Ionizace, iontové zdroje

Hmotnostní detekce v separačních metodách II. Iontové zdroje - Iontové zdroje pracující za sníženého tlaku: EI/CI - Iontové zdroje pracující za atmosferického tlaku: ESI, nano-esi, APCI, APPI Ionizace, iontové zdroje

Iontový zdroj Část hmotnostního spektrometru, ve které jsou generovány ionty v plynné fázi. Vzorek Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua Ionizace Proces, během kterého jsou neutrální molekuly, případně ionty v roztoku převedeny na ionty v plynné fázi Příklady ionizací: M + e - -> M + + 2e - (tvorba radikál kationtu v EI) M + e - -> M 2+ +3e - (vznik vícenásobně nabitých iontů v EI) M + h -> M + + e - (tvorba radikál kationtu v APPI) M + [BH] + -> [M+H] + + B (přenos protonu, CI, ESI, APCI) M + B -> [M-H] - + [BH] + (vznik negativně nabitých iontů v CI, ESI, APCI) M + X + -> [M+X] + (elektrofilní adice, kationizace, ESI, MALDI) molekulární ion (M + ) vs. molekulární adukt ([M+H] +, [M+Na] +, [M+NH 4 ] + )

Ionizační techniky Neexistuje univerzální ionizační technika pro všechny molekuly, pro různé typy sloučenin jsou vhodné různé ionizace, které vedou k molekulárním iontům nebo aduktům. ionizace měkká ionizace za sníženého tlaku tvrdá za atmosférického tlaku Rozdělení podle energie tvrdé ionizační techniky vysoce energetická ionizace, molekuly se rozpadají na fragmenty (EI, PB) měkké ionizační techniky málo energetické, vznikají hlavně molekulární adukty, minimální fragmentace (API techniky, MALDI) Rozdělení podle tlaku v iontovém zdroji: ionizace může probíhat za sníženého tlaku (EI, MALDI) nebo za atmosférického tlaku tzv. API techniky, MALDI Ionizační techniky ESI MALDI APCI: chemická ionizace za atmosférického tlaku molární hmotnost EI APCI APPI APPI: fotoionizace za atmosférického tlaku EI: elektronová ionizace ESI: ionizace elektrosprejem MALDI: ionizace za účasti matrice polarita

Iontové zdroje pracující za sníženého tlaku EI/CI Elektronová a chemická ionizace, EI a CI vlákno EI zdroje (filament) V EI módu molekuly interagují s elektrony (energie 70 ev) emitovanými ze žhaveného wolframového vlákna. Vznikají radikál-kationty (M + ), přebytek energie vede k jejich rozsáhlé fragmentaci. V CI módu je do ionového zdroje zaváděn reakční plyn, který interaguje s elektrony emitovanými z filamentu. Vzniká reaktivní plasma, která ionizuje analyt přenosem protonu ([M+H] + ). Fragmentace je silně potlačena.

Elektronová a chemická ionizace, EI a CI EI: M + e - -> M + + 2e - Ionizační energie IE: minimální množství energie, které musí být absorbováno neutrální molekulou aby došlo k ionizaci odstraněním elektronu. IE pro většinu molekul je v rozmezí 7-15 ev. Nejvyšší účinnost ionizace je kolem 70 ev. CI: M + [BH] + -> [M+H] + + B Protonová afinita PA: změna enthalpie spojená s protonizací (PA = - H r0 ). Protonizace (chemická ionizace) proběhne pouze pokud je reakce exotermní. Používané reakční plyny: methan, isobutan, amoniak. CH 4 CI: chemická ionizace s methanem tvorba reaktivních částic (např. CH 5+ ) CH 4 + e - -> CH + 4, CH + 3, CH + 2, CH +, C +, H + 2, H + CH + 4 + CH 4 -> CH + 5 + CH 3 Spektra EI a CI EI methionin CI

