro H S : H k = 2q t u (7) ( k + ) 2 S d 1 kde t d je čas potřebný k desorpci molekuly daného analytu Pro gelovou chromatografii se nahradí poslední člen rovnicí: H SM 2 dp u k = (8) 30 D m ( k + 1) 2 kde D m je difúzní koeficient složky v mobilní fázi V praxi je často možno členy H S a H SM zanedbat

Pro popsání závislosti H versus u se v kapalinové chromatografii používá i jednoduchý vztah odvozený Snyderem: a H = D u (9) D je pro jistý chromatografický systém konstanta odpovídající H pro u=1 cm/s. Konstanta D zahrnuje velikost částic sorbentu, hodnotu difúzního koeficientu atd. Konstanta a obvykle nabývá hodnot 0.3-0.7. Pro pelikulární náplně je hodnota a ~ 0.4 a pro porézní a ~ 0.6

Rovnici se dvěma parametry navrhli také Kennedy a Knox pro vyjádření závislosti redukované výšky patra h na redukované lineární rychlosti ν: h 1 3 = A ν + C ν (10) h=h/d p a ν=ud p /D m A, C jsou konstanty První člen vztahu (10) reprezentuje vliv turbulentní difúze Konstanta A má vztah ke kvalitě naplněné kolony, u dobrých kolon je A < 1 Člen C ν představuje odpor proti přenosu hmoty v mobilní i stacionární fázi, pro konstantu C platí zpravidla C < 0.1

2.1. Technika sloupcové chromatografie 1. Systém otevřený nízkotlaký Low(Medium) Pressure Liquid Chromatography 2. Systém uzavřený vysokotlaký High Performance Liquid Chromatography

2.1.1. Čerpadla Zásobník mobilní fáze Filtrace kapalin membránové filtry 0.45 µm Frita 2 µm Odplynění - helium, vakuum, ultrazvuk Požadavky kladené na čerpadlo pro analytickou HPLC: Konstantní průtok s přesností lepší než 0.5 % Bezpulzní provoz Průtok regulovatelný v rozsahu od desítek mikrolitrů do 10 ml/min, správnost a přesnost Malý objem hlav => umožní rychlé změny složení kapalin Inertnost čerpadla k mobilní fázi rubín, safír, titan, polymery-teflon, PEEK Provozní tlaky do 40 MPa

2.1.1.1. Čerpadla s konstantním průtokem a) Čerpadla reciprokační Průtok se nastavuje volbou délky zdvihu nebo frekvence Objem hlavy čerpadla ~10-100 µl Výhody: Nepřetržitá dodávka mobilní fáze, snadná změna mobilní fáze Nevýhoda: Pulzní chod => detektor-šum => dvoupístové uspořádání, tlumič pulzů

b) Lineární dávkovače Objem ~ 200 500 ml Výhoda: Konstantní průtok mobilní fáze-bezpulzní čerpadlo => velmi vhodné pro mikrokolonové aplikace Nevýhoda: Nutnost plnit zásobník čerpadla, diskontinuální provoz, nesnadná změna fází

2.1.1.2. Čerpadla s konstantním tlakem Pneumatické membránové čerpadlo Výhody: Vysoké tlaky (kolem 70 MPa), stabilita tlaku, vhodné pro plnění kolon a pro vysoké průtoky-pro preparativní HPLC, nízká cena Nevýhody: Konstantní tlak-ne průtok! Průtok závisí na viskozitě mobilní fáze

2.1.2. Zařízení pro tvorbu gradientu V řadě případů je nutno nahradit izokratickou eluci elucí gradientovou Gradientová eluce: Definovaná změna složení mobilní fáze v průběhu analýzy Měnit se může polarita solventu, iontová síla, ph, atd. Změny složení mohou být skokové, lineární nebo nelineární Míchání složek mobilní fáze v mixérech-pasivní, aktivní Gradienty-binární, ternární, kvartérní V současné době se pro HPLC užívají především dva typy gradientových systémů: 1) Nízkotlaký 2) Vysokotlaký

ad 1) Nízkotlaký gradient

ad 2) Vysokotlaký gradient

2.1.3 Nástřik vzorku Pro aplikace v HPLC se již nepoužívá technika nástřiku stříkačkou přes septum, ani technika nástřiku na kolonu se zastaveným tokem mobilní fáze Nástřik stříkačkou má v současnosti význam jen u otevřených systémů Téměř výlučně se vzorek nastřikuje pomocí ventilů: (Rheodyne, Valco) Nástřik bez zastavení toku mobilní fáze Ventily mají vysokou tlakovou odolnost přes 40 MPa Chemická odolnost je dobrá, odolnost vzhledem k vysokému ph se může zvýšit volbou materiálů Vespel; PEEK Vysoká reprodukovatelnost nástřiku ~ 0.2% Plnění smyčky-úplné, částečné Smyčka-interní, externí

2.1.4. Kolony pro HPLC Typy HPLC kolon: ID vnitřní průměr Kapilární kolony ~ stovky, desítky mikrometrů Mikrokolony 1 mm Narrow-bore kolony 2 mm Analytické kolony ~2 mm do ~10 mm Semipreparativní kolony~10 mm do ~25 mm Preparativní kolony nad 25 mm Materiály: Nerezová ocel-pasivace povrchu Sklo-tvrzené (odolnost do ~20MPa) Ti-Zr PEEK-nižší odolnost vzhledem ke koncentrovaným anorganickým kyselinám a THF

Rozměry analytických kolon - trendy Nekompatibilita kolon a částí Cartridge systém Radiální a axiální komprese Minimalizace mimokolonových objemů, rozmytí (směrodatná odchylka) Plnění kolon - za sucha vs. slurry metoda