UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové. DSC studium lipidických systémů II

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické technologie DSC studium lipidických systémů II DIPLOMOVÁ PRÁCE Vedoucí diplomové práce: RNDr. Marie Musilová, CSc. Hradec Králové 213 Veronika Bucharová

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové dne: Podpis:

Děkuji vedoucí diplomové práce RNDr. Marii Musilové, CSc. za odborné vedení, všestrannou pomoc, hodnotné rady a veškerý čas, který mé práci věnovala.

Abstrakt Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické technologie Autor: Veronika Bucharová Školitel: RNDr. Marie Musilová, CSc. Název diplomové práce: DSC studium lipidických systémů II Tato práce se zabývá interakcí kožních lipidů s vodou. Lipidy (zejména ceramidy a cholesterol) vytváří spolu s vodou lamelární struktury, které jsou podstatou kožní bariéry. Pro vytvoření lipidické vrstvy jsme použili cholesterol a syntetický pseudoceramid 14S24, syntetizovaný na Katedře anorganické a organické chemie Farmaceutické fakulty v Hradci Králové. Poměr obou složek jsme zvolili tak, aby se cholesterol v roztaveném pseudoceramidu rozpouštěl a ani při ochlazování samostatně nekrystalizoval. Vzorky této směsi s vodou i bezvodé jsme hodnotili pomocí diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC). V kelímcích odolávajících vysokému vnitřnímu tlaku jsme vzorky opakovaně zahřívali nad a pod teplotu tání a tuhnutí směsi a sledovali jsme změny kalorimetrických charakteristik, které mohou svědčit o interakci lipidické směsi s vodou. Zjistili jsme, že po přidání vody ke směsi cholesterolu a pseudoceramidu dochází k výraznému snížení hodnoty tepla tání inkorporované vody, což poukazuje na interakci směsi s vodou.

Abstract Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Technology Author: Veronika Bucharová Supervisor: RNDr. Marie Musilová, CSc. Title of diploma thesis: DSC study of lipid systems II This work deals with the interaction of skin lipids and water. The epidermal lipids (especially ceramides and cholesterol) and water create together lamellar structure which is the essence of the skin barrier. To create a lipid layer we used a cholesterol and a synthetic pseudoceramide 14S24 (synthesized at the Department of Inorganic and Organic Chemistry, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové). The ratio of these two components is chosen so that the cholesterol in the molten pseudoceramide dissolves and during cooling down doesn t separately crystallize. Samples of this mixture with water and without water were evaluated by using differential scanning calorimetry (DSC). The samples were in high-pressure sample crucibles repeatedly heated up above and below the melting point and congealing of the mixture. We watched the changes of calorimetric characteristic that may be indicative of interaction lipid mixtures with water. We find out that value of heat of melting for inserted water decreases after adding water to mixture of cholesterol and pseudoceramide. It shows on interaction of lipid components with water.

Obsah 1 Zadání práce... 7 2 Úvod... 8 3 Teoretická část... 9 3.1 Kožní bariéra... 9 3.2 Průnik kožní bariérou... 12 3.3 Transdermální aplikační systémy... 15 3.3.1 První generace transdermálních aplikačních systémů... 15 3.3.2 Druhá generace transdermálních aplikačních systémů... 15 3.3.3 Třetí generace transdermálních aplikačních systémů... 17 4 Experimentální část... 19 4.1 Seznam použitých surovin... 19 4.2 Seznam použitých přístrojů... 2 4.3 Seznam použitých zkratek a symbolů... 21 4.4 Pracovní postup... 22 4.5 Výsledky měření... 24 5 Diskuze... 67 6 Závěr... 72 7 Seznam literatury... 73

1 Zadání práce Tato práce se týká kožních lipidů. Hlavní složkou kožních lipidů jsou ceramidy a cholesterol. Tyto dvě hlavní komponenty spolu s dalšími potom s vodou vytváří lipidické vrstvy, které jsou součástí kožní bariéry. Pro vytvoření lipidické vrstvy se v pokusech in vitro vedle přírodních ceramidů používají i syntetizované pseudoceramidy. V této práci se bude pracovat s cholesterolem, pseudoceramidem 14S24, syntetizovaným na Katedře anorganické a organické chemie Farmaceutické fakulty v Hradci Králové a originálním ceramidem, N-acetyl-D-sfingosinem. Složení lipidické směsi použijeme takové, aby v teplotách kolem 9 C nebyl v tavenině přítomný krystalický cholesterol. Poměr složek zvolíme na základě výsledků předcházející práce. Homogenní směs lipidů bude připravena na vakuové odparce. Vlastní měření proběhne na DSC v kelímcích odolávajících vysokému vnitřnímu tlaku. Vzorky s vodou i bezvodé budou opakovaně zahřívány nad a pod teplotu tání a tuhnutí směsi, dokud opakované záznamy DSC nebudou shodné. Za stejných podmínek změříme čtyři vzorky: homogenní bezvodou směs, suspenzi homogenní směsi s vodou, vzorek připravený přidáním vody k homogenní směsi opakovaně zahřívané a chlazené a vzorek obsahující vodu, cholesterol a N-acetyl-D-sfingosin. Porovnáme změny záznamu DSC v závislosti na opakovaném zahřívání a chlazení a rozdíly mezi jednotlivými vzorky. U hydratovaných vzorků bude dále zjišťována přítomnost volné a krystalické vody v lipidové vrstvě a přítomnost stabilních a nestabilních forem lipidické vrstvy. Výstupem práce bude konstatování, zda změny, ke kterým dochází v přítomnosti vody, jsou způsobeny hydratací, či pouze opakovaným zahříváním a chlazením. 7

2 Úvod Kůže představuje pro organismus ochranný a regulační orgán, který lze také využít k podávání léčiv s místním i systémovým účinkem. Transdermální aplikace léčiv poskytuje pacientovi celou řadu výhod a tvoří tak zajímavou cestu pro podání léčiva do organismu. Takto aplikované léčivo např. nedráždí trávicí trakt, obchází jaterní first-pass metabolismus a může se delší dobu pozvolně uvolňovat, čímž se prodlouží interval aplikace. Pro pochopení přestupu látek přes kůži a rozšíření palety transdermálně aplikovatelných léčiv jsou základem detailní znalosti stavby kůže. V bariérové funkci kůže hraje zásadní roli její povrchová vrstva stratum corneum. Ta je tvořena korneocyty a mezibuněčnou lipidovou hmotou. Lipidová hmota obsahuje kožní lipidy, zejména ceramidy a cholesterol, které spolu s vodou vytváří lamelární struktury. Vzniklá struktura je nezbytná pro zajištění správné funkce kožní bariéry. Tato práce navazuje na sérii prací, které se zabývají lipidickou vrstvou kůže. Zaměřuje se na interakci kožních lipidů s vodou a tvorbu hydratované lamelární struktury. 8

3 Teoretická část 3.1 Kožní bariéra Kůže je zevní orgán lidského těla, který pokrývá povrch organismu a vytváří tak bariéru mezi organismem a vnějším prostředím. Ochraňuje organismus před fyzikálními, chemickými a mikrobiologickými škodlivinami z okolí, reguluje tělesnou teplotu a zabraňuje ztrátám vody z organismu. [1,2] Bariérovou funkci zprostředkovává především epidermis prostřednictvím nejsvrchnější vrstvy kůže, která se nazývá stratum corneum, neboli rohová vrstva. Tato vrstva je tvořena korneocyty a mezibuněčnou lipidovou hmotou. Struktura, kterou tyto dvě zcela odlišné části rohové vrstvy vytvářejí, je obvykle popisována jako cihly a malta. Přičemž bezjaderné korneocyty představují cihly a lipidická složka je nazývána maltou. [2] Obě stavební složky vznikají diferenciací keratinocytů, jejíž schéma je zobrazeno na obrázku č. 1. Obr. č. 1 Schéma epidermální diferenciace [3] 9