Knihovny EI spekter NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library Wiley Registry of Mass Spectral Data 276 248 EI spekter (70 ev) 234 284 MS/MS spekter, retenční indexy látek strukturní vzorce 719 000 spectra EI spekter (70 ev) strukturní vzorce Elektronová & chemická ionizace EI/CI iontový zdroj VG ZAB EQ

Elektronová & chemická ionizace EI/CI iontový zdroj Agilent - MSD Elektronová a chemická ionizace, EI, CI EI/CI je zdroj používaný pro GC/MS. Klasický způsob ionizace v organické MS. - poskytuje spektra, která jsou informačně obsažná, lze je interpretovat, prohledávat v databázích - dobrá kompatibilita s analyty vhodnými pro GC, vysoká citlivost, univerzální detekce EI někdy nelze určit ze spektra molekulovou hmotnost CI vyžaduje optimalizaci (výběr reakčního plynu a jeho tlaku) Využití: pro všechny analyty, které lze analyzovat pomocí GC

Elektronová a chemická ionizace, aplikace Př. identifikace organických látek v dechu kuřáka a nekuřáka metodou GC/Q-MS SPME 15 min, GC/MS, identifikace dle spekter, porovnání s knihovnou Nekuřák: ethanol, acetone, isoprene, carbon disulfide, 2- and 3-methylpentane, benzene, methylcyclopentane, hexane, toluene Kuřák- látky navíc: acetonitrile, furan, 3-methylfuran, 2,5-dimethylfuran, 2-butanone, octane, decane DOI 10.1002/bmc.1141 Elektronová a chemická ionizace, aplikace Př. Stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v odpadních vodách metodou GC/QqQMS/MS; SPE LODs < 0.1g/L Chromatogram směsi standardů DOI 10.1016/j.aca.2011.03.010

Studená elektronová ionizace Elektronová ionizace molekul, které jsou vibračně ochlazené supersonickou expanzí nosného plynu do vakua. Mobilní fáze z GC kolony je spolu s pomocným (make-up) plynem zavedena do trysky směřující do čerpaného prostoru (vakua). Dojde k expanzi plynu, při které se molekuly ochladí (zamrznou v určitém vibračním módu). Následuje ionizace elektrony ze žhaveného vlákna (filamentu). Výhody: vysoká intenzita molekulového píku rozdíly ve spektrech izomerů nižší šum, omezení chvostování píků způsobené zdrojem Studená elektronová ionizace http://www.avivanalytical.com/

Přímé spojení nanolc/ei-ms Mobilní fáze (300-500 nl/min) se zavádí přímo do iontového zdroje. Ve vysokém vakuu se tvoří aerosol dochází k rychlému odpaření rozpouštědla. Ve zdroji je vysoká teplota 300-400 C nutná ke kompenzaci výparného tepla. K ionizaci dochází v plynné fázi mechanismem EI (nedochází k CI). Vlastnosti - univerzální detektor pro malé molekuly - EI spektra (možnost porovnání s knihovnami) - ng citlivost v plném skenu (pg v SIM) Komerčně nedostupný A. Cappiello et al., http://en.wikipedia.org/ Iontové zdroje pracující za atmosférického tlaku ESI, nanoesi, APCI, APPI

HPLC/MS HPLC Hmotnostní spektrometr Data Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Zdroj vakua Iontové zdroje pro detekci v HPLC Iontové zdroje v LC/MS dle WOS Aplikační oblasti iontových zdrojů:

Sprejování mobilní fáze Společným prvkem technik ionizace za atmosférického tlaku je tvorba spreje. elektrickým polem (elektrosprej) sprejování pneumatické, za pomocí plynu vyhříváním kapiláry Vzájemné uspořádání sprejeru a vstupu do hmotnostního spektrometru (kóna, kapilára) ovlivňuje citlivost, velikost matričních efektů i robustnost systému. Iontová optika iontových zdrojů - maximalizace transportu iontů do analyzátoru / omezení vstupu neutrálních částic - účinná desolvatace / deklasterizace Účinnost přenosu iontů z iontového zdroje do MS zásadním způsobem ovlivňuje citlivost a dynamický rozsah spektrometru Skimmer (clona): kónická elektroda s otvorem, která odděluje oblasti s různým tlakem; vzorkování iontů ve spreji nebo v expanzním prostoru za štěrbinou Vyhřívaná vstupní kapilára: vyhřívaná trubice, která odděluje oblasti s různým tlakem Ztráty při převodu iontů z vyššího tlaku do nižšího v oblasti skimmeru (u ESI může být detekovaný iontový proud až o 3 řády nižší než generovaný).

Iontová optika iontových zdrojů Iontová nálevka (ion funnel) soustava prstencových elektrod s otvory, jejichž vnitřní průměr se postupně snižuje. Na elektrody se vkládá stejnosměrné a střídavé napětí ionty jsou kolizně ochlazeny, zaostřeny do úzkého svazku a účinně přeneseny dále do MS. Zvýšení citlivosti oproti skimmerům: 10x 30x Shaffer et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 1997, 11, 1813 1817; Firemní materiály Agilent, Bruker ELEKTROSPREJOVÁ IONIZACE

Elektrosprej Elektrosprej je jev, při kterém dochází ke zmlžení kapalné fáze na konci kapiláry pomocí elektrického pole za vzniku nabitých kapiček. Iontový zdroj pro elektrosprejovou ionizaci (ESI) Kapalný vzorek prochází kapilárou, na kterou je vloženo vysoké napětí. Intenzivní elektrické pole na konci kapiláry tvoří kónický meniskus, ze kterého se uvolňuje sprej vysoce nabitých kapiček. Odpařením rozpouštědla vznikají ionty. Tvorba elektrospreje 0 V kv 1 Výchozí stav (kapalina v kapiláře, napětí není vloženo) Vkládání napětí, postupně se zvyšuje intenzita el. pole. Nabité částice (ionty v roztoku) jsou vytahovány z kapiláry, zmenšuje se poloměr zakřivení menisku. kv 2 Při určité intenzitě el. pole (kv 2 >kv 1 ) se zakřivení menisku limitně blíží k nule a tvoří se stabilní Taylorův kužel Z Taylorova kužele se začnou okamžitě vypuzovat jemné nabité kapky, které se vzájemně odpuzují, neboť mají souhlasné náboje (kv 3 kv 2 ). kv 3

Tvorba elektrospreje Stabilní elektrosprej vzniká pouze v poměrně úzké oblasti pracovních parametrů, tj. zejména průtokové rychlosti kapaliny a vloženého napětí. Různé formy elektrospreje: a: kuželová tryska (Taylor cone-jet ) b, c: vícenásobná tryska při vyšším napětí a/nebo průtoku kapaliny) Při vysokém vloženém napětí může docházet ke koronovému výboji (zejména v negativní módu). Richard B. Cole, Electrospray and MALDI Mass Spectrometry, 2010

Tvorba elektrosprejových iontů Rozpouštědlo z malých (mikrometrových) kapiček se rychle odpařuje, roste nábojová hustota na povrchu kapek. Rayleighův limit - stav, kdy jsou odpudivé síly stejné jako povrchové napětí, které drží kapku pohromadě Zbytkový náboj (CRM, charged residue model ) Vypařování iontů (IEM ion evaporation model CRM se pravděpodobně uplatňuje u velkých molekul (proteiny), IEM spíše u malých.

