Laboratorní diagnostika bakteriálních infekcí GIT prasat MVDr. Ivana Kucharovičová Oddělení bakteriologie Státní veterinární ústav Jihlava
Obsah přednášky 1) Správný odběr vzorků u infekcí GIT prasat 2) Výběr laboratorních metod a interpretace výsledků 3) Vybraná etiologická agens (+ bakteriologické diagnostické metody) infekcí GIT prasat
Státní veterinární ústav Jihlava Komplexní diagnostika chorob GIT prasat ODDĚLENÍ bakteriologie virologie patologie chemie parazitologie krmiva bakteriologická vyšetření virologická a sérologická vyšetření molekulárně-biologická vyšetření histologická a imunohist. vyšetření patologicko anatomická vyšetření biochemická, toxikologická a hematologická vyšetření parazitologická vyšetření mikrobiologická, mykologická a chemická vyšetření Výsledek vyšetření + interpretace, konzultace a návrh řešení.
Spolehlivá a včasná laboratorní diagnostika nezbytná pro správnou volbu terapie, prevencea profylaxe Výsledek laboratorní diagnostiky ovlivněn mnoha faktory: odběrem a transportem vzorků zpracováním a uchováváním vzorků výběrem laboratorních metod
Odběr vzorků pro bakteriologické vyšetření - obecně Správné vzorkování musí být: kvalitní (odběr a skladování) jak?, do čeho?, kde?, při jaké teplotě? správný počet vzorků kolik? reprezentativní popř. náhodné -jak? Dále je důležité: načasování odběru kdy? (vzhledem k průběhu onemocnění) frekvence vzorkování jak často? (někdy důležitější než počet vzorků) Před odběrem - správně definované cíle = proč? vyšetřuji (diagnostika choroby, monitoring) a k čemu bude vzorek sloužit (i virologie? parazitologie? PCR? apod.) => různé vzorkování za různým účelem Kvalitní vzorek/ odběr je základem pro kvalitní diagnostiku Správné vzorkování = validní výsledek
Požadované proměnné: Správný odběr vzorků: Kolik? Výpočet POČTU VZORKŮ (SAMPLE SIZE) pro diagnostiku: průkaz choroby/terénní infekce velikost (četnost) populace (hala/farma) odhad prevalence (procento infikovaných zvířat) požadovaná jistota detekce infekce -tzv. interval spolehlivosti nebo též konfidenční interval. Hodnota spolehlivosti (značená jako 1- α) se nejčastěji volí 0,95 (95 %) a udává pravděpodobnost, s níž je skutečná hodnota parametru XYnalezeným intervalem pokryta. citlivost používané metody - tzv. senzitivita procento infikovaných zvířat, která jsou testem detekovaná (pozitivně) NEBOLI: pravděpodobnost, že test bude pozitivní u nemocných zvířat. Senzitivita < 100% je příčinou nesprávně (falešně) negativních výsledků.
Počet vzorků k potvrzení nákazy Excel tabulka (včetně vlivu sensitivity použitého testu) Velikost populace (ks) 1 000 Požadovaná spolehlivost (95%) 95% Citlivost metody (%) 90% Předpokládaná prevalence (%) 10% Počet vzorků (ks) n 32 n = potřebný počet vzorků α = požadovaná jistota detekce infekce (většinou 0,95) D = počet infikovaných zvířat (odhad prevalence) N = velikost (četnost) populace
Velikost populace Počet vzorků pro 95% jistotu detekce infekce (1 nebo více) s testem se 100% senzitivitou Prevalence (%) 50 40 30 25 20 15 10 5 2 1 0.5 0.1 20 4 6 7 9 10 12 16 19 20 20 20 20 30 4 6 8 9 11 14 19 26 30 30 30 30 40 5 6 8 10 12 15 21 31 40 40 40 40 50 5 6 8 10 12 16 22 35 46 50 50 50 60 5 6 8 10 12 16 23 38 55 60 60 60 70 5 6 8 10 13 17 24 40 62 70 70 70 80 5 6 8 10 13 17 24 42 68 79 80 80 90 5 6 8 10 13 17 25 43 73 87 90 90 100 5 6 9 10 13 17 25 45 78 96 100 100 150 5 6 9 11 13 18 27 49 95 130 148 150 200 5 6 9 11 13 18 27 51 105 155 190 200 500 5 6 9 11 14 19 28 56 129 225 349 500 1000 5 6 9 11 14 19 29 57 138 258 450 950 5000 5 6 9 11 14 19 29 59 147 290 564 2253 10000 5 6 9 11 14 19 29 59 148 294 581 2588 5 6 9 11 14 19 29 59 149 299 596 2995
Správný počet vzorků Používáme malé množství vzorků, abychomzískaliinformace o velkém množství zvířat. Výsledek má zajistit relevantní informaciaplikovatelnounaceloupopulaci(halu,farmu). statistika určuje ideální počet vzorků praxe bere v úvahu také ekonomickou stránku Chovatel/majitel tlačí počet vzorků a frekvenci vzorkování dolů.potom přichází klíčové otázky: Kolik informací ztrácím? Jaká rizika vznikají snížením počtu vzorků (popř. frekvence)?
Odběr vzorků pro bakteriologické vyšetření POSTMORTEM nebo INTRAVITÁLNĚ 1) POSTMORTEM: selata - 3 ks utracených selat stypickými klinickými příznaky nebo 3 čerstvě uhynulá selata; střevo vždy podvázané a samostatně balené vnepropustném obalu (sáček, kontejner): jejunum, ileum 10 cm, colon ¼ až ½ obsah střeva cca 5 ml vuzavřeném kontejneru, trusovce, plný vhodné pro anaerobní kultivaci stěr ze střeva - do transportního media DORUČIT ČERSTVÉ/CHLAZENÉ DO LABORATOŘE
Odběr vzorků pro bakteriologické vyšetření 2) INTRAVITÁLNĚ trus: do kontejneru cca 25g trusu (2-3 polévkové lžíce) požadavek: čerstvý trus od konkrétního jedince vhodné spíše pro virologii (rota/koronaviry) a parazitologii nedoporučujeme směsovat (citlivost, kontaminace) rektální výtěr: vždy do transportního media nejčastěji: Amies medium a Cary Blair, popř. spec. výtěrovky: flokedswab, eswab (Copan) aj. výtěry s trasportním médiem doručit do 48 hod (20 C) do laboratoře
Výběr vhodných laboratorních metod metody laboratoř volí s ohledem na druh vyšetřovaného materiálu, citlivost testů a vybavenost laboratoře: klasické bakteriologické metody molekulárně biologické metody (PCR, Real-timePCR, ) přímý průkaz patogenu druhově specifické potvrzení bakteriálních izolátů stanovení faktorů virulence druhová identifikace hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF Vhodná a správná kombinace přístupů klasické bakteriologie, MALDI-TOF, molekulární biologie a sérologie společně se správnou interpretací je cestou k úspěšné diagnostice.
Rodová a druhová identifikace mikroorganismů hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, s analyzátorem doby letu TimeofFlightMass Spectrometry) rychlá a přesná identifikace izolovaných bakterií, plísní a kvasinek
MALDI-TOF MS vzorek (tj. kolonie mikroorganismu) je druhově identifikován porovnáním jeho hmotnostního spektra sdatabází - obsahujíce tisíce referenčních molekulárních identifikátorů získaných pro jednotlivé referenční kmeny mikroorganismů kombinací hmotnostních spekter zopakovanýchanalýz. výstupem srovnávacího algoritmu je druhová identifikace mikroorganismu spřiřazenou hodnotou skóre vyjadřujícího shodu hmotnostního spektra vyšetřovaného vzorku s referenčním molekulárním identifikátorem vdatabázi MALDI Biotyper. vlastní interpretaci výsledků provádí vždy mikrobiolog. (vyšetření se vněkterých případech neobejde bez dalších konfirmačních vyšetření)
MALDI-TOF MS Výhody metody: vysoce přesná aplikovatelná pro široké spektrum mikroorganismů výrazně rychlejší ve srovnání s tradičními metodami (provedení samotné analýzy v řádu minut) ekonomicky efektivní robustní
Obecné zásady interpretace výsledků Před interpretací laboratorních výsledků je třeba znát mnohá fakta a to jak z laboratoře tak z terénu, jinak: nebezpečí nesprávné interpretace! laboratorní výsledek diagnóza Data z terénu: anamnéza? věk zvířat? fáze infekce? akutní, chronická,.. vzorkování? původ vzorků, jak odebíráno, jak jsou vzorky staré, prevalence? epizootologická situace Data z laboratoře: co test detekuje? antigen, NK, senzitivita testu? specifita testu? robustnost a opakovatelnost testu?
Etiologie bakteriálních infekcí GIT prasat Průjmová bakteriální onemocnění selat do věku 4 týdnů: kolibacilóza - Escherichia coli nástup v prvních dnech klostridiové enteritidy C. perfringens typ A ac, C. difficile v prvních dnech samonelóza -Salmonella sp. nástup po prvním týdnu enterokokóza -Enterococcus durans Průjmová bakteriální onemocnění prasat starších 4 týdnů: kolibacilóza - Escherichia coli klostridiové enteritidy C. perfringens typ A ac, C. difficile samonelóza -Salmonella sp. dyzentérie prasat - Brachyspirasp. proliferativní ileitida Lawsonia intracelularis Yersinia sp.
Diagnostika Escherichia coli Postup: 1) detekce bakterie - základní a selektivní kultivační media: Krevní agar, Columbia agar, Endův agar, TSI, Mac Conkay,chromogenní agary atd. 2) přesná identifikace E. coli selektivní média, biochemické testy a MALDI MS 3) diagnostika faktorů virulence PCR a sérotypizace CÍL = DETEKOVAT A IDENTIFIKOVAT PATOGENNÍ KMEN E.coli a následně provést testacicitlivosti na antimikrobiální látky cíleně pouze na patogenní kmen E. coli
Diagnostika faktorů virulence Escherichia coli exotoxiny, endotoxiny, fimbrie, intimin Metody: PCR a serotypizace PCR - detekce faktorů virulence metodou multiplex - PCR průkaz genů = nositelů faktorů virulence. kvalitativní metoda - detekovány geny jednotlivých faktorů virulence v jedné reakci výhodou oproti sérologickým metodám je nezávislost na expresi antigenů in vitro, která je u některých fimbriových antigenů velmi slabá
Diagnostika faktorů virulence E. coli - průkaz genů pro jednotlivé faktory Multiplex PCR I. : kombinace 3Multiplex PCR STEC (VTEC) Shiga-like toxin typ 1 (Stx1) kódóvángenem stx 1 Shiga-like toxin typ 2 (Stx2) kódóvángenem stx 2 STEC+EPEC adherenční faktor intimin eae kódóvángenem eaea EHEC enterohemolysin kódóvángenem hlya Multiplex PCR II. : ETEC termolabilní toxin LT termostabilní toxin typ A (STa) termostabilní toxin typ B (STb) Multiplex PCR III. : ETEC 5 fimbriálních adhezinů (pili) -F4(K88), F5(K99), 987P(F6), F41(F7), F18
Sérotypizace E. coli Sérotypy mají také souvislost s faktory virulence determinace: O - somatického antigenu (173) K - kapsulárního antigenu (80) H - bičíkového antigenu (56) F - fimbriového antigenu, adhezinu METODA: rychlá sklíčková nebo pomalá aglutinace Komplikace: velké množství kmenů /sér laboratoř většinou diagnostikuje jen některé ztráta faktorů virulence vázaných na plazmidy při práci s kmenem rozdílná kvalita a dostupnost antisér subjektivní posouzení výsledků
Interpretace diagnostiky E. coli NOSOLOGICKÉ JEDNOTKY Vyhodnocení výsledků z laboratoře molekulárné biologie: negativní kmen - na nejfrekventovanější sledované faktory virulence - je to komenzál - antibiogram se neprovádí; pozitivní kmen - INTERPRETACE dle nosologických jednotek provede se antibiogram, kmen se zamrazí, je k dispozici pro eventuální další vyšetření např. další diagnostiku, sérotypizaci, výrobu vakcíny apod.: ENTERÁLNÍ KOLIINFEKCE: novorozená a sající selata - ETEC: Sta, Stb, Lta, Ltb selata po odstavu - ETEC + EPEC: Sta, Stb, Lta, Ltb + eae intimin edémová choroba - STEC (VTEC): Stx1, Stx2 EXTRAINTESTINÁLNÍ KOLIINFEKCE: kóliseptikémie -SEPEC
Pozitivní typizace E. coli metodou PCR na SVÚ Jihlava patogenní E.coli 2012 2013 k 23.9.2014 2012-2014 % pozitivních STEC/VTEC 18,2 13,5 4,0 12,6 EPEC 27,3 23,0 28,0 25,8 ETEC 51,5 55,4 58,0 54,7 koinfekce 3,0 8,1 10,0 6,8
E. coli - testacecitlivosti na antimikrobiální látky 1) disková difusní metoda 2) stanovení MIC dilučnímetodou Problémy, které řeší laboratoře a terénní veterinární lékaři: Kritéria hodnocení pro veterinární patogeny: CLSI (USA CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS ISTITUTE), nebo humánní evropský EUCAST (European Commitee on Antimicrobial Susceptibility Testing) Rezistence bakterií k některým antimikrobiálním látkám indikační omezení ochranné lhůty nejsou kdispozici disky
Diagnostika Brachyspirasp. Brachypirahyodysenteriae patogenní, vyvolává DYSENTERII PRASAT Brachyspirapilosicoli patogenní, vyvolává střevní SPIROCHETOZU prasat Ostatní druhy: Brachyspiramurdorchii, B. innocens, B. intermedia, B. hampsonii PATOGENNÍ X NEPATOGENNÍ? potencionálně patogenní možnost smíšených infekcí diferenciální diagnostika
Diagnostika Brachyspirasp. VZOREK: kadáver, tlusté střevo, trus anaerobně odebraný plná vzorkovnice bez přístupu vzduchu, rektální výtěr. Kvalitní vzorek základ úspěšné laboratorní diagnostiky! Laboratorní diagnostické postupy: 1. Mikroskopické vyšetření trusu, histologické vyšetření 2. Sérologické vyšetření (imunoblotting, ELISA) 3. Detekce původce - kultivační vyšetření (izolace, purifikace) 4. Identifikace původce - biochemicky (zdlouhavé a ne vždy přesné) -molekulárně biochemickými metodami -PCR -MALDI-TOF (vlastní knihovna) 5. Testace citlivosti k antimikrobiálním látkám MIC (jen některé laboratoře) komerčně připravené desky např. VetMICBrachy časově a kultivačně náročné Důležité - NRL Praha: 99% kmenů B.hyodysenteriae je rezistentní k TYLANU = zákaz používat TYLAN
Diagnostika Brachyspirasp. Molekulárně biologické vyšetření 1) real-timepcr primární test citlivější a specifičtější než konvenční PCR 2) konvenční PCR přímý průkaz nebo konfirmační test kultivační metody 2 nezávislé testy na B. hyodysenterie a B. pilosicoli 3) PCR-RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphism) ve druhém kroku (RFLP) restrikční analýzou probíhá druhová diferenciace (všechny kmeny)
Diagnostika Lawsonia intracelluraris proliferativní enteropatie prasat, ileitida prasat INTRACELULÁRNÍ BAKTERIE Důležitý je kvalitní odběr vzorku! = samostatný odběr (střevo, trus, rektální výtěr) Laboratorní diagnostické postupy: 1) histologické a mikroskopické vyšetření 2) kultivační vyšetření (5 laboratoří na světě) - DOSUD SE JI NEPODAŘILO VYKULTIVOVAT na nebuněčných kultivačních mediích 3) nested PCR základní detekční metoda 4) sérologie (ELISA Ab, IFAT, IPMA) 5) testace citlivosti k antimikrobiálním látkám neexistuje MIC použití ABT jen empiricky: VALNEMULIN, LINCOMYCIN, TYLAN, TYLVALOSIN
VZOREK: Diagnostika Salmonella sp. Post-mortem střevo, játra, MU Intra vitam trus, rektální výtěr, nebo vzorky z prostředí stěry apod. Laboratorní diagnostické postupy: 1. DETEKCE PŮVODCE kultivace a PCR 2. IDENTIFIKACE (podezřelé) chromogenní agar biochemická identifikace MALDI-TOF sérologická identifikace sklíčkovou aglutinací 3. SEROTYPIZACE/FAGOTYPIZACE (Kaufmann-White systém) 4. TESTACE CITLIVOSTI k ANTIMIKROBIÁLNÍM LÁTKÁM
Diagnostika Salmonellasp. TESTACE CITLIVOSTI K ANTIMIKROBIÁLNÍM LÁTKÁM a) disková difusní metoda b) stanovení MIC dilučnímetodou Problémy současné doby: rezistence multirezistence. léčba antibiotiky pouze zmírnění příznaků onemocnění malá účinnost léčby. Kritéria hodnocení pro veterinární patogeny: CLSI (USA CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS ISTITUTE ) nebo humánní evropský EUCAST (European Commiteeon AntimicrobialSusceptibility Testing)
Diagnostika klostridiových infekcí VZOREK: rektální výtěr v transportním médiu, trus, střevo (anaerobní prostředí) Clostridium perfringens typ A: ENTERITIDIS Clostridium perfringens typ C: NEKROTICKÁ ENTERITIDA Clostridium difficile Laboratorní diagnostické postupy: 1. DETEKCE PŮVODCE 2. IDENTIFIKACE 3. DETEKCE TOXINŮ GENŮ PRO TVORBU TOXINŮ 4. TESTACE CITLIVOSTI k ANTIMIKROBIÁLNÍM LÁTKÁM
Diagnostika klostridiových infekcí Ad 1) DETEKCE PŮVODCE a ) kultivační vyšetření: - anaerobní kultivace na základních i selektivních mediích (krevní agar, TSC, selektivní Clostridium difficille agar atd.) b) imunoenzymatické rychlotesty Ad 2) IDENTIFIKACE MALDI TOF biochemické testy selektivní media
Diagnostika klostridiových infekcí DETEKCE TOXINŮ resp. GENŮ PRO TVORBU TOXINŮ A) PCR Clostridium perfringens geny pro toxin detekovány multiplex -PCR α, β, β2, enterotoxin, ε, ι B) ELISA TESTY
Diagnostika klostridiových infekcí TESTACE CITLIVOSTI K ANTIMIKROBIÁLNÍM LÁTKÁM problém běžně se neprovádí citlivost k PNC antibiotikům lze doporučit: PNC, AMP, AMC, ENR. DIF, MARBO, DOX, FFC EUCAST MIC pro humánní medicínu
Závěrem Spolehlivá a včasná laboratorní diagnostika je nezbytná pro správnou volbu terapie, prevence a profylaxe. Výsledek laboratorní diagnostiky ovlivňuje mnoho faktorů, jako je např. odběr, transport, zpracování a uchovávání vzorků, výběr laboratorních metodapod. K úspěšné diagnostice je nutná vhodná a správná kombinace klasické bakteriologie, MALDI-TOF a molekulární biologie společně se správnou interpretací výsledků. Laboratorní diagnostika, následná léčba a preventivní opatření v chovech jsou úspěšné za předpokladu, že vzájemně spolupracují chovatel, veterinární lékař a laboratoř.
Děkuji za pozornost!
STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA