VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY

VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXVI PROSINEC 2007 ČÍSLO 6 PREDIKTIVNÍ A PROGNOSTICKÉ FAKTORY INVAZIVNÍHO KARCINOMU PRSU V PRAXI 1 Petr CINEK, 2 Stanislav FILIP 1 Oddělení klinické onkologie Ústřední vojenské nemocnice Praha, Praha 2 Klinika onkologie a radioterapie Fakultní nemocnice a Lékařské fakulty Univerzity Karlovy, Hradec Králové Souhrn Invazivní karcinom prsu je nemoc heterogenní. Nejenže pacientky přicházejí v různých stadiích vývoje onemocnění, ale tumory jsou také velmi odlišné, pokud jde o rychlost jejich růstu, schopnost metastazovat a další biologické vlastnosti. Pro karcinom prsu byla stanovena celá řada důležitých prognostických a preditivních faktorů. Těmi hlavními jsou klinické stadium onemocnění, velikost primárního nádoru, stav spádových lymfatických uzlin, histologický typ karcinomu, stupeň diferenciace (grading), stav exprese steroidních receptorů a receptoru HER-2/neu, invaze do krevních a lymfatických cév, markery proliferační aktivity, biologický a hormonální věk pacientky, hodnoty sérových markerů. V naší práci jsme vyhodnotili soubor pacientek s invazivním karcinomem prsu léčených na Oddělení klinické onkologie ÚVN Praha v letech 1991 2004 se zaměřením na prognostický význam těchto ukazatelů: velikost primárního nádoru, patologická N-klasifikace, stadium onemocnění, grading, stav exprese estrogenových receptorů (ER), stav exprese receptoru HER-2/neu a typ provedené operace. Klíčová slova: Invazivní karcinom prsu; Prognostický faktor; Prediktivní faktor; Celkové přežití. Predictive and Prognostic Factors of Invasive Breast Cancer in Practice Summary The invasive breast cancer is a heterogenous disease. Patients come not only with different stages of the disease, but also their carcinomas are various in growth speed, metastatic potency and other biological attributes. A number of important prognostic and predictive factors was determined for breast cancer. The main factors are clinical stage, size of primary tumor, involvement of regional lymph nodes, histological type of carcinoma, grade, status of steroid and HER-2/neu receptors expression, invasion into blood and lymph vessels, proliferative markers, biological and hormonal age of patients, and levels of serum markers. In our study we evaluated a group of breast cancer patients who were treated at the Department of Clinical Oncology of the Central Military Hospital Prague in 1991 2004, with a view to prognostic signification of these indicators: primary tumor size, pathological N classification, stage, grade, oestrogen receptor (ER) expression, HER-2/neu receptor status and type of performed surgery. Key words: Invasive breast cancer; Prognostic factor; Predictive factor; Overall survival. Úvod Prognostický faktor je jakákoli naměřená hodnota dostupná v době stanovení diagnózy invazivního karcinomu prsu, která koreluje s celkovým přežitím pacientek nebo přežitím bez příznaků nemoci bez ohledu na léčbu. Prediktivní faktor je jakákoli hodnota spojená s odpovědí na danou terapii (1). Prediktivní faktory obecně informují, jaký přínos bude mít konkrétní léčba u konkrétní pacientky.

206 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 Invazivní karcinom prsu je nemoc heterogenní. Nejenže pacienky přicházejí v různých stadiích vývoje onemocnění, ale tumory jsou také velmi odlišné, pokud jde o rychlost jejich růstu, schopnost metastazovat a další biologické vlastnosti. Prospěch z jakékoli konkrétní terapie je také u každé pacientky jiný. Adjuvantní léčba může jednu pacientku vyléčit, u jiné prodloužit život a u třetí dokonce paradoxně zkrátit dobu přežití. Existuje mnoho praktických důvodů, proč je velmi užitečné identifikovat faktory spojené s delší nebo kratší dobou přežití bez ohledu na léčbu (tj. prognostické faktory) a dále identifikovat pacientky, u nichž bude konkrétně definovaná, nejlépe pak individualizovaná léčba s větší či menší pravděpodobností úspěšná (tj. prediktivní faktory). Některé faktory jsou zároveň prognostické i prediktivní. Pro karcinom prsu byla stanovena celá řada důležitých prognostických a prediktivních faktorů. Ne všechny ale našly využití v každodenní klinické praxi při rozhodování o strategii léčby u konkrétní pacientky. Těmi hlavními faktory jsou: klinické stadium onemocnění, velikost primárního nádoru, stav spádových lymfatických uzlin, histologický typ karcinomu, stupeň diferenciace (grading), stav exprese steroidních receptorů a receptoru HER-2/neu, invaze do krevních a lymfatických cév, markery proliferační aktivity, biologický a hormonální věk pacientky, hodnoty sérových markerů (6). V naší práci jsme vyhodnotili soubor pacientek s invazivním karcinomem prsu léčených na Oddělení klinické onkologie ÚVN Praha v letech 1991 až 2004 se zaměřením na prognostický význam těchto ukazatelů: velikost primárního nádoru, patologická N klasifikace, stadium onemocnění, grading, stav exprese estrogenových receptorů (ER), stav exprese receptoru HER-2/neu a typ provedené operace. Charakteristika souboru Do souboru bylo zařazeno 281 žen s invazivním karcinomem prsu z celkového počtu 324 pacientek, které byly diagnostikovány a léčeny na Oddělení klinické onkologie ÚVN Praha v období od 15. prosince 1991 do 31. prosince 2004. Ze souboru bylo vyřazeno 43 žen, vesměs z důvodu nemožnosti zpětně získat sledované parametry, jako například stav receptoru HER-2/neu v primárním nádoru. Dále nebyly do souboru zařazovány pacientky s onemocněním ve stadiu carcinoma in situ. Průměrný věk pacientek byl 62 let a 7 měsíců, medián věku 63 let. Nejmladší pacientce bylo 34 let a nejstarší 85 let. Z hlediska hormonální aktivity bylo 43 (15,3 %) pacientek premenopauzálních, 11 (3,9 %) perimenopauzálních a nejvíce 227 (80,8 %) bylo postmenopauzálních. Ke dni 12. 4. 2006 zemřelo 50 žen, tj. 17,8 % souboru. Z tohoto počtu bylo 13 (26 %) úmrtí v důsledku jiných příčin než nádorových a tyto pacientky zemřely v remisi nádorové choroby. Třicet sedm pacientek (74 % všech úmrtí) zemřelo na generalizaci karcinomu prsu. U 269 pacientek se jednalo pouze o jednostranné onemocnění, z toho 127krát vpravo a 142krát vlevo, 12 pacietek mělo synchronní nebo metachronní nádor ve druhém prsu. Duplicitní tumory v jiných orgánech se vyskytly u 23 žen, nejčastěji se jednalo o karcinomy gastrointestinálního traktu. V souboru bylo identifikováno více histologických typů karcinomů mléčné žlázy. Nejvíce bylo čistých duktálních karcinomů 179 (63,7 %), čistých lobulárních karcinomů 37 (13,1 %) a karcinomů smíšených duktálních a lobulárních 40 (14,2 %). Dohromady tyto 3 nejčastější varianty představovaly 91 % (256 pacientek) všech primárních nádorů. Jiné histologické typy byly zjištěny u 25 žen, což představuje dohromady 9 % všech hodnocených pacientek. Stupeň diferenciace primárních nádorů byl stanoven u 155 pacientek (55,2 %) podle čtyřstupňové klasifikace. Nejvíce karcinomů bylo vyhodnoceno s gradingem II a III (85, resp. 58), nejméně s gradingem I a IV (8, resp. 4). U 126 žen nebyl grading hodnocen. Stav HER-2/neu v primárním nádoru byl ve 107 případech hodnocen podle manuálu DAKO skórem 0, skóre 1+ bylo zjištěno v 91 karcinomech. Dohromady tedy bylo hodnocení stavu HER-2/neu jako negativní (skóre 0 a 1+) u 198 žen (70,5 %). Jednoznačná pozitivita s hodnoceným DAKO skórem 3+ byla zjištěna u 45 pacientek (16 %). Imunohistochemický nález označovaný skórem 2+ mělo 38 (13,5 %) primárních nádorů. Většina pacientek měla vysoce pozitivní expresi estrogenových jaderných receptorů (ER), a to v rozmezí 70 100 %. Nicméně druhou početně největší skupinou byly ženy s nulovou expresí estrogenových receptorů nebo s expresí pod 10 %. Podobné bylo rozložení souboru i při hodnocení progesteronových receptorů (PgR), jen s tím rozdílem, že maximum primárních karcinomů (90) nevykazovalo žádnou expresi tohoto receptoru.

ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 207 TNM klasifikace a stadium onemocnění byly hodnoceny podle současné aktuální klasifikační metodiky (TNM klasifikace zhoubných novotvarů, UICC, 2002, 6. vyd., česká verze, 2004) platné od 1. ledna 2004, což bylo důvodem, proč byla stadia onemocnění všech pacientek diagnostikovaných před tímto datem přehodnocena, aby bylo možné jednotlivé zkoumané parametry porovnávat. Z hlediska rozsahu onemocnění bylo 76 pacientek (27 %) diagnostikováno ve stadiu I, 138 pacientek (49 %) ve stadiu II, 46 pacientek (16,5 %) ve stadiu III a 21 pacientek (7,5 %) ve stadiu IV. Odstranění primárního tumoru bylo provedeno u 251 žen: 191 pacientek (68 %) podstoupilo ablaci prsu a 60 (21,3 %) parciální chirugický výkon. U třiceti žen (10,7 %) byla provedena pouze biopsie nádoru k histologické verifikaci s ponecháním tumoru in situ a pacientky byly léčeny systémovou terapií. Poměr mezi počtem provedených ablací prsu a počtem prs záchovných operací se v průběhu let postupně měnil ve prospěch parciálních chirurgických výkonů a v roce 2004 byly oba tyto typy chirurgické léčby v souboru stejně frekventní. Při hodnocení velikosti primárního karcinomu je zřejmé, že většina pacientek měla největší průměr nádoru v době diagnózy méně než 2 cm (T1) nebo méně než 5 cm (T2) v průměru 107, resp. 124 žen. Čtyřicet devět pacientek (17,4 %) ale mělo již lokálně pokročilé nádory T3 a T4. U jedné pacientky se primární nádor nepodařilo identifikovat. Dohromady bylo v celém souboru pacientkám odstraněno a vyšetřeno 2207 axilárních mízních uzlin. U třiceti pěti žen nemohla být histologicky vyšetřena žádná lymfatická uzlina. V jedenácti případech byl počet odstraněných uzlin 1 3, ve 136 případech 4 9 uzlin a 10 a více uzlin bylo získáno u 99 pacientek. Největší počet odebraných lymfatických uzlin při jedné operaci byl 31. Průměrný počet odebraných axilárních mízních uzlin v průběhu let narůstal a v roce 2004 byl 11,5 uzliny na jednu exenteraci axily. Patologická N klasifikace byla stanovena u 246 pacientek. Negativní nález ve smyslu uzlinových metastáz (pn0) byl u 140 pacientek, metastatické postižení maximálně 3 uzlin (pn1) bylo v 73 případech, 4 9 (pn2) lymfatických uzlin s metastázou karcinomu mělo 28 žen a více než 9 postižených uzlin (pn3) bylo u 5 případů. Jak již bylo uvedeno, u 35 pacientek nebylo možné stanovit patologickou N klasifikaci (pnx). Dvacet jedna pacientek (7,5 %) mělo v době diagnózy identifikované vzdálené metastázy, které byly prokázány standardními vyšetřovacími metodami: RTG plic, sonografie jater a scintigrafie skeletu. Statistické metody Hodnocení celkového přežití pacientek bylo provedeno pomocí počítačového statistického programu NCSS, PASS and GESS 2001 fy NCSS Kaysville, Utah, USA, testem neparametrické analýzy Kaplan- -Meier Curves na hladině významnosti p = 0,05. Byly stanoveny křivky přežití v závislosti na zadaných ukazatelích. Na ose x je uveden počet dní od stanovení diagnózy, na ose y je procentuální pravděpodobnost přežití. Statistické zpracování provedl ing. Milan Zouhar z Kliniky onkologie a radioterapie Lékařské fakulty UK a Fakultní nemocnice v Hradci Králové. Výsledky Graf 1 znázorňuje křivky přežití v závislosti na velikosti primárního karcinomu neboli na klinické T klasifikaci. Čím byl primární nádor větší, tím měly pacientky větší pravděpodobnost kratšího přežívání. pravděpodobnost přežití 100% 75% 50% 25% T4 0 1050 2100 3150 4200 počet dní Graf 1: Křivky přežití v závislosti na velikosti primárního nádoru ct ( p = 0,05) Počet pozitivních lymfatických uzlin (pn klasifikace) také nepřímo úměrně koreloval s celkovým přežitím. Prognosticky výrazně nepříznivou skupinou byly ženy s metastázami ve více než 9 uzlinách (graf 2). I. a II. stadium onemocnění nevykazovalo v našem souboru z hlediska přežívání zásadní rozdíly, nicméně III. a IV. stadium již výrazně ovlivnilo délku života pacientek (graf 3). T1 T3 T2

208 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 pravděpodobnost přežití 100% 75% 50% 25% 0 1050 2100 3150 4200 počet dní Graf 2: Křivky přežití v závislosti na počtu pozitivních axilárních uzlin pn (p = 0,05) pravděpodobnost přežití 100% 75% 50% 25% IV Graf 3: Křivky přežití v závislosti na stadiu onemocnění (p = 0,05) Hodnocení vztahu gradingu primárních karcinomů a přežití ukazuje graf 4. Nádory jsme rozdělili do 2 skupin s vysokým stupněm diferenciace (grading I a II) a s nízkým stupněm diferenciace (grading III a IV). Z hlediska přežívání je jednoznačně nepříznivým faktorem nižší stupeň diferenciace invazivního karcinomu. I 0 4-9 > 9 1-3 0 1050 2100 3150 4200 počet dní II III Vztah celkového přežití byl závislý i na expresi jaderného estrogenového receptoru v nádoru. Při pozitivitě estrogenových receptorů alespoň v 10 % nádorových buněk byly křivky přežití signifikantně lepší než v situaci, kdy byly tyto receptory velmi nízké nebo nebyly prokázány vůbec (graf 5). Graf 6 hodnotí vliv stavu receptoru HER-2/neu na přežívání pacientek v našem souboru. Jednoznačná imunohistochemická pozitivita, označovaná jako skóre 3+, znamenala špatnou prognózu. O něco lepší prognózu měla skupina žen s nádory HER-2/neu negativními skóre 0 a 1+. Nejlepší křivka přežití byla zaznamenána u skóre 2+. Jde o nehomogenní skupinu 38 pacientek, kde část invazivních karcinomů je HER-2/neu pozitivních a část negativních. Graf 7 ukazuje křivky přežití v závislosti na typu provedené operace. Biopsie znamená, že pacientkám nebyl odstraněn primární karcinom. Vesměs se jednalo o pacientky ve IV. stadiu onemocnění. Na druhou stranu jsme nezjistili žádný signifikantní rozdíl mezi provedenou ablací a prs záchovným chirurgickým výkonem. pravděpodobnost přežití 100% 75% 50% 25% > 50% 10 50% < 10% 0 1050 2100 3150 4200 počet dní Graf 5: Křivky přežití v závislosti na stupni exprese estrogenových receptorů (p = 0,05) pravděpodobnost přežití 100% 75% 50% 25% I + II III + IV pravděpodobnost přežití 100% 75% 50% 25% 0 a 1+ 2+ 3+ 0 1050 2100 3150 4200 počet dní Graf 4: Křivky přežití v závislosti na stupni diferenciace primárních nádorů gradingu (p = 0,05) 0 1050 2100 3150 4200 počet dní Graf 6: Křivky přežití v závislosti na stavu exprese receptoru HER-2/neu (p = 0,05)

ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 209 pravděpodobnost přežití 100% 75% 50% 25% Graf 7: Křivky přežití v závislosti na typu provedené operace primárního nádoru: ablace, kvadrantektomie a ponechání primárního nádoru in situ (p = 0,05) Diskuse kvadrant ablace biopsie 0 1050 2100 3150 4200 počet dní Hrubá incidence invazivního karcinomu prsu má v populaci českých žen dlouhodobě trvalý vzestup, zatímco hrubá mortalita se v posledních letech pohybuje přibližně na stejné úrovni. To znamená, že narůstá absolutní počet žijících pacientek, které se pro toto onemocnění léčily nebo léčí (barevná příl. s. I, obr. 1). Cílem současného přístupu k těmto pacientkám je snaha zjistit a vyhodnotit faktory, které určují prognózu onemocnění a které dokáží předpovědět úspěch či neúspěch konkrétně definované léčby u dané pacientky. Jsou to prognostické a prediktivní faktory. Velikost primárního nádoru dobře koreluje s prognózou onemocnění, což bylo prokázáno v mnoha studiích (6). V našem souboru byl tento fakt jednoznačně potvrzen, pokud jde o pokročilejší karcinomy ct3 a ct4. Žádný rozdíl v pravděpodobnosti přežití pacientek s karcinomy ct1 a ct2 po 8 letech od stanovení diagnózy je v našem souboru způsoben faktem, že při tomto hodnocení nebyl brán zřetel na stav axilárních mízních uzlin. Dalším hodnoceným kritériem byla patologická N klasifikace. Rozdíly v přežití jednotlivých skupin pacientek nebyly tak velké v porovnání s literárními údaji (5), nicméně pacientky se stavem axilárních uzlin pn3 (10 a více pozitivních uzlin) měly jednoznačně velmi špatnou prognózu. Křivky přežití podle stadia onemocnění přinesly překvapivý výsledek pro stadium I a II. Podle literárních údajů (6) je největší pravděpodobnost nejdelšího přežití u stadia I. V našem souboru ale byla tato pravděpodobnost prakticky stejná jak pro I., tak pro II. stadium. Při bližším zkoumání tohoto jevu se nabízí jedno vysvětlení. Období zařazování pacientek do naší studie bylo relativně dlouhé 13 let. Během této doby se měnila léčebná schémata a doporučení, do praxe byly zaváděny nové, účinnější léky, měnila se role radioterapie. Kontrolou chorobopisů bylo zjištěno, že v dřívějších letech nebyly pacientky z našeho souboru s I. stadiem onemocnění tak často léčeny adjuvantní chemickou a/nebo hormonální léčbou, na rozdíl od současných standardů. Navíc pro léčbu relapsů se dříve méně často používaly taxany a cílená biologická léčba byla nedostupná. To vše vedlo ke zhoršení přežití pacientek ve stadiu I v provnání se stadiem II. Při hodnocení závislosti mezi stupněm diferenciace primárních karcinomů a dobou života pacientek jsme spojili nižší grading I a II do jedné skupiny a porovnali tuto skupinu se skupinou žen, jejichž nádory měly grading vyšší III a IV. Toto sloučení bylo provedeno z důvodu malého počtu nádorů, jež měly stupeň diferenciace I (8) a IV (4). Naše poznatky odpovídají literálním údajům (6), vyšší grading znamená horší prognózu. Stav exprese estrogenových jaderných receptorů (ER) je také významným prognostickým a prediktivním faktorem (2, 6). V našem souboru jsme pacientky rozdělili do 3 skupin podle stupně pozitivity ER v primárních nádorech: méně než 10 %, 10 50 % a více než 50 %. V souladu s literálními údaji jsme potvrdili signifikantně lepší pravděpodobnost přežití při expresi ER v nádorových buňkách od 10 % do 100 %. Pozitivita ER umožňuje podání antiestrogenní terapie (10). Nadměrná exprese receptoru HER-2/neu v membráně nádorových buněk je negativním prognostickým faktorem a jako prediktivní faktor předurčuje pacientky s těmito nádory k systémové chemické léčbě na bázi antracyklinů a k cílené biologické léčbě (8, 11, 12). V našem souboru jsme pozorovali negativní prognostickou roli pozitivity HER-2/neu (skóre 3+) v porovnání se skupinou pacientek, jejichž nádory byly HER-2/neu negativní (skóre 0 a 1+). Pravděpodobnost přežití byla nejlepší u skupiny pacientek, jejichž karcinomy měly expresi receptoru stanovenou jako skóre 2+. Část těchto karcinomů (HER-2/neu skóre 2+) je HER-2/neu pozitivních a část HER-2/neu negativních. V literatuře je udávána skutečná pozitivita HER-2/neu 2+ nádorů, potvrzená průkazem amplifikace příslušného kódujícího genu, v 10 % až 50 % (3, 4, 9). V našem souboru jsme stanovení amplifikace tohoto genu indikovali jen u malého počtu nádorů, a to vždy v korelaci s klinickým průběhem onemocnění (relaps duk-

