SLEDOVÁNÍ REZISTENCE VŮČI ANTIMYKOTIKŮM U LÉKAŘSKY VÝZNAMNÝCH KVASINEK

Masarykova univerzita Lékařská fakulta SLEDOVÁNÍ REZISTENCE VŮČI ANTIMYKOTIKŮM U LÉKAŘSKY VÝZNAMNÝCH KVASINEK Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Martina MAHELOVÁ Autor: Veronika LAZECKÁ Brno, duben 2014

Jméno a příjmení autora: Veronika Lazecká Název bakalářské práce: Sledování rezistence vůči antimykotikům u lékařsky významných kvasinek Pracoviště: Mikrobiologický ústav Fakultní nemocnice u svaté Anny v Brně Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Martina Mahelová Rok obhajoby bakalářské práce: 2014 Souhrn: Nejčastějšími původci mykotických onemocnění jsou kvasinky rodu Candida. K jejich léčbě se používají antimykotika. Flukonazol patří k velmi často používaným antimykotikům, avšak díky jeho častému užívání došlo k rozvoji rezistence k tomuto léku. Cílem této práce bylo zjištění rozvoje rezistence k flukonazolu u kvasinek rodu Candida (C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. dubliniensis) získaných z klinického materiálu v laboratořích Mikrobiologického ústavu Fakultní nemocnice u svaté Anny v Brně. Poté byly získané výsledky porovnány s literaturou. Práce je rozdělena na část teoretickou, která se zabývá obecnými vlastnostmi rodu Candida, charakteristikou jednotlivých druhů, kandidózami, léčbou kvasinkových infekcí a rezistencí. Praktická část obsahuje vlastní experiment, zjištění rozvoje rezistence k flukonazolu. Klíčová slova: Candida, kandidózy, antimykotika, rezistence, flukonazol Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Martiny Mahelové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne 30. 4. 2014 Veronika Lazecká

Ráda bych zde poděkovala vedoucí své bakalářské práce Mgr. Martině Mahelové za její odborné rady, cenné připomínky a čas, který mi věnovala. Rovněž bych chtěla poděkovat zaměstnancům Mikrobiologického ústavu Fakultní nemocnice u svaté Anny za pomoc při realizaci praktické části.

Obsah 1 Úvod... 9 I TEORETICKÁ ČÁST... 10 2 Rod Candida... 10 2.1 Taxonomické zařazení... 10 2.2 Obecný úvod... 10 2.3 Zastoupení druhů... 10 2.4 Morfologie... 11 2.5 Epidemiologie... 11 2.6 Cesty přenosu... 13 2.7 Faktory virulence... 13 3 Charakteristika jednotlivých druhů... 17 3.1 Candida albicans... 17 3.2 Candida glabrata... 17 3.3 Candida tropicalis... 18 3.4 Candida dubliniensis... 19 4 Kandidózy... 21 4.1 Povrchové kandidózy... 21 4.2 Invazivní kandidózy... 24 5 Léčba kvasinkových infekcí... 27 5.1 Azoly... 27 5.2 Polyeny... 28 5.3 Antimetabolity... 29 5.4 Echinokandiny... 30 5.5 Ostatní... 31 6 Rezistence... 33 6.1 Definice rezistence... 33

6.2 Primární a sekundární rezistence... 33 6.3 Mechanismy rezistence k antimykotikům... 34 II PRAKTICKÁ ČÁST... 41 7 Cíle práce... 41 8 Materiál a metody... 42 8.1 Materiál... 42 8.1.1 Mikroorganizmy... 42 8.2 Metody... 45 9 Výsledky... 51 9.1 Testování indukce rezistence kmenů kvasinek k flukonazolu... 51 9.2 Výsledky E-testů... 51 9.3 Srovnání původních a indukovaných kmenů... 55 10 Diskuze... 57 11 Závěr... 59 Použitá literatura... 60 Internetové zdroje... 64

Seznam použitých zkratek a symbolů 5-FC 5-FU ABC 5-fluorocytosin 5-fluorouracil ATP binding cassette ABCD Amphotericin B colloidal dispersion (Koloidní disperze amfotericinu B) ABLC Amphotericin B lipid complex (Lipidový komplex amfotericinu B) AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome (Syndrom získaného imunodeficitu) ALS ATP Agglutinin-like sequence Adenosintrifosfát C. Candida CMK CNA CNS DK DM DMSO DNA EK EPA EUCAST Chronická mukokutánní kandidóza Candida-non-albicans (Kandidy non-albicans) Centrální nervový systém Diseminovaná kandidóza Diabetes mellitus Dimethylsulfoxid Deoxyribonukleová kyselina Esofageální kandidóza Epithelial adhesin European Comittee On Antimicrobial Susceptibility Testing EUCAST-AFST European Comittee On Antimicrobial Susceptibility Testing - subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing FdUMP FUTP GI 5-fluorodeoxyuridin monofosfát 5-fluorouridin trifosfát Gastrointestinální

HIV Human Immunodeficiency Virus (Virus lidského imunodeficientu) HWP1 Hyphal wall protein 1 McF MFS MH MIC PCR PL RNA RPMI SAP UPRTáza VVK McFarlandova stupnice optické denzity Major facilitator superfamily Mueller-Hinton Minimální inhibiční koncentrace Polymerase chain reaction (Polymerázová řetězová reakce) Phospholipase (Fosfolipáza) Ribonukleová kyselina Roswell Park Memorial Institute Secreted Aspartyl Proteinases (Sekretované aspartylové proteinázy) Uracil fosforibosyltransferáza Vulvovaginální kandidóza

1 Úvod Kvasinky rodu Candida patří mezi nejčastější původce mykotických onemocnění u člověka. U zdravých jedinců se chovají jako komenzálové, jsou součástí normální mikrobiální sliznice dutiny ústní, gastrointestinálního traktu a pochvy. Dojde-li k oslabení imunitního systému nebo k narušení přirozené mikroflóry, mohou vyvolat infekce, kandidózy. Kandidózy mohou být povrchové až život ohrožující invazivní infekce. K léčbě kandidóz se používají antimykotika. Flukonazol je nejčastěji používaným azolovým antimykotickým léčivem, protože je účinný, bezpečný a dobře dostupný. Díky těmto příznivým vlastnostem došlo k rozšířenému užívání flukonazolu a brzy byly zaznamenány flukonazol-rezistentní izoláty. 9

I TEORETICKÁ ČÁST 2 Rod Candida 2.1 Taxonomické zařazení Říše: Fungi Kmen: Ascomycota Podkmen: Ascomycotina Třída: Ascomycetes Řád: Saccharomycetales Čeleď: Saccharomycetaceae Rod: Candida (www.doctorfungus.org/thefungi/candida_spp.php) 2.2 Obecný úvod Kvasinky rodu Candida jsou nejčastější původci mykotických onemocnění člověka a také nejčastěji izolovanými houbami z humánního klinického materiálu. (Votava, 2010, 461) 2.3 Zastoupení druhů Rod Candida se skládá ze skupiny heterogenních organizmů. Z této skupiny je více než 17 různých druhů známých jako původci lidských infekcí (Sardi a kol., 2013). Nejčastějším původcem infekcí je Candida albicans (Sullivan a kol., 2004). Kromě C. albicans se na etiologii podílejí i další druhy kandid, které označujeme termínem kandidy non-albicans 10

(CNA) (Votava, 2000; Votava, 2003). Candida tropicalis byla určena jako nejčastější patogenní druh ze skupiny CNA (Kothavade a kol., 2010). Mezi další CNA patří Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida dubliniensis a další (Votava, 2003). Dříve se C. albicans vyskytovala v 70-80 % případů a ostatní druhy CNA se vyskytovaly jen zřídka. Nicméně v průběhu posledních 10-30 let se CNA druhy objevují jako významné oportunnní patogeny u člověka. Důvodem může být zlepšení diagnostických metod anebo změny v lékařské praxi. C. albicans je stále nejčastějším původcem, ale její výskyt klesá s rostoucím výskytem jiných druhů, jako jsou C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis (Silva a kol., 2012). 2.4 Morfologie Rod Candida patří k dimorfním houbám, což znamená, že se mohou vyskytovat v různých formách podle podmínek prostředí (Sardi a kol., 2013; Votava, 2003). Blastokonidie (neboli blastospory) jsou kvasinkové buňky oválného či kulatého tvaru o velikosti kolem 3-15 µm. Množí se nepohlavně pučením, kdy z buňky vypučí buňka dceřiná. Protáhlé blastokonidie se nazývají pseudohyfy (Votava, 2003; Bednář, 1996). Pseudohyfy jsou vláknité útvary a soubor těchto hyf se označuje jako pseudomycelium. Pseudomycelium vzniká z pučících buněk, jednotlivé buňky se však zůstávají navzájem spojené a protahují se (Klaban, 2005). Také mohou vytvářet pravé hyfy (Bednář, 1996). C. albicans a C. dubliniensis mohou vytvářit další útvary tzv. zárodečné klíčky (germ tubes) a chlamydokonidie (neboli chlamydospory) (Bednář, 1996; Merz a Hay, 2005). Zárodečné klíčky jsou jemná vlákna pučící z blastokonidií bez zaškrcení, můžeme je pozorovat v prvních hodinách kultivace (Votava, 2003; Bednář, 1996). Chlamydokonidie jsou kulaté, silnostěnné buňky o velikosti 7-10 µm. Mohou být umístěny na konci hyf nebo i po stranách hyf (Bednář, 1996). 2.5 Epidemiologie Kvasinky rodu Candida se u zdravých lidí chovají jako komenzálové. Jsou součástí normální mikrobiální sliznice dutiny ústní, gastrointestinálního traktu či pochvy (Sardi a kol., 2013). Tato kolonizace se může stát zdrojem infekce, pokud makroorganizmus 11

nad kvasinkami ztratí kontrolu (oslabení imunitního systému, potlačení normální mikroflóry) a dojde k jejich přemnožení či invazi. (Votava, 2010, 462) Kriticky nemocní nebo imunokompromitovaní pacienti jsou více náchylní k rozvoji infekcí. Mezi predisponující faktory, které se podílející na nárůstu infekcí patří rostoucí počet imunokompromitovaných pacientů, stále častější zavádění intravenózních katétrů, celková parenterální výživa, invazivní postupy, hojné užívání širokospektrých antibiotik, cytotoxická chemoterapie a transplantace (Sardi a kol., 2013). Kvasinky tohoto rodu mohou způsobit širokou škálu lidských nemocí, a to od povrchových slizničních infekcí (jako jsou vulvovaginální a orální kandidózy) až po život ohrožující invazivní infekce. Ve většině případů se orální a systémové infekce vyskytují pouze u jedinců, kteří jsou těžce nemocní a nebo imunokompromitováni. Orální kandidózy jsou velmi často diagnostikovány u nemocných infikovaných virem HIV a u osob s AIDS. Zatímco invazivní infekce jsou často spojeny s pacienty, kteří mají neutropenii (například v důsledku protinádorové nebo imunosupresivní léčby) (Sullivan a kol., 2004). C. albicans je převládající příčinou invazivních mykotických infekcí a představuje závažný zdravotní problém vzhledem k vysoké míře úmrtnosti, zvýšení nákladů na péči a době trvání hospitalizace. Ačkoli je C. albicans nejrozšířenějším druhem podílející se na invazivních mykotických infekcích, roste výskyt infekcí způsobených kandidami non-albicans. Studie z evropských zemí ukázala, že více než polovina případů kandidémie byla způsobena druhem C. albicans a incidence infekcí způsobených kandidami non-albicans byla 14 % pro C. glabrata a C. parapsilosis, 7 % pro C. tropicalis a 2 % pro C. krusei. C. dubliniensis se obvykle vyskytuje společně s jiným druhem, zejména s C. albicans. Byl zjištěn vysoký výskyt C. dubliniensis v ústní dutině nemocných infikovaných virem HIV a u pacientů s AIDS. C. parapsilosis je významný nozokomiální patogen a vyvolává zejména endoftalmitidy, endokarditidy, septické artritidy, peritonitidy a fungémie. Kandidózy způsobené druhem C. tropicalis jsou spojovány s rakovinou, zejména s leukémií a také s neutropenií. Kandidózy způsobené druhem C. glabrata byly hlášeny v souvislosti s užíváním flukonazolu (Sardi a kol., 2013). 12

2.6 Cesty přenosu U nemocí způsobených kandidami je hlavním zdrojem infekce pacient. Nezbytnou podmínkou pro propuknutí nemoci je snížení obranyschopnosti hostitele. Přenos kandid ze střeva do krevního oběhu vyžaduje přemnožení kvasinek ve střevě. To znamená, že většina infekcí se přenáší endogenně. Význam exogenního přenosu závisí na charakteru onemocnění. Bylo popsáno propuknutí nákazy vyplývající z kontaminovaných materiálů. Například pooperační endoftalmitida způsobená kontaminovanými intravitreálními roztoky nebo kandidóza způsobená kontaminovanými roztoky pro celkovou parenterální výživu. Byl prokázán přenos od personálů k pacientovi a také přenos mezi pacienty navzájem, ale tyto cesty přenosu jsou významné pouze ve specializovaném prostředí, jako jsou například popáleninové jednotky, transplantační jednotky a jednotky intenzivní péče (Anaissie a kol., 2009). 2.7 Faktory virulence Patogenita je umožněna díky několika virulenčním faktorům. Nejdůležitější z nich jsou adheze (přilnavost) k hostitelským tkáním či implantátům, tvorba biofilmu a sekrece hydrolytických enzymů (např. proteázy, fosfolipázy a hemolyziny). Dalšími virulenčními faktory jsou morfogeneze a přepínání fenotypu (Sardi a kol., 2013). Nejlépe byly tyto faktory popsány u C. albicans, a proto se tato kapitola zabývá především tímto druhem. 2.7.1 Adheze Hlavním faktorem kolonizace lidských tkání je přilnutí na hostitelské povrchy. Tento proces je řízen a indukován několika buněčnými signálními kaskádami. Kandidy mohou přilnout i na povrchy implantátů a vytvářet na nich biofilm. Adheze je dosaženo kombinací nespecifických (hydrofobnost a elektrostatické síly) a specifických mechanismů (adheziny) (Sardi a kol., 2013; Anaissie a kol., 2009). 13

Adheziny jsou specializované proteiny přítomné na povrchu buněk. Adheziny vážou aminokyselinové nebo cukerné zbytky na povrch jiných buněk nebo podněcují vazbu k abiotickým povrchům (Verstrepen a Klis, 2006). Mezi adheziny patří rodina genů ALS (agglutinin-like sequence) kódující velké povrchové buněčné glykoproteiny, které jsou zapojeny do procesu adheze k hostitelským povrchům (Hoyer, 2001). Als1p a Als5p mají adhezivní funkci k bukálním epiteliálním buňkám. Als1p je důležitý pro adhezi na sliznici dutiny ústní během rané fáze infekce (Yang, 2003). Dále sem patří gen HWP1 kódující vnější povrch manoproteinu (Calderone a Fonzi, 2001). Hwp1 (hyphal wall protein 1) je protein potřebný k vytvoření stabilního připevnění k epitelilním buňkám (Anaissie a kol., 2009). Dalším genem je INT1, který kóduje povrchový protein a mannosyl transferázu (Anaissie a kol., 2009). Delece v genu MNT1 může mít vliv na adhezi a virulenci. Geny PMT1, PMT6 jsou také potřebné pro adhezi k epiteliálním buňkám. Všechny tyto tři geny jsou zapojeny do syntézy mannanů, mannan je hlavní složkou buněčné stěny hub. A proto se proteiny Mnt1p, Pmt1p, Pmt6p mohou podílet na rozpoznávání hostitele (Yang, 2003). 2.7.2 Tvorba biofilmu Biofilmy jsou specifická a organizovaná společenstva buněk, která jsou připojena k různým živým i neživým povrchům (Douglas, 2003). Studie ukázaly, že mikroorganizmy téměř neexistují v jejich volné planktonické formě, ale jsou seskupeny dohromady a tvoří mnohobuněčná společenstva na tkáních, protézách, katétrech a dalších površích. Připevnění buněk na materiály je zprostředkováno nespecifickými interakcemi (hydrofobní a elektrostatické síly) a specifickými adhezin-ligandovými vazbami. Biofilmy mohou pomoci zachovat úlohu hub jako patogenů. Díky biofilmu jsou kvasinky schopny vyhnutou se hostitelským imunitním mechanismům, odolat antimykotickým látkám a odolat konkurenčnímu tlaku jiných organizmů (Sardi a kol., 2013). Tvorba biofilmu je jev se třemi základními fázemi: a) připevnění a kolonizace kvasinkových buněk k substrátu, b) růst buněk a tvorba bazální vrstvy, c) zrání 14

biofilmu - prodloužení hyf a pseudohyf, produkce extracelulární matrix (Anaissie a kol., 2009). 2.7.3 Sekrece hydrolytických enzymů Extracelulární hydrolytické enzymy produkované kandidami hrají důležitou roli v adhezi, penetraci do tkání, invazi a ničení hostitelských tkání. Nejdůležitější hydrolytické enzymy jsou sekretované aspartylové proteinázy a fosfolipázy (Sardi a kol., 2013). Kvasinkové buňky mají hydrolytické enzymy, které ničí nebo narušují složky hostitelských buněčných membrán, což vede k jejich dysfunkci anebo k narušení. Buněčné membrány jsou složeny z fosfolipidů a proteinů a na ně enzymy útočí. Proteinázy hydrolyzují peptidové vazby proteinů a fosfolipázy hydrolyzují fosfolipidy (Ghannoum, 2000). Sekretované aspartylové proteinázy (secreted aspartyl proteinases, sap) jsou produkovány C. albicans, C. parapsilosis a C. tropicalis (Anaissie a kol., 2009). SAP u C. albicans má 10 různých izoenzymů a ty jsou zodpovědné za aktivitu proteázy. Izoenzymy jsou kódovány pomocí genů SAP 1-10 (Sardi a kol., 2013). SAP jsou asociovány s různými místy a mohou mít různou patogenezi. Například exprese SAP 1-3 byla prokázána jako velmi zásadní pro povrchové infekce, kdežto SAP 4-6 mohou být důležité pro systémové infekce. Fosfolipázy jsou produkovány C. albicans, C. dubliniensis, C. glabrata, C. parapsilosis a C. tropicalis (Anaissie a kol., 2009). Fosfolipázy zahrnují čtyři skupiny: PLA, PLB, PLC a PLD (Calderone a Fonzi, 2001). Například fosfolipáza B je nezbytná pro virulenci u C. albicans a je vylučována v průběhu infekce (Anaissie a kol., 2009). Také produkce hemolyzinů hraje důležitou roli ve virulenci. Hemolyziny jsou nezbytné pro přežití a souvisí se získáváním železa. Hemolyziny jsou proteiny produkované mikroorganizmy k destrukci červených krvinek. Železo je zásadní prvek pro rozvoj mikroorganizmů, včetně kvasinek a schopnost získat tento prvek je zásadní pro vytvoření infekčního procesu (Sardi a kol., 2013). 15

2.7.4 Morfogeneze Kvasinky rodu Candida mají schopnost reverzibilního přechodu mezi jednobuněčnými kvasinkovými buňkami a růstem ve formě hyf (Calderone a Fonzi, 2001). Ze všech kandid, jen C. albicans a C. dubliniensis mohou vytvářet oba typy vláknitých útvarů (hyfy a pseudohyfy). Což naznačuje, že tyto kvasinky jsou schopny růst izotropicky (kvasinkové buňky) nebo apikálně na vrcholu (hyfy a pseudohyfy) a proto mohou být označovány jako polymorfní (Sardi a kol., 2013; Calderone a Fonzi, 2001). 2.7.5 Phenotypic switching ( Přepínání fenotypu ) Dalším virulenčním faktorem C. albicans je specifická fenotypová nestabilita, která umožňuje kmenům přepínat fenotyp kolonií, aniž by to ovlivnilo genotyp. Tento jev je označován jako přepínání fenotypu (Fidel, 1999). Přepínání fenotypu je spojeno s morfologickými změnami kolonií u C. albicans. Dochází k přechodu kolonií hladkých na drsné nebo k přechodu kolonií bílých na neprůhledné a k dalším morfologickým změnám (Merz a Hay, 2005). Pomes a kol. prokázali, že nízké dávky UV záření vedli u C. albicans k tvorbě hrubých kolonií ve vysokých frekvencích (3 x 10-3 ) a navrácení tohoto fenotypu na původní hladké kolonie se vyskytlo ve frekvenci 9 x 10-4. Proto je přepínání fenotypu reverzibilní a vyskytuje se ve vysokých frekvencích (Calderone a Fonzi, 2001). Nejvíce studovaný je kmen WQ-1, ve kterém hladké bílé kolonie přecházejí na ploché šedé kolonie. Existuje několik rozdílů mezi těmito dvěma typy kolonií, zahrnují tvar buněk, povrch buněčných struktur a pučení při 37 C (Merz a Hay, 2005). 16

3 Charakteristika jednotlivých druhů 3.1 Candida albicans Candida albicans je považována za významný patogenní druh kvasinek rodu Candida a je často izolována z klinického materiálu (Votava, 2010). C. albicans je u zdravých lidí izolována z gastrointestinálního traktu, z ústní sliznice, z vaginální sliznice a také z kůže. Obvykle nezpůsobuje problémy, ale pokud dojde k narušení normální mikroflóry je schopna vyvolat symptomatické infekce sliznic (Votava, 2010; Kim a Sudbery, 2011). Povrchové slizniční infekce vznikají narušením normální mikroflóry v důsledku užívání antibiotik, vaginální infekce jsou způsobeny hormonálními změnami u jinak zdravé ženy (Calderone a Clancy, 2011). C. albicans je potenciálním patogenem, což znamená, že u zdravého hostitele se chová jako komenzál a za určitých podmínek může dojít ke vzniku virulence (Bednář, 1996). Faktory virulence jsou podrobně popsány v kapitole 2.8. 3.2 Candida glabrata C. glabrata byla původně zařazena do rodu Torulopsis a to z důvodu nedostatečné produkce pseudohyf. V roce 1978 bylo zjištěno, že schopnost produkovat pseudohyfy není spolehlivý rozlišovací faktor pro příslušníky rodu Candida. A proto bylo navrženo, aby byla T. glabrata zařazena do rodu Candida (Fidel, 1999; Bialková a Šubík, 2006). C. glabrata byla považována za poměrně nepatogenní druh u zdravých jedinců a jen zřídka způsobovala závažné infekce. Ale se zvýšeným užíváním imunosupresiv spolu s širokospektrými antimykotickými léky se frekvence infekcí způsobených C. glabrata výrazně zvýšila. V závislosti na místě infekce je C. glabrata druhou nebo třetí nejčastější příčinou kandidóz po C. albicans. Infekce mohou být slizniční nebo systémové a jsou běžné u abnormálních hostitelů (u osob s oslabenou imunitou nebo u osob s DM). C. glabrata je nedimorfní kvasinka, která roste pouze jako malá blastokonidie. Je to jediný druh kandid, který netvoří pseudohyfy při teplotách nad 37 C (Fidel, 1999). 17

Důležitým rozlišujícím genetickým znakem C. glabrata je její haploidní genom. Ostatní CNA včetně C. albicans mají diploidní genom (Silva a kol., 2012). C. glabrata se v poslední době ukázala jako významný nozokomiální patogen, ale zatím je jen málo známo o epidemiologii. Vyznačuje se přirozeně zvýšenou rezistencí vůči antimykotikům, konkrétně vůči flukonazolu (Fidel, 1999). C. glabrata je často izolována z intravenózních katétrů, stolice, moči a z různých povrchů u onkologických a HIV pacientů, dále u pacientů s DM, transplantáty, popáleninami a u novorozenců (Bialková a Šubík, 2006). U C. glabrata jsou faktory virulence mnohem méně prostudovány než u C. albicans (Fidel, 1999). Absence hyf, absence specifických antigenů a nevelká adheze k endoteliálním a epiteliálním buňkám jsou fakta, která nepodporují schopnost C. glabrata způsobovat infekci. Potenciálními virulenčními faktory mohou být fosfolipázy, které usnadňují pronikání přes fosfolipidovou bariéru epiteliálních buněk nebo adheze k trombocytům, které usnadňují šíření kvasinek v krevním oběhu (Bialková a Šubík, 2006). Hlavní skupina adhezinů je kódována genovou rodinou EPA (epithelial adhesin). Struktura Epa proteinů je podobná jako u proteinů Als. Pouze jedna studie prokázala, že C. glabrata je schopna produkovat proteinázy, ale typ proteinázy nebyl specifikován (Silva a kol., 2012). 3.3 Candida tropicalis C. tropicalis lze nalézt jako součást běžné komenzální mikroflóry u člověka, mohou způsobovat invazivní kandidózy u pacientů se závažným primárním onemocněním, především u pacientů s rakovinou (Calderone a Clancy, 2011). C. tropicalis je považována za třetí nejčastěji izolovaný druh CNA z krve a močových kultur (Silva a kol., 2012). Bylo zjištěno, že C. tropicalis je nejčastější příčinou invazivní kandidózy u pacientů s neutropenií, například u pacientů s akutní leukémií nebo u těch, kteří podstoupili transplantaci kostní dřeně (Kothavade a kol., 2010). Některé epidemiologické studie prokázaly, že C. tropicalis je spojena s vyšší úmrtností než ostatní druhy CNA včetně C. albicans. Tato tendence by mohla souviset s faktory virulence, které tento druh vykazuje. Mezi faktory virulence patří tvorba biofilmu, sekrece proteinázy a dimorfismus (Silva a kol., 2012). 18

C. tropicalis je stále se rozvíjející patogen po celém světě. Mezi hlavní faktory, které přispívají ke vzniku infekcí způsobených C. tropicalis, patří: a) zvýšené používání antimykotik, b) zvyšující se počet pacientů s oslabenou imunitou, c) dlouhodobé používání katétrů, d) užívání širokospektrých antibiotik, e) komplikace při léčbě základních subklinických stavů spojených s nesnášenlivostí k antimykotikům, opakující se infekce a nozokomiální nákazy (Kothavade a kol., 2010). 3.4 Candida dubliniensis C. dubliniensis je fenotypově i genotypově velmi podobná druhu C. albicans (Klaban, 2005). Tento druh byl původně identifikován jako C. albicans na základě toho, že oba tyto druhy mají schopnost produkovat zárodečné klíčky a chlamydospóry (Sullivan a Coleman, 1998). C. dubliniensis byla poprvé popsána Sullivanem a jeho kolegy v případě orální kandidózy u HIV-infikovaných jedinců a pacientů s AIDS v roce 1995 (Sullivan a kol., 2005). Tento druh byl pojmenován po Dublinu, hlavním městě Irské republiky, kde byl nový druh poprvé identifikován (Sullivan a Coleman, 1998). C. albicans a C. dubliniensis jsou fenotypově velmi podobné a z toho důvodu je často velmi obtížné je od sebe odlišit (Calderone a Clancy, 2011). K jejich odlišení bylo vyvinuto velké množství fenotypových a genotypových testů. Identifikační fenotypové testy jsou shrnuty v tabulce 1. Tyto testy většinou nejsou 100 % přesné (Sullivan a kol., 2004). Testy založené na principu PCR jsou stále nejpřesnější metody k identifikaci C. dubliniensis (Calderone a Clancy, 2011). V ideálním případě by v klinických laboratořích měla být použita více než jedna metoda ke konečné identifikaci izolátů C. dubliniensis. S tímto druhem se jen zřídka setkáváme v normální orální mikroflóře u imunokompetentních jedinců, ale setkáváme se s ním v ústní dutině imunokompromitovaných pacientů, zejména u HIV-infikovaných jedinců a u pacientů s AIDS, kteří dostávali antimykotickou léčbu (Sullivan a kol., 2004). Velmi zajímavou vlastností C. dubliniensis je nízká incidence tohoto druhu jako složky normální lidské mikroflóry a jako příčina systémových infekcí (Sullivan a kol., 2005). Sullivan a jeho kolegové provedli studii orální kandidózy a prokázali, že C. dubliniensis se 19

vyskytovala v ústní dutině u 26 % HIV-infikovaných jedinců a u 32 % pacientů s AIDS s klinickými příznaky orální kandidózy. Zatímco u pacientů bez klinických příznaků orální kandidózy se vyskytovala u 18 % HIV-infikovaných jedinců a u 25 % pacientů s AIDS (Sullivan a kol., 2004). Existuje jen několik studií, které se zabývají srovnáním virulence C. dubliniensis a C. albicans (Sullivan a kol., 2005; Gilfillan a kol., 1998; Hannula a kol., 2000). Zjistilo se, že jsou určité rozdíly mezi virulenčními faktory těchto dvou srovnávaných druhů. C. dubliniensis dobře roste in vitro při 37 C, za určitých podmínek vytváří biofilm a bylo zjištěno, že tempo růstu je nižší než u C. albicans. Dále bylo prokázáno, že C. dubliniensis je schopna podstoupit přepínání fenotypu a to dokonce častěji než C. albicans (Sullivan a kol., 2004). Tab. 1: Porovnání specifických fenotypových znaků u C. albicans a C. dubliniensis (upraveno podle Sullivan a kol., 2004) Znak C. albicans C. dubliniensis Produkce zárodečných klíčků ++ + Produkce chlamydokonidií + ++ Růst při teplotě 37 C a ++ ++ Růst při teplotě 42 C a ++ - Růst při teplotě 45 C a + - Růst v bujónu s 6,5 % NaCl + - Růst na xylóze b + - Růst na laktóze b + - Růst na α-methyl-d-glukozidu b + - Růst na trehalóze b + +- Barva kolonií na CHROMagaru zelené tmavě zelené Morfologie kolonií na Palově agaru hladké nerovné a na bramborovém dextrózním agaru b na základě údajů získaných použitím ID32C identifikačního systému kvasinek (biomérieux, France) 20

4 Kandidózy Jak již bylo zmíněno výše, infekce způsobené rodem Candida se nazývají kandidózy nebo kandidiázy. Kandidózy mohou být jednak povrchové (neboli superficiální) a druhou skupinu tvoří invazivní kandidózy (Sardi a kol., 2013). Tabulka 2. Tab. 2: Rozdělení kandidóz (upraveno podle Merz a Hay, 2005) Povrchové kandidózy Kožní infekce Infekce nehtů Slizniční infekce Invazivní kandidózy Kandidózy kardiovaskulárního systému Kandidózy ledvin a močových cest Kandidózy centrálního nervového systému Kandidózy respiračního systému Kandidózy gastrointestinálního systému Diseminovaná kandidóza a kandidémie 4.1 Povrchové kandidózy Povrchové infekce jsou výsledkem invaze povrchových vrstev kůže anebo sliznic mikroorganizmy. Makroskopicky jsou infekce charakterizovány tvorbou šedavých plaků, které jsou obklopeny edémy (Merz a Hay, 2005). 4.1.1 Kožní infekce Kandidy mohou napadnout jakýkoliv povrch těla a způsobit tak povrchové infekce kůže, vlasů a nehtů. Suchá neporušená kůže je velmi odolnou překážkou proti fungální invazi. Nejčastějšími původci infekcí kůže a nehtů jsou C. albicans a C. tropicalis. Tyto organizmy upřednostňují růst v teplém vlhkém prostředí, což jsou například kožní záhyby u obézních 21

jedinců, prostory mezi prsty na rukou a nohou, třísla a podpaží (Anaissie a kol., 2009; Dismukes a kol., 2003). Mezi nejčastější typy kožní kandidózy patří intertrigo, interdigitální (neboli meziprstní) kandidóza, perianální (neboli plenková) vyrážka a chronická mukokutánní kandidóza. Intertrigo je nejčastější klinická forma kožní kandidózy. Kandidy mohou snadno kolonizovat kožní záhyby, zejména za ušima, pod prsy, v tříslech a v podpaží. Při intertrigu jsou léze zarudlé s přítomností puchýřků a vřídků. Při interdigitální kandidóze jsou postiženy kožní záhyby mezi prsty rukou. Kožní záhyby mezi prsty jsou macerované a svědí. Dalším typem kožní kandidózy, týkající se především dětí, které nosí plenky, je perianální vyrážka. Tato vyrážka se vyskytuje v perianální oblasti a na hýždích (Merz a Hay, 2005). Chronická mukokutánní kandidóza popisuje skupinu onemocnění, při kterých mají pacienti perzistentní nebo opakující se infekce kůže, nehtů a sliznic. CMK je považována za nejzávažnější onemocnění z povrchových kandidóz a je asociována s řadou predisponujících faktorů. Obecně mezi predisponující faktory patří kongenitální imunologické nebo endokrinologické poruchy (Merz a Hay, 2005; Kirkpatrick, 2001). 4.1.2 Infekce nehtů Mezi kandidózy napadající nehty patří infekce nehtového valu, paronychium. Postižené nehtové valy jsou bolestivé, zarudlé a oteklé. Onychomykóza je plísňová infekce nehtů. Obě infekce mohou být často viděny u jedinců s dlouhodobým máčením rukou ve vodě (např. u umývačů nádobí a barmanů) a také u pacientů s DM (Anaissie a kol., 2009; Dismukes a kol., 2003). 4.1.3 Slizniční infekce Poškození sliznic je považováno za nejčastější klinický projev kandidózy. Mezi slizniční infekce patří orální kandidóza a vulvovaginální kandidóza (Merz a Hay, 2005). 22

4.1.3.1 Orální kandidóza Orální kandidóza je běžná oportunní infekce ústní dutiny a je způsobena přemnožením nebo infekcí dutiny ústní kandidami (Akpan a Morgan, 2002). C. albicans je nejčastější druh zodpovědný za orální kandidózu (80-90 %). Tyto infekce jsou nejčastější u novorozenců, starších osob a vyskytují se v souvislosti se závažnými onemocněními, jako jsou například DM, leukémie, neoplazie a HIV infekce (Dismukes a kol., 2003). Existuje několik různých typů orální kandidózy: akutní pseudomembranózní, akutní atrofická, chronická atrofická, chronická hyperplastická a angulární cheilitida (Merz a Hay, 2005). Akutní pseudomembranózní kandidóza je nejčastější forma orální kandidózy (Dismukes a kol., 2003). Také známá pod pojmem soor (česky moučnivka). Je charakterizována šedobílými pseudomembranózními lézemi na dásních, jazyku a také na sliznici dutiny ústní. Léze, zejména pokud pokrývají větší plochy, mohou být bolestivé a narušit příjem potravy. Někdy se mohou rozšířit na sliznici jícnu, jak je vidět u pacientů s HIV/AIDS a způsobit poruchy polykání. Akutní atrofická kandidóza je charakterizována bolestivou erytematózní sliznicí, zejména na jazyku (Merz a Hay, 2005). S chronickou atrofickou kandidózou se často setkáváme u starších osob, zejména u těch, kteří používají zubní protézy. Tato infekce je často asymptomatická, ale někdy se vyznačuje zarudnutím a otokem sliznic pod zubními protézami. Chronická atrofická kandidóza byla zaznamenána u 24-60 % nositelů zubních protéz (Merz a Hay, 2005; Dismukes a kol., 2003). Chronická hyperplastická kandidóza (leukoplakie) se projevuje skvrnitými nebo homogenními bílými lézemi, které se mohou objevit na sliznici dutiny ústní a na postranních okrajích jazyka. Je zde prokázána souvislost s kouřením. Tato kandidóza je schopna progredovat až k těžké dysplazii nebo k zhoubnému bujení a proto se jí někdy říká kandidózní leukoplakie (Akpan a Morgan, 2002). Angulární cheilitida je klinicky charakterizována zarudnutím a fisurami v koutcích úst. Zvrásnění v koutcích úst a podél nosoretních rýh, zejména u starších lidí, vede k chronicky vlhkému prostředí, které předurčuje k těmto lézím (Merz a Hay, 2005; Akpan a Morgan, 2002). 23

4.1.3.2 Vulvovaginální kandidóza Vulvovaginální kandidóza je infekční onemocnění ženských genitálií způsobené kvasinkami rodu Candida, jedná se o druhou nejčastější vaginální infekci. Během reprodukčního věku prodělá nejméně 75 % žen alespoň jednu epizodu VVK a u 40-50 % žen dojde k opakovanému výskytu tohoto onemocnění (Dismukes a kol., 2003; Kliment a kol., 1998). C. albicans je nejčastějším původcem VVK (85-90 %), dále je to C. glabrata (5-10 %) a C. tropicalis (1-3 %) (Horák, 2011b). Candida je přítomna v genitálním traktu asi u 10-20 % asymptomatických zdravých žen v plodném věku. K přenosu do pochvy dochází z přilehlé perianální oblasti a poté kandidy adherují k epiteliálním vaginálním buňkám (Dismukes a kol., 2003; Horák, 2011b). Mezi rizikové faktory, které jsou asociovány se zvýšeným výskytem VVK, patří těhotenství, DM, užívání orální antikoncepce s vysokým obsahem estrogenů či předchozí léčba antibiotiky (Merz a Hay, 2005). Germinace kandid zvyšuje kolonizaci a invazi do tkání. Faktory, které zvyšují nebo usnadňují germinaci (například již zmíněné těhotenství nebo hormonální antikoncepce s vysokým obsahem estrogenů) mají tendenci vyvolat symptomatické záněty pochvy, zatímco faktory, které inhibují klíčení (např. bakteriální mikroflóra) mohou zabránit akutní VVK u žen, které jsou pouze asymptomatickými přenašečkami kandid (Dismukes a kol., 2003). Ve většině případů se jedná o akutní formu VVK. Příznaky jsou většinou mírné, ale nepříjemné (svědění, vaginální bolest, dyspareunie, dysurie a vaginální výtok), rychle reaguje na lokální léčbu. Asi u 5 % žen se rozvíjí rekurentní forma VVK, je charakterizována 4 a více epizodami za rok (Anaissie a kol., 2009). U mužů jsou pohlavní infekce mnohem méně časté než u žen. Infekce se u nich projevují jako balanitidy s lézemi a erytémem na penisu (Merz a Hay, 2005; Anaissie a kol., 2009). 4.2 Invazivní kandidózy Mezi nejzávažnější infekce patří diseminované a orgánové kandidózy. Kandidy mohou do tkání pronikat invazí nebo krevním řečištěm, kde infikují například ledviny, plíce a bronchy, GI trakt (Bednář, 1996). 24

Kandidy mohou infikovat srdeční chlopně (endokarditida), myokard (myokarditida) a perikard (perikarditida). Nejčastějším typem je endokarditida (Calderone a Clancy, 2011). Kandidová endokarditida je závažné onemocnění, které je spojováno s vysokou úmrtností a s vysokou mírou recidivy (Doctor Fungus, 2007 [online]). Endokarditida se vyskytuje především u jedinců s poškozenou nebo protetickou srdeční chlopní, u intravenózních uživatelů drog a také u pacientů po kardiochirurgickém zákroku (Merz a Hay, 2005). Ledviny patří mezi nejčastější cílové orgány při infekcích krevního řečiště kandidami, izolaci kandid v moči (kandidurie) lze považovat za jeden z prvních projevů diseminované kandidózy. Kandidurie je především odrazem kolonizace dolních cest močových, často se vyskytuje u pacientů s močovými katétry, kteří jsou léčeni širokospektrými antibiotiky (Calderone a Fonzi, 2001). Močové katétry mohou sloužit jako brána vstupu pro mikroorganizmy do močových cest, všechny katétry mohou být kolonizovány, pokud je ponecháme na místě příliš dlouho (Dismukes a kol., 2003). Méně často se s kandidurií setkáme u pyelonefritidy (infekce ledvinných pánviček), která vzniká jako důsledek ascendentní infekce z dolních cest močových. Kandidy mohou infikovat CNS jako následek hematogenní diseminované kandidózy a také vznikají v důsledku pooperačních komplikací neurochirurgických postupů, zejména po umístění ventrikuloperitoneálního šantu (Calderone a Fonzi, 2001). Rozvíjí se akutní nebo chronické kandidové meningitidy a abscesy (Anaissie a kol., 2009). Respirační infekce mohou postihnout plíce a bronchy, objevují se především u pacientů se základním primárním onemocněním (Merz a Hay, 2005). Byly popsány dvě formy kandidové pneumonie. Jednou z nich je místní nebo difúzní bronchopneumonie vzniklá bronchogenním šířením. Druhou formou je pneumonie, která vznikla jako následek rozsáhlého rozsevu u pacientů s kandidémií (Dismukes a kol., 2003). Mezi příznaky esofageální kandidózy (EK) patří bolestivá dysfagie a případně i bolest na hrudi. Bílé skvrny, podobné těm u orální kandidózy, mohou být rozpoznány endoskopicky na sliznici jícnu. Epidemie HIV dramaticky zvýšila výskyt EK. U HIV-pozitivního pacienta může být EK prvním projevem AIDS. Odhaduje se, že 10-30 % pacientů s AIDS, kteří mají orální kandidózu, mohou mít také esofageální kandidózu (Merz a Hay, 2005; Calderone a Fonzi, 2001). 25

Žaludeční kandidózy jsou méně časté než EK, což znamená, že žaludeční sliznice je více odolná vůči kandidám. Kandidy obvykle postihují již existující žaludeční léze, zejména žaludeční vředy (Dismukes a kol., 2003). Diseminovanou kandidózu (DK) je možné definovat jako multiorgánovou infekci včetně možné kandidémie. Jak již bylo uvedeno, diseminované kandidózy mohou zahrnovat postižení CNS, ledvin nebo jiných orgánů a systémů. DK způsobená C. albicans a dalšími kandidami je asociována s oslabením, to můžeme vidět u pacientů s rakovinou, po chirurgickém výkonu, po transplantaci, u předčasně narozených dětí, u pacientů s popáleninami a u drogově závislých (Merz a Hay, 2005). Kandidémie neboli kandidóza krevního řečiště se stala jednou z nejvýznamnějších nozokomiálních infekcí v průběhu posledních dvou dekád (Doctor Fungus, 2007 [online]) Klinické příznaky kandidémie jsou velmi nespecifické - horečka a septický stav (Ráčil a kol., 2007). C. albicans byla historicky nejčastější příčinou kandidémie, zachycena v 85-90 % všech kandidémií. Od roku 1990 došlo ke změně, incidence C. albicans postupně klesala (až pod 50 %) a v ostatních případech byly izolovány CNA (Doctor Fungus, 2007 [online]; Haber a kol., 2009b). Tato změna souvisí s plošným zavedením flukonazolu do lékařské praxe (Haber a kol., 2009b). GI trakt je primárním zdrojem infekce, původ je tedy endogenní. S exogenním zdrojem se setkáváme jen výjimečně, jedná se o dlouhodobě zavedené centrální žilní katétry (Haber a kol., 2009a; Haber a kol., 2008). 26

5 Léčba kvasinkových infekcí K léčbě infekcí způsobených kvasinkami rodu Candida se používají antimykotika. Antimykotika rozdělujeme na lokálně a celkově neboli systémově působící (Horák, 2011a). Podle chemické struktury se antimykotika dělí na azoly, polyeny, antimetabolity, echinokandiny a ostatní (Rozsypal, 2008), jak je přehledně uvedeno v tabulce 3. Tab. 3: Přehled antimykotik (upraveno podle Rozsypal, 2008) Skupina Zástupci Azoly Imidazoly Ketokonazol, Mikonazol Triazoly Flukonazol, Intrakonazol, Vorikonazol, Posokonazol, Ravukonazol Polyeny Amfotericin B, Nystatin, Natamycin Antimetabolity Flucytosin Kaspofungin, Anidulafungin, Echinokandiny Micafungin Ostatní Allylaminy Terbinafin, Naftifin Morfoliny Amorolfin 5.1 Azoly V klinické praxi se azoly používají od konce 70. let 20. století. V budoucnu se tato skupina léčiv bude dále rozšiřovat (Krausová, 2009). Azoly jsou vhodné pro lokální užití i pro systémové užití. Mikonazol, klotrimazol, flutrimazol, ekonazol, ketokonazol jsou příklady léčiv pro lokální užití (Horák, 2011a). Azoly pro systémové užití lze podle struktury rozdělit na dvě skupiny. Starší imidazoly (ketokonazol, mikonazol) s molekulou se dvěma atomy dusíku v pětičlenném kruhu jsou méně specifické a z toho důvodu mají více nežádoucích účinků. Novější triazoly (flukonazol, itrakonazol, vorikonazol, posakonazol, ravukonazol) mají méně nežádoucích účinků a jejich heterocyklus obsahuje tři atomy dusíku. Triazoly se mohou dále dělit na generace: do první řadíme flukonazol, itrakonazol a do druhé vorikonazol, posakonazol, ravukonazol (Rozsypal, 2008). Všechna azolová antimykotika (imidazoly, triazoly) inhibují aktivitu enzymu cytochrom P450-dependentní C-14α-demethylázy (kódovaný genem ERG11), což je enzym zodpovědný 27

za přeměnu lanosinu na ergosterol (Merz a Hay, 2005; Pánková, 2012). Inhibice tohoto enzymu zablokuje syntézu ergosterolu v buněčných membránách hub, kdy ergosterol je hlavní složkou buněčných membrán. Nedostatek ergosterolu a akumulace fosfolipidů v buňce vedou ke smrti buňky (Merz a Hay, 2005; Rozsypal, 2008). Flukonazol je nejpoužívanější azolová sloučenina. Má příznivou klinickou účinnost, je bezpečný a dobře dostupný ve formě orálních a parenterálních přípravků. Díky těmto vlastnostem došlo k rozšířenému používání flukonazolu pro léčbu i profylaxi. Proto byly brzy zaznamenány flukonazol-rezistentní izoláty, s čímž souvisí snaha vyvinout nové sloučeniny s příznivým účinkem proti flukonazol-rezistentním organizmům (Merz a Hay, 2005). Obr. 1: Struktura flukonazolu (http://www.doctorfungus.org/thedrugs/fluconazole.php) 5.2 Polyeny Polyeny jsou makrolidová antibiotika s nenasycenými dienovými vazbami (Merz a Hay, 2005). Mezi polyeny řadíme tři antimykotika: amfotericin B, nystatin a natamycin. Nystatin a natamycin jsou vhodná léčiva pro lokální užití a amfotericin B je vhodný pro systémové užití (Horák, 2011a). Polyeny se vážou na steroly, převážně na ergosterol. Důsledkem této vazby dojde k narušení permeability buněčné membrány a k úniku intracelulárních iontů (draslíku a hořčíku) z cytoplazmy. Polyeny také narušují funkci oxidativních enzymů v cílových buňkách (Merz a Hay, 2005; Matoušková, 2005). Amfotericin B patřil mezi významná antimykotika používaná k léčbě invazivních kandidóz. Dnes už se v klasické, tzv. konvenční podobě příliš nevyužívá pro jeho vysokou 28

toxicitu (Horák, 2011a). Akutní toxicita je provázená slabostí, horečkou, třesavkou, bolestmi hlavy a chronickou nefrotoxicitou (Horák, 2011a; Rozsypal, 2008). Aby se snížila toxicita, využívají se různé lipidové formy amfotericinu B: lipozomální amfotericin B, koloidní disperze (ABCD) a lipidový komplex (ABLC). V ČR se využívá lipidový komplex a koloidní disperze (Horák, 2011a). Obr. 2: Struktura amfotericinu B (http://www.doctorfungus.org/thedrugs/ampho_deoxycholate.php) 5.3 Antimetabolity Hlavním zástupcem antimetabolitů je flucytosin (fluorovaná pyrimidinová báze 5-fluorocytosin, 5-FC) (Rozsypal, 2008). Flucytosin je aktivním transportem převeden do buňky pomocí cytosin-permeázy, v buňce je aktivován na 5-fluorouracil (5-FU) pomocí enzymu cytosin-deaminázy (Merz a Hay, 2005; Matoušková, 2005). 5-FU může být převeden pomocí enzymů na 5-fluorodeoxyuridin monofosfát (FdUMP), který je specifickým inhibitorem thymidylát syntetázy (zásadní enzym pro syntézu DNA) a 5-fluorouridin trifosfát (FUTP) (Klepser, 2001; White a kol., 1998). Vestavěním do mykotické RNA je narušena syntéza proteinů a výsledkem je zánik buňky (Rozsypal, 2008; Ráčil a kol., 2008). 29

Obr. 3: Struktura flucytosinu (http://www.doctorfungus.org/thedrugs/flucytosine.php) 5.4 Echinokandiny Echinokandiny jsou antimykotika určená pro systémové použití. Do klinické praxe byly zavedeny teprve nedávno (začátkem 21. století). Mezi hlavní zástupce řadíme kaspofungin, anidulafungin a micafungin (Horák, 2011a). Echinokandiny jsou polysyntetické cyklické glykoproteiny o molekulové hmotnosti kolem 1200 kd (Haber, 2005). Chemicky jde o cyklické hexapeptidy s N-acyl lipidovým postranním řetězcem. Struktura postranního řetězce je zásadní pro antifungální aktivitu. (Haber, 2008, 297) Mechanismus účinku se výrazně liší od ostatních skupin antimykotik (Haber, 2005). Echinokandiny inhibují β-1,3-d-glukan syntázu nezbytnou pro produkci 1,3-β-glukanu, což je hlavní složka buněčné stěny většiny hub. β-1,3-d-glukan syntáza je enzymový komplex, který se skládá ze dvou podjednotek: z velkého intergrálního membránového proteinu, který je označovaný jako FKS1 nebo FKS2 (kódovaný genem FKS1 nebo FKS2) a z malé podjednotky RHO1. Glukany spolu s chitinem, mannany a manoproteiny jsou hlavní složky buněčné stěny hub. β-1,3-d-glukan syntáza je vhodným místem pro zásah antimykotik, nenachází v savčích buňkách a díky tomu tyto látky vykazují jen minimální nefrotoxicitu a hepatotoxicitu. Echinokandiny se vážou na buněčnou stěnu a mohou difúzně ovlivnit její syntézu (Merz a Hay, 2005). V důsledku toho dojde k narušení integrity buňky a k lýze buňky (Rozsypal, 2008). 30

Obr. 4: Struktura kaspofunginu (http://www.doctorfungus.org/thedrugs/caspofungin.php) 5.5 Ostatní 5.5.1 Allylaminy Hlavními zástupci allylaminů jsou terbinafin a naftifin (Rozsypal, 2008). Jsou to léčiva lokálně i systémově působící, ale mají omezené použití jen na superficiální mykózy (Horák, 2011a). Mechanismus účinku allylaminů je podobný jako u azolů, na rozdíl od azolů k inhibici dochází dříve a za účasti jiného enzymu. Allylaminy inhibují aktivitu enzymu skvalenepoxidázy (kódovaný genem ERG1), který konvertuje skvalen na 2,3-oxoskvalen (Merz a Hay, 2005; Horák, 2011a; Hamal a Svobodová, 2011). To vede k akumulaci skvalenu a následně k zvýšené propustnosti membrány a k narušení buněčné organizace. 31

Nejčastěji používaným allylaminem v klinické praxi je terbinafin (Merz a Hay, 2005). Terbinafin je syntetické antimykotikum. Je vysoce lipofilní povahy a má tendenci hromadit se v kůži, v nehtech a v tukové tkáni (Doctor Fungus, 2007 [online]). 5.5.2 Morfoliny Amorolfin je jediným zástupcem morfolinů. Morfoliny fungují na podobném principu jako allylaminy a také se používají jen k léčbě superficiálních mykóz (Hamal a Svobodová, 2011). 32

6 Rezistence 6.1 Definice rezistence Rezistence je absence aktivity léčiva proti konkrétnímu mikroorganizmu. Tento termín je nepřesný, je důležité rozlišovat mezi in vitro, molekulární a klinickou rezistencí. In vitro rezistence je vyšší hodnota minimální inhibiční koncentrace (MIC, jednotky µg/ml) léčiva proti určitému kmenu než mezní hodnota tohoto léčiva (tzv. breakpoint). Molekulární rezistence znázorňuje rezistenci na genetické úrovni, což může zahrnovat detekci bodových mutací, genové převody či genové amplifikace, které vedou ke zvýšené expresi nebo mitotické rekombinaci. Klinická rezistence znamená klinické selhání v reakci na léčbu antifungálními látkami. Nejen in vitro aktivita léčiva, ale také farmakokinetické a farmakodynamické vlastnosti, imunitní stav hostitele, faktory virulence a permanentní katétry mohou mít vliv na konečný klinický výsledek (Merz a Hay, 2005). 6.2 Primární a sekundární rezistence Rezistence může být primární (vnitřní) a sekundární (získaná) (Kanafani a Perfect, 2008). Primární rezistence znamená přirozenou odolnost určitého druhu nebo rodu bez předchozí expozice léčivem (Merz a Hay, 2005; Kanafani a Perfect, 2008). Jedná se o předvídatelný typ rezistence, a proto je kladen důraz na identifikaci druhů hub z klinického materiálu (Kanafani a Perfect, 2008; Klepser, 2001). Typickým příkladem tohoto typu rezistence je rezistence C. krusei k flukonazolu (Kanafani a Perfect, 2008). Je-li C. krusei izolována z klinického materiálu, flukonazol nesmí být vybrán pro léčbu (Klepser, 2001). Sekundární rezistence se může vyvinout prostřednictvím různých mechanismů, které mohou vést k selhání léčby (Anaissie a kol., 2009). Nejčastěji se rozvíjí u dosud citlivých kmenů po expozici antimykotikem a obvykle je závislá na změněné genové expresi (Kanafani a Perfect, 2008). Je mnohem méně předvídatelná a problematičtější než primární rezistence (Klepser, 2001). Příkladem je vznik rezistence k flukonazolu u C. albicans (Kanafani a Perfect, 2008). 33

6.3 Mechanismy rezistence k antimykotikům 6.3.1 Azoly Rezistence proti azolovým antimykotickým látkám může být vnitřní, jak je tomu u C. krusei a C. glabrata nebo může být získaná v průběhu léčby. Získaná rezistence nás zajímá zvláště u pacientů s AIDS, kteří trpí orální kandidózou. Přesto, že flukonazol a jiné azoly, jsou účinné při léčbě orální kandidózy, může docházet k selhání léčby spojené se vznikem azolových rezistentních kmenů C. albicans. Získaná azolová rezistence byla hlášena také u ústních izolátů C. glabrata od pacientů se syndromem AIDS (Barker a Rogers, 2006). Je známo několik mechanismů rezistence vůči azolům u rodu Candida, které jsou popsány níže. Přehled viz obrázek 5. 6.3.1.1 Bodové mutace v ERG11 Jedním z mechanismů rezistence u kandid jsou bodové mutace v genu ERG11, které vedou k aminokyselinovým substitucím (Pfaller, 2012; Marie a White, 2009). Aby byly mutace efektivní, musí dojít ke snížení afinity enzymu k léčivu bez poškození jeho buněčné funkce. Substituce aminokyselin jsou omezeny na konkrétní hot spots v cílových enzymech (Marie a White, 2009). Bylo zjištěno přes 80 aminokyselinových substitucí v ERG11 (Kanafani a Perfect, 2008). Bodové mutace vedoucí k nahrazení argininu lysinem na aminokyselině 467 (zkráceně R467K, kde R a K představují arginin a lysin) jsou spojeny s azolovou rezistencí u klinického kmene C. albicans (Merz a Hay, 2005; Klepser, 2001). Předpokládá se, že tato mutace má za následek změny v hem kofaktoru (Klepser, 2001). Další bodová mutace v ERG11 byla vyvinuta v laboratoři u kmene C. albicans, jedná se o nahrazení threoninu alaninem v poloze 315 (T315A) (Merz a Hay, 2005). Mutace T315A se nachází v aktivním místě enzymu, snižuje se enzymatická aktivita a vazba azolů na aktivní místo, což způsobuje rezistenci k flukonazolu (Merz a Hay, 2005; White a kol., 1998). D116E E266D jsou další dvě bodové mutace, které se často vyskytují v ERG11 u C. albicans (Merz a Hay, 2005). 34

6.3.1.2 Zvýšená exprese ERG11 Byla prokázána zvýšená exprese ERG11 u klinických izolátů C. albicans rezistentních k azolům, přesto podíl tohoto jevu na rozvoji rezistencí zůstává prozatím neznámý (Merz a Hay, 2005). Zvýšená exprese ERG11 vždy doprovází další změny spojené s rezistencí - expresi efluxních pump, bodovou mutace R467K, a proto musí být ještě přesně vymezeno, jakou hraje roli ve vývoji azolové rezistence (Klepser, 2001). Zvýšení exprese ERG11 může být dosaženo prostřednictvím zvýšeného počtu kopií a či amplifikací genu (Merz a Hay, 2005). 6.3.1.3 Efluxní pumpy Ke snížení intracelulární akumulace léčiva může dojít zabráněním vstupu léčiva do buňky nebo usnadněním jejího odstranění, případně kombinací obou mechanismů. Exprese nebo zvýšená exprese efluxních pump je považována za primární mechanismus, kterým kandidy mění intracelulární akumulaci léčiva (Klepser, 2001). Byly identifikovány dva typy efluxních pump, které přispívají k rezistenci vůči azolům u kandid: ATP binding cassette (ABC) transporters a major facilitator superfamily (MFS) proteins (Merz a Hay, 2005). ABC systém se skládá ze 4 proteinových domén: dvou membránových domény, z nich se každá skládá z 6 nebo 7 segmentů a dvou nukleotidových vazebných domén (White a kol., 1998). Jako zdroje energie využívá ATP, které se váže na ABC (Merz a Hay, 2005; White a kol., 1998). MFS proteiny neobsahují nukleotidové vazebné domény. Jsou složeny převážně z 12 až 14 membránových segmentů (White a kol., 1998). MFS proteiny využívají protonovou hnací sílu v membráně (H+ gradient přes membránu) jako zdroj energie. ABC transportéry jsou kódovány několika geny, hlavními jsou CDR geny. Zvýšená exprese genů CDR1 a CDR2 koreluje s azolovou rezistencí u kmenů C. albicans. Údaje týkající se genetické regulace MFS bílkovin jsou omezenější než u ABC systému. MDR1 je hlavním MFS genem. Současné údaje naznačují korelaci mezi zvýšenou expresí MDR1 a azolovou rezistencí u C. albicans a C. dubliniensis (Merz a Hay, 2005). Jedním z rozlišujících znaků mezi geny CDR a MDR je, že exprese u CDR je spojena s efluxem různých azolů, včetně flukonazolu, itrakonazolu, ketokonazolu, zatímco exprese 35