Ionty vytvořené elektrosprejem Měkká ionizační technika (minimum fragmentace) - tvorba jedenkrát nabitých iontů [M + H] +, [M + Na] +, [M + NH 4 ] + (pozitivní mód) a [M H], [M + Cl] (negativní mód) v závislosti na složení mobilní fáze - - tvorba vícenásobně nabitých iontů [M + nh] n+, [M + nna] n+ (pozitivní mód) a [M nh] n (negativní mód) u látek s větším počtem polárních funkčních skupin, typicky biomakromolekuly proteiny, oligonukleotidy apod. malá molekula protein [M+H] + [M+15H] 15+ [M+14H] 14+ [2M+H] + [M+13H] 13+ [M+12H] 13+ Elektrosprejový iontový zdroj ESI zdroj Bruker ESI zdroj Sciex (Turbo V)

Technická řešení elektrospreje 1. sprejovací napětí vkládané na kapiláru - většina konstrukčních řešení 2. sprejovací napětí vkládané na vstupní čočku - výhodné pro CZE-MS 3. sprejovací napětí vkládané na impaktor (UniSpray) - nový typ iontového zdroje uvedený na trh v roce 2016 - ionizace širšího spektra látek Vlastnosti elektrospreje jednoduchý, s velmi širokou oblastí použití, díky tvorbě vícenásobně nabitých iontů umožňuje analyzovat velmi velké molekuly (proteiny apod.) omezená použitelnost pro nepolární mobilní fáze a nepolární analyty; při vyšších průtocích silné matriční efekty - koncentrační detektor pro vysoké průtoky, hmotnostní detektor pro nízké průtoky Varianty elektrospreje podle průtoků: Vysokoprůtokový (vyhřívaný) ESI (1000 3000 μl/min) Klasický ESI (1 1000 μl/min) Micro ESI (1 10 μl/min) Nano ESI (25 500 nl/min) Pozn: rozsah průtoků jen orientační

Nanoelektrosprej NanoESI (nanospray): varianta ESI pro submikrolitrové průtoky (spojení s nanohplc a CZE) - sprejovací kapiláry o velmi malém průměru (několik μm) - tvoří se menší kapky, které se rychleji odpařují; sprejer je blíže vstupní čočce, čímž se minimalizují ztráty vzorku - možnost sprejování z vody bez rizika výboje jako v případě ESI; tolerance k solím, menší potlačení signálu nečistotami - experimentální náročnost - množství konstrukčních řešení včetně mikrofabrikovaných sprejerů Nanoelektrosprej je používaný pro kapilární a nano-hplc/ms a CZE/MS. nanoelektrosprej Proxeon Nanoelektrosprej Při ESI se tvoří daleko větší kapky, musí se odpařit mnohem více rozpouštědla nečistoty (např. sůl) se více zakoncentrují v ESI než v nanoesi ESI (10 μm) nanoesi (1 μm) Inzulín v 10 mm NaCl v methanol/vodě Schmidt et al., J Am Soc Mass Spectrom. 2003 14(5):492

Využití nanoelektrospreje v proteomice Příklad: Analýza tryptického digestu cytochromu c chromatogram MS spektrum MS/MS spektrum Nejčastější využití nanoesi analýza proteinů po jejich enzymatickém štěpení na peptidy. Nanoelektrosprej ve formě čipu Čip = mikrofabrikovaná chromatografická kolona pro UHPLC, spojovací kapilára a nanoelektrosprejer (keramický materiál) Zdroj: Waters Čip = mikrofabrikovaná chromatografická kolona, spojovací kapilára a nanoelektrosprejer (polyimid); sendvičová struktura, čipy na zakázku Zdroj: Agilent

Nanoelektrosprej ve formě čipu Čip = křemíková destička s mikrofabrrikovanými sprejery a integrovanou SD kartou. Automatická změna sprejeru při zablokování. Zdroj: Advion Historie elektrospreje 1882 Teoretické základy elektrosprejového jevu - anglický fyzik Lord Rayleigh (1842 1919) - vypočítal množství náboje, které je možné umístit na kapku 1917 Experimentální studium elektrosprejového jevu - česko americký fyzik John Zeleny (1872 1951) - studoval vliv elektrického pole na meniskus kapaliny 1968 1989 1994 Iontový zdroj elektrosprej - americký chemik Malcolm Dole (1903 1990) - první použití elektrospreje, studium polymerů Elektrosprejová ionizace biomolekul - americký analytický chemik John B. Fenn (1917-2010) - spojení LC/ESI-MS pro biomolekuly, Nobelova cena 2002 Nanoelektrosprej - německý chemik Matthias Mann (1959 -) - působil u J. Fenna, vyvinul statický nanoelektrospray