Buňky lidské pokožky se neustále pravidelně obměňují. Od svého vzniku až do odloučení putují keratinocyty několika epidermálními vrstvami. Nové buňky vznikají mitózou ve stratum basale, pak postupně procházejí stratum spinosum a stratum granulosum, kde keratinocyty ztrácí jádra, poté postupují stratum lucidum a stratum corneum, až se z jejího povrchu nakonec odlučují do prostředí. Celý tento proces trvá přibližně 4 týdny. Stratum lucidum někde není viditelná. Nejpatrnější je v místech s tlustší pokožkou (na dlaních a ploskách nohou). [1,4] Jak již bylo uvedeno, funkci kožní bariéry zajišťuje stratum corneum skládající se z korneocytů a lipidové matrix. Korneocyty jsou bezjaderné buňky vyplněné keratinem. Pod jejich cytoplazmatickou membránou se nachází korneocytální obálka. Jedná se o strukturu tvořenou silnou proteinovou vrstvou, na níž se z vnější strany váže pomocí kovalentních vazeb vrstva ceramidů. Tato vrstva tvoří základ pro následné připojení volných ceramidů, volných mastných kyselin a cholesterolu. [5,6] Již ve stratum spinosum se v keratinocytech vytvářejí oválná lamelosní tělíska (Odlandova tělíska), která jsou vyplněna lipidy. Tělíska putují k cytoplazmatické membráně keratinocytů a na rozhraní stratum granulosum a stratum corneum dochází k jejich spojení s membránou a následnému uvolnění lipidického obsahu do mezibuněčného prostoru. Mezibuněčné prostory vyplněné hmotou bohatou na proteoglykany jsou až do úrovně stratum granulosum propustné i pro makromolekulární látky. Po uvolnění obsahu Odlandových tělísek dochází k tvorbě lipidových lamel, které promění mezibuněčné prostory v nepropustnou lipidovou matrix. [1,5] Lipidová matrix tvoří kromě bariéry propustnosti také fyzickou překážku pro prostup mikroorganismů, dodává antimikrobiálně působící látky (defensiny a cathelicidiny) a má antioxidační funkce. Korneocyty naproti tomu představují ochranu před UV zářením, působí jako mechanická překážka a zajišťují hydrataci stratum corneum. Regulace těchto ochranných funkcí spolu úzce souvisí. Lokalizaci ochranných funkcí ve stratum corneum představuje obrázek č. 2. [2] 1

Obr. č. 2 Lokalizace různých ochranných funkcí ve stratum corneum [2] Poškození kožní bariéry umožňuje vstup alergenů, následné imunologické reakce a zánět. Narušení bariéry mohou vyvolat změny ve složení kožních lipidů či procesu epidermální diferenciace. Tyto změny hrají důležitou roli v patogenezi některých kožních onemocnění, např. kontaktní dermatitidy, ichtyózy, lupénky a atopické dermatitidy. [6] 11

3.2 Průnik kožní bariérou V roce 1979 schválila FDA ve Spojených státech amerických náplast, která zajišťovala třídenní dodávání skopolaminu při léčbě cestovních nevolností. O deset let později zviditelnily transdermální podávání léčiv pro širokou veřejnost nikotinové náplasti. [7] Transdermální podávání představuje zajímavou možnost dopravy léčiva do organismu. Oproti jiným cestám podání má řadu výhod. Obchází např. jaterní first-pass metabolismus, což umožní snížení dávky podávaného léčiva. Přičemž nižší dávkování obvykle vede i ke snížení nežádoucích účinků. Na rozdíl od perorálního podání není vstřebávání transdermálně podaného léčiva ovlivněno momentální žaludeční náplní, léčivo nedráždí sliznice trávicího traktu a v případě potřeby máme možnost rychlého přerušení přísunu léčiva (např. při alergické reakci). [7,8,9] Výhody má transdermální podávání i oproti injekční aplikaci. Ta je bolestivá a vytváří nebezpečný zdravotnický odpad. Zejména v rozvojových zemích hrozí riziko opakovaného použití jehly, jehož prostřednictvím může dojít k přenosu chorob. Naproti tomu jsou transdermální systémy neinvazivní, mohou uvolňovat léčivo po delší dobu (až jeden týden) a zlepšují compliance pacienta. [7,1] Látky mohou vstoupit do kůže třemi různými cestami: 1.) Intercelulární cesta vedoucí přes lipidovou matrix vyplňující mezibuněčné prostory korneocytů, 2.) Intracelulární cesta procházející přes korneocyty, 3.) Cesta přes kožní adnexa (vlasové folikuly a mazové a potní žlázy). [1] Intracelulární průnik léčiv do kůže a kůží je poměrně problematický. Usnadněn může být zvýšenou hydratací stratum corneum. Nárůst obsahu vody je možný, jelikož v korneocytech se nalézá velké množství hydrofilních aminokyselin, které obsahují funkční skupiny ( COOH, NH 2, OH) schopné vodu vázat. Po navázání vody dojde ke zbobtnání korneocytů a rozvolnění lipidové matrix. Tím je kožní bariéra narušena, což umožňuje zvýšení průniku látek do kůže. Nadměrná hydratace pokožky ovšem také vede k porušení schopnosti trvale vodu vázat, a tím ke vzniku suché kůže. [11,12] Cesta přes kožní adnexa se také neosvědčila jako příliš výhodná. Adnexa zaprvé zaujímají na kůži pouze malou plochu, jen asi,1 % pokožky, což ovlivňuje množství 12

přijatého léčiva. A za druhé přestup s jejich pomocí vyžaduje od léčiv určité fyzikálněchemické vlastnosti, které ne každé léčivo splňuje. Průnik přes potní žlázy předpokládá velkou hydrofilitu a dostatečný koncentrační gradient. Pro prostup cestou mazové žlázy je naopak potřeba určitá lipofilita a hrozí, že léčiva se zde budou kumulovat. Bez komplikací není ani transfolikulární průnik. [11] Intercelulární cesta vedoucí přes lipidovou matrix se tedy ukázala jako nejpravděpodobnější cesta pro přestup léčiv. Výzkum se tedy zaměřil na lipidovou hmotu a průnik látek přes ni, protože jen detailní znalost tohoto prostoru umožňuje studium prostupu látek přes stratum corneum a rozvoj nových transdermálních systémů podávání léčiv. [1,13] Lipidová matrix je tvořena lipidy uspořádanými do lamelární struktury. Jsou zde zastoupeny ceramidy (přibližně 5 %), cholesterol (25 %), volné mastné kyseliny (1 %), cholesterol sulfát, estery cholesterolu a glukosylceramidy. Toto složení a uspořádaní je pro bariérové funkce stratum corneum velmi důležité. Největší zastoupení v lipidové složce mají ceramidy. Skládají se z bazického alkoholu (sfingosinu, fytosfingosinu, nebo 6-hydroxysfingosinu), který je amidovou vazbou připojen k mastné kyselině. Může to být nesubstituovaná mastná kyselina, nebo α-, či ω-hydroxykyselina. Pro stavbu lipidických lamel jsou nejdůležitější ceramidy tvořené sfingosinem a ω-hydroxykyselinou s 3 34 uhlíky. Další významnou složkou lipidové matrix je cholesterol. Zajišťuje určitou fluiditu membrány nezbytnou pro ohebnost kůže. Bez cholesterolu by membrána byla rigidní a křehká. Z volných mastných kyselin se ve stratum corneum vyskytují především kyseliny s 22 a 24 uhlíky (kyselina behenová a lignocerová). [11,13] Stratum corneum tedy představuje lipofilní bariéru, která obsahuje pouze 13 % vody. Směrem ke spodním vrstvám kůže se hydratace zvyšuje. Životaschopné vrstvy epidermis jsou již značně hydrofilní, obsahují více než 5 % vody. Dermis dokonce asi 7 % vody. Průnik léčiv přes kůži je ovlivněn jejich hydrofilitou či lipofilitou. Lipofilní látky se budou hromadit ve stratum corneum, zatímco hydrofilní látky nebudou moci proniknout bariérou a zůstanou na povrchu pokožky. Optimální prostup přes kůži je umožněn amfifilním látkám. [13] 13

Ke zvýšení průniku látek do kůže, nebo přes kůži se používají různé postupy, které budou uvedeny v následující kapitole. Jestliže se po průchodu kožní bariérou léčivo dostává pomocí cévního zásobení v dermis do systémové cirkulace, hovoříme o permeaci. Průnik a/nebo permeace je ovlivňován fyzikálně-chemickými vlastnostmi látky, závisí i na vehikulu, ve kterém je látka formulována a na interakci mezi vehikulem a kůží. [13] 14