210 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 tálního invazivního karcinomu). Proto tuto skupinu nelze blíže stratifikovat. Vyhodnocení vztahu mezi způsobem odstranění primárního tumoru (ablace versus prs záchovná operace) a pravděpodobností přežití v souboru potvrzuje fakt, že správně indikovaný parciální chirurgický výkon nemá vliv na celkové přežití (7). Závěr V našem souboru 281 pacientek s invazivním karcinomem prsu jsme potvrdili prognostický význam pro pravděpodobnost přežití u následujících ukazatelů: velikost primárního nádoru, počet pozitivních axilárních mízních uzlin, stadium onemocnění, stupeň diferenciace primárního nádoru, stav exprese estrogenových receptorů a stav exprese receptoru HER-2/neu. Nezjistili jsme rozdíl mezi provedenou ablací prsu a kvadrantektomií. Literatura 1. CIANFROCCA, M. GOLDSTEIN, LJ. Prognostic and predictive factors in early-stage breast cancer. Oncologist., 2004, vol. 9, no. 6, p. 606 616. 2. DILLON, DA. Molecular Markers in the Diagnosis and Staging of Breast Cancer. Seminars in Radiation Oncology, 2002, vol. 12, no. 4, p. 305 318. 3. DOWSETT, M., et al. Correlation between immunohistochemistry (HercepTest) and fluorescence in situ hybridization (FISH) for HER-2 in 426 breast carcinomas from 37 centres. J. Pathol., 2003, vol. 199, no. 4, p. 411 417. 4. FALO, C., et al. Algorithm for the diagnosis of HER-2/neu status in breast-infiltrating carcinomas. Am. J. Clin. Oncol., 2003, vol. 26, no. 5, p. 465 470. 5. KENDAL, WS. Lymph node-based prognostics: limitations with individualized cancer treatment. Am. J. Clin. Oncol., 2006, vol. 29, no. 3, p. 298 304. 6. KLENER, P. Klinická onkologie. 2002. 7. LESAR, M. STANEC, M. BANOVIC M. Significance of the relative size of a breast tumor in deciding the method of surgical treatment. Tumori, 2006, vol. 92, no. 1, p. 18 20. 8. MÉNARD, S., et al. Biologic and therapeutic role of HER2 in cancer. Oncogene, 2003, vol. 22, no. 42, p. 6570 6578. 9. OGURA, H., et al. Evaluation of HER-2 status in breast carcinoma by fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry. Breast Cancer, 2003, vol. 10, no. 3, p. 234 240. 10. PONZONE, R., et al. Antihormones in prevention and treatment of breast cancer. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2006, 1089, p. 143 158. 11. TAGLIABUE, E., et al. The early relapse of premenopausal patients after surgery for node-positive breast carcinoma. Breast Cancer Re.s Treat., 2001, vol. 70, no. 2, p. 155 156. 12. XU, R., et al. Amplification of HER-2/neu Gene in HER- -2/neu-Overexpressing and Nonexpressing Breast Carcinomas and Their Synchronous Benign, Premalignant, and Metastatic Lesions Detected by FISH in Archival Material. Modern Pathology, 2002, vol. 15, no. 2, p. 116 124. Podporováno Výzkumným záměrem MZO 00179906. Korespondence: Pplk. MUDr. Petr Cinek Ústřední vojenská nemocnice Praha Oddělení klinické onkologie U Vojenské nemocnice 1200 169 02 Praha 6-Střešovice e-mail: petr.cinek@uvn.cz Do redakce došlo 9. 3. 2007

ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 211 MEMBRÁNOVÝ RECEPTOR HER-2/neu STRUKURA A FUNKCE, PROGNOSTICKÝ A PREDIKTIVNÍ VÝZNAM PRO PACIENTKY S INVAZIVNÍM KARCINOMEM PRSU 1 Petr CINEK, 2 Stanislav FILIP 1 Oddělení klinické onkologie Ústřední vojenské nemocnice Praha, Praha 2 Klinika onkologie a radioterapie Fakultní nemocnice a Lékařské fakulty Univerzity Karlovy, Hradec Králové Souhrn Receptor HER-2/neu, patřící do rodiny transmembránových HER receptorů, hraje významnou roli při spuštění signální dráhy, která zprostředkovává přenos extracelulárního podnětu do jádra buňky. Fyziologické pochody vedoucí k aktivaci receptoru i jeho celá signální kaskáda jsou dnes dobře prostudovány. Zvýšená HER-2/neu signalizace při nadbytku receptoru v buněčné membráně je zapojena ve složitých pochodech kancerogeneze a je zodpovědná za vytvoření malignějšího fenotypu nádorové buňky s agresivnějším biologickým chováním. Vyšetření stavu exprese HER-2/neu v nádorových buňkách invazivního karcinomu prsu se provádí pomocí imunohistochemických metod, počet kopií kódujícího genu (c-erbb-2) lze určit fluorescenční in situ hybridizací. Odštěpená extracelulární doména receptoru je detekovatelná v séru pacientek. Zvýšená exprese receptoru HER-2/neu je negativním prognostickým faktorem pro pacientky s invazivním karcinomem prsu, protože tyto ženy jsou více ohroženy časným relapsem a generalizací choroby. Kromě toho je overexprese HER-2/neu také prediktivním faktorem, protože pomáhá vybrat pacientky, které jsou vhodné pro cílenou biologickou léčbu a pro kombinovanou chemoterapii na bázi antracyklinů. Klíčová slova: Invazivní karcinom prsu; Receptor HER-2/neu; Overexprese; Prognostický faktor; Prediktivní faktor. The Membrane HER-2/neu Receptor Structure and Function, Prognostic and Predictive Role for Invasive Breast Cancer Patients Summary The HER-2/neu receptor, a member of transmembrane HER receptors family, plays a very important role in activation of the signalling downstream path which mediates the transfer of extracellular signal into the cell nucleus. The physiological processes, leading to receptor activation, as well as its whole signalling cascade are understood well today. The increased HER-2/neu activation, in the case of its abundance in cellular membrane, participates in complicated processes of cancerogenesis and is liable for the formation of tumor cells with a more malignant phenotype and more aggressive biological behaviour. The status of HER-2/neu expression in invasive breast cancer cells is assessed by immunohistochemical methods, and the number of encoding gene copies (c-erbb-2) by fluorescent in situ hybridization. The measurement of dividual extracellular receptor domain is possible in patients blood serum. The increased HER-2/neu receptor expression is a negative prognostic factor for invasive breast cancer patients because these women have a higher risk for early recurrence and generalization of the disease. Moreover, HER-2/neu overexpression is also a predictive factor which helps to mark patients who benefit from the target biological treatment and anthracyclin based chemotherapy. Key words: Invasive breast cancer; HER-2/neu receptor; Overexpression; Prognostic factor; Predictive factor. Úvod Zhoubná nádorová onemocnění provázejí lidstvo odnepaměti a jsou důkazy o jejich výskytu již tisíce let před naším letopočtem. Stejně tak staré jsou ale i pokusy o jejich léčení. V naší moderní době můžeme pozorovat trvale se zvyšující incidenci malignit v české populaci pro nádorové onemocnění se nyní léčí každý třetí Čech a každý čtvrtý na něj zemře. Nejčastějším zhoubným nádorem žen je karcinom prsu s hrubou incidencí 110,45 v roce 2003 ÚZIS ČR (barevná příl. s. I, obr. 2). Karcinom prsu je velmi nehomogenní společenství někdy i mnoha různých klonů nádorových buněk, které se od sebe navzájem liší svým genotypem, fenotypem, svými biologickými vlastnostmi a

212 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 odpovědí na onkologickou léčbu. Dalším typickým rysem buněk karcinomu mléčné žlázy je jejich schopnost měnit se v čase, v maligních buňkách probíhají následné genetické změny, které většinou vedou k posílení a stabilizaci více maligního potenciálu. Navíc podanou onkologickou léčbou můžeme vyselektovat rezistentní buněčné klony. To vše se ve svém důsledku projeví progresí choroby se všemi negativními dopady pro pacientku. A to jsou také důvody, proč je stále v popředí zájmu kliniků co nejpřesnější předpověď biologického chování karcinomů, k čemuž slouží také stanovení exprese receptoru HER-2/neu. HER-2/neu receptor: struktura a funkce v normální tkáni Receptor HER-2/neu je transmemránový glykoprotein a je produktem genu c-erb-b2. Má svoji vnitřní tyrozinkinázovou aktivitu a jeho molekulární hmotnost je 185 kda. Tento receptor patří do rodiny dnes již dobře poznaných HER (human epidermal receptor) neboli erbb receptorů, která se skládá ze čtyř homologních, vzájemně spolupracujících členů označovaných HER-1, HER-2, HER-3 a HER-4 (barevná příl. s. II, obr. 3). Transmembránové HER receptory přenášejí extracelulární podněty do jádra buňky: po navázání ligandu na extracelulární doménu, dimerizaci receptoru a aktivaci tyrozinkinázy se spustí složitá signální kaskáda. Receptor HER-2/neu má tři části: extracelulární, transmembrální a intracelulární (barevná příl. s. II, obr. 4). Extracelulární doména se skládá ze 632 aminokyselin a jako pro jedinou z celé rodiny HER receptorů pro ni zatím nebyl identifikován žádný známý ligand (barevná příl. s. III, obr. 5). Hydrofobní transmembrální část je složena z 22 aminokyselin a zajišťuje ukotvení receptoru k buněčné membráně. Intracelulární doména, tvořená 580 aminokyselinami, obsahuje místo odpovědné za tyrozinkinázovou aktivitu a další regulační funkce (4). Za fyziologického stavu jsou receptory HER rodiny důležité pro plynulou obnovu epiteliálních tkání. Každý HER receptor je v zásadě inaktivní monomer, který se stává dimerem v odpovědi na navázání ligandu, nejčastěji růstového faktoru. Tento proces se nazývá homodimerizace, jde-li o receptor toho samého typu (např. dimer HER-1/HER-1), daleko častěji však dochází k heterodimerizaci, naváže-li se jiný receptor HER rodiny (např. dimer HER-1/HER-2) (barevná příl. s. III, obr. 6). Teprve tento dimerizační proces má za následek aktivaci receptoru a autofosforylaci tyrozinkinázy, která poté spouští kaskádu metabolických pochodů tvořících komplexní signální dráhu přenášející extracelulární podnět do jádra buňky (4). Zde přenesený signál modifikuje genovou kontrolu a proteinovou transkripci, což má ve svém důsledku účinky na klíčové buněčné regulační procesy, jako jsou diferenciace, adheze, růst, migrace a apoptóza. Porušená, dysregulovaná receptorová funkce a změny v několika nebo ve všech signálních kaskádách mohou vyústit v buněčnou transformaci a maligní zvrat. V intracelulárním přenosu signálů, vycházejících z HER receptorů a směřujících do jádra buňky, jsou nejčastěji zapojeny dráha Ras/MAPK a dráha PI3-K/ /Akt (4). HER-2/neu vykazuje výraznou strukturální podobu s HER-1, ale doposud pro něj nebyl zjištěn žádný známý ligand (2, 7). Proto jeho aktivace bývá spojena prakticky vždy s heterodimerizací s dalšími členy rodiny HER. Navíc receptor HER-2/neu hraje klíčovou roli při tvorbě heterodimer, protože jako dimerický partner je preferován a v některých lidských tkáních se dokonce jedná o nejčastěji se vyskytující heterodimery. Dimery obsahující HER- -2/neu také dokáží produkovat silnější intracelulární signály než ty, které vznikají z jiných komplexů (5). Receptor HER-2/neu v nádorech Receptor HER-2/neu vykazuje abnormální nebo zvýšenou expresi v mnoha typech nádorů, což svědčí pro jeho zapojení v tumorigenezi. Mimoto jeho nadměrná exprese koreluje se stadiem a progresí nemoci, přežitím a odpovědí na léčbu. Informace o heterodimerách a jejich aktivaci jsou v normálních buňkách a tkáních pod neustálou kontrolou, ale v nádorových buňkách byla zjištěna dysregulace této sítě, kdy zvýšená exprese HER-2/neu (např. v karcinomu prsu) nebo HER-1 (např. v karcinomu plic) poskytuje buňkám růstovou výhodu. Bylo prokázáno, že overexprese HER-2/neu, pozorovaná asi u 20 30 % karcinomů prsu a vaječníku, aktivuje PI3-K/Akt cestu přežití, čímž upřednostňuje buněčnou proliferaci inhibicí apoptózy. Signál přežití je za normálního stavu spárován s aktivací další, tzv. proliferační dráhy Ras/MAPK. Zvýšená HER- -2/neu exprese v nádorech proto zvyšuje a prodlužuje signalizaci prostřednictvím obou těchto drah,

ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 213 PI3-K/Akt i Ras/MAPK. Ve zvýšené přítomnosti HER-2/neu signálu je tedy umožněn posun od apoptózy k proliferaci a přežití (5), což potvrzuje spojení HER-2/neu receptoru s maligním fenotypem (4). Klíčová role členů HER rodiny ve zvyšování metastatického potenciálu spočívá také v jejich schopnosti vyvolat sekreci tkáňových membránových degradačních emzymů metaloproteáz (MMP), které modifikují tkáňovou architekturu prostřednictvím defektu v matrix a následně vedou k poruše interakcí mezibuněčných a interakcí buňka matrix. Tyto poruchy společně se změnami integrinové a kadherinové funkce jsou často pozorovány u nádorových buněk s aktivovanou HER signalizací. Usnadňují komunikaci mezi nádorovými buňkami a jejich proklouznutí z kontroly v mikroprostředí. Zejména tvorba nových interakcí HER receptorů s integriny, jako např. interakce HER-2/neu s integrinem α 6 β 4 a fokální adheze kináz spouští PI3-K cestu indukující vyplavení sekundárních poslů fosfoinositidů a kalcia. Tyto molekuly postupně aktivují multiproteinové komplexy, které hrají roli v reorganizaci aktinového cytoskeletu a tím v migraci nádorových buněk (1). Zjištěná vysoká exprese HER- -2/neu v invadopodiích nádorových buněk svědčí také pro její účast v buněčné migraci. Receptor HER-2/neu hraje predominantní roli v motogenní a mitogenní signalizaci. Možnosti stanovení receptoru HER-2/neu a genu c-erbb-2 v invazivním karcinomu prsu Přesné určení stavu tyrozinkinázového receptoru HER-2/neu v buňkách invazivního karcinomu prsu je nezbytné pro stanovení prognózy pacientky a dále určuje volbu chemické, hormonální a biologické léčby. Protože je zvýšená exprese receptoru HER- -2/neu téměř vždy důsledkem amplifikace příslušného protoonkogenu c-erbb-2, můžeme dnes standardními vyšetřovacími metodami identifikovat buď počet kopií genu c-erbb-2 v jádru buňky, nebo množství jeho produktu receptoru HER-2/neu v buněčné membráně, neboli stanovit membránovou pozitivitu. Počet kopií genu se vyšetřuje metodami fluorescenční in situ hybridizace (FISH) nebo chromogenní in situ hybridizace (CISH). Jde o metody náročné na přístrojové vybavení, zkušený personál, čas a jsou poměrně drahé. Stanovení exprese receptoru v buněčné membráně se provádí imunohistochemicky (IHC). Je to metoda široce dostupná, relativně jednoduchá, spolehlivá a levná. Oba postupy mají své výhody i nevýhody. Imunohistochemie obecně využívá afinitu antigenu a specifické protilátky a detekuje jejich vzájemnou vazbu. Při imunohistochemickém vyšetření invazivních karcinomů prsu se stanovuje stupeň HER-2/neu proteinové exprese v parafinových tkáňových vzorcích použitím protilátek, jež se vážou na HER-2/neu exprimovaný na buněčných membránách. Toto vyšetření je semikvantitativní a výsledek se udává jako odstupňované skóre od 0 do 3+. V současné době je v ČR nejčastěji používána pro hodnocení exprese HER-2/neu metodika DakoCytomation. Skóre 0 a 1+ znamená negativitu, skóre 3+ pozitivitu a skóre 2+ nejistotu. Fluorescenční in situ hybridizace zahrnuje hodnocení DNA v metafázických nebo interfázických buňkách za použití značených DNA sond a počítání mikroskopických signálů. Použití různých fotoreaktivních barviv umožňuje obarvit různé zkoumané chromozomální sekvence a simultánní analýzu mnohočetných sekvencí. FISH může být použita k detekci mnoha různých typů rozmanitých chromozomálních a genových abnormalit, abnormalit počtu, translokací, delecí a přesmyků. Vzhledem ke známému faktu, že overexprese receptoru HER-2/neu v karcinomech prsu je v naprosté většině případů výsledkem amplifikace příslušného genu, využívají se FISH metody stanovení kopií genu většinou k potvrzení imunohistochemické pozitivity 3+ nebo k potvrzení či vyvrácení pozitivity při skóre 2+. Dynamika amplifikace genu c-erbb-2 v synchronních benigních, předmaligních, maligních a metastatických lézích Nejčastějším histologickým typem maligního nádoru prsu je duktální invazivní karcinom. A právě jen u tohoto histologického typu byla potvrzena nadměrná membránová exprese receptoru HER-2/ /neu spojená s amplifikací příslušného genu v jádru buňky. Podle našich současných poznatků tedy můžeme hovořit o skutečné overexpresi HER-2/neu receptoru jen v případech duktálních karcinomů, což má zásadní důsledky pro indikaci biologické léčby. Vznik duktálního karcinomu z normálních buněk epitelu duktů můžeme sledovat přes duktální hyperplazii (DH), atypickou duktální hyperplazii (ADH) a

214 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 duktální karcinom in situ (DCIS), což jsou morfologické jednotky, které se ale také mohou vyskytovat synchronně již spolu s invazivním karcinomem (DIC). Při další progresi onemocnění dochází k vytvoření metastáz (M). Toto je typická vývojová řada invazivního duktálního karcinomu. Bylo zjištěno, že amplifikace genu pro receptor HER-2/neu se může objevit de novo v každém stadiu vývoje onemocnění od ADH až k metastázám. Nejčastěji se poprvé vyskytuje v ADH nebo DCIS, ale jen méně často v primárním nebo metastatickém karcinomu. Pokud již k amplifikaci dojde, pak se jedná o relativně stabilní genetickou změnu, jež je většinou předávána na vývojově vyšší stupně onemocnění (10). Jsou zdokumentovány ale i opačné případy, kdy primární nádor vykazoval vysokou expresi receptoru HER-2/neu s FISH vyšetřením potvrzenou amplifikací c-erbb-2 genu, nicméně buňky korespodující metastázy měly nižší membránovou pozitivitu receptoru a nebyla u nich prokázána amplifikace genu (6). Tyto případy existují, jsou ale výjimečné. Sérový HER-2: biologie, detekce, klinický význam Extracelulární doména (ECD) receptoru HER-2/ /neu prochází proteolytickým štěpením metaloproteázami a je odlučována do krve jako cirkulující antigen. HER-2/neu ECD je glykoprotein o hmotnosti 97 115 kd a je také někdy označován jako p105, ale všeobecně je znám jako sérový HER-2/ /neu. Sérový HER-2/neu je tedy cirkulující onkoprotein a může být detekován v séru zdravých lidí, stejně jako u pacientů s různými solidními nádory. Stanovení hladin sérového HER-2/neu poskytuje prognostické a prediktivní informace pro kliniku a může být využito pro monitorování pacientek s metastatickým onemocněním. Vyšetření sérového HER-2/neu poskytuje také doplňkové informace tam, kde není možné opakovat bioptické vyšetření tkáně v průběhu nádorové choroby (3, 8). Jak prokázaly mnohé studie, pacientky s HER-2/ /neu pozitivními nádory mají horší prognózu než ženy s HER-2/neu negativními nádory. Prognostický dopad HER-2/neu pozitivity souvisí zejména s prvními 3 až 4 lety po operaci. Důvodem pro časný relaps u HER-2/neu pozitivních nádorů je přítomnost zbytkové choroby již v době operace. Bylo zjištěno, že růstové faktory vyplavené během hojení operační rány stimulovaly přednostně růst HER-2/neu pozitivních nádorů (9). Tyto růstové faktory mají tedy pravděpodobně stimulační účinky na diseminované mikrometastázy HER-2/neu pozitivních karcinomů, jejichž přítomnost se předpokládá zejména u pacientek s pozitivními spádovými lymfatickými uzlinami. HER-2/neu receptorová overexprese je prediktorem odpovědi na chemickou léčbu antracykliny. Četné velké studie potvrdily, že pacientky s pozitivními spádovými lymfatickými uzlinami měly benefit z podání doxorubicinu, ale pouze v případě HER-2/neu pozitivních nádorů. Naopak žádný benefit nebyl pozorován v případě HER-2/neu negativity. HER-2/neu pozitivita dále souvisí s rezistencí na endokrinní léčbu, a to dokonce i u pacientek s pozitivními hormonálními receptory (5). Stav exprese membránového receptoru HER-2/neu předpovídá odpověď na cílenou biologickou léčbu monoklonální protilátkou trastuzumab, která je směřována proti extracelulární doméně receptoru. V současné době jsou touto protilátkou léčeny pacientky s HER-2/neu pozitivními karcinomy adjuvantně a paliativně. Závěr Vyšetření stavu receptoru HER-2/neu v membráně buněk se stalo standardní součástí diagnostiky invazivního karcinomu prsu. Zvýšená exprese tohoto receptoru má zásadní význam pro pacientky s duktálními nádory: jako negativní prognostický faktor pacientky předurčuje k agresivnější systémové léčbě pro vyšší riziko generalizace, jako prediktivní faktor vybírá pacientky k chemické léčbě antracykliny a k individualizované cílené biologické léčbě. Exprese receptoru HER-2/neu v prognóze a v predikci odpovědi na léčbu Literatura 1. FELDNER, JC. BRANDT, BH. Cancer cell motility on the road from c-erb-b2 receptor steered signaling to actin reorganization. Exp. Cell Res., 2002, vol. 272, no. 2, p. 93 108. 2. HACKEL, PO., et al. Epidermal growth factor receptors:

ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 215 critical mediators of multiple receptor pathways. Curr. Opin Cell Biol., 1999, vol. 11, no. 2, p. 184 189. 3. LÜFTNER, D. LÜKE, C. POSSINGER, K. Serum HER-2/neu in the management of breast cancer patients. Clin. Biochem., 2003, vol. 36, no. 4, s. 233 240. 4. MASS, RD. The HER receptor family: a rich target for therapeutic development. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., 2004, vol. 58, no. 3, p. 932 940. 5. MÉNARD, S., et al. Biologic and therapeutic role of HER2 in cancer. Oncogene, 2003, vol. 22, no. 42, p. 6570 6578. 6. ROSSI, E., et al. Different expression of HER-2/neu oncogene in breast carcinoma and in liver metastasis. Description of a case. Tumori, 2006, vol. 92, no. 6, p. 536 539. 7. SEMBA, K., et al. A v-erbb-related protooncogene, c-erbb- -2, is distinct from the c-erbb-1/epidermal growth factor- -receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1985, vol. 82, no. 19, p. 6497 6501. 8. ŠIMČÍKOVÁ, M., aj. Prediktivní význam sérového HER-2/ /neu u nemocných s karcinomem prsu léčených Herceptinem. Klin. Onkol., 2005, roč. 18, č. 1, s. 23 26. 9. TAGLIABUE, E., et al. The early relapse of premenopausal patients after surgery for node-positive breast carcinoma. Breast Cancer Res. Treat., 2001, vol. 70, no. 2, p. 155 156. 10. XU, R., et al. Amplification of HER-2/neu gene in HER-2/ /neu-overexpressing and nonexpressing breast carcinomas and their synchronous benign, premalignant, and metastatic lesions detected by FISH in archival material. Modern Pathology, 2002, vol. 15, no. 2, p. 116 124. Podporováno Výzkumným záměrem MZO 00179906. Korespondence: Pplk. MUDr. Petr Cinek Ústřední vojenská nemocnice Praha Oddělení klinické onkologie U Vojenské nemocnice 1200 169 02 Praha 6-Střešovice e-mail: petr.cinek@uvn.cz Do redakce došlo 20. 2. 2007

216 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 VÝSKYT OCHRATOXINU A V ČESKÝCH REGIONECH 1 Helena ŠULTESOVÁ, 1 Miroslav BRNDIAR, 1 Jaroslav KAČEROVSKÝ, 2 František MALÍŘ, 3 Jiří KNÍŽEK, 1 Ladislav JEBAVÝ, 1 Jan M. HORÁČEK 1 Univerzita obrany, katedra válečného vnitřního lékařství Fakulty vojenského zdravotnictví, Hradec Králové 2 Oddělení xenobiochemie Zdravotního ústavu, Hradec Králové 3 Univerzita Karlova, Ústav lékařské biofyziky Lékařské fakulty v Hradci Králové Souhrn Katedra válečného vnitřního lékařství Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany pracuje již několik let ve spolupráci se Zdravotním ústavem v Hradci Králové na zkoumání ochratoxinu A (OTA).OTA patří mezi mykotoxiny a je produkován plísněmi rodu Aspergillus a Penicillinum. Vyskytuje se v běžně konzumovaných potravinách a jeho přítomnost byla prokázána v séru zcela zdravých osob. K experimentálně prokázaným nežádoucím účinkům OTA na organismus patří nefrotoxicita, genotoxicita, teratogenita, imunosupresivní účinky a také možnost akutní intoxikace. V práci byl sledován vývoj hladiny OTA v séru zdravých dárců krve v České republice v průběhu několika let. Nalezené hodnoty byly porovnány s hodnotami v jiných zemích. Bylo konstatováno, že hladina OTA má v ČR od roku 1994 vzestupnou tendenci, přičemž bavorský region již v polovině 80. let minulého století dosahoval osmkrát vyšší hodnoty OTA než Česká republika v polovině 90. let. Tyto skutečnosti jsou pravděpodobně důsledkem globalizace potravinového řetězce. Při porovnání hladin OTA ve dvou českých regionech (Praha a Ústí nad Labem) byla zjištěna vyšší koncentrace OTA v Severočeském regionu, pravděpodobně v důsledku odlišných stravovacích návyků a ekonomické síly obyvatelstva. Byl zjištěn vzestup hladiny OTA se stoupajícím věkem (retenční mechanismus při poklesu glomerulární filtrace). Závislost sérové koncentrace OTA na množství tělesného tuku je málo významná. Klíčová slova: Mykotoxiny; Ochratoxin A; Sérové koncentrace OTA v populaci; OTA a BMI; OTA a pohlaví; OTA a věk; OTA v regionech ČR. Incidence of Ochratoxin A in Czech Regions Summary The Department of Military Internal Medicine of the Faculty of Military Health Sciences University of Defence has been working on the research of ochratoxin A (OTA) in cooperation with the Health Institute in Hradec Kralove for several years. OTA belongs to mycotoxins and is produced by Aspergillus and Penicillinum fungi. It occurs in common food; its presence has been proved in the serum of healthy people. Among experimentally proved undesirable effects of OTA on the organism belong: nephrotoxicity, genotoxicity, teratogenicity, immunosuppressive effects and also possible acute intoxication. The study involves the development of OTA level in the serum of healthy blood donors in the Czech Republic within several years. The values have been compared with those in other countries: since 1994, OTA level has an upward trend in the Czech Republic whereas the Bavarian region in the mid-eighties of the 20 th century reached eight times higher OTA values than the Czech Republic in the mid-ninetieth. These facts are probably consequences of the food chain globalization. While comparing OTA levels in two Czech regions (Prague and Usti nad Labem), a higher OTA concentration has been found in the North Bohemian region, probably due to different eating habits and economic power of the population. OTA level was rising with higher age (retentive mechanism with decreasing glomerular filtration). The dependence of serum OTA concentration on the amount of body fat is not very significant. Key words: Mycotoxins; Ochratoxin A; Serum OTA concentrations in population; OTA and BMI; OTA and sex; OTA and age; OTA in Czech regions. Úvod Ochratoxin A byl poprvé izolován jihoafrickými badateli v roce 1965 během laboratorního screeningu toxinogenních mikromycet. Jako přirozeně se vyskytující kontaminant kukuřice byl OTA poprvé nalezen v USA, a to až v roce 1969. Při jeho produkci se uplatňují především dva rody plísní:

ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 217 Aspergillus (A. ochraceus) v tropických a subtropických oblastech a rod Penicillinum (P. viridicatum) v oblastech chladnějších. OTA se vyskytuje v řadě komodit rostlinného i živočišného původu (tabulka 1). Dalšími zdroji mohou být např. rozinky, fíky, lékořice, grepová šťáva, červené a růžové víno nebo vinný ocet (13). Cereálie Živočišné zdroje Ostatní Možné zdroje OTA v potravinách mouka, kroupy Tabulka 1 vepřové maso, játra, slezina, ledviny, krev káva, pivo, koření, luštěniny Cíle práce V práci jsou porovnány průměrné koncentrace OTA v séru zdravé populace České republiky v letech 1994 (n = 680), 1998 (n = 1758) a 2006 (n = 1434). Srovnávané skupiny představují dárci krve z různých regionů. Vzájemně porovnány byly také průměrné koncentrace OTA v séru obyvatel ČR se zahraničím. Srovnávanými oblastmi byly Bavorsko, jako blízký region na západ od ČR, a vzdálené Alžírsko a Tunisko s jinými než středoevropskými potravinovými zvyklostmi. Dále byly porovnány průměrné hodnoty hladin OTA ve dvou českých regionech, Praze a Ústí nad Labem. Byla sledována závislost hladin OTA na Body Mass Indexu (BMI), věku a pohlaví. Příjem OTA probíhá tedy alimentární cestou. Zpracováván je dále v játrech a je vylučován ledvinami. Detekovatelný je v krevním séru a v některých případech také v moči, a to i u zdravých osob. Přípustná koncentrace v séru ještě není definitivně stanovena. Na základě empiricky získaných hodnot jsou tolerovány hladiny do 14,4 µg/l. Je však zřejmé, že čím nižší bude hladina OTA v krvi, tím menší jsou zdravotní rizika způsobená ochratoxikózou. V tabulce 2 je uveden přehled hlavních nežádoucích účinků OTA bezpečně prokázaných na podkladě experimentálních poznatků (4, 6, 7). Přehled hlavních nežádoucích účinků OTA Citace Nefrotoxicita 1, 6, 10 Genotoxicita 2, 9 Teratogenita 5, 14 Imunosupresivní účinky 11, 12 Potenciální kancerogenita 16 Neurotoxicita 2, 9 Možnost akutní intoxikace 3, 17 Tabulka 2 Hygienický limit OTA pro potraviny, který platí v celé EU, je 3 µg/kg (1). Metodika stanovení OTA Pro stanovení OTA byla použita metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s fluorescenční detekcí po předchozí extrakci OTA z 5 ml séra založené na dělicím koeficientu OTA ve vodných (roztok chloridu hořečnatého a kyseliny chlorovodíkové, roztok 0,1 mol/l hydrogenuhličitanu sodného) a organických rozpouštědlech (chloroform) ve vztahu k hodnotě ph (cca 2,5). Po odpaření chloroformu ve vodní lázni byl odparek rozpuštěn v metanolu a napipetován do Eppendorfových špiček. Jeden díl byl použit pro přímou analýzu OTA, druhý díl k potvrzení OTA, např. po jeho rozkladu enzymem karboxypeptidázou (za vzniku ochratoxinu α a fenylalaninu), třetí díl byl zálohován pro případnou kontrolu. Dobře uzavřené a popsané špičky byly uloženy v chladničce do doby vlastní analýzy. (Při tomto způsobu uložení a uzavření jsou stabilní asi 1 rok). Pro stanovení OTA na HPLC byla použita mobilní fáze: metanol:acetonitril:0,05 mol/l octan sodný:kyselina octová. Rychlost průtoku mobilní fáze byla 1,5 ml/min. Parametry fluorescenčního detektoru: vlnová délka excitace 340 nm, emise 465 nm. Při těchto podmínkách byl eluční čas OTA delší než 7 minut. Současně se vzorky byly vždy analyzovány standardy OTA 0,4 µg/l, 4 µg/l metanolu, slepý vzorek a podle možnosti i vzorky sér uměle spikované OTA. Pro zjištění koncentrace OTA (µg/l) byla použita metoda vnějšího standardu, kdy se reálná koncentrace OTA ve vzorku vypočte ze součinu koncen-

218 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 trace standardu a poměru ploch vzorku/standardu. Jedná se o metodu srovnatelnou s metodami používanými celosvětově, s detekčním limitem (což představuje současně i mez stanovitelnosti) 0,1 µg OTA/l séra. Výsledky Porovnáním průměrných koncentrací OTA v krvi zdravé populace ČR v letech 1994, 1998 a 2004 byl zaznamenán nárůst průměrné sérové koncentrace OTA (tab. 3). V tabulce 4 jsou porovnané hladiny OTA mezi ČR, Bavorskem, Alžírskem a Tuniskem. Hladina v Bavorsku z roku 1985 je 8krát vyšší než hladina u nás měřená o 10 let později. Hodnoty OTA ze zemí severní Afriky jsou pak jen o 2 roky mladší než v České republice, ale jsou 14krát (Alžírsko) a 17krát (Tunisko) vyšší než u nás. Při porovnání hladin OTA v České republice (rok 2004) ve vybraných regionech a mezi oběma pohlavími byly zjištěny vyšší sérové hladiny OTA u žen (0,257 µg/l) oproti mužům (0,216 µg/l), ale pouze v regionu hlavního města Prahy. V Ústí nad Labem měly obě sledované skupiny hladiny shodné (0,266 µg/l) a zároveň obě průměrně vyšší než v Praze (tab. 5). Při zkoumání vztahu hladiny OTA k věku u dárců krve v ČR bylo patrné, že koncentrace OTA má s rostoucím věkem stoupající tendenci. Mezi zdravými dárci krve do 25 let je průměrná sérová hladina 0,232 µg/l, u osob mezi 26. a 40. rokem je 0,266 µg/l a po 41. roce roste až na hodnotu 0,288 µg/1. V grafech 1 a 2 je uveden vztah mezi sérovou hladinou OTA a BMI. Korelační koeficient dosáhl hodnoty 0,114 v Praze a 0,16 v Ústí nad Labem, což ukazuje na slabou vzájemnou závislost. Hodnoty přesto nejsou rozvrženy zcela nahodile. Výsledky byly zpracovány programem NCSS 2004 and PASS 2002. Diskuse Globalizací potravinového řetězce a otevřením se české ekonomiky světu dochází i u nás k výskytu onemocnění v minulosti prakticky neznámých. V potravinách zpracovávaných a skladovaných v podmínkách vhodných pro růst a rozmnožování plísní Průměrné koncentrace OTA v České republice Rok Počet sledovaných osob Tabulka 3 Průměrná hladina OTA (µg/l) 1994 680 0,2 1998 1758 0,252 2004 1434 0,311 Hladiny OTA v některých oblastech Země Rok Počet osob Tabulka 4 Hladina OTA (µg/l) ČR 1994 680 0,2 Bavorsko 1984 84 1,3 Alžírsko 1992 346 2,8 Tunisko 1992 442 3,5 Koncentrace OTA v regionech Praha a Ústí nad Labem Pohlaví Region Počet osob Tabulka 5 Hodnota OTA (µg/l) muži Praha 240 0,216 Ústí 291 0,266 celkem 531 0,241 ženy Praha 110 0,257 Ústí 101 0,266 celkem 211 0,262 celkem 742 0,262

ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 219 Ochratoxin_A Praha Graf 1: Závislosti hladiny OTA (µg/l) na BMI pro Prahu Ochratoxin_A_Usti Plot of Ochratoxin_A Praha = PolyRatio(BMI_Praha, 5, 0) 2.0 1.4 0.8 0.1-0.5 15.0 22.5 30.0 37.5 45.0 BMI_Praha Plot of Ochratoxin_A_Usti = PolyRatio(BMI_Usti, 5, 0) 2.5 1.8 1.0 0.3-0.5 15.0 21.3 27.5 33.8 40.0 BMI_Usti Graf 2: Závislosti hladiny OTA (µg/l) na BMI pro Ústí nad Labem (subtropické a tropické oblasti) a následně distribuovaných k nám, se ve zvýšené míře tyto mikroorganismy objevují buď samotné, nebo jejich toxiny. Jedním z nich je i OTA, s velkým možným počtem nežádoucích účinků na lidský organismus (tab. 2). Některé práce potvrzují, že se OTA chová jako kumulativní jed s rychlou absorpcí a pomalým vylučováním, jehož poločas je u člověka asi 35 dní. Hlavními místy jeho záchytu jsou játra, ledviny, varlata a střevo (rychlá kinetika), rezervu tvoří tuková tkáň a svaly. V krvi je velmi silně vázán na albumin a na makromolekulu o relativní molekulární hmotnosti asi 20 000 (7, 8, 15). V této práci bylo prokázáno, že reprezentativní vzorek naší populace (1750 osob) má určitou hladinu OTA v séru, tzn. že konzumuje potraviny kontaminované tímto toxinem. Jednalo se o osoby zdravé, u nichž nebylo zjištěno žádné onemocnění (zdraví dárci krve). Výsledky studie dále prokázaly, že hladina OTA má u nás od roku 1994 vzestupnou tendenci. Skutečnost, že bavorský region již v polovině 80. let 20. století dosahoval průměrné koncentrace OTA 8krát vyšší než Česká republika v polovině 90. let by mohl být důkazem zařazení ČR do globálního potravinového řetězce. Vysvětlení výrazně vyšších hladin OTA v severní Africe oproti Evropě pak lze hledat v lepších klimatických podmínkách pro růst plísní, zejména rodu Aspergillus. Zvýšenou průměrnou koncentraci u mužů i u žen v regionu Ústí nad Labem (0,266 µg/l) oproti Praze (0,236 µg/l) je možné vysvětlit zvýšeným přísunem OTA potravou. Příčinou mohou být odlišné stravovací návyky v obou regionech, nezanedbatelnou příčinou je také rozdílná ekonomická síla obyvatelstva. Stejné hladiny OTA u mužů i žen v regionu Ústí nad Labem ukazují na příjem stejně kvalitních potravin u obou pohlaví. Pražské ženy mají vyšší hladinu OTA než muži, což může být důsledek konzumace zdravějších potravin z dovozu v rámci dietních režimů propagovaných sdělovacími prostředky. Rozdílnost hladin OTA v závislosti na věku lze vysvětlit poklesem glomerulární filtrace ledvin a tím postupné retence OTA se stoupajícím věkem. Také zde hrají roli rozdílné stravovací návyky v různých věkových skupinách. Sérové koncentrace OTA stoupají málo významně v závislosti na vzestupu BMI v obou sledovaných regionech. Množství tukové tkáně není tedy určujícím faktorem hladiny OTA v séru. Tento je spíše deponován v periferním kompartmentu (tuková tkáň). Závěry 1. Zjištěno promoření naší populace OTA. 2. Koncentrace OTA v séru u nás má od r. 1994 stoupající tendenci (otevírání se našeho trhu). 3. Populace v sousedním regionu Bavorsko měla podle literárních údajů 8krát vyšší sérovou koncentraci OTA již 10 let před prvními měřeními v České republice (otevřený německý trh). 4. Zjištěna zvýšená koncentrace OTA v regionu Ústí nad Labem oproti Praze závisí pravděpodobně na jiné skladbě potravin. 5. Pozorovány rozdílné hladiny OTA u mužů (0,216 µg/l) a u žen (0,257 µg/l) v Praze. Pravděpodobně závisí na příjmu odlišných potravin. 6. Zjištěno zvýšení hladiny OTA v závislosti na věku (zánik nefronů) a také na odlišných stravo-

220 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 vacích návycích v jednotlivých věkových skupinách. 7. Zjištěna malá významnost závislosti sérové koncentrace OTA na BMI, protože OTA je deponován hlavně v tukové tkáni. 8. Studium koncentrací OTA u zdravých osob je základním předpokladem ke studiu koncentrací OTA u celé řady chorob. Z teoretického hlediska se v současné době nabízí podrobnější studium hladin OTA u některých ledvinných či jaterních chorob, zvláště v souvislosti s nádorovým postižením těchto orgánů. Literatura 1. BAHNEMANN, E., et al. Renal transepithelial secretion of ochratoxin A in thenon-filtering toad kidney. Toxicology, 1997, vol. 120, no. 1, p. 11 17. 2. BAUDRIMONT, I. Variation de la nephrotoxicité de l ochratoxine A sous l effet de facteurs métaboliques et non métaboliquep. (These pour le Doctorat, No. 2). Bordeaux, Université II. 25. 10. 1995, p. 3 205. 3. BREITHOLTZ-EMANUELSSON A., et al. Ochratoxin A in human serum samples collected in southern Italy from healthy individuals and individuals suffering from different kidney disorderp. Nat. Toxins, 1994, vol. 2, no. 6, p. 366 370. 4. BRNDIAR, M. KAČEROVSKÝ, J. MALÍŘ, F. VO- SEČKOVÁ, A. JEBAVÝ, L. Mykotoxiny jako bojové biologické látky. Voj. zdrav. Listy, 2003, roč. 72, č. 5, s. 203 207. 5. BROWN, MH. SZCZECK, GM. PURMALIS, BP. Teratogenic and toxic effects of ochratoxin A in ratp. Toxicol. Appl. Pharmacol., 1976, vol. 37, p. 31 38. 6. GEKLE, M. SILBERNAGL, P. Mechanism of ochratoxin A-induced reduction of glomerular filtration rate in ratp. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1993, vol. 267, no. 1, p. 316 321. 7. HOOD, RD. NAUGHTON, MJ. HAYES, AW. Teratogenic effects of ochratoxin A in hamsterp. Teratology, 1975, vol. 11, p. 23A. (Abstract). 8. HOOD, RD. NAUGHTON, MJ. HAYES, AW. Prenatal effects of ochratoxin A in hamsterp. Teratology, 1976, vol. 13, p. 11 14. 9. IARC MONOGRAPHS on the Evaluation of Carcinogenic Risks of Chemical to Humans: Some naturally occuring substances: some food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxinp. Lyon, IARC Scientific Publications, 1993, vol. 56, p. 489 521. 10. KROGH, P. Mycotoxic porcine nephropathy: a possible model for Balkan endemic nephropathy. In PULCHEV, A., et al. (eds.). Endemic nephropathy. Sofia, Bulgarian Academy of Science, 1972, p. 266 270. 11. LEA, T. STEIEN, K. STORMER, C. Mechanisms of ochratoxin A induced immunusuppression. Mycopathologia, 1989, vol. 107, p. 153 159. 12. LUSTER, MI., et al. Selective immunosuppressions in mice of natural killer cell activity by ochratoxin A. Cancer Res., 1987, vol. 47, p. 2259 2263. 13. MALÍŘ, F. Ochratoxiny: mykotoxiny s významnými toxikologickými vlastnostmi. (Habilitační práce). VLA JEP, Hradec Králové, 2004. 14. MAYURA, K., et al. Embryocidal, fetotoxic and teratogenic effects of ochratoxin A in ratp. Toxicology, 1982, vol. 25, p. 175 185. 15. PFOHL-LESKOWICZ, A., et al. Les mycotoxines dans l alimentation:évaluation et gestion du risque. Londres, New York, Lavoisier, Tec-Doc, 1999. 16. PFOHL-LESKOWICZ, A., et al. Ochratoxin A related DNA ductus in urinary tract tumours of Bulgarian subjectp. In Postlabelling methods for detection of DNA adductp. Lyon, IARC Scientific Publications, 1993, no. 124, p. 141 148. 17. SZCZECH, GM. CARLTON, WW. TUITE, J. Ochratoxicosis in beagle dogp. II. Pathology. Vet. Pathol., 1973, vol. 10, p. 219. Korespondence: MUDr. Helena Šultesová Univerzita obrany Fakulta vojenského zdravotnictví Katedra válečného vnitřního lékařství Třebešská 1575 500 01 Hradec Králové Helisuli@seznam.cz Do redakce došlo 20. 3. 2007

ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 221 SMOKELESS TOBACCO: ANOTHER FORM OF HAZARDOUS TOBACCO 1 Sajith VELLAPPALLY, 1 Zdeněk FIALA, 1 Jindra ŠMEJKALOVA, 1 Vimal JACOB, 2 Pilathadka SHRIHARSHA 1 Charles University in Prague, Faculty of Medicine in Hradec Kralove, Department of Hygiene and Preventive Medicine, Czech Republic 2 Charles University in Prague, Faculty of Medicine in Hradec Kralove, Department of Dentistry, Czech Republic Summary This review deals with the smokeless tobacco products, their use, composition, systemic and oral diseases associated with it. It is evident that smokeless tobacco is carcinogenic to human and causes various systemic and oral diseases. One of the major cancers caused by smokeless tobacco use is oral cancer and other oral diseases like leucoplakia, dental caries, smokeless keratosis, and other negative influences of smokeless tobacco on oral cavity including staining of teeth, bad breath, mouth sores, attrition and abrasion. This review also tries to describe the possible tobacco cessation intervention in dental office. Key words: Smokeless tobacco; Systemic diseases; Oral diseases; Tobacco cessation. Bezdýmný tabák: jiná forma nebezpečného tabáku Souhrn Tato práce se zabývá bezdýmnými tabákovými produkty, jejich užíváním, složením a systémovými onemocněními a chorobami ústní dutiny spojenými s jejich účinky. Je zřejmé, že bezdýmný tabák je pro člověka karcinogenní a způsobuje různá systémová onemocnění a choroby ústní dutiny. Jednou z nejčastějších nemocí způsobených užíváním bezdýmného tabáku je rakovina ústní dutiny další jsou např. leukoplakie, zubní kaz, bezdýmná keratóza a jiné negativní vlivy bezdýmného tabáku na ústní dutinu, včetně zbarvení zubů, zápachu z úst, boláků, opotřebování a abraze. Práce rovněž popisuje snahu zubních lékařů o to, aby pacienti přestali užívat tabákové produkty. Klíčová slova: Bezdýmný tabák; Systémová onemocnění; Onemocnění ústní dutiny; Skončení užívání tabáku. Introduction Tobacco, in general, is used as smoking and smokeless form (ST) (46). The negative health consequences of cigarette smoking are understood very well. Because smoking is declining in the modern world, the tobacco industry has to look for other products that can keep the old customers and attract new ones. Different forms of ST are currently massively promoted and are gaining importance (35). The recent trend has been boosted by marketing of a few types of ST as a harmless alternative to smoking cigarettes (47). In recent years, some health scientists have even suggested ST to be actively promoted among cigarette smokers as a safer (i.e. a harm-reduction product) alternative for those having difficulty to quit smoking (21). Some people even think ST is safe or less harmful than cigarettes. Most people, including smokers, and some health care professionals know almost nothing about ST products, or even worse, are completely misinformed about the basic characteristics of ST products. Thus, it is important to understand these products, how they are used, their contents and ill effects. There is also a growing interest in the possible adverse health effect of ST because of the increasing popularity of ST use among youth adults. This review article gives a brief picture about the different types of ST products, their composition and method of use, as well as about their systemic and oral effects. Finally, the possibility of tobacco cessation intervention in dental practice is discussed. Smokeless tobacco products ST is a very broad term that refers to more than 30 different types of products around the world (26). ST products are those in which there is no combustion or pyrolysis at the time of use (40). Types,

222 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 composition and pattern of use of ST products are highly variable in different parts of the world and within regions (45, 9). ST is normally consumed orally or nasally, and includes products that are placed in mouth, cheek or lip and sucked (dipped) or chewed (26). ST products exist in two major forms: snuff and chewing tobacco. Snuff may be moist or dry. Moist snuff is usually taken orally (25). Normally, a pinch of snuff is placed in the gingival fold under the upper lip, close to the midline frenulum, where it is kept in place for a varying period of time and frequently replaced. The total daily exposure can vary from less than an hour to twenty hours. Snuff is considered a safe alternative to smoking and is socially widely accepted in countries like Sweden. Its popularity was further promoted by introduction of the portion-bag pack, which makes the habit more discreet and easier to handle than the earlier form of loose weight tobacco (47). Dry snuff is usually inhaled through the nose and less commonly used. Chewing tobacco is coarser than snuff and exists in three forms: loose- -leaf (sold in a soft package or pouch), plug (sold in a small block) and twist (dried tobacco leaves that are twisted into strands). Chewing tobacco is usually placed in the oral buccal vestibule, and it is called as chaw or quid. This quid may be retained in the mouth for hours, and the user expectorates saliva that mixes with the tobacco extract (25). Another type of ST product also includes paste or powder that is used on the gums or teeth (26). ST products are placed in contact with oral or nasal cavities against the mucosal site that permits the absorption of nicotine into the human body (45). Cigarette smoking is pandemic, affecting large proportions of the population worldwide. In contrast, the use of ST is endemic, mainly restricted to certain geographical areas such as North America, the Scandinavian countries, India, Bangladesh, Southeast Asia and part of Africa (4). South Asia is a major producer and net exporter of tobacco. Over one-third of tobacco consumed regionally is ST (14). Oral ST (moist snuff) is popular in Sweden and Norway, but it is banned from sale within the majority of the European Union countries (39). The use of moist snuff is widespread in Sweden. In 2004, approximately 800,000 Swedes were daily users, which corresponds to 22% of the male population and 3% of the female population (2). There are approximately 100 million users of ST products in India and Pakistan (40). In developing countries ST is mostly chewed with other ingredients. Chewing is practiced in different ways: the main ingredients are usually areca nut (betel), leaf, lime and tobacco (9). This mixture is referred to as betel quid (45). The main types of ST in western countries are chewing tobacco and oral snuff (9). Worldwide, several names are used to denote different ST products; plug, gutkha, khiwan, khani, iq milk, zarda, naswar, nass, chimo, toobak, shamma, gudhaku, gul, mishri, maras and moist snus (44). ST is a complex chemical mixture, including not only components of the tobacco leaf, but also chemicals added during the manufacturing process. ST contains addictive chemical nicotine and more than 20 cancer-causing chemical substances (31), but the actual number of carcinogens found is fewer than in cigarette smoke (44). The most important carcinogens identified in ST are tobacco-specific N-nitrosamine (TSNA), N'-nitrosonornicotine (NNN), and 4(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK). NNN and NNK are formed from nicotine during curing, ageing and especially during fermentation of tobacco (17). Moreover, chemicals including radium-226 and lead-210 are also found in ST products (25). Tobacco-specific nitrosamines are the most prevalent strong carcinogens in ST products. Carcinogens and other chemicals present in ST products can vary widely in different parts of the world. It has been reported that the levels of tobacco- -specific nitrosamines in ST products used in India are considerably higher than those found in most ST products marketed in Europe and North America (40). On the base of epidemiological study (Cogliano, 2004), the International Agency for Research on Cancer (IARC) concluded that there is sufficient evidence that the oral use of ST is carcinogenic to humans (8). Smokeless tobacco and systemic disease Generally, the youth start experimenting with ST products at the age of 9 to 16, less possibly after the age of 20 (41). One of the important systemic effects of ST is nicotine dependence or addiction compared to cigarette smoking. Because it contains higher levels of addictive nicotine (one can of snuff delivers as much nicotine as 60 cigarettes) and prolonged mean usage time, it can be harder to quit compared to cigarettes (3, 23). Withdrawal symptoms

ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 223 such as drowsiness, nervousness, headache, irritability, and cravings have been reported (25). Oral ST causes a duration-dependent increase in oxidative stress (34). ST is a risk factor for osteoporosis in populations where its use is prevalent (27) and also associated with cataract (29), cardiovascular diseases (9), and immediate increase in blood pressure and heart rate (5). A recent study to find the influence of tobacco chewing on cardiovascular risk found that the risk is similar in chewing tobacco and cigarette use (13). The increased risks of mortality or morbidity among ST users include stomach, rectal, prostate (1) and pancreatic cancers (1, 6). Tobacco chewing (mostly tobacco with areca nut/betel quid) is a highly significant risk factor for laryngeal and esophageal cancer (9, 14). A recent study from Pakistan reported that many women with bladder carcinoma had a long history of smokeless tobacco use (28). In a few countries, exposure to ST with extremely high nitrosamine concentrations has been found to induce cancers in the head-neck region (22). The metabolites of nitrosamines, primarily NNN and NNK, are found locally in saliva of the oral cavity of ST users as well as in their body fluids. These agents are known to cause toxic effects, particularly cancer and other cellular and DNA changes, at the local placement site or by indirect systemic effects (44). In females, ill effects of smoking over the reproductive system are well documented (24). The same types of ill effects over the reproductive system are also seen in female ST users. The consumption of ST during pregnancy decreases the gestational age at birth and birth weight (15), and increases stillbirth risk (16). Pregnant women in India who used ST have a threefold increased risk of stillbirth and a two- to threefold increased risk of having a low birth weight infant (14). Preeclampsia is also associated with ST use (10). Neurobehavioral signs occur in neonates born to women who use ST (18). In males, a decrease in sperm quality and, to a lesser extent, with oligoasthenozoospermia or azoospermia was found in a group of tobacco chewing men who are undergoing infertility evaluation (33). In the Indian subcontinent, inhalation of nasal snuff is a common habit (37). Morphological and functional changes in the nasal mucosa happen due to chronic abuse (35), and a form of chronic rhinitis develops as a consequence of which the nose is blocked and becomes stuffy (37). Smokeless tobacco and oral disease Oral cancer ST is very strongly related to cancer of the cheek and gums, locations typically in direct contact with tobacco (9, 44). This association is evident from the studies in the US, Scandinavia, and also from Asia and Africa where ST is used extensively. The risk of oral cancer increases with the length of exposure, and is greatest at the anatomic site where ST product is held in contact with oral mucosa for the longest time (44). Carcinogenic tobacco-specific nitrosamines are likely to be the procarcinogen acting at the target site (45). ST users are 50 times more likely to get oral cancer than non-users (19). Even ST products that claim to be low in nitrosamines are likely to raise the risk among users up to 30% risk of oral cancer in smokers (44). It is reported that the chronic stimulation of the lenfoid tissues in oral mucosal membrane may be related to the increase in oral cancer (3). The risk of oral cancer from ST tobacco varies in different parts of the world; one possible explanation for this is the qualitative difference in the production of ST and different contents of carcinogenic tobacco-specific N-nitrosamines (47). The two most common forms of cancers found in association with ST use are verrucous carcinoma and squamous cell carcinoma (25, 44) Dental caries Especially people who use chew tobacco appear to have more dental caries than non-users (46). A review of studies conducted from 1988 1990 on oral consequences of snuff and chewing tobacco use among professional baseball players in the US found that ST use shows a significantly higher prevalence of root caries than comparable sites in non-smokers (32). The data from the multipurpose health survey (Third National Health and Nutrition Examination Survey) conducted in the USA from 1988 to 1994 were used to examine the relationship between chewing tobacco and other forms of tobacco use and decayed or filled coronal or root surface caries. Chewing tobacco users had a slightly higher mean number of decayed and filled coronal surfaces than individuals using other forms of tobacco. In addition, the mean number of decayed and filled root surfaces in those who used chewing tobacco was four times higher than in those who did not use tobacco. It is important to note that the

224 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXVI, 2007, č. 6 decayed or filled surfaces tended to match that side of the mouth on which the ST was used although this did not reach statistical significance. The results showed that the mean number of decayed and filled root surfaces rose with the increasing number of chewing tobacco packages used per week and duration of use in years (43). A biologically reasonable explanation for an association between chewing tobacco use and dental caries is that the high levels of fermentable sugar in ST products can stimulate growth of cariogenic bacteria (12, 43). Leucoplakia and snuff dippers lesion Oral leucoplakia, a precancerous lesion to oral cancer, is strongly linked to ST use (44). Oral leucoplakia occurs in up to 60% of ST users within 6 months to 3 years after starting of ST use, mostly occurring at the site of ST use; it is mainly the result of local irritation (40). A typically wrinkled appearance at the site of placement of the moist snuff and chewing tobacco was described by Axell and his colleagues. The severity of the leucoplakia lesion associated with ST rises with the increasing amount and duration of use, suggesting a dose- -response relationship (44). Betel quid chewing is an important risk factor for precancerous lesion oral submucous fibrosis and oropharyngeal cancer in South Asia (14). Another well recognized and predictable lesion that appears at the site where ST is held in oral cavity is snuff dipper s lesion. This lesion appears white keratotic in nature and is translucent rather than opaque whiteness (36), and is present in 15% of chewing tobacco users and 60% of snuff tobacco users (41). It is reversible when the affected person discontinues the habit (36). This lesion is also known by some other names tobacco pouch keratosis or smokeless keratosis, and is mostly seen in snuff dippers (44). Other oral effects In addition to the above mentioned conditions, ST is found to be associated with the periodontal disease (11). Acute Necrotizing Ulcerative Gingivitis (ANUG), gingivitis, and periodontitis are found in ST users. Gingival recession and attachment loss are generally seen in the area adjacent to where the ST is held (25). Cessation of ST use does not reverse the gingival recession it is estimated to be present in 7 to 27% of ST users (41). Other negative effects include stained teeth, bad breath and mouth sores (19). The use of ST is also associated with tooth abrasion of the incisal and occlusal surface of the teeth (25). Especially tobacco chewing is positively associated with both moderate and severe tooth wear (20). Abrasive materials found in tobacco products like silica or silicon may contribute to dental attrition in chronic users of ST (7). Tobacco cessation intervention in dental practice The number of tobacco using patients visiting dentists for a regular dental treatment is quite high. A dental office with well motivated dental staff can be a good place for headstorm starting of the tobacco cessation intervention. In 1996, the World Dental Federation (FDI) recognized the role of dentists as professional interventionists; the body also urged to instigate tobacco use prevention and cessation program into daily dental routine and daily dental care (30). Recognizing of patients according to the psychological status of cessation habits can be grouped as precontemplation, contemplation, preparation, action, and maintenance (38). The action plan of intervention has to be individually planned according to the above mentioned patient groups. Dentists and dental hygienists can motivate patients who are adversely thinking about quitting the tobacco use. For motivated patients they can draw a road map to retrieve from the habit with a time frame. The continuous encouragement of such patients can be psychologically rewarding for them during the recall of general dental treatment. And dentists have an opportunity to assess the stages of quitting the patients habits. The five major steps recommended for tobacco cessation activity in the dental office are popularly known as 5 As (ask, advise, assess, assist, arrange) (30, 42). These steps, if followed effectively by the professional and patient, result in an effective outcome of the treatment, in other words in cessation of the tobacco habit (Table 1). Conclusion Smoking is considered to be a risk factor for multiple diseases. The myth that ST is less harmful than smoking is not well justified. The fact that