STRATEGIE NEXT-GENERATION SEKVENOVÁNÍ PRO REALIZACI PROJEKTŮ MALÉHO AŽ STŘEDNÍHO ROZSAHU NÁVOD NA OBJEDNÁNÍ

Transkript

1 SHARESEQ STRATEGIE NEXT-GENERATION SEKVENOVÁNÍ PRO REALIZACI PROJEKTŮ MALÉHO AŽ STŘEDNÍHO ROZSAHU NÁVOD NA OBJEDNÁNÍ

2 OBSAH SHARESEQ - NEXT-GENERATION SEKVENAČNÍ PROTOKOL PRO REALIZACI PROJEKTŮ MALÉHO AŽ STŘEDNÍHO ROZSAHU... 3 Kolik ShareSeq stojí?... 3 VZORKY NA SHARESEQ... 4 Jaké vzorky můžu zaslat na ShareSeq?... 4 Můžu na ShareSeq zaslat genomovou DNA (např. virovou, bakteriální, kvasinkovou apod.)?... 4 Je ShareSeq vhodný pro sekvenování amplikonů / PCR produktů?... 4 Můžu na ShareSeq zaslat RNA?... 4 Kde najdu pokyny jak připravit vzorky na ShareSeq?... 4 PŘÍPRAVA SEKVENAČNÍCH KNIHOVEN... 5 Jakou metodu DNA fragmentace používáte?... 5 Jak funguje služba Efficient amplicon multiplexing?... 5 Co jsou to panely AmpliSeq?... 6 ALOKACE SEKVENAČNÍ KAPACITY... 8 Jakou kapacitu sekvenátoru si mám alokovat?... 8 Jaká je minimální a maximální kapacita, kterou si mohu alokovat?... 8 Maximální sekvenační kapacita ShareSequ mi nestačí, co můžu dělat?... 8 Garantujete objem dat, jaký získám?... 8 PROVEDENÍ SHARESEQ... 9 Co se s mými vzorky stane ve vaší laboratoři?... 9 Jak mám změřit koncentraci DNA?... 9 Co když moje vzorky neprojdou kontrolou kvality ve vaší laboratoři?... 9 Když objednávám ShareSeq, měl/a bych poskytnout nějaké doplňující údaje o vzorcích? VÝSLEDKY A ANALÝZA DAT Jak dlouho budu muset čekat na výsledky ShareSequ? Budou data, která dostanu, analyzovaná? Kde můžu získat detailnější informace o analýze dat v rámci ShareSeq? Jak dlouho uchováváte výsledky na svých serverech? PŘÍKLAD 1 - DE NOVO SEKVENOVÁNÍ VIROVÝCH GENOMŮ PŘÍKLAD 2 - MUTAČNÍ ANALÝZA KÓDUJÍCÍCH OBLASTÍ TUMORSUPRESOROVÝCH GENŮ BRCA1 A BRCA2 POMOCÍ PANELU AMPLISEQ BRCA1 A BRCA PŘÍKLAD 3 - MUTAČNÍ/SEKVENAČNÍ ANALÝZA NE/KÓDUJÍCÍCH CÍLOVÝCH OBLASTÍ VAŠEHO ZÁJMU V LIBOVOLNÉM ORGANISMU PAGE 2 VERSION

3 SHARESEQ - NEXT-GENERATION SEKVENAČNÍ PROTOKOL PRO REALIZACI PROJEKTŮ MALÉHO AŽ STŘEDNÍHO ROZSAHU ShareSeq je strategie Next-Generation sekvenování pro realizaci projektů malého až středního rozsahu za rozumné ceny. Jelikož disponují velmi vysokou kapacitou, generují vysokokapacitní sekvenátory obrovské objemy dat, To je nevyhnutelně spojeno s vysokými náklady a každý sekvenační projekt tudíž vyžaduje pečlivé plánování i provedení. Není žádnou výjimkou, že výzkumník má (z rozpočtových důvodů) možnost provést jen jeden běh Next-Generation sekvenování (NGS) pro otestování konkrétní hypotézy a nezdar takového běhu z jakýchkoliv důvodů může mít nemilé následky. ShareSeq je navržen právě s cílem odstranění těchto přirozených překážek a umožňuje provést i takové NGS projekty, které jsou rozpočtově limitovány, nebo projekty malého až středního rozsahu. ShareSeq je založen na principu kombinování vzorků pocházejících z různých zdrojů v jediném sekvenačním běhu, což umožňuje významné snížení nákladů na jednotlivé projekty, a přitom jsou zachovány všechny přednosti, které metoda Next-Generation sekvenování nabízí: velký objem sekvenačních dat (nicméně volitelný na základě individuálních požadavků), standardní protokoly přípravy sekvenačních knihoven, škálovatelnost, běžně používané formáty dat apod. Kolik ShareSeq stojí? Každý projekt ShareSeq je vždy naceněn individuálně v závislosti na počtu vzorků a požadavcích na sekvenaci a případně analýzu dat. Máte dvě možnosti: 1. Na stránce v části ShareSeq klikněte na možnost "Zvolit" a specifikujte detaily vašeho projektu, systém vám automaticky spočítá cenu. Abyste mohli tuto možnost využít, musíte být na našem webu registrováni, ale není třeba objednávku dokončit, cena se počítá průběžně a proces můžete kdykoliv přerušit. 2. Na stránce specifikujte detaily vašeho projektu v kalkulačce nákladů. Systém vám spočítá přibližnou cenu vašeho projektu ShareSeq. Doporučujeme využít první odkaz/možnost, poněvadž umožňuje přesnější specifikaci projektu a výpočet je tedy přesnější. Níže v sekci Příklady jsme pro vás připravili několik různých ShareSeq projektů, z nichž je zřejmé, jak ShareSeq efektivně využít. Jejich cenu si spočítejte sami podle postupu výše, jsme si jisti, že budete příjemně překvapeni. PAGE 3 VERSION

4 VZORKY NA SHARESEQ Jaké vzorky můžu zaslat na ShareSeq? V zásadě jakékoliv standardní typy templátů pro Next-generation sekvenování genomovou DNA, amplikony či jiné směsi DNA fragmentů (vlastní směsi, panely AmpliSeq apod.) nebo RNA. V jedné zakázce lze zaslat nejvýše 24 vzorků. Můžu na ShareSeq zaslat genomovou DNA (např. virovou, bakteriální, kvasinkovou apod.)? Rozhodně ano. Je ShareSeq vhodný pro sekvenování amplikonů / PCR produktů? Ano. To je naprosto perfektní způsob využití ShareSequ. Viz též možnost Efficient amplicon multiplexing níže. Můžu na ShareSeq zaslat RNA? Rozhodně ano. V objednávce musíte zvolit i doplňkovou službu Příprava RNA knihovny, případně včetně možnosti rrna deplece. Kde najdu pokyny, jak připravit vzorky na ShareSeq? V dokumentu Pokyny pro přípravu vzorků na našich webových stránkách. PAGE 4 VERSION

5 PŘÍPRAVA SEKVENAČNÍCH KNIHOVEN Jakou metodu DNA fragmentace používáte? ShareSeq je vhodný pro sekvenování jakýchkoliv DNA fragmentů do velikosti 250 bp. Této délky dosáhnete bez fragmentace v zásadě pouze tak, že nám zašlete PCR amplikony (<250 bp). Jiné DNA vzorky např. bakteriální chromozomální DNA musí být nejprve fragmentovány a následně získány fragmenty o správné velikosti, typicky na gelu. Tato služba je součástí přípravy knihovny vy zasíláte chromozomální (nebo jinou dlouhou ) DNA a my ji zpracujeme. Standardně používáme sonikaci, která se nám nejlépe osvědčila. Každopádně to může být věcí diskuze, pokud by to bylo potřeba. Jak funguje služba Efficient amplicon multiplexing? Jedná se o tu nejeekonomičtější možnost využití ShareSequ určenou pro sekvenování amplikonů. Uvažujme např. takovýto sekvenační projekt: Chcete sekvenovat 50 různých amplikonů z každého vzorku (pacienti, environmentální vzorky apod.) a vzorků máte 20. To je celkem 1000 amplikonů, které si připravíte. Použít na to metodu Sangerova sekvenování by bylo neúměrně nákladné. Trik je v tom, provést PCR pomocí primerů s našimi adaptéry. Každý primer (celkem 100 pro vašich 50 amplikonů) bude mít na 5 konci univerzální sekvenci (adapter CS1 na forward a CS2 na reverzním primeru). S těmito primery provedete PCR a získáte 1000 PCR amplikonů, které spojíte do 20 zkumavek (1 vzorek/pacient = 1 zkumavka = 50 PCR amplikonů). Všechny amplikony mají stejné 5 a 3 konce. Těchto 20 vzorků zašlete na ShareSeq. My provedeme fúzní multiplexní PCR pomocí primerů jejichž 3 konce odpovídají sekvencím adaptérů CS1 a CS2 a a na 5 koncích nesou specifické čárové kódy (barcody BC), pro každý vzorek unikátní (20 čárových kódů celkem). Poté všech 20 vzorků spojíme do jediné zkumavky a připravíme pouze jednu sekvenační knihovnu! Tatko vytvoříme a sekvenujeme komplexní směs 1000 amplikonů v jediné zkumavce, přičemž sekvenci každého z nich lze snadno identifikovat jednak podle čárového kódu a jednak podle jeho vlastní unikátní sekvence, díky níž následně alignuje s příslušnou oblastí referenční sekvence. PAGE 5 VERSION

6 Náklady takového projektu se počítají maximálně ve stovkách Eur! Viz též Příklady projektů dále. Sekvence: CS1: 5 -ACACTGACGACATGGTTCTACA-(AMPLIKON-SPECIFICKÝ FW PRIMER)-3 CS2: 5 -TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT-(AMPLIKON-SPECIFICKÝ RV PRIMER)-3 Co jsou to panely AmpliSeq a lze je analyzovat v rámci ShareSeq? Panely Ion AmpliSeq jsou soubory primerů určených k amplifikaci kódujících oblastí různých genů nebo oblastí genomu. Panelů AmpliSeq existuje celá řada, např. na dědičná či infekční onemocnění, pro výzkum rakoviny, BRCA geny a další. Kompletní seznam panelů je na webu technologie Ion AmpliSeq (Thermo Fisher Scientific). V případě zájmu o tuto službu nás prosím kontaktujte. PAGE 6 VERSION

7 Nabídka AmpliSeq panelů (stav v říjnu 2016, zdroj: ampliseq.com) AmpliSeq umožňuje jednoduchou, rychlou a cenově dostupnou amplifikaci specifických genů nebo oblastí genomu na principu ultramultiplexní PCR. PAGE 7 VERSION

8 ALOKACE SEKVENAČNÍ KAPACITY Jakou kapacitu sekvenátoru si mám alokovat? Alokace se odvíjí od celé řady faktorů např. počtu vzorků, průměrné délky fragmentů, celkové délky sekvenované oblasti, požadované hloubky čtení apod. Nelze dát obecné doporučení. Připravili jsme pro vás ale několik modelových příkladů, viz sekce Příklady dále. Zadáváte-li objednávku, bude automaticky spočítán přibližný objem dat, která reálně získáte (v megabázích) a můžete parametry objednávky ShareSeq upravit (změnit alokaci), aby to odpovídalo vašim představám. Jaká je minimální a maximální kapacita, kterou si mohu alokovat? Min. 1 milion, max. 70 miliónů readů na zakázku a minimálně readů na vzorek. Maximální sekvenační kapacita ShareSequ mi nestačí, co můžu dělat? Obraťte se na naše specialisty na adrese ngs@seqme.eu. Naše společnost nabízí kromě servisu ShareSeq i standardní next-generation sekvenování ne téměř všech dostupných platformách od společností Illumina, IonTorrent a Pacific Biosciences. Garantujete objem dat, jaký získám? Ne. Jsme schopni to pouze odhadnout. Ačkoliv vždy vyvíjíme maximální úsilí pro dosažení co nejlepšího výsledku, nikdy nemáme všechny faktory ovlivňující úspěch či neúspěch projektu plně pod kontrolou (např. kvalitu/čistotu vzorků). Kromě toho některé kroky v základní analýze dat ShareSeq Basic (příkladem je quality trimming) mají významný a dopředu neodhadnutelný vliv na množství získaných dat. Proto nemůžeme garantovat dosažení konkrétního objemu dat. Na druhé straně si na základě svých zkušeností dovolujeme být optimisté a jsme hrdi na to, že dodáváme klientům vysoké objemy velmi kvalitních dat, včetně ale nikoliv výhradně ShareSequ. PAGE 8 VERSION

9 PROVEDENÍ SHARESEQ Co se s mými vzorky stane ve vaší laboratoři? Prvním krokem je kontrola kvality (měření koncentrace, analýza na gelu či bioanalyzeru apod.). Pokud vzorky projdou kontrolou kvality, následuje příprava knihoven a sekvenování a případně analýza dat. Výsledná data nahrajeme na náš web, odkud si je ze svého uživatelského profilu můžete kdykoliv stáhnout (budete upozorněni automatickým em). Jak mám změřit koncentraci DNA? Prosím použijte měření na bázi fluorescence jako je Qubit nebo Picogreen assay, je specifické pro DNA. DNA můžete rovněž kvantifikovat na 1% agarózovém gelu porovnáním s velikostním standardem s deklarovanou koncentrací. ROZHODNĚ NEPOUŽÍVEJTE NANODROP pro měření koncentrace! UV-spektrofotometry jsou obecně nepřesné a Nanodrop je se svým nízkým objemem vzorku ta nejhorší varianta vůbec, jeho použití vede k významnému nadhodnocení množství DNA! Pro kontrolu koncentrace vašich vzorků vždy využijeme Qubit, takže pokud jej máte k dispozici, měla by to být vaše první volba! Co když moje vzorky neprojdou kontrolou kvality ve vaší laboratoři? Zásadním předpokladem úspěchu ShareSequ je, že dodáte dostatečné množství kvalitního materiálu. Pokud to není ten případ a vaše vzorky neprojdou kontrolou kvality, můžeme se na vás obrátit s žádostí o zaslání nových vzorků (musí být zaslány v podstatě obratem), můžeme zpracování vašeho projektu odložit, případně se i tak můžeme rozhodnout pokračovat přípravou knihoven (závisí to hlavně na tom, jak moc se parametry vašich vzorků liší od našich požadavků v dokumentu Pokyny pro přípravu vzorků), který je k dispozici na našich webových stránkách. Mějte prosím na paměti, že ShareSeq je založen na sdílení kapacity sekvenátoru, takže neprojdou-li vaše vzorky kontrolou kvality a musí se čekat na jejich opakované zaslání, mohlo by to zpozdit dodání dat i jiným klientům, což je situace, ke které nesmí dojít. Vyhražujeme si proto právo rozhodnout o dalším postupu výhradně sami. Dbejte prosím na to, aby vaše vzorky splňovaly požadavky našich Pokynů pro přípravu vzorků, předejdete tak zbytečným komplikacím. Opakovaná kontrola kvality je vždy zpoplatněna. PAGE 9 VERSION

10 Když objednávám ShareSeq, měl/a bych poskytnout nějaké doplňující údaje o vzorcích? Ano. Zadáváte-li objednávku, musíte zadat koncentraci a objem každého vzorku (minimální požadavky viz Pokyny pro přípravu vzorků). Musíte rovněž poskytnout doplňkové údaje o způsobu přípravy vzorků jako z jakého organizmu pocházejí, uvést metodu DNA izolace, zda byly opracovány RNázou, jak byla měřena koncentrace (Qubit, UV-spektrofotometr), atd. Velmi užitečné je, když přiložíte data dokumentující vaše vzorky (např. fotky gelů, výstupy bioanalyzeru). Objednáváte-li analýzu dat Mapování a odečet variant (ShareSeq Advanced) musíte rovněž nahrát referenční sekvenci (ve formátu FASTA, nejvýše jednu na celou zakázku). Všechna data jsou zadávána a soubory nahrávány online při objednání ShareSequ. PAGE 10 VERSION

11 VÝSLEDKY A ANALÝZA DAT Jak dlouho budu muset čekat na výsledky ShareSequ? Většinou několik týdnů (jako i u jiných projektů NGS). Pokud jste si objednali analýzu dat na zakázku ShareSeq Custom tak o něco déle. Budou data, která dostanu, analyzovaná? Záleží na tom, co si objednáte. Všechny vzorky vždy projdou analýzou ShareSeq Basic, což je povinná primární analýza dat, která je nedílnou součástí každého projektu, a jejím výstupem jsou soubory ve formátech UBAM nebo FASTQ. Pokud si neobjednáte další bioinformatické služby, dostanete tyto datové soubory. Objednáte-li si analýzu dat ShareSeq Advanced nebo ShareSeq Custom, budou výstupy záviset na všich požadavcích. Prosím kontaktujte nás. Rovněž doporučujeme vaší pozornosti vzorové zprávy o analýze dat na našem webu. Kde můžu získat detailnější informace o analýze dat v rámci ShareSeq? V dokumentu ShareSeq Data Analysis Technical Specification (pouze v anglické verzi). Jak dlouho uchováváte výsledky na svých serverech? Alespoň 60 dnů. Každopádně vám doporučujeme ihned poté, co je zakázka ukončena, si data stáhnout a vytvořit si záložní kopii, s kterou nebudete manipulovat. PAGE 11 VERSION

12 PŘÍKLAD 1 - DE NOVO SEKVENOVÁNÍ VIROVÝCH GENOMŮ Počet vzorků: 10 Typ vzorku: Virová genomická dsdna Velikost sekvenované oblasti (genomu): 0,03 Mb Průměrná délka fragmentu: 200 bp Hloubka čtení: 100x Jakou sekvenační kapacitu potřebujete: - Počet vzorků x Velikost sekvenované oblasti x Hloubka čtení = 10 x 0,03 Mb x100 = 30 Mb Co potřebujete objednat: Příprava knihoven: - Standardní příprava knihoven Alokace sekvenační kapacity: - 1 milión 200 bp readů teoreticky znamená 200 Mb dat a vy potřebujete 30 Mb. I když nelze očekávat, že byste dostali skutečně 200 Mb (náš odhad je v tomto případě spíše asi 150 Mb), je celkem zřejmé, že 1 milión readů je na tento ShareSeq projekt víc než dost. Analýza dat - V rámci ShareSeq Advanced nabízíme de novo assembly za fixní cenu na vzorek! PAGE 12 VERSION

13 PŘÍKLAD 2 - MUTAČNÍ ANALÝZA KÓDUJÍCÍCH OBLASTÍ TUMORSUPRESOROVÝCH GENŮ BRCA1 A BRCA2 POMOCÍ PANELU AMPLISEQ BRCA1 A BRCA2 Počet pacientů: 8 Typ vzorku: PCR produkty získané pomocí panelu AmpliSeq BRCA1 a BRCA2 Velikost sekvenované oblasti: 0,016 Mb Průměrná délka fragmentu: 150 bp Hloubka čtení: 2000x Jakou sekvenační kapacitu potřebujete: Počet vzorků x Velikost sekvenované oblasti x Hloubka čtení = 8 x 0,016 Mb x 2000 = 256 Mb Co potřebujete objednat: Příprava knihoven: - Standardní příprava knihoven - Příprava knihoven AmpliSeq Kontaktujte nás! Alokace sekvenační kapacity: - 1 milión 150 bp readů teoreticky znamená 150 Mb dat a vy potřebujete 256 Mb. Měli byste si objednat nejméně 2 milióny readů (což je v tomto případě teoreticky 300 Mb dat ale náš odhad je spíše 225 Mb), takže raději trochu víc cena za např. 2 milióny readů navíc (celkem 4 milióny) je totiž jen o málo vyšší a rozhodně to tedy stojí za zvážení. Analýza dat: - V rámci ShareSeq Advanced nabízíme analýzu Resekvenování / Cílené sekvenování za fixní cenu za vzorek pro každý vzorek od nás dostanete seznam variant (VCF soubor) a BAM soubor! PAGE 13 VERSION

14 PŘÍKLAD 3 - MUTAČNÍ/SEKVENAČNÍ ANALÝZA NE/KÓDUJÍCÍCH CÍLOVÝCH OBLASTÍ VAŠEHO ZÁJMU V LIBOVOLNÉM ORGANISMU Počet vzorků: 20 (50 amplikonů na vzorek) Typ vzorku: PCR produkty získané pomocí primerů s našimi adaptéry (adapter CS1 na forward a CS2 na reverzním primeru). S těmito primery provedete PCR a získáte 1000 PCR amplikonů, které spojíte do 20 zkumavek (1 vzorek = 1 zkumavka = 50 PCR amplikonů). Velikost sekvenované oblasti: 7,5 kb Průměrná délka fragmentu: 150 bp Hloubka čtení: 1000x Jakou sekvenační kapacitu potřebujete: Počet vzorků x Velikost sekvenované oblasti x Hloubka čtení = 20 x 7,5 kb x 1000 = 150 Mb Co potřebujete objednat: Příprava knihoven: - Standardní příprava knihoven - Efficient amplicon multiplexing Alokace sekvenační kapacity: - Nejnižší počet readů, jaký můžete objednat, je na vzorek (a 1 milión na zakázku). Pro 20 vzorků to je min. 2 milióny readů. 2 milióny 150 bp readů se teoreticky rovná 300 Mb dat, což je dvakrát víc, než teoreticky potřebujete. Analýza dat: - V rámci ShareSeq Advanced nabízíme analýzu Resekvenování / Cílené sekvenování za fixní cenu za vzorek pro každý vzorek od nás dostanete VCF a BAM soubor! PAGE 14 VERSION