3.3 Transdermální aplikační systémy Vývoj v oblasti transdermálních aplikačních systémů můžeme rozdělit do třech generací. První generace využívá k transdermální aplikaci pouze léčiva, která jsou schopna projít přes kožní bariéru samostatně bez zásadních úprav. Druhá generace již využívá určité prostředky ke zlepšení průniku léčiv přes stratum corneum. Použití látek nebo technik, které zvyšují kožní propustnost nebo dodávají potřebnou hnací sílu k permeaci, je ale stále ještě omezeno jen na přestup malých molekul. Teprve třetí generace aplikačních systémů přináší možnost transdermálního podávání malých molekul i makromolekul prostřednictvím cíleného ovlivnění propustnosti stratum corneum. [7] 3.3.1 První generace transdermálních aplikačních systémů První generaci reprezentují dnes běžně využívané transdermální náplasti. Používají se pouze taková léčiva, která jsou na základě svých vlastností schopna překonat kožní bariéru. K přestupu přes stratum corneum je zapotřebí dostatečná rozpustnost v tucích, vysoký rozdělovací koeficient a relativní molekulová hmotnost nepřesahující 5. Molekuly s větší relativní molekulovou hmotností než 5 kožní bariérou neprojdou. Omezeno je i množství podávaného léčiva. Použít lze pouze léčiva vyžadující miligramové a menší denní terapeutické dávky. [7,1] 3.3.2 Druhá generace transdermálních aplikačních systémů Snaha o rozšíření spektra transdermálně podávaných léčiv vedla k rozvoji metod usnadňujících průnik léčiv přes kůži. Tyto metody zahrnujeme do druhé generace transdermálních aplikačních systémů. Jedná se o prostředky, které mají reverzibilně narušit stratum corneum, dodat potřebnou hnací sílu k usnadnění přestupu přes kožní bariéru a zároveň chránit hlubší tkáně před poškozením. Mezi tyto metody řadíme aplikaci akcelerantů transdermální penetrace, iontoforézu a použití ultrazvuku. Jejich pomocí je dosaženo zlepšení permeace malých molekul, dopad na podávání makromolekul je však nízký. [7] Akceleranty transdermální penetrace Akceleranty transdermální penetrace (urychlovače) jsou látky vyvinuté ke zvýšení průniku látek přes kůži. Použitím těchto urychlovačů dochází k narušení bariérových 15

funkcí kůže, což usnadňuje přestup látek přes kůži. Akceleranty jsou schopny reagovat se strukturami pokožky. Jejich působením dochází k porušení lamelární struktury lipidové matrix a tím ke zlepšení penetrace látek. Akcelerant může reagovat i s intracelulárními proteiny pokožky a optimalizovat hodnotu rozdělovacího koeficientu léčiva. Kromě schopnosti narušit kožní bariéru by akceleranty měly splňovat obecné požadavky pro pomocné látky. Měly by být netoxické, nedráždivé, nealergizující, neměly by vykazovat vlastní farmakologický efekt a nesmí negativně ovlivňovat léčivo ani ostatní složky přípravku. [9] Iontoforéza Iontoforéza je technika, kterou lze využít k usnadnění průniku nabitých léčiv přes kožní bariéru. K prostupu ionizovaných molekul léčiva přes kůži dochází za pomoci průchodu stejnosměrného elektrického proudu mezi dvěma elektrodami. Množství elektrického proudu musí být malé, fyziologicky přijatelné (,5 ma/cm 2 nebo méně). Přestup látek přes kůži je založen na principu elektrostatického odpuzování. Využívá se toho, že kladně nabitá elektroda (anoda) odpuzuje kladně nabité látky a naopak záporně nabitá elektroda (katoda) odpuzuje záporně nabité látky. Rozpustíme-li např. kladně nabité léčivo v elektrolytu kolem anody, dojde k elektrostatickému odpuzování a anoda odrazí léčivo. Je-li současně na jiném místě těla umístěna katoda, dochází k pohybu léčiva ke katodě. Jelikož byla prokázána pouze nepatrná komunikace mezi elektrodami podél povrchu těla, je pohyb léčiva uskutečňován přes kůži. Z důvodu vytvoření správného kontaktu a zabránění popálení kůže musí být pokožka vlhká. Kromě elektrostatického odpuzování využívá iontoforéza ke zlepšení průniku léčiv přes stratum corneum ještě elektroosmózy. Jelikož je kůže při fyziologickém ph záporně nabitá, podporuje pohyb kationtů od anody. [14] Ultrazvuk Ultrazvuk je vlnění o frekvenci vyšší, než je slyšitelnost lidského ucha (nad 2 khz). Použití ultrazvuku k transdermálnímu podávání léčiv je běžně známé jako sonoforéza nebo fonoforéza. Ultrazvuk lze využít ke zlepšení průniku léčiv přes kožní bariéru dvěma způsoby. Je možné pokožku nejprve ošetřit pomocí ultrazvuku, zvýšit tak propustnost stratum corneum a až poté aplikovat léčivo, které bude přes porušenou pokožku lépe pronikat. Nebo léčivo může být obsaženo přímo ve spojovacím médiu při aplikaci ultrazvuku. Přičemž působením ultrazvuku by mohlo dojít k degradaci léčiva, proto je tento způsob méně častý. Podle použité frekvence rozlišujeme sonoforézu 16

vysokofrekvenční (,7 MHz) a nízkofrekvenční (2 1 khz). Obě metody jsou schopné zvýšit propustnost kůže, liší se ovšem v rozsahu jejího ovlivnění. Vysokofrekvenční sonoforéza vykazuje 1 1ti násobné zlepšení penetrace a je spíše využívána k usnadnění průniku léčiv do kůže. Zatímco nízkofrekvenční sonoforéza je ještě účinnější a díky spektru látek, jejichž permeaci usnadňuje je řazena do třetí generace transdermálních aplikačních systémů. [15] 3.3.3 Třetí generace transdermálních aplikačních systémů Techniky používané v rámci třetí generace ještě cíleněji ovlivňují kožní bariéru. Snaží se o efektivnější prostup léčiv prostřednictvím silnějšího narušení stratum corneum. Zároveň by ale stále neměly poškozovat hlubší tkáně. Jejich pomocí je docíleno transdermálního podání malých molekul i makromolekul, včetně proteinů a vakcín. Do této generace můžeme zařadit využití mikrojehel, kavitační ultrazvuk, elektroporaci, dermabrazi a termální ablaci. [7] Mikrojehly Mikrojehly jsou plné nebo duté jehličky s přibližnou délkou 5 9 μm a vnějším průměrem nejvýše 3 μm. Tyto tenké a krátké jehličky mohou být pro transdermální podávání léčiv aplikovány jako náplast. Pomocí mikrojehel dojde k narušení stratum corneum, což vede k usnadnění přestupu látek do kůže. S touto pomocí lze distribuovat i makromolekulární látky, např. inzulín, růstové hormony a další peptidy a proteiny. Mikrojehly jsou navrženy tak, aby pronikaly pouze do povrchových vrstev pokožky a nepronikaly do dermis. Tím je zajištěna bezbolestná aplikace, protože teprve v dermis se nacházejí nervová zakončení. Rozdělit lze mikrojehly do tří kategorií: plné, duté a rozložitelné. Podle toho mohou být vyrobeny ze skla, křemíku, titanu, nerezové oceli či různých biodegradabilních i nebiodegradabilních polymerů. Použití mikrojehel umožňuje zlepšit průnik léčiv přes stratum corneum. [16] Kavitační ultrazvuk Nízkofrekvenční sonoforéza umožňuje průnik hydrofilních i makromolekulárních léčiv přes kůži. Porušení kožní bariéry je dosaženo prostřednictvím akustické kavitace nad kůží. Dochází ke vzniku lokalizovaných transportních oblastí, které jsou propustnější než okolní stratum corneum. Dalšího zvýšení kožní propustnosti může být docíleno při kombinaci 17

nízkofrekvenční sonoforézy s povrchově aktivní látkou (např. laurylsulfát sodný). Tato kombinace umožňuje prostup hydrofilních látek i makromolekul, včetně bílkovin, hormonů, biopolymerů, vakcín, lipozomů, a dokonce i nanočástic. [17] Elektroporace Při elektroporaci dochází k přechodnému narušení kožní bariéry. Metoda je založena na použití vysokonapěťových elektrických impulzů, pomocí kterých se ve stratum corneum vytvářejí nanokanálky, kterými pak mohou snadněji prostupovat malé i velké molekuly látek. Aby nedošlo k narušení hlubších vrstev kůže, musí být elektrické impulzy velmi krátké (pouze mikrosekundy až milisekundy). [8,18] Dermabraze Dermabraze spočívá v odstranění povrchových odumřelých buněk pokožky pomocí mikrokrystalů přiváděných na povrch kůže. Exfoliace je tradičně používána v kosmetice. Běžně je využívána k léčbě akné, jizev a jiných kožních potíží. Odstraněním zrohovatělých buněk pokožky dojde ke zvýšení propustnosti kožní bariéry. Bylo prokázáno několikanásobné zlepšení průniku nízkomolekulárních látek, což umožňuje využít tuto metodu k usnadnění transdermálního podávání léčiv. [8] Termální ablace Termální ablace využívá externí zdroj tepelné energie, který po velmi krátkou dobu ohřívá povrch kůže na několik stovek stupňů Celsia, až dojde k odstranění stratum corneum. Zjistilo se, že povrch kůže je možné zahřívat 1 µs na teplotu 11 C, aniž by došlo k poškození živých epidermálních vrstev kůže. [8,19] 18

4 Experimentální část 4.1 Seznam použitých surovin 1. Cholesterol (C 27 H 46 O, M = 386,66) čistota 99 %, Sigma-Aldrich 2. Pseudoceramid 14S24 (M = 65,9) (tetradecylester kyseliny (S)-2-tetracosanoylamino-3-hydroxypropionové) Katedra anorganické a organické chemie, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové 3. N-acetyl-D-sfingosin (C 2 H 39 NO 3, M = 341,53) čistota 98 %, Sigma-Aldrich 4. Čištěná voda FaF HK 19

4.2 Seznam použitých přístrojů 1. DSC 2 F3 Maia diferenciální skenovací kalorimetr Výrobce: NETZSCH Gerätebau GmbH Selb, Německo Teplotní rozsah: -17 C +6 C Rychlost ohřevu:,1 K/min 1 K/min Chlazení: Intracooler 7 (kompresorové chlazení), NETZSCH, Německo Zahřívání: cirkulační topné těleso kolem senzoru Průtokový plyn N 2 2. Vysokotlaké kelímky Cr - Ni ocel, dno: šestiúhelník, šířka 6 mm Maximální vnitřní tlak: 1 bar (= 98,96 atm) Maximální teplota: 5 C Au těsnění Objem: 27 µl Výrobce: NETZSCH Gerätebau GmbH Selb, Německo 3. Zařízení pro uzavírání vysokotlakých kelímků Skládá se ze základní desky a nastavitelného dynamometrického klíče. Výrobce: NETZSCH Gerätebau GmbH Selb, Německo 4. Digitální analytické váhy OHAUS Discovery Výrobce: Ohaus Corporation, Pine Brook, USA 5. Vakuová odparka 6. Exsikátor (sorbent tvrdý parafín, pod vakuem) 2

4.3 Seznam použitých zkratek a symbolů = teplota v měřící komoře při vložení vzorku = izoterma = ohřev = chlazení P.T. = počátek tuhnutí 21

4.4 Pracovní postup V práci jsou uvedeny záznamy a vyhodnocení celkem šesti druhů vzorků. Vzorek značený voda byl připraven navážením 13,35 mg vody do měřícího kelímku. Jedná se o množství vody, které je přibližně stejné jako množství vody přidávané k dalším vzorkům. Vzorek označený jako pseudoceramid se připravil navážením 1,99 mg pseudoceramidu přímo do měřícího kelímku. Toto množství přibližně odpovídá množství pseudoceramidu v dále navažované lipidické směsi. Vzorek A byl připraven rozpuštěním pseudoceramidu (71,32 %) a cholesterolu (28,68 %) v prchavém rozpouštědle (acetonu), které bylo následně odpařeno na vakuové odparce. Poté byla odpařená směs 24 hodin uchovávána v exsikátoru nad tvrdým parafínem pod vakuem, aby se odstranily zbytky rozpouštědla. Tato směs pak byla navážena do měřícího kelímku. Vzorek B je vzorek A, který prošel několika cykly zahřívání a chlazení a potom k němu byla přidána voda. Při přípravě vzorku C 1 byla použita stejná lipidická směs jako v případě vzorku A. Směs byla navážena do měřícího kelímku a ihned k ní byla přidána voda. Před přidáním vody tedy nedošlo k roztavení směsi. Během prvního cyklu ohřevu vzorku C 1 došlo k úniku vody z měřícího kelímku. Původní obsah vody, který představoval 81,29 % hmotnosti vzorku, se snížil na 75,84 % hmotnosti vzorku. Tento vzorek s nižším množstvím vody je v práci uváděn jako vzorek C 2. Vzorek D byl připraven navážením originálního ceramidu, cholesterolu a vody přímo do měřícího kelímku (před přidáním vody nedošlo k roztavení lipidických složek). 22

Kelímky byly pomocí pinzety vkládány do přístroje DSC a měřeny při různých teplotních režimech. Režimy jsou uváděny u grafů záznamů měření. Přesné navážky a procentuální zastoupení jednotlivých složek ve vzorcích uvádí tabulka č. 1. Tabulka č. 1 Složení vzorků Vzorek Lipidická směs [mg] Lipidická směs [%] Celková Voda Voda navážka Chol. Pseudocer./Cer. Chol. Pseudocer./Cer. [mg] [%] [mg] A,83 2,5 28,68 71,32,, 2,88 B,83 2,5 28,68 71,32 16,61 85,22 19,49 C 1,87 2,15 28,68 71,32 13,12 81,29 16,14 C 2,87 2,15 28,68 71,32 9,48 75,84 12,5 D,91 5,7 13,77 86,23 5,46 45,24 12,7 23

4.5 Výsledky měření Graf č. 1 Záznam měření pseudoceramidu exo 8 6 4 2-2 -4-6 -8-1 5 1 15 2 Time /min Temp. / C 24 C, 5 min., 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Graf č. 2 Tání pseudoceramidu [1.16] exo 6 5 4 3 2 5. - Tmax: 88,4 C 4. - Tmax: 88,4 C 3. - Tmax: 88,4 C 2. - Tmax: 88,3 C 1. - Tmax: 88,7 C 7 75 8 85 9 24

Graf č. 3 Tuhnutí pseudoceramidu [1.17] exo -2-4 -6-8 -1-12 -14 5. - Tmax: 79,7 C 4. - Tmax: 79,7 C 3. - Tmax: 79,6 C 2. - Tmax: 79,6 C 1. - Tmax: 79,5 C -16-18 45 5 55 6 65 7 75 8 Tabulka č. 2 Teploty T max tuhnutí a tání pseudoceramidu Křivka T max tání [ C] T max tuhnutí [ C] 1. 88,7 79,5 2. 88,3 79,6 3. 88,4 79,6 4. 88,4 79,7 5. 88,4 79,7 25

Graf č. 4 Tání vody při rychlosti ohřevu 5 C/min. (ohřev od -5 C) exo 4.5 4. 3.5 3. 2.5 2. 1.5 1..5 onset: 2,5 C, Tmax: 9,1 C, plocha: 366,5 J/g -2-1 1 2 3 Graf č. 5 Tání vody při rychlosti ohřevu,3 C/min. (ohřev od -5 C) exo 1.2 1..8.6.4.2. onset: -,9 C, Tmax:,8 C, plocha: 344,8 J/g -15-1 -5 5 26

Graf č. 6 Srovnání tuhnutí vody 2 [1.2] exo -2-4 Voda - 2. chlazení - počátek tuhnutí: -17,2 C, Tmax1: -17,7 C, Tmax2: -25,3 C, plocha: -292,7 J/g Voda - 1. chlazení - počátek tuhnutí: -14,1 C, Tmax: -14,7 C, plocha: -32,8 J/g -6-8 -1-3 -2-1 1 27

Graf č. 7 Záznam měření vzorku A 1. cyklus exo 4 2-2 -4 Temp. / C 9 8 7 6 5 4 3 2 1 5 1 15 2 Time /min 26 C, 5 min., 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. Graf č. 8 Tání vzorku A 1. cyklus [1.16] exo 4. 3.5 3. 2.5 2. 1.5 1..5 5. - onset: 81,1 C, Tmax: 84,1 C, plocha: 85,26 J/g 4. - onset: 81,3 C, Tmax: 84,1 C, plocha: 85,77 J/g 3. - onset: 81,3 C, Tmax: 84,2 C, plocha: 85,46 J/g 2. - onset: 81,2 C, Tmax: 84,2 C, plocha: 85,2 J/g 1. - onset: 82,1 C, Tmax: 84, C, plocha: 84,21 J/g 6 65 7 75 8 85 28

Graf č. 9 Tuhnutí vzorku A 1. cyklus [1.17] exo 5. - P.T.: 73,9 C, Tmax: 71,8 C, plocha: -11,3 J/g -3-4 -5 4. - P.T.: 73,9 C, Tmax: 71,7 C, plocha: -11,8 J/g 3. - P.T.: 73,8 C, Tmax: 71,5 C, plocha: -111,2 J/g 2. - P.T.: 73,7 C, Tmax: 71,4 C, plocha: -111,3 J/g 1. - P.T.: 73,5 C, Tmax: 7,9 C, plocha: -112,1 J/g -6-7 45 5 55 6 65 7 75 Graf č. 1 Záznam měření vzorku A 2. cyklus exo 4 2-2 -4 Temp. / C 9 8 7 6 5 4 3 2 1-6 2 4 6 8 1 12 14 16 Time /min 24 C, 5 min., 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. 29

Graf č. 11 Tání vzorku A 2. cyklus [1.13] exo 4.5 4. 3.5 3. 2.5 4. - onset: 78,5 C, Tmax: 81,9 C, plocha: 14,2 J/g 3. - onset: 78,5 C, Tmax: 82, C, plocha: 15,2 J/g 2. - onset: 78,7 C, Tmax: 82, C, plocha: 13,7 J/g 1. - onset: 78,9 C, Tmax: 82,1 C, plocha: 1,3 J/g 55 6 65 7 75 8 85 Graf č. 12 Tuhnutí vzorku A 2. cyklus [1.14] exo -3 4. - P.T.: 7,5 C, Tmax: 68,5 C, plocha: -19,5 J/g -4 3. - P.T.: 7,6 C, Tmax: 68,6 C, plocha: -19,4 J/g -5 2. - P.T.: 7,8 C, Tmax: 68,8 C, plocha: -11,8 J/g -6 1. - P.T.: 7,9 C, Tmax: 68,9 C, plocha: -19,6 J/g -7-8 35 4 45 5 55 6 65 7 3

Graf č. 13 Záznam měření vzorku A 3. cyklus DSC /(µv/mg) exo 15 1 5-5 -1-15 Temp. / C 9 8 7 6 5 4 3 2 1-2 2 4 6 8 1 12 14 16 Time /min 24 C, 5 min., 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. Graf č. 14 Tání vzorku A 3. cyklus DSC /(µv/mg) [1.13] exo 15 14 13 12 11 1 9 8 7 4. - onset: 79,9 C, Tmax: 83,5 C 3. - onset: 8, C, Tmax: 83,5 C 2. - onset: 8,1 C, Tmax: 83,5 C 1. - onset: 8, C, Tmax: 83,6 C 5 55 6 65 7 75 8 85 9 31

Graf č. 15 Tuhnutí vzorku A 3. cyklus DSC /(µv/mg) [1.14] exo -1 4. - P.T.: 72, C, Tmax: 7, C -12 3. - P.T.: 72,1 C, Tmax: 7, C -14-16 -18 2. - P.T.: 72,1 C, Tmax: 7,1 C 1. - P.T.: 72,1 C, Tmax: 7,1 C -2-22 -24 4 45 5 55 6 65 7 75 Graf č. 16 Záznam měření vzorku A 4. cyklus exo 4 2-2 -4 Temp. / C 8 6 4 2-6 1 2 3 4 5 Time /min 23 C, 5 min., 5 C, 1 min., 9 C, C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. 32

Graf č. 17 Tání vzorku A 4. cyklus exo 4.8 4.6 4.4 4.2 4. 3.8 3.6 3.4 3.2 onset: 77,9 C, Tmax: 81,6 C, plocha: 17,4 J/g 55 6 65 7 75 8 85 Graf č. 18 Tuhnutí vzorku A 4. cyklus exo -3. -3.5 P.T.: 7,2 C, Tmax: 68,2 C, plocha: -15,5 J/g -4. -4.5-5. -5.5 35 4 45 5 55 6 65 7 33

Graf č. 19 Záznam měření vzorku A 5. cyklus 3 exo 2 1-1 -2 Temp. / C 14 12 1 8 6 4-3 5 1 15 2 25 Time /min 2 17 C, 5 min., 15 C, 15 C, 15 C, 15 C, 15 C, 15 C, 15 C, 15 C, 15 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. Graf č. 2 Tání vzorku A 5. cyklus [1.4] exo 1..5 5. - Tmax: 78,4 C, plocha: 74,18 J/g. 4. - Tmax: 79,5 C, plocha: 77,21 J/g 3. - Tmax: 8,4 C, plocha: 83,49 J/g -.5 2. - Tmax: 81,4 C Peak: 69.2 C, -.766 mw/mg -1. 1. - Tmax: 82,5 C, plocha: 91,54 J/g 5 6 7 8 9 34

Graf č. 21 Tuhnutí vzorku A 5. cyklus 1.5 [1.9] exo 1..5. -.5-1. 5. - P.T.: 53,3 C, Tmax: 52,1 C, plocha: -72,34 J/g 4. - P.T.: 55,1 C, Tmax: 53,5 C, plocha: -79,99 J/g 3. - P.T.: 6, C, Tmax: 57, C, plocha: -85,21 J/g 2. - P.T.: 62,2 C, Tmax: 6,4 C, plocha: -92,63 J/g 1. - P.T.: 63,9 C, Tmax: 62,2 C, plocha: -93,2 J/g -1.5-2. 3 4 5 6 7 8 9 1 Graf č. 22 Záznam měření vzorku A 6. cyklus exo 3 2 1-1 -2 Temp. / C 12 1 8 6 4-3 5 1 15 2 Time /min 2 24 C, 5 min., 13 C, 15 C, 13 C, 15 C, 13 C, 15 C, 13 C, 15 C, 13 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. 35

Graf č. 23 Tání vzorku A 6. cyklus [1.4] exo.4.2. -.2 -.4 -.6 -.8 Peak: 57.3 C, -.6624 mw/mg Peak: 57.3 C, -.6589 mw/mg Peak: 56. C, -.6586 mw/mg Peak: 54.6 C, -.6642 mw/mg 5. - Tmax: 75,4 C 4. - Tmax: 75,8 C 3. - Tmax: 76,3 C 2. - Tmax: 76,7 C 1. - Tmax: 77,1 C 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 Graf č. 24 Tuhnutí vzorku A 6. cyklus [1.11] exo.5 5. - Tmax: 47,1 C, A-B: 55,8 C-57,6 C 4. - Tmax: 48,4 C, A-B: 55,6 C-57,5 C 3. - Tmax: 49,6 C, A-B: 55,5 C-57,2 C. 2. - Tmax: 5,6 C, A-B: 52,9 C-54,4 C 1. - Tmax: 51,5 C, A-B: 53, C-54,7 C -.5 B A -1. 3 4 5 6 7 36

Graf č. 25 Záznam měření vzorku A 7. cyklus 3 exo 2 1-1 -2 Temp. / C 14 12 1 8 6 4 2-3 5 1 15 2 Time /min 14 C, 5 min., 15 C, 5 C, 15 C, 5 C, 15 C, 5 C, 15 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. Graf č. 26 Tání vzorku A 7. cyklus [1.8] exo -.4 Peak: 52.8 C, -.6529 mw/mg -.6 -.8-1. -1.2-1.4-1.6 Peak: 53. C, -.6986 mw/mg Peak: 52.9 C, -.6874 mw/mg Peak: 55.1 C, -.6732 mw/mg 4. - Tmax: 64,8 C 3. - Tmax: 65,8 C 2. - Tmax: 73,3 C 1. - Tmax: 75, C 4 5 6 7 8 9 1 11 37

Graf č. 27 Tuhnutí vzorku A 7. cyklus [1.9] exo.8.7.6.5.4.3.2 A 4. - A-B: 56,7 C-59,1 C 3. - A-B: 56,7 C-58,8 C 2. - A-B: 56,3 C-58,5 C 1. - A-B: 56,3 C-58,2 C.1 B 3 4 5 6 7 8 9 Graf č. 28 Srovnání vybraných ohřevů vzorku A [1.8] exo 28. ohřev (do 15 C) - Tmax: 64,8 C -1-2 2. ohřev (do 13 C) - Tmax: 75,4 C -3-4 14. ohřev (do 9 C) - Tmax: 81,6 C -5 1. ohřev (do 9 C) - Tmax: 84, C 4 5 6 7 8 9 38

Graf č. 29 Srovnání vybraných chlazení vzorku A (po ohřevu do 9 C) [4.5] exo -1-2 -3-4 -5-6 15. chlazení - Tmax: 68,2 C 1. chlazení - Tmax: 7,9 C -7-8 -9 4 45 5 55 6 65 7 75 Graf č. 3 Srovnání vybraných chlazení vzorku A (po ohřevu do 13 C/15 C) [1.7] exo 2. 1.5 1. 26. chlazení - Tmax: 48, C.5. 23. chlazení - Tmax: 48,4 C -.5-1. 2 3 4 5 6 39

Tabulka č. 3 Teplotní charakteristiky tání všech cyklů měření vzorku A Cyklus Tání Onset [ C] T max [ C] ΔH [J/g] 1. (ohřev do 9 C) 2. (ohřev do 9 C) 3. (ohřev do 9 C) 4. (ohřev do 9 C) 5. (ohřev do 15 C) 6. (ohřev do 13 C) 7. (ohřev do 15 C) 1. 82,1 84, 84,21 2. 81,2 84,2 85,2 3. 81,3 84,2 85,46 4. 81,3 84,1 85,77 5. 81,1 84,1 85,26 1. (6.) 78,9 82,1 1,3 2. (7.) 78,7 82, 13,7 3. (8.) 78,5 82, 15,2 4. (9.) 78,5 81,9 14,2 1. (1.) 8, 83,6 nelze hodnotit 2. (11.) 8,1 83,5 nelze hodnotit 3. (12.) 8, 83,5 nelze hodnotit 4. (13.) 79,9 83,5 nelze hodnotit 1. (14.) 77,9 81,6 17,4 1. (15.) nelze hodnotit 82,5 91,54 2. (16.) nelze hodnotit 81,4 nelze hodnotit 3. (17.) nelze hodnotit 8,4 83,49 4. (18.) nelze hodnotit 79,5 77,21 5. (19.) nelze hodnotit 78,4 74,18 1. (2.) nelze hodnotit 77,1 nelze hodnotit 2. (21.) nelze hodnotit 76,7 nelze hodnotit 3. (22.) nelze hodnotit 76,3 nelze hodnotit 4. (23.) nelze hodnotit 75,8 nelze hodnotit 5. (24.) nelze hodnotit 75,4 nelze hodnotit 1. (25.) nelze hodnotit 75, nelze hodnotit 2. (26.) nelze hodnotit 73,3 nelze hodnotit 3. (27.) nelze hodnotit 65,8 nelze hodnotit 4. (28.) nelze hodnotit 64,8 nelze hodnotit 4

Tabulka č. 4 Teplotní charakteristiky tuhnutí všech cyklů měření vzorku A Cyklus 1. (ohřev do 9 C) 2. (ohřev do 9 C) 3. (ohřev do 9 C) 4. (ohřev do 9 C) 5. (ohřev do 15 C) 6. (ohřev do 13 C) Tuhnutí Počátek tuhnutí [ C] T max [ C] ΔH [J/g] 1. 73,5 7,9-112,1 2. 73,7 71,4-111,3 3. 73,8 71,5-111,2 4. 73,9 71,7-11,8 5. 73,9 71,8-11,3 1. (6.) 7,9 68,9-19,6 2. (7.) 7,8 68,8-11,8 3. (8.) 7,6 68,6-19,4 4. (9.) 7,5 68,5-19,5 1. (1.) 72,2 7,1 nelze hodnotit 2. (11.) 72,1 7,1 nelze hodnotit 3. (12.) 72,1 7, nelze hodnotit 4. (13.) 72, 7, nelze hodnotit 1. (14.) 7,2 68,2-15,5 1. (15.) 63,9 62,2-93,2 2. (16.) 62,2 6,4-92,63 3. (17.) 6, 57, -85,21 4. (18.) 55,1 53,5-79,99 5. (19.) 53,3 52,1-72,34 1. (2.) 53, 51,5 nelze hodnotit 2. (21.) 52,9 5,6 nelze hodnotit 3. (22.) 55,5 49,6 nelze hodnotit 4. (23.) 55,6 48,4 nelze hodnotit 5. (24.) 55,8 47,1 nelze hodnotit 7. (ohřev do 15 C) 1. (25.) až 4. (28.) nelze hodnotit 41

Graf č. 31 Záznam měření vzorku B 1. cyklus exo 2 1-1 -2 Temp. / C 8 6 4 2-2 -3 5 1 15 2 25 3 Time /min -4-6 25 C, 5 min., -5 C, 5 min., 9 C, 15 C, 9 C, 15 C, 9 C, 15 C, 9 C, 15 C, 9 C, 15 C, 9 C, 15 C, 9 C, -5 C, 5 min., 9 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. Graf č. 32 Tání lipidických součástí vzorku B 1. cyklus [1.19] exo.6.4.2. -.2 -.4 8. - Tmax: 62,5 C 7. - Tmax: 62,5 C 6. - Tmax: 62,6 C 5. - Tmax: 62,4 C 4. - Tmax: 62,4 C 3. - Tmax: 62,4 C 2. - Tmax: 62,3 C 1. - Tmax: 63,1 C 45 5 55 6 65 7 42

Graf č. 33 Záznam měření vzorku B 2. cyklus exo.6.4.2. -.2 Temp. / C 9 8 7 6 5 4 -.4 -.6 2 4 6 8 1 12 Time /min 3 2 1 18 C, 5 min., 9 C, 15 C, 9 C, 15 C, 9 C, 15 C, 9 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. Graf č. 34 Tání lipidických součástí vzorku B 2. cyklus [1.8] exo.8.6 4. - Tmax: 62,4 C.4.2. 3. - Tmax: 62,6 C 2. - Tmax: 62,5 C 1. - Tmax: 62,3 C -.2 5 55 6 65 7 43

Graf č. 35 Záznam měření vzorku B 3. cyklus 2 exo 1-1 -2 Temp. / C 8 6 4 2-2 -3 5 1 15 2 25 3 35 4 45 Time /min -4-6 25 C, 5 min., 85 C, 25 C, 85 C, 25 C, 85 C, 25 C, 85 C, 25 C, 85 C, 25 C, 85 C, 25 C, 85 C, -5 C, 5 min., 85 C, 25 C Rychlost ohřevu/chlazení 2 C/min., od chlazení do -5 C rychlostí 5 C/min. Graf č. 36 Tání lipidických součástí vzorku B 3. cyklus [1.17] exo.6 8. - Tmax: 62,2 C.4 7. - Tmax: 61,1 C.2 6. - Tmax: 6,5 C. -.2 -.4 -.6 -.8 -.1 5. - Tmax: 6,8 C 4. - Tmax: 6,9 C 3. - Tmax: 61, C 2. - Tmax: 61,2 C 1. - Tmax: 6,3 C 4 45 5 55 6 65 7 75 44

Graf č. 37 Záznam měření vzorku B 4. cyklus 2 exo 1-1 -2 Temp. / C 12 1 8 6 4 2-2 -3 5 1 15 2 Time /min -4-6 24 C, 5 min., 11 C, 15 C, 11 C, 15 C, 11 C, 15 C, 11 C, -5 C, 5 min., 9 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. Graf č. 38 Tání lipidických součástí vzorku B 4. cyklus [1.11] exo.1.5. -.5 -.1 5. - Tmax: 62,3 C 4. - Tmax: 62,2 C 3. - Tmax: 62,2 C 2. - Tmax: 62,2 C -.15 1. - Tmax: 62,3 C -.2 45 5 55 6 65 7 75 8 45

Graf č. 39 Srovnání vybraných tání lipidických součástí ve vzorku B a ve vzorku A [2.11] exo.2.1. -.1 Vzorek B - 25. ohřev - Tmax: 62,3 C Vzorek B - 2. ohřev - Tmax: 62,3 C -.2 -.3 -.4 -.5 -.6 Vzorek A - 28. ohřev - Tmax: 64,8 C 4 45 5 55 6 65 7 75 46

Tabulka č. 5 Teploty T max tání lipidických součástí vzorku B Cyklus Tání T max [ C] 1. 2. 3. 4. 1. 63,1 2. 62,3 3. 62,4 4. 62,4 5. 62,4 6. 62,6 7. 62,5 8. 62,5 1. (9.) 62,3 2. (1.) 62,5 3. (11.) 62,6 4. (12.) 62,4 1. (13.) 6,3 2. (14.) 61,2 3. (15.) 61, 4. (16.) 6,9 5. (17.) 6,8 6. (18.) 6,5 7. (19.) 61,1 8. (2.) 62,2 1. (21.) 62,3 2. (22.) 62,2 3. (23.) 62,2 4. (24.) 62,2 5. (25.) 62,3 47

Tabulka č. 6 Vybrané hodnoty ΔH při tání lipidických složek ve vzorku B Tání ΔH [J/g] 1. 23,4 8. 27,3 2. 24,8 22. 23,3 Graf č. 4 Srovnání vody a vody ve vzorku B [4.11] exo 2 1-1 -2-3 B - 4. cyklus B - 3. cyklus B - 1. cyklus, 8. ohřev B - 1. cyklus, 1. ohřev -4-5 -6 Voda -3-2 -1 1 2 Tabulka č. 7 Teplotní charakteristiky vody a vody ve vzorku B Vzorek Onset [ C] Tmax [ C] ΔH [J/g] Voda 2,5 9,1 353,9 B 1. cyklus (1) 1,7 9,9 257,4 B 1. cyklus (2) 1,6 1, 253,5 B 3. cyklus 1,5 9,5 248,9 B 4. cyklus 1,5 9,3 245,5 48

Graf č. 41 Záznam měření vzorku C 1 exo 1.5 1..5 Temp. / C 8 6 4. -.5-1. -1.5-2. 5 1 15 2 Time /min 2-2 -4-6 12 C, 5 min., -5 C, 1 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 25 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. Graf č. 42 Tání lipidických součástí vzorku C 1 [1.16] exo.4.2 5. - Tmax: 82,5 C. 4. - Tmax: 82,5 C -.2 -.4 3. - Tmax: 82,5 C 2. - Tmax: 82,5 C -.6 1. 45 5 55 6 65 7 75 8 85 49

Graf č. 43 Tuhnutí lipidických součástí vzorku C 1 [1.17] exo. -.2 -.4 5. - P.T.: 66,3 C, Tmax: 64,6 C, plocha: -1,11 J/g 4. - P.T.: 66,3 C, Tmax: 64,6 C, plocha: -1,23 J/g 3. - P.T.: 66,2 C, Tmax: 64,6 C, plocha: -9,94 J/g -.6 -.8 2. - P.T.: 66,3 C, Tmax: 64,7 C, plocha: -1,55 J/g 1. - P.T.: 66,5 C, Tmax: 64,8 C, plocha: -11,45 J/g -1. 4 45 5 55 6 65 Graf č. 44 Záznam měření vzorku C 2 1. cyklus exo 1.5 1..5. -.5-1. -1.5 Temp. / C 4 2-2 -4-2. 5 1 15 2 25 3 35 4 Time /min 14 C, 5 min., -5 C, 1 min., 4 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. 5

Graf č. 45 Srovnání vody ve vzorcích C 1 a C 2 (první cyklus ohřevů) [1.4] exo 1.5 1..5. C-2 - onset: 4,3 C, Tmax: 11,4 C, plocha: 212,4 J/g -.5 C-1 - onset: 4,6 C, Tmax: 11,9 C, plocha: 256,4 J/g -3-2 -1 1 2 3 Graf č. 46 Záznam měření vzorku C 2 2. cyklus exo 1..5. -.5 Temp. / C 9 8 7 6 5 4 3-1. -1.5 2 4 6 8 Time /min 1 12 14 16 2 1 19 C, 5 min., 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. 51

Graf č. 47 Tání lipidických součástí vzorku C 2 2. cyklus [1.13] exo 1.2 1..8.6.4.2 4. - Tmax: 79, C 3. - Tmax: 79, C 2. - Tmax: 79,1 C 1. - Tmax: 79,1 C. 45 5 55 6 65 7 75 8 85 Graf č. 48 Tuhnutí lipidických součástí vzorku C 2 2. cyklus [1.14] exo -.8-1. -1.2-1.4-1.6 4. - P.T.: 65,8 C, Tmax: 63,9 C, plocha: -2,56 J/g 3. - P.T.: 65,8 C, Tmax: 64,1 C, plocha: -2,32 J/g 2. - P.T.: 65,7 C, Tmax: 64,1 C, plocha: -19,65 J/g 1. - P.T.: 65,9 C, Tmax: 64,2 C, plocha: -19,86 J/g -1.8-2. 4 45 5 55 6 65 52

Graf č. 49 Záznam měření vzorku C 2 3. cyklus exo 1..5. -.5-1. Temp. / C 9 8 7 6 5 4 3 2-1.5 2 4 6 8 1 12 14 16 Time /min 1 21 C, 5 min., 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. Graf č. 5 Tání lipidických součástí vzorku C 2 3. cyklus [1.13] exo 1.4 1.2 1..8 4. - Tmax: 79, C 3. - Tmax: 79, C.6 2. - Tmax: 79, C.4 1. - Tmax: 79, C.2 5 55 6 65 7 75 8 85 9 53

Graf č. 51 Tuhnutí lipidických součástí vzorku C 2 3. cyklus -1. [2.14] exo 4. - P.T.: 65,7 C, Tmax: 63,9 C, plocha: -2,7 J/g -1.1-1.2 3. - P.T.: 65,6 C, Tmax: 64, C, plocha: -2,6 J/g -1.3-1.4-1.5 2. - P.T.: 65,8 C, Tmax: 63,9 C, plocha: -2,61 J/g 1. - P.T.: 65,7 C, Tmax: 63,9 C, plocha: -2,54 J/g -1.6-1.7-1.8-1.9 35 4 45 5 55 6 65 Graf č. 52 Záznam měření vzorku C 2 4. cyklus exo 1-1 -2-3 -4-5 Temp. / C 2 1-1 -2-3 -4-6 5 1 15 2 25 3 35 4 Time /min -5 24 C, 5 min., -5 C, 18 min., 15 C Rychlost chlazení 5 C/min., ohřevu,3 C/min. 54

Graf č. 53 Srovnání vody a vody ve vzorku C 2 4. cyklus [1.4] exo 1..8.6.4.2. -.2 Voda ve vzorku C-2 - onset: -3,9 C, Tmax:,6 C, plocha: 339,8 J/g Voda - onset: -,9 C, Tmax:,8 C, plocha: 344,4 J/g -3-25 -2-15 -1-5 5 Graf č. 54 Záznam měření vzorku C 2 5. cyklus exo.8.6.4.2. -.2 -.4 -.6 -.8-1. 5 1 15 2 Time /min Temp. / C 9 8 7 6 5 4 3 2 1 26 C, 5 min., 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. 55

Graf č. 55 Tání lipidických součástí vzorku C 2 5. cyklus [1.19] exo.8.7.6.5.4.3.2.1. 6. - Tmax: 78,5 C 5. - Tmax: 78,6 C 4. - Tmax: 78,5 C 3. - Tmax: 78,5 C 2. - Tmax: 78,6 C 1. - Tmax: 78,6 C 45 5 55 6 65 7 75 8 85 Graf č. 56 Tuhnutí lipidických součástí vzorku C 2 5. cyklus [3.2] exo -.4 6. - P.T.: 66,1 C, Tmax: 64,2 C, plocha: -2,96 J/g -.6 -.8-1. 5. - P.T.: 66,1 C, Tmax: 64,2 C, plocha: -2,98 J/g 4. - P.T.: 66,1 C, Tmax: 64,2 C, plocha: -2,71 J/g 3. - P.T.: 66,1 C, Tmax: 64,3 C, plocha: -2,96 J/g 2. - P.T.: 66,2 C, Tmax: 64,2 C, plocha: -2,31 J/g 1. - P.T.: 66,2 C, Tmax: 64,2 C, plocha: -2,61 J/g -1.2-1.4 35 4 45 5 55 6 65 7 56

Graf č. 57 Záznam měření vzorku C 2 6. cyklus exo.8.6.4.2. -.2 -.4 -.6 Temp. / C 9 8 7 6 5 4 3 2 -.8-1. 5 1 15 2 25 Time /min 1 24 C, 5 min., 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 5 C, 5 min., 9 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. Graf č. 58 Tání lipidických součástí vzorku C 2 6. cyklus [1.21] exo.8.6.4.2. -.2 -.4 7. - Tmax: 78,5 C 6. - Tmax: 78,5 C 5. - Tmax: 78,5 C 4. - Tmax: 78,5 C 3. - Tmax: 78,5 C 2. - Tmax: 78,5 C 1. - Tmax: 78,5 C 45 5 55 6 65 7 75 8 85 57

Graf č. 59 Tuhnutí lipidických součástí vzorku C 2 6. cyklus.2 [1.17] exo. -.2 -.4 -.6 -.8-1. -1.2 7. - P.T.: 66, C, Tmax: 64, C, plocha: -2,81 J/g 6. - P.T.: 66, C, Tmax: 64, C, plocha: -2,81 J/g 5. - P.T.: 65,9 C, Tmax: 64, C, plocha: -2,8 J/g 4. - P.T.: 66, C, Tmax: 64,2 C, plocha: -2,93 J/g 3. - P.T.: 66, C, Tmax: 64,1 C, plocha: -2,93 J/g 2. - P.T.: 66,1 C, Tmax: 64,1 C, plocha: -2,87 J/g 1. - P.T.: 66, C, Tmax: 64,2 C, plocha: -2,92 J/g -1.4-1.6 25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 Graf č. 6 Záznam měření vzorku C 2 7. cyklus exo 4 2-2 -4-6 5 1 15 2 25 3 Time /min Temp. / C 8 6 4 2-2 -4-6 24 C, 5 min., -5 C, 5 min., 9 C, -5 C, 5 min., 9 C, -5 C, 5 min., 9 C, -5 C, 5 min., 9 C, -5 C, 5 min., 9 C, -5 C, 5 min., 3 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. 58

Graf č. 61 Tání lipidických součástí vzorku C 2 7. cyklus [1.13] exo 1.2 1..8.6 5. - Tmax: 78,6 C 4. - Tmax: 78,6 C 3. - Tmax: 78,6 C.4 2. - Tmax: 78,6 C.2 1. - Tmax: 78,6 C 45 5 55 6 65 7 75 8 85 Graf č. 62 Tuhnutí lipidických součástí vzorku C 2 7. cyklus [1.5] exo. 5. - P.T.: 65,7 C, Tmax: 63,9 C, plocha: -2,83 J/g -.2 4. - P.T.: 65,8 C, Tmax: 63,9 C, plocha: -2,72 J/g -.4 -.6 -.8 3. - P.T.: 65,6 C, Tmax: 63,9 C, plocha: -2,83 J/g 2. - P.T.: 65,6 C, Tmax: 63,9 C, plocha: -2,65 J/g 1. - P.T.: 65,7 C, Tmax: 63,8 C, plocha: -2,92 J/g -1. -1.2 4 45 5 55 6 65 59

Graf č. 63 Záznam měření vzorku C 2 8. cyklus 4 exo 2-2 -4 Temp. / C 8 6 4 2-2 -4-6 5 1 15 2 25 3 35 4 Time /min -6 18 C, 5 min., -5 C, 5 min., 9 C, -5 C, 5 min., 9 C, -5 C, 5 min., 9 C, -5 C, 5 min., 9 C, -5 C, 5 min., 9 C, -5 C, 5 min., 9 C, -5 C, 5 min., 3 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. Graf č. 64 Tání lipidických součástí vzorku C 2 8. cyklus [1.7] exo 1.6 1.4 1.2 1..8 6. - Tmax: 79,2 C 5. - Tmax: 79,2 C 4. - Tmax: 79,2 C 3. - Tmax: 79,2 C 2. - Tmax: 79,2 C 1. - Tmax: 79,2 C.6 45 5 55 6 65 7 75 8 85 6

Graf č. 65 Tuhnutí lipidických součástí vzorku C 2 8. cyklus [1.5] exo.4.2. -.2 -.4 -.6 -.8-1. 6. - P.T.: 64,8 C, Tmax: 63, C, plocha: -18,67 J/g 5. - P.T.: 64,9 C, Tmax: 63, C, plocha: -18,23 J/g 4. - P.T.: 64,8 C, Tmax: 63, C, plocha: -18,1 J/g 3. - P.T.: 64,8 C, Tmax: 63,1 C, plocha: -18,3 J/g 2. - P.T.: 64,8 C, Tmax: 63, C, plocha: -18,74 J/g 1. - P.T.: 64,9 C, Tmax: 63,2 C, plocha: -17,88 J/g -1.2 3 35 4 45 5 55 6 65 Graf č. 66 Srovnání vody ve vzorku C 2 7. cyklus [1.19] exo 3 2 1-1 -2 6. - onset: -,1 C, Tmax: 5,4 C, plocha: 346,52 J/g 5. - onset: -,1 C, Tmax: 5,7 C, plocha: 348,36 J/g 4. - onset: -,1 C, Tmax: 5,5 C, plocha: 348,76 J/g 3. - onset: -,1 C, Tmax: 5,3 C, plocha: 344,8 J/g 2. - onset: -,1 C, Tmax: 5,5 C, plocha: 344,1 J/g 1. - onset: -, C, Tmax: 5,8 C, plocha: 351,27 J/g -4-3 -2-1 1 2 61

Graf č. 67 Srovnání vody ve vzorku C 2 8. cyklus [1.19] exo 3 2 1-1 -2 7. - onset:,6 C, Tmax: 6,9 C, plocha: 313,42 J/g 6. - onset:,6 C, Tmax: 6,7 C, plocha: 313,55 J/g 5. - onset:,6 C, Tmax: 6,4 C, plocha: 315,53 J/g 4. - onset:,6 C, Tmax: 6,4 C, plocha: 315,8 J/g 3. - onset:,6 C, Tmax: 6,4 C, plocha: 315,14 J/g 2. - onset:,6 C, Tmax: 6,4 C, plocha: 313,55 J/g 1. - onset:,7 C, Tmax: 6,2 C, plocha: 318,96 J/g -3-2 -1 1 2 Graf č. 68 Srovnání vybraných tání lipidických součástí vzorku A, C 1 a C 2 [1.4] exo 2 1 Vzorek C2-14. ohřev - Tmax: 78,6 C Vzorek C1-2. ohřev - Tmax: 82,5 C -1-2 Vzorek A - 14. ohřev - Tmax: 81,6 C 6 65 7 75 8 85 62

Graf č. 69 Záznam měření vzorku D 1. cyklus exo 2 1-1 -2 Temp. / C 1 8 6 4 2-2 -4-3 1 2 3 4 5 6 Time /min -6 16 C, 5 min., -5 C, 5 min., 95 C, 25 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. Graf č. 7 Křivka tání vzorku D 1. cyklus exo Peak: 5.9 C, 2.142 mw/mg 2. Peak: 56.8 C, 1.596 mw/mg Peak: 65. C, 1.712 mw/mg 1.5 1..5. 2 4 6 8 63

Graf č. 71 Záznam měření vzorku D 2. cyklus exo 3 2 1-1 -2-3 Temp. / C 15 1 5-4 -5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Time /min -5 18 C, 5 min., 14 C, -5 C, 1 min., 85 C, 2 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min., rychlost chlazení do -5 C 1 C/min. Graf č. 72 Tání lipidických součástí vzorku D 2. cyklus [1.5] exo 1.8 1.6 1.4 1.2 1. 2. - onset: 5,9 C, Tmax: 55,7 C, plocha: 97,64 J/g.8.6.4.2 1. - onset: 53,3 C, Tmax: 56,4 C, plocha: 111,46 J/g 3 4 5 6 7 64

Graf č. 73 Záznam měření vzorku D 3. cyklus exo 1.5 1..5. -.5-1. -1.5 Temp. / C 8 6 4 2-2 -4 2 4 6 8 1 12 14 16 Time /min 15 C, 5 min., 8 C, 1 C, 8 C, 1 C, 8 C, 5 C, 8 C, -5 C, 5 min., 8 C, 25 C Rychlost ohřevu/chlazení 5 C/min. Graf č. 74 Tání lipidických součástí vzorku D 3. cyklus [2.11] exo.8.6.4.2. -.2 5. - onset: 52,6 C, Tmax: 57,3 C, plocha: 8,47 J/g 4. - onset: 52,8 C, Tmax: 57,4 C, plocha: 8,6 J/g 3. - onset: 53,1 C, Tmax: 57,5 C, plocha: 87,26 J/g 2. - onset: 53, C, Tmax: 57,5 C, plocha: 8,36 J/g 1. - onset: 53,2 C, Tmax: 57,6 C, plocha: 77,79 J/g 3 35 4 45 5 55 6 65 7 65

Graf č. 75 Srovnání tání vody ve vzorku D [1.5] exo 2.5 2. 3. cyklus - onset: 1,9 C, Tmax: 5,4 C, plocha: 185,5 J/g 1.5 1..5 2. cyklus - onset:,1 C, Tmax: 3,2 C, plocha: 243,39 J/g 1. cyklus - onset:,1 C, Tmax: 5,9 C, plocha: 297,99 J/g. -2-1 1 2 Graf č. 76 Srovnání tuhnutí vody ve vzorku D [2.9] exo 1 3. cyklus - P.T.: -15,6 C, Tmax: -16,6 C, plocha: -183,15 J/g -1-2 1. cyklus - P.T.: -8, C, Tmax: -9,8 C, plocha: -276,33 J/g -3-4 -45-4 -35-3 -25-2 -15-1 -5 66

5 Diskuze Vzorky hodnocené v této práci obsahují vodu, syntetický pseudoceramid, či originální ceramid a cholesterol. Cholesterol a pseudoceramid, resp. ceramid tvoří lipidickou část vzorku. Použili jsme tyto látky ve složení, kdy se cholesterol v roztaveném pseudoceramidu rozpouští a ani při ochlazování samostatně nekrystalizuje. Teplota tání tohoto složení nepřekračuje teplotu tání pseudoceramidu. [2] Nejdříve v práci uvádíme charakteristiky výchozích komponent, pseudoceramidu a vody. Cholesterol neuvádíme, protože jeho charakteristiky jsou všeobecně známy. Na grafu číslo 1 je záznam měření pseudoceramidu. Vzorek jsme opakovaně zahřívali a chladili, protože dále potom prováděná hydratace vzorku vyžaduje mnohonásobné zahřívání a chlazení. Během těchto opakovaných cyklů dochází k hydrataci vzorku, a tím i ke změně teplotních charakteristik. V první fázi tedy potřebujeme vědět, zda se na budoucích očekávaných změnách může podílet samotný pseudoceramid. Na grafu č. 2 je znázorněno tání a na grafu č. 3 chlazení roztaveného vzorku. Vyhodnocovali jsme pouze teplotu T max, která je uvedena v tabulce č. 2. Z hodnocení vyplývá, že ani opakované zahřívání vzorku nezpůsobuje změny teplotních charakteristik pseudoceramidu. Na grafu č. 4 je znázorněno tání vody při rychlosti ohřevu 5 C/min. Touto rychlostí jsou potom zahřívány a chlazeny hodnocené vzorky. Pokud dojde k hydrataci vzorku, měla by být na záznamu DSC viditelná voda vázaná v hydratované lamele. Prokázání této vody vyžaduje dlouhodobou temperaci při velmi nízké teplotě a následující ohřev velmi malou rychlostí. Z tohoto důvodu jsme tentýž vzorek vody opět ochladili a zahřívali nyní rychlostí,3 C/min. Záznam je uveden na grafu č. 5. Tuhnutí obou vzorků probíhalo stejnou rychlostí. Záznam znázorňuje graf č. 6. Tepla tuhnutí jsou v podstatě shodná, ale vidíme zde rozdíly v hodnotách T max. Na grafu č. 7 je záznam prvního cyklu ohřevů a chlazení vzorku A. Tání a tuhnutí lipidické směsi zobrazují grafy č. 8 a č. 9. Teplotní charakteristiky jsou uvedeny 67