Next Generation Sequencing v klinické genetice, Iveta Valášková,
Sekvenování je v tomto oboru nepostradatelné Cílem molekulární diagnostiky je přinést v krátké době správné a přesné výsledky, které lékař použije k cílené léčbě.
Vývoj sekvenačních metod za posledních 30 let Stratton et al. 2009 Nature 458:719-724
Kapilární sekvenování Příprava DNA fragmetnů. Fragmenty DNA se připravují jednotlivě (PCR amplifikace či klonování). Sekvenace jednotlivých DNA fragmentů. Možnost paralelní sekvenace max. 96 sekvencí v jednom běhu (96 kapilárové sekvenátory) Délka získané sekvence cca 650 bp. Max. sekvenační výtěžek jednoho běhu cca 60 kb
Sekvenování nové generace ( next-generation sequencing, NGS) Revoluční technologie. Poskytuje levné, správné a přesné informace o genomické sekvenci. Tato technologie od svého uvedení postupně téměř ovládla oblast základního či aplikovaného výzkumu zabývajícího se analýzou DNA.
Sekvenování nové generace ( next-generation sequencing, NGS) (massivelly parallel sequencing) Fragmentace DNA. PCR se provádí paralelně pro všechny fragmenty DNA Paralelní sekvenování několika miliónů sekvencí. Délka získaných sekvencí cca 50 600 bp. Sekvenační výtěžek jednoho běhu několik až několik tisíc Gb (o 4 až 6 řádů vyšší než u kapilárního sekvenování). Cena sekvenace za bázi o řád až dva nižší než u kapilárního sekvenování.
Sekvenování nové generace ( next-generation sequencing, NGS) Humánní genom Celogenomové - de novo - resekvenování Exomové Transkriptonové Cílené sekvenování amplikonové sekvenování ultra-široké - ultra-hluboké - Hybridization based capture Non-humánní genom člověk Metagenomické studium mirobiálního složení v různých typech prostředí střevní mikroflóra, zubní plak.
Nyní NGS vstupuje i do klinické diagnostiky. Jedná se zejména o aplikace, kde se vyžaduje velké množství sekvenačních informací případně vysoká citlivost. Pro diagnostické účely zatím není požadováno celogenomové nebo exomové sekvenování, které se v medicíně používá především pro výzkumné účely. V současné době sekvenování v klinické diagnostice znamená sekvenování v malém rozsahu zaměřené na analýzu jednotlivých genů nebo vybraných skupin genů asociovaných s konkrétním onemocněním. Pro splnění těchto požadavků jsou vhodné tyto postupy: amplikonové sekvenování sekvenování vybraných úseků DNA získaných na základě hybridizace sond komplementárních k cílové sekvenci (hybridization-based capture sequencing, Hyb-Seq) Liší se tvorbou knihovny cílové DNA
NGS Amplikonové sekvenování Amplikonové sekvenování
Tvorba knihovny
Amplikonové sekvenování Příprava knihovny amplikonů může probíhat třemi způsoby záchytu vybrané oblasti pomocí fúzních primerů je nejjednodušším a zároveň nejlevnějším postupem jsou primárně vhodné pro experimenty s nižším počtem sekvenovaných amplikonů a vzorků, protože každý amplikon vyžaduje syntézu svého specifického páru primerů (+)MID (-)MID využití již existujících amplikonů, které vznikly amplifikací s normálními primery. Na takto vzniklé amplikony se poté připojí tzv. Y adaptory. Tyto adaptory jsou podobné fúzním primerům. Obsahují sekvenci komplementární k mikrokuličkám, která se naváže na templát, a mohou také obsahovat MID. Tento přístup je obzvlášť vhodný, pokud je možné připravit více amplikonů pomocí páru jednoduchých primerů, v případě většího množství amplikonů či vzorků je však tento postup dražší a složitější MASTR assay (z anglického Multiplex Amplification of Specific Targets for Resequencing ) produkt firmy Multiplicon (www.multiplicon.com), lze redukovat množství specifických primerů, neboť je prováděna dvoukroková mnohonásobná PCR. V prvním kroku jsou použity primery složené z univerzální sekvence a sekvence komplementární k templátu. To vyžaduje jen tolik párů primerů, kolik bude sekvenováno druhů amlikonů. V druhém kroku PCR jsou poté použity fúzní primery s MID, které cíleně nasedají na univerzální sekvenci z předchozího kroku. To sníží množství použitých specifických fůzních primerů na počet odpovídající počtu sekvenovaných vzorků. Celkově tedy MASTR assay vyžaduje pouze tolik párů primerů, kolik činí součet všech amplikonů a vzorků v experimentu. Je vhodné využít při větším množství vzorků
Ultra-hluboké sekvenování využívá přípravu knihovny amplikonů, kde jsou amplifikovány a sekvenovány cílené geny nebo oblasti genů. Tato metoda nabízí dostatečně velkou hloubku pokrytí čteného fragmentu, Aby bylo možno identifikovat i sekvenční varianty s frekvencí nižší než 1 % v analyzovaném vzorku To je možné díky tomu, že každý zmnožený fragment je sekvenován zvlášť Nachází své uplatnění tam, kde je nutné detekovat mutace, které se vyskytují ve vzorku v malém počtu amplikonů (mozaicismus, somatické mutace). Ultra-široké sekvenování Využívá přípravu knihovny amplikonů a pomocí hybridizace s komplementárními sondami (Hybridization-based capture sequencing-seqcap) Hledá varianty s vyšší frekvencí výskytu ve velkém počtu vzorků najednou Například se může jednat o detekci heterozygotní ch SNP (jednonukleotidový polymorfismus; z anglického Single Nucleotide Polymorfism ) ve velké skupině exonů. To umožňuje za krátký čas analyzovat vzorky od většího množství pacientů. Výsledky ukázali, že ultraširoké sekvenování má 30x větší pokrytí než klasická Sangerova metoda s pouze 0,05 % falešně pozitivních výsledků.
Hybridization-based capture sekvenování K získání vybraných úseků z fragmentované celkové DNA, jsou používány sondy komplementární k cílové sekvenci Hybridizační sondy označeny biotinylovanou značkou a po navázání vybraného úseku DNA jsou připojeny na mikrokuličky pokryté streptavidinem. Po uvolnění fragmentů lze vybraný úsek sekvenovat. Pro větší efektivitu bývá použito několik cyklů zachycení
Masivně paralelní sekvenování probíhá ve dvou následných postupech: 1. Oddělení a namnožení jednotlivých fragmentů nukleových kyselin zajištěn pomocí emulzní PCR (empcr) nebo amplifikací ve shlucích empcr dochází k vytvoření tzv. mikroreaktorů, vytvořených v olejové emulzi. Mikroreaktory obsahují složky pro normální PCR reakci (nukleotidy, enzym polymeráza, primery) a mikrokuličky s navázaným fragmentem nukleové kyseliny. dochází ke klonální amplifikaci všechny molekuly DNA vytvořené v mikroreaktoru pochází z jediné molekuly templátu. Na konci empcr k mikrokuličce přichyceno v průměru 10 milionů identických kopií původní jednořetězcové DNA. 2. Čtení sekvence u dostupných platforem NGS řešena dvěma metodami: sekvenováním syntézou ( sequencing by synthesis ), které používá např. platforma 454 sekvenování a sekvenováním založeném na ligaci ( ligation based sequencing ) používaným platformou Solid ( Sequencing by Oligo Ligation and Detection ).
Platforma 454 (2005) využívá k namnožení DNA empcr a sekvenci DNA čte pomocí pyrosekvenování.
454 Genome Sequencers FLX System 1 million reads/run 400-650 bp/read GS Junior 0.1 millions reads/run 400 bp/read
Solexa-Illumina (2007) Můstková bridge PCR Sekvenování pomocí DNA syntézy 1. Navázání jednořetězcových fragmentů k destičce ( the flow cell ), jejiíž povrch je pokryt oligonukleotidy komplementárními k oběma typům adaptérů. Můsková amplifikace 2. Přidání neznačených nukleotidů a enzymů.po přidání enzymů dochází k ohnutí fragmentu. 3. Enzymy inkorporují neznačené nukleotidy a staví dvouřetězcové mosty na solid phase substrátu. Tento proces je také nazýván jako tzv. vytváření shluků ( cluster generation ). Dochází ke klonování každého fragmentu knihovny a výsledkem této izotermické amplifikace je sto milionů jedinečných svazků. 4. V závěru můstkové amplifikace dochází na konci každého úseku DNA k navázání primeru. 5. V průběhu sekvenování se připojují 4 značené terminátory (T,A,G,C), po laserové excitaci je emitují fluorescenci z každého shluku na flow cell 6. Opakováním cyklů sekvenování je determinována sekvence bazí fragmentu
Illumina sequencers Illumina MiSeq 4 millions reads/run 150bp/read Illumina GAIIX 300 millions reads/run 150bp/read Illumina HighSeq 1500-3000 millions reads/run 100bp/read
Solid (2008) Emulzní PCR Sekvenování pomocí ligace
Solid sequencer Solid 5500xl 1500 millions reads/run 75bp/read
Další sekvenační metody nové generace Ion Torrent (2010) Sekvenování na polovodičovém čipu Pacific Bioscience (2010) Single molecul real- time sequencing Není třeba PCR Sekvence čtena přímo při procesu replikace DNA pomocí DNA polymerázy používající fluorescenčně značené nukleotidy Dlouhé sekvence (860-1500bp) Oxford Nanopore (2012) Single molecul sequencing Báze DNA jsou určeny na základě elektrické vodivosti při průchodu nanopórem
GS Junior System je představitelem laboratorního sekvenátoru, který přináší všechny výhody sekvenování nové generace ( next-generation sequencing, NGS) je založen na ověřené 454 technologii pyrosekvenování umožňuje velmi rychle (za cca. 12 hodin) osekvenovat stovky úseků DNA pocházejících od různých pacientů 100 000 čtení v jednom běhu 35 milionů bazí v jednom běhu
Kritická místa
Příprava knihovny 1.Vzorek genomové DNA rozštěpen do krátkých (300-800 bp) fragmentů. Vzorek DNA je vložen do nebulizéru, ve kterém je DNA řetězec vlivem stlačeného vzduchu (220,6 kpa po dobu 6 minut) rozdělen na menší fragmenty Nebulizace je reprodukovatelná technika, která není závislá na sekvenci DNA a zároveň je rychlá a levná. Pro menší vzorky jako např. malé nekódující RNA nebo amplikony PCR není nutná fragmentace. 2. Konce fragmentů jsou opravovány enzymatickou reakcí. 3. Příprava DNA knihovny. Mezi standardní molekulárně biologické techniky patří specifické připojení krátkých adaptérů A a B na 3 a 5 -konec každého odděleného úseku DNA. Adaptéry jsou důležité pro čištění, amplifikaci a sekvenaci
kapilára Kalibrační přímka koncentrace standardu ng/µl fluorescence 1 1 99.87 2 0.5 67.38 3 0.25 41.9 4 0.125 30.88 5 0.0625 16.19 6 0.03125 13.6 7 0.015625 7.3 8 0 4.3 Kvantifikace knihovny vzorky fluorescence koncentrace ng/µl x 100 Délky (bp) počet molekul v µl µl TE 1 7.45 0.202 20.21 600 30897720432 29.89 2 10.75 0.237 23.70 600 36224913610 35.22 3 6.27 0.190 18.97 600 28992845296 27.99 4 13.55 0.267 26.66 600 40744956307 39.74 5 7.244 0.094 9.44 600 14429784291 13.42 6 5.402 0.181 18.05 600 27591632060 26.59 7 3.785 0.163 16.34 600 24981307403 23.98 8 4.905 0.175 17.53 600 26789324481 25.78 9 4.1 0.167 16.68 600 25489812206 24.48 10 57.23 0.728 72.78 600 1.11258E+11 110.25 11 36.08 0.504 50.45 600 77115157004 76.12 12 50.2 0.516 65.36 600 99909086601 98.91 Hodnoty fluorescence vzorků, vypočítané koncentrace, počet molekul v μl a množství TE pufru pro dosažení koncentrace 10 9 kopií/μl. Koncentrace a hodnoty fluorescence standardů
Kontrola obohacení cílové sekvence Hybridization-based capture sequencing-seqcap Model analýzy kontroly obohacení cílové sekvence pomocí qpcr. Data QF PCR kontroly obohacení generovaná LightCycler 480 Instrument. Pro oblast cílové sekvence hodnoty Cp z QF PCR z amplifikované zachycené cílové DNA (CAP-Cp RYR1 ) byly signifikantně nižší než hodnoty Cp z QF PCR amplifikované knihovny vzorků fragmentované celkové DNA (NON-Cp RYR1 ). Naopak pro oblast kontrolní hodnoty Cp z QF PCR amplifikované zachycené DNA CAP-Cp NF1 ) byly signifikantně vyšší než hodnoty Cp z QF PCR amplifikované knihovny vzorků fragmentované celkové DNA (NON-Cp NF1 ).
Výsledek emulzní PCR Doporučené množství pro sekvenování na GS Junior je 500 000 obohacených kuliček. Stanovení množství obohacených kuliček bylo provedeno pomocí počítače GS Junior Bead Counter. Spodní okraj okna počítače definuje 500000 kuliček a horní hrana definuje 2000000 kuliček. V okénku počítače u dolní rysky byl vidět vrch peletky navázaných kuliček, což ukazuje, že množství obohacených kuliček je dostačující pro sekvenaci (cca 500 000 obohacených kuliček).
A B C A Graficky znázorněný průběh pyrosekvenační reakce B Záznam CCD kamery, zeleně svítí jamky, kde probíhá sekvenační reakce C detail záznamu CCD kamery
Kontrola počtu čtení jednotlivých vzorků
Vedlejší škody NGS: způsobuje obrovské hromadění dat, vyžadující výpočetní biology a bioinformatiky http://biocomicals.blogspot.cz/2011/05/collateral-damage-of-next-generation.html
Analýza dat Sekvenační jsou byla analyzována pomocí softwaru Sequence Pilot (SeqNext module, JSI Medical Systems).
Autosomálně dominantní Frekvence 1:3000 Lokus 17q 50% mutací de novo Neurofibromatoza typu 1 von Recklinhausen disease Predispozice k tumorům nervového systému NF1 gen - 350 kb - 60 exonů - 11-13 kb mrna Protein neurofibromin - 2818 aminokyselin - tumor supresor Lisch nodule Café-au- lait spots Neurofibromy absence hot spot oblastí - nutnost vyhledávání mutací v celém genu
Amplikonové sekvenování Neurofibromatosa typu 1 - Testováno 9 pacientů v jednom běhu - Průměrné pokrytí exonů je 44 z 58 - Záchyt kauzální mutace u 66% pacientů z 45 analyzovaných - U pacientů bez nálezu mutace bylo sekvenováno zbývajících 9 exonů metodou Sangerova sekvenování, mutace nebyla nalezena Všechny mutace objevené 4-5-4 sekvenováním byly potvrzeny klasickou sekvenací
Srovnání finančních nákladů Sangerova metoda x NGS Sanger NGS univerzální adaptor fúzní primery 39 402 6 744 4 111
Retinoblastom zhoubný nádor oka, pocházející z primitivních buněk sítnice incidence 1/5 000 až 1/20 000 živě narozených dětí manifestace do 5-ti let věku projevy: ztráta zrakové ostrosti, strabismus, leukokorie, slepota, zvětšování oka, zarudnutí, otok postižení: oko, mozek, mícha (může se šířit do CNS přes opticus) léčba: chemoterapie, lokální terapie (kryoterapie, nitrooční podání cytostatik), enukleace oka (oko je už většinou slepé, jde o život zachraňující výkon) úspěšnost léčby při zahájení: nádor uvnitř oka 95% mimo oblast oka 10%
Gen RB1 jediný známý gen asociovaný se vznikem retinoblastomu (RBL) lokalizace - 13q14.1-14.2 27 exonů, >180kb genomické DNA kóduje retinoblastomový tumorsupresorový protein,(prb,928 aa), významný negativní regulátor buněčného cyklu tumor-supresorová aktivita mutace RB1 gen inaktivace ztráta deregulace buněčného cyklu vznik retinoblastomu
Retinoblastom metodou 4-5-4 sekvenování Porovnání výsledků pomocí Sangerova sekvenování versus sekvenování nové generace na přístroji GS JUNIOR Pacient Rb1 na cdna (iz. z PK) nebyla zachycena mutace pomocí Sangera na DNA (iz. z PK) mutace zachycena pomocí Sangera na DNA i cdna (iz. z PK) zachycena mutace pomocí GS JUNIOR!!!
Retinoblastom metodou Sangerovo sekvenování RB1 gen: p.[r255x]+[=], c. [763C>T]+[=] DNA cdna
Retinoblastom metodou 4-5-4 sekvenování DNA
cdna Retinoblastom metodou 4-5-4 sekvenování cdna
RNA-antisense decay
Cystická fibróza U nás jedno z nejčastějších dědičných onemocnění s přibližným výskytem dle nových poznatků 1 na 5000 novorozených dětí. Onemocnění postihuje dýchací a zažívací systém postižených jedinců a je charakteristické tvorbou abnormálně hustého hlenu v těchto orgánech. Molekulární podstata choroby porucha v transportu iontů chlóru, sodíku a vody přes apikální membránu specializovaných epiteliálních buněk
CFTR gen lokalizován na chromozomu 7 (7q31) 250 kb dlouhý 27 exonů cdna sekvence dlouhá 6129 bp kóduje 1480 aminokyselin CFTR proteinu
Cystická fibróza Scoring nejčastějších mutací SSCP s pozitivními kontrolami analýza teploty tání s pozitivními kontrolami PCR s primery ohraničujícími předpokládané delece v DNA hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy PCR s alelově specifickými primery (ARMS test) Scanning raritních mutací jednořetězcový konformační polymorfismus (SSCP) denaturační gradientová elektroforéza analýza teploty tání sekvenování
Multiplex Amplification of Specific Targets for Resequencing (MASTR) using NGS Technolgy Mutační analýza CFTR genu sekvenací multiplexů za využití platformy NGS MASTR kombinace PCR primerů v ready-to-use kit,
The output of the software JSI, group evaluation (pool).
Coverage analysis 76 74 72 70 68 66 64 62 Coverage for bp 25-400 Average mean 40000 30000 run 1 69 20000 run 2 75 10000 run 3 67 0 1 2 3 Coverage for MIDs (MID1 MID8) 40000 30000 20000 10000 0 60000 40000 20000 run 1 1 2 3 4 5 6 7 8 run 2 1 2 3 4 5 6 7 8 run 3 MID 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Detected sequence changes in CFTR gene false positive true positive homopolymers CF causal mutation Variant Novel sequence change
Workflow NGS for analyzing CFTR DNA Next Generation Sequencing Target enrichment (CFTR MASTR Multiplicon) Target resequencing (454 Titanium Chemistry, GS Junior Roche) Data analysis Variant report Coverage report Filtering deletion and insertion in homopolymers coverage > 25 forward coverage or reverse coverage = 0. Coverage >25 Visual inspection Sanger sequencing
Variants in homopolymer sequences Mutation 2184delA wasn t detected, lies in 7-mer homopolymer tract
CFTRdele2,3(21kb) 1,0 100 90 80 70 60 0,5 50 40 30 20 10 0 Exon 3 1 2 3 4 5 6 7 8 calibrator Normalized amplicon valuee = Normalized amplicon valuee 0, 5 100 1,0 90 80 70 60 0,5 0,5 50 40 30 20 10 0 amplicon reads MID reads amplicon reads MID reads Exon 2 1 2 3 4 5 6 7 8 calibrator sample calibrator calibrators samples without 21kb deletions 0,5
Novel mutations c.2537_2547delinstcggtcacaagag, p.w846fs* c.729g>a, p.m243i c.2863t>c, p.s955p c.2537_2547delinstcggtcacaagag, p.w846fs* c.2863t>c, p.s955p
Sequence variation may be predicted to cause CF if: it introduces a premature termination signal (insertion, deletion or nonsense mutation) it alters the invariant nucleotide of intron splice sites absence of the sequence change from 100 control samples for exclusion of polymorphisms the sequence variant changes a highly evolutionarily conserved amino acid residue the sequence variation creates a novel/cryptic splice site Indirect evidence that a CFTR sequence variations does not cause CF is: the other allele is carrying a well know CF-causing mutation in a clearly asymptomatic individual a silent exonic sequence variation, without a priori splicing modification an intronic sequence variation outside the known consensus sites and which does not create a splicing site frequency in the general population equal to or above 0.4% Castellani et al, 2008
Nová mutace c.2537_2547delins
Nová missense mutace c.2863t>c, p. S955P
nová missense mutace c.2863t>c, p. S955P. p.[f508del]+[=] p.[=]+[s955p] p.[=]+[s955p] p.[f508del]+[s955p]
Maligní hypertermie exprimace život pacienta bezprostředně ohrožující komplikace celkové anestezie potenciálně letální farmakogenetická choroba manifestuje se na základě geneticky podmíněné dispozice s autozomálně dominantní dědičností po expozici tzv. vyvolávajících substancí. chromozom 19 poloha 19q13.1 počet exonů 106 velikost RYR 1 v kosterním svalstvu 15376nt počet AK v proteinu 5032 Za hlavní příčinu je považována porucha funkce ryanodinového receptoru RYR1 sval se změněnou funkcí RYR1 - vnímavý sval hmotnost proteinu 563,5kD
Mutační analýza genu RYR1 Mutace asociované s MH jsou nahromaděny ve třech mutačních hot spot oblastech. a Tetramerická struktura RYR uvolňujícího kanálu s membránovou topologií vyznačené v jedné podjednotce. b Distribuce více než 300 mutací asociovaných s MH (převzato Betzenhauser & Marks, 2010). Metody Scanning Mutační analýza hot spot RYR1 genu pomocí sekvenování na úrovni genomické DNA Mutační analýza hot spot RYR1 genu pomocí sekvenování na úrovni cdna Scoring Detekce mutací pomocí analýzy teploty tání MLPA
Maligní hypertermie Byly analyzovány celé kódující oblasti a přilehlé intronové oblasti (50bp) genu RYR1 na chromosomu 19 v oblasti 19:38,924,339-39,078,204 a genu CACNA1S na chromosomu 1 v oblasti 1:201008642-201081694. Celková délka analyzované oblasti je 36 559 bp.
Kalkulace Hybridization-based capture sekvenování genu RYR1 a CACN1S Kat. číslo Produkt cena s DPH počet reakcí cena s dph počet knihoven v cena s dph v balení za 1 reakci jednom běhu použité v běhu Příprava knihovny - produkty Roche 6740278001 SeqCap EZ Developer Library 4 Reaction 157300 50 3146 12 37752 5634261001 SeqCap EZ Hybridisation and wash kit 24 rxn 3079 24 128 2 257 5608228001 GS Rapid Library Prep Kit 44171 12 3681 12 44171 5619211001 GS Rapid Library MID Adap. Kit 45224 96 471 12 5653 5480647001 COT Human DNA, Fluorometric Grade 11929,39 100 119 1 119 4738284001 FastStart HiFi PCR System, dntpack 5190,9 50 104 14 1453 4707516001 LightCycler 480 SYBR Green I Master 12617,88 500 25 12 303 Příprava knihovny - produkty třetích stran 653-05 Dynabeads M-270 Streptavidin (Invitrogen) 9,995.00 2ml 500 3 1500 Drobný materiál: 0 NA qpcr QC oligos 0 NA Blocking oligos HE (IDT) 20000 50 100 12 1200 NA LM PCR oligos 3000 100 30 14 420 A63881 Agencourt AMPure XP Kit (Beckmann) 4900 5 ml 98 2 196 28106 QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen) 2740 50 54,8 14 767,2 5067-1506 Agilent DNA 7500 Kit (Agilent) 17622 12 1468,5 není potřeba NA Acetic Acid, glacial (Fisher scientific) 787,8 10000 0,07878 0 Sekvenování - produkty Roche 5996481001 GS Junior Titanium empcr Kit (Lib-L) 8129 1 8129 1 8129 5996619001 GS Junior Titanium PicoTiterPlate Kit 6927 1 6927 1 6927 5996554001 GS Junior Titanium Sequencing Kit 19073 1 19073 1 19073 Celkem celkem 127920 cena za 1 vzorek 10660 s 21% DPH
Výstup s hodnotícího softwaru JSI, skupinové hodnocení (pool).
Výstup s hodnotícího softwaru JSI, detekce mutace p.1041-2ma >IS v genu CACN1S.
Výstup s hodnotícího softwaru JSI, sekvenční změna v homopolymeru