CHEMICKÁ IONIZACE ZA ATMOSFERICKÉHO TLAKU Chemická ionizace za atmosférického tlaku Chemická ionizace je proces, při kterém se tvoří nabité částice v plynné fázi reakcí neutrálních částic s ionty. Iontový zdroj pro chemickou ionizaci za atmosférického tlaku (APCI) Kapalný vzorek je rozprašován do vyhřívané komůrky (až 400-500 C), ve které je zdroj elektronů typicky jehla s korónovým výbojem nebo β-zářič 63 Ni. Kaskádou reakcí zahrnující interakci elektronů se zmlžovacím plynem a reakce primárních iontů s rozpouštědly vznikají sekundární reakční ionty (např. (H 2 O) n H + ), které ionizují molekuly analytu.

Chemická ionizace za atmosférického tlaku Mechanismus tvorby iontů v APCI: kladně nabité ionty: přenos protonu, výměna náboje záporně nabité ionty: ztráta protonu, záchyt elektronu Ionty vytvořené při APCI Měkká ionizační technika (určitá fragmentace) - Ionty se sudým počtem elektronů: [M + H] +, [M + NH 4 ] +, produkty reakcí s rozpouštědly (pozitivní mód) a [M H] (negativní mód) - Ionty s lichým počtem elektronů: M +, produkty reakcí s rozpouštědly - fragmenty

Chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI Příklad: analýza triacylglycerolů v tukovém tělese čmeláků 150 mm + 300 mm NovaPak C18 J. Chromatogr.A, 1101, 226-237, 2006 Iontový zdroj pro APCI APCI zdroj Varian APCI zdroj Waters http://wp.ms-textbook.com/

Vlastnosti zdroje pro APCI jednoduchý, snadná kombinace s konvenční HPLC včetně možnosti použití nepolárních mobilních fází, oproti ESI využitelný pro méně polární analyty Nevhodná technika pro velmi polární a termálně nestálé sloučeniny - hmotnostně-sensitivní detektor - typické průtoky pro APCI: 100 2000 μl/min - Využití APCI: polární a méně polární tepelně stabilní sloučeniny s molekulovou hmotností do 1500 Da. Typické aplikace: analýzy pesticidů, léčiv a jejich metabolitů, nepolárních lipidů APCI při nízkých průtocích vzorku Komerční APCI zdroje jsou navrženy pro vysoký průtok vzorku vývoj zdroje pro (sub)mikrolitrové průtoky, kombinace s mikro-hplc - vyšší citlivost, nižší spotřeba vzorku - možnost ovlivnění ionizačních cest konstrukčním řešením zdroje otevřený zdroj uzavřený zdroj [M+H] + [M+H]+ M + Strmeň, Vrkoslav, Rumlová, Cvačka et al., nepublikováno

GC/APCI-MS McEwan and McCay, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 16, 1730 1738 (2005). APCI lze použít jako iontový zdroj pro GC. lze použít vyšší průtoky nosného plynu, rychlé přepínání polarit méně univerzální než EI (nelze ionizovat např. uhlovodíky), méně fragmentace, spektra nejsou vhodná pro srovnávání s EI knihovnami Stejně jako u LC/APCI vznikají molekulární adukty [M+H] +. Historie APCI 1966 Chemická ionizace - americký chemik M. S. Burnaby Munson (1933 ) - americký chemik Frank H. Field (1922 2013) 1973 První iontový zdroj pro APCI - americký chemik Evan C. Horning (1916 1993) - vývoj zdroje s 63 Ni, později (1975) s korónovým výbojem 1982 Vylepšený iontový zdroj pro APCI - americký chemik Jack D. Henion - APCI s vyhřívaným zmlžovačem, později komercionalizace ve spolupráci s fy SCIEX

FOTOIONIZACE ZA ATMOSFERICKÉHO TLAKU Fotoionizace za atmosférického tlaku Fotoionizace je proces, při kterém se tvoří ionty interakcí neutrálních částic s fotony. Iontový zdroj pro fotoionizaci za atmosférického tlaku (APPI) Kapalný vzorek je rozprašován do vyhřívané komůrky. VUV lampa je zdrojem fotonů (zhruba 120 nm, 10 ev), které interagují s molekulami analytu v plynné fázi za vzniku M + ; současně se mohou uplatňovat reakce přenosu protonu s rozpouštědlem. Do zdroje se může přivádět dopant s nízkou ionizační energií (toluen, aceton) ke zvýšení citlivosti detekce.

Role dopantu v APPI Přímá fotoionizace analytu (M) v APPI je většinou málo účinná -> pro zvýšení signálu se používá dopant (D) D + hv D + + e - M + D + M + + D fotoionizace dopantu IE D < energie fotonu charge exchange, výměna náboje; IE M < IE D v přítomnosti protického rozpouštědla (solvent S) se tvoří protonované molekuly D + + n S (D - H) + S n H + M + S n H + [M + H] + proton transfer, výměna protonu; PA S > PA D PA M > PA S Dopanty: aceton, chlorbenzen, toluen, anisol Kr 10.6 ev Ionty vytvořené při APPI Měkká ionizační technika (určitá fragmentace) - Ionty s lichým počtem elektronů: M +, produkty reakcí s rozpouštědly - Ionty se sudým počtem elektronů (zejména v přítomnosti dopantu): [M + H] +, produkty reakcí s rozpouštědly (pozitivní mód) a [M H] (negativní mód) - fragmenty carbamazepine diphenyl sulfide Robb et al., Anal. Chem. 2000, 72, 3653-3659

Vlastnosti zdroje pro APPI jednoduchý, snadná kombinace s konvenční HPLC včetně možnosti použití nepolárních mobilních fází, oproti APCI využitelný pro širší rozsah analytů. Širší lineární dynamický rozsah než APCI i ESI. Nevhodná technika pro termálně nestálé sloučeniny. Někdy současná tvorba M + a [M + H] +. - typické průtoky pro APPI: <100 1000 μl/min - Využití APPI: polární a méně polární tepelně stabilní sloučeniny s molekulovou hmotností do 1500 Da. Typické aplikace: analýzy aromátů a polyaromátů, steroidů, léčiv a jejich metabolitů, složek ropy Fotoionizace za atmosférického tlaku VUV lampy PhotoSpray zdroj SCIEX

Historie APPI 1973 Fotoionizační detektor (PID) - detekce těkavých látek po jejich ionizaci UV zářením - samostatné zařízení, později spojení s GC (1976) 1985 První použití APPI v hmotnostní spektrometrii - ruský chemik Igor A. Revel'skij (1936 ) - citlivá detekce par uhlovodíků v nosném plynu 2000 APPI-MS jako detektor pro kapalinovou chromatografii - holandský chemik Andries P. Bruins (1944 ) - Jack A. Syage, později komercionalizace (Syagen Inc.) Kombinované (duální) iontové zdroje: ESI + APCI - současná detekce v módu ESI a APCI bez nutnosti přepínání zdroje - pro ionizace látek, které mají výrazně jiné citlivosti v ESI a APCI Př. Analýza vitamínů Zdroj: Agilent, Shimadzu

Kombinované (duální) iontové zdroje: APCI + APPI Př. Polycyklické látky - současná ionizace v módu APCI a APPI může zvyšovat celkovou odezvu detektoru Zdroj: Thermo