Bioimaging rostlinných buněk, CV.2

Bioimaging rostlinných buněk, CV.2 Konstrukce mikroskopu (optika, fyzikální principy...) Rozlišení - kontrast Live cell microscopy Modulace kontrastu (Phase contrast, DIC) Videomikroskopia

Nízký kontrast biologických objektů

Nízký kontrast biologických objektů Metodika přípravy objektů: objekt musí být prosvítitelný je třeba zvýšit kontrast je třeba využit různé difrakční indexy

A. Pozorovat můžeme: celý objekt - protoplasty, pyl, krevní buňky... clearing

A. Pozorovat můžeme: roztlak, roztěr

B. Zvýšení kontrastu barvení

C. Řezání objektu fyzické řezy

C. Řezání objektu optické rezy

Metody modulace kontrastu ve světelné mikroskopii Pozorování ve světlém poli Pozorování ve tmavém poli Fázový kontrast Polarizační mikroskopie Diferenciální interferenční kontrast

Zvyšování kontrastu biologických objektů: tmavé pole

Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast Mikroskop zobrazuje objekty na základě změny amplitudy světla. Ta se mění díky kontrastním rozdílům ve vzorku. Když jsou biologické vzorky průsvitné a málo kontrastní, nejsou vidět. Obsahují ale struktury, které se liší svým indexem lomu, na nichž dochází k fázovým posunům. Fázový kontrast mění rozdíly ve fázi světla v rozdíly v amplitudě.

Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast

Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast Teorie difrakčního gradientu (Abbe teorie): Na zadní fokální rovině objektivu je rozptýlené (diffracted, scattered) světlo prostorově separované od nerozptýleného (undiffracted, 0th order)

Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast Fazovy kontrast změna amplitudy procházejícího světla cez preparát dva kroužky, u kterých nastává při přechodu světla posun fáze světelné vlny Fázová maska mění fázi procházejícího záření o úhel α Při fázovém kontrastu se intenzita světla v obrazu objektu mění lineárně se změnou fáze světla procházejícího objektem. S fázovou maskou měnící fázi o -π /2 se silnější části objektu jeví tmavší, tzv. pozitivní fázový kontrast. Při změně fáze o π /2 je tomu naopak, tzv. negativní fázový kontrast. V obrazové ohniskové rovině objektivu se nachází fázová destička, opět ve tvaru mezikruží, jež posunuje fázi o + /2 nebo - /2, tj. o čtvrtinu vlnové délky. Tato destička propouští paprsky, které nezměnily svůj směr na fázových objektech. Ostatní paprsky destičku minou a jejich fáze se nezmění.

Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast - fázová destička v přední ohniskové rovině kondenzoru - fázová destička v obrazové ohniskové rovině objektivu, která posunuje fázi o + π/2 nebo - π/2), tj. o čtvrtinu vlnové délky (λ/4) - výsledný posun fázy difraktovaného svetla k nedifraktovanému je λ/2 (180 ) - obraz se vytváří interferencí fázově posunutých a neposunutých paprsků

Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast

Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC

Porovnání kontrastu při fázovém kontrastu a DIC

Porovnání kontrastu při fázovém kontrastu a DIC bright field phase contrast DIC

Důvody proč studovat živé buňky neinvazivními metodami chemická a fyzikální fixace může způsobovat artefakty procesy jako růst a pohyb organel jsou velice dynamické možnost aktuálního sledování exprese reportérových genů a distribuce modifikovaných proteinů ve fyziologických podmínkách

Metody mikroskopie živých buněk videomicroscopy contrast enhanced microscopy ultraviolet microscopy low-light intensity fluorescence microscopy CLSM (confocal laser scanning microscopy)

Optimalizace podmínek k live cell imaging - teplota - přísun kyslíku - vlhkost - osmolarita - ph, pufrování média - fototoxicita - fotopoškození - microscope focus drift - intenzita signálu - rozlišení -

Videomokroskopie - využívá video-umocněný kontrast, t.j. digitální zesílení relativně malých lokálních rozdílů v intenzitě světla - pracuje s odečtem pozadí zahrnující všechny nežádoucí odrazy a rozptyl světla v optické soustavě mikroskopu, včetně neostrých obrazů mimo ohniskovou rovinu - možnost zesílit signál za podmínek, kdy není dost fotonů na to, aby vytvořily obraz bez šumu - možnost změny poměru signál/šum integrací několika po sobě jdoucích obrazů

Videomokroskopie Způsoby snímání: - real-time microscopy recording - time-lapse image sequence acquisition (repeated imaging of a cell at defined time points) Dimensions: - 2-D - sequential capture of single focal planes (x-y in widefield microscopy and x- y, x-z, and y-z in confocal microscopy) - 3-D - optical stacks from multiple focal planes in a variety of dimensional formats with thick specimens - 4-D - time-lapse imaging, a single focal point in the lateral plane (x and y) is combined with z-stack imaging as a function of time - 5-D - imaging with adding of different wavelengths - 6-D - time-lapse imaging adds either multiple wavelengths or multiple lateral regions

Arabidopsis thaliana vývin kořenových vlásků jako developmentální model

morfologická a fyziologická změna polarity vývin kořenových vlásků jako developmentální model

základní způsoby růstu rostlinných buněk

příprava viabilního objektu pro live cell mikroskopii cílem je pozorování vrcholového růstu kořenových vlásků 0 min 5 min 10 min 15 min

videomikroskopie rostoucích kořenových vlásků

vizualizace vezikul v apexu kořenového vlásku elektronovou mikroskopií

vizualizace vezikul v apexu pylové láčky elektronovou mikroskopií

porovnání klasické světelné (DIC) a elektronové mikroskopie

vysoké rozlišení elektronické světelné mikroskopie electronic light microscopy video-enhanced contrast light microscopy

kombinace videomikroskopie a kontrast-enhancement

0.00s 0.12s 0.24s 0.36s 0.48s 1.00s 1.12s 1.24s 1.36s 1.48s 2.00s

dají se studovat chemické inhibice pohybu organel