FORMULACE NANOČÁSTIC S TERBINAFINEM

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ TECHNOLOGIE FORMULACE NANOČÁSTIC S TERBINAFINEM Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Milan Dittrich, CSc. Hradec Králové 2013 Nikola Mrázková

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při pracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Tato práce nebyla použita k získání jiného, či stejného titulu. V Hradci Králové 15. 5. 2013... Nikola Mrázková

Poděkování Děkuji Doc. RNDr. Milanovi Dittrichovi, CSc. za odborné vedení, trpělivost, cenné rady a pomoc při vypracování mé diplomové práce. Dále děkuji pracovníkům Katedry farmaceutické technologie za příjemné pracovní prostředí. Velké poděkování také patří celé mé rodině za podporu během celého studia.

Abstrakt Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické technologie Studentka: Nikola Mrázková Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Milan Dittrich CSc. Název práce: Formulace nanočástic s terbinafinem V teoretické části je prezentován základní přehled o využití nanotechnologií ve zdravotnictví, charakteristika a rozdělení nanočástic, jejich použití ve farmakoterapii s důrazem kladeným na cílený transport léčiv. Těžiště práce je v experimentu. Byly připraveny částice submikronových rozměrů emulzní metodou za rozdělování rozpouštědla v emulzi typu o/v. Jako nosič byl použit terpolymer kyseliny DL-mléčné s kyselinou glykolovou větvený hvězdicovitě na tripentaerytritolu. Cílem bylo připravit co nejmenší nanočástice. Velikost a distribuce velikosti částic byly měřeny metodou PCS na přístroji ZetaSizer ZS. Byl testován vliv dvou různých koncentrací emulze, dvou typově odlišných emulgátorů a dvou koncentrací emulze na granulometrické parametry připravených částic. Byla sledována stálost parametrů při uchovávání nanodisperzí při snížené teplotě a ve zmraženém stavu po dobu 24 hodin po jejich přípravě. Byly monitorovány změny velikosti částic v disperzním médiu v různých intervalech po dobu 250 minut. Byly rozšířeny některé dosavadní praktické poznatky týkající se změn nanodisperzí po jejich přípravě a některých možností při snížení jejich rozsahu.

Abstract Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Technology Student: Nikola Mrázková Supervisor of Diploma thesis: Doc. RNDr. Milan Dittrich CSc. Title of Diploma thesis: Formulation of nanoparticles with terbinafine In the theoretical part of this diploma thesis is presented review concerning basic applications of nanotechnology in health service, characteristic of nanoparticles, their dividing and use in pharmacotherapy, especially in targeted drug transport. The focus of the thesis presented here is in experimental part. Particles of submicrom size were fabricated by the using of emusion solvent distribution method in the emulsion of o/w type. Star-like terpolymer of DL-lactic acid and glycolic acid branched on tripentaerytritole as core was used as potential drug carrier. The aim was to prepare the smallest particles as possible. The size and the size distribution were measured by the PCS method by the using of the device Zeta Sizer ZS. The impact of two from the chemical point of view different emulsifiers and two emulsion concentrations on the granulometric parameters of the prepared particles was evaluated. The stability of parameters during storage at lowered temperature and in the frozen state during the one day period after preparation was monitored. The change of the particle size in the dispersion medium in various time intervals until 250 minutes were recorded. Practical knowledges concerning the changes of nanodispersions in short period after their preparation and some possibilities in the lowering of their extent were acquired in this work.

Obsah 1. Seznam tabulek... 1 2. Seznam obrázků... 2 3. Seznam zkratek... 4 4. Úvod... 5 5. Zadání práce... 6 6. Teoretická část... 7 6.1 Biokompatibilita... 7 6.1.1 Pegylace... 8 6.1.2 Biodegradace... 10 6.2 Nanočástice jako nosiče léčiv... 10 6.2.1 Význam velikosti částic... 10 6.3 Typy nanočástic... 11 6.3.1 Polymerní nanočástice... 11 6.3.3 Uhlíkové polymery... 12 6.3.4 Dendrimery... 13 6.3.5 Lipidové nanočástice... 13 6.3.6 Kovové nanočástice... 14 6.4 Biodegradabilní polymery PLGA a PLA... 14 6.4.1 Biodegradace PLGA... 15 6.4.2 Faktory ovlivňující degradaci... 16 6.5 Nanočástice v medicíně... 17 6.5.1 Terapie... 17 6.4.2 Diagnostika... 18 7. Experimentální část... 19 7.1 Použité přístroje... 19 7.2 Použité chemikálie... 19

7.3 Postup přípravy... 20 7.3.1 Příprava terbinafinu... 20 7.3.2 Příprava vnější fáze... 20 7.3.3 Příprava vnitřní fáze... 20 7.3.4 Příprava nanočástic... 20 7.4 Parametry měření velikosti nanočástic... 21 7.5 Výsledky měření... 21 7.5.1 Parametry nanočástic. Vliv použitého tenzidu, koncentrace terbinafinu.... 21 7.5.2 Vliv snížené teploty na stabilitu nanočástic... 24 7.5.3 Porovnání vlastností nanočástic vůči času... 27 7.5.4 Viskozita jako parametr ovlivňující velikost částic... 35 8. Diskuze... 37 8.1 K zaměření práce... 37 8.2 K nanočásticím připraveným s kationickým a neionickým emulgátorem... 38 8.3 K vlivu uchovávání nanodisperzí... 38 8.4 Ke standardnosti metody přípravy a měření nanočástic bez léčiva... 39 9. Závěr... 41 10. Literatura... 42

1. Seznam tabulek Tab. 1: Velikost nanočástic. 0,2% CET, 1% terbinafin.... 22 Tab. 2: Velikost nanočástic. 0,2% CET, 3% terbinafin.... 22 Tab. 3: Velikost nanočástic. 0,2% PS, 1% terbinafin.... 22 Tab. 4: Velikost nanočástic. 0,2% PS, 3% terbinafin.... 23 Tab. 5: Vliv uchovávání při snížené teplotě (5 ºC nebo -16 C) na velikost nanočástic. 3% T3, 0% terbinafin.... 25 Tab. 6: Vliv uchovávání při snížené teplotě (5 ºC nebo -16 C) na velikost nanočástic. 1% T3, 0% terbinafin.... 25 Tab. 7: Vliv uchovávání při snížené teplotě (5 ºC nebo -16 C) na velikost nanočástic. 3% T3, 0% terbinafin.... 27 Tab. 8: Složení vzorků pro testování změn velikosti částic v médiu po jejich přípravě. 28 Tab. 9: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 0 % terbinafinu, 5 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8.... 28 Tab. 10: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 0 % terbinafinu, 15 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8.... 31 Tab. 11: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 21 % terbinafinu, 5 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8.... 32 Tab. 12: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 21 % terbinafinu, 15 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8.... 34 Tab. 13: Viskozita.... 36 1

2. Seznam obrázků Obr. 1: Biokompatibilita. Když nanočástice reagují s organismem, může docházet k celé řadě reakcí, které se liší typem nanočástic. Nanočástice zlata budou reagovat jinak než polymerní nanočástice [6]... 8 Obr. 2: PEG (polyethylenglykol)... 8 Obr. 3: Konformace PEG: Mushroom versus Brush... 9 Obr. 4: Různé typy nanočástic [6].... 11 Obr. 5: PLGA - Poly (D,L-lactide-co-glycolide): n je počet jednotek kyseliny mléčné, m je počet jednotek kyseliny glykolové... 15 Obr. 6: Vzorek č. 10 - intenzitní průměr nanočástic- frekvenční křivka. 0,2% PS, 3% T3, 1% terbinafin.... 23 Obr. 7: Vzorek č. 11 - intenzitní průměr nanočástic- frekvenční křivka. 0,2% PS, 3% T3, 3% terbinafin.... 23 Obr. 8: Vliv použitého tenzidu a koncentrace terbinafinu na velikost částic. Byly připravovány dva shodné vzorky.... 24 Obr. 9: Vzorek č. 2 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 2 hod míchání.... 26 Obr. 10: Vzