Mikroskopické metody Přednáška č. 3 Základy mikroskopie Kontrast ve světelném mikroskopu
Nízký kontrast biologických objektů
Nízký kontrast biologických objektů Metodika přípravy objektů pro světelnou mikroskopii: objekt musí být prosvítitelný je třeba zvýšit kontrast je třeba využit různé difrakční indexy
A. Pozorovat můžeme: celý objekt - protoplasty, pyl, krevní buňky... clearing
A. Pozorovat můžeme: roztlak, roztěr
B. Zvýšení kontrastu barvení
C. Řezání objektu fyzické řezy
C. Řezání objektu optické rezy
Vlnový charakter světla při tvorbě obrazu v mikroskopu
Zvyšování kontrastu biologických objektů: interference světelných vln Teorie difrakčního gradientu (Abbe teorie): Na zadní fokální rovině objektivu je rozptýlené (diffracted, scattered) světlo prostorově separované od nerozptýleného (undiffracted, 0th order)
Zvyšování kontrastu biologických objektů: interference světelných vln
Metody modulace kontrastu ve světelné mikroskopii Pozorování ve světlém poli Pozorování ve tmavém poli Fázový kontrast Polarizační mikroskopie Diferenciální interferenční kontrast
Zvyšování kontrastu biologických objektů: tmavé pole
Zvyšování kontrastu biologických objektů: tmavé pole
Zvyšování kontrastu biologických objektů: tmavé pole
Zvyšování kontrastu biologických objektů: tmavé pole
Zvyšování kontrastu biologických objektů: tmavé pole
Zvyšování kontrastu biologických objektů: tmavé pole
Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast Mikroskop zobrazuje objekty na základě změny amplitudy světla. Ta se mění díky kontrastním rozdílům ve vzorku. Když jsou biologické vzorky průsvitné a málo kontrastní, nejsou vidět. Obsahují ale struktury, které se liší svým indexem lomu, na nichž dochází k fázovým posunům. Fázový kontrast mění rozdíly ve fázi světla v rozdíly v amplitudě.
Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast - fázová destička v přední ohniskové rovině kondenzoru - fázová destička v obrazové ohniskové rovině objektivu, která posunuje fázi o + π/2 nebo - π/2), tj. o čtvrtinu vlnové délky (λ/4) - výsledný posun fázy difraktovaného svetla k nedifraktovanému je λ/2 (180 ) - obraz se vytváří interferencí fázově posunutých a neposunutých paprsků
Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast Fazovy kontrast změna amplitudy procházejícího světla cez preparát dva kroužky, u kterých nastává při přechodu světla posun fáze světelné vlny Fázová maska mění fázi procházejícího záření o úhel α Při fázovém kontrastu se intenzita světla v obrazu objektu mění lineárně se změnou fáze světla procházejícího objektem. S fázovou maskou měnící fázi o -π /2 se silnější části objektu jeví tmavší, tzv. pozitivní fázový kontrast. Při změně fáze o π /2 je tomu naopak, tzv. negativní fázový kontrast. V obrazové ohniskové rovině objektivu se nachází fázová destička, opět ve tvaru mezikruží, jež posunuje fázi o + /2 nebo - /2, tj. o čtvrtinu vlnové délky. Tato destička propouští paprsky, které nezměnily svůj směr na fázových objektech. Ostatní paprsky destičku minou a jejich fáze se nezmění.
Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast
Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast
Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast http://www.microscopyu.com/tutorials/java/phasecontrast/opticaltrain/index.html
Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast
polarizácia
Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC http://www.microscopyu.com/tutorials/java/polarized/polarizerrotation/index.html
Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC
Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC
Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/dic/dicoverview.html
Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC
Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC
Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC
Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC
Porovnání kontrastu při fázovém kontrastu a DIC http://www.microscopyu.com/tutorials/java/phasedicmorph/index.html
Porovnání kontrastu při fázovém kontrastu a DIC bright field phase contrast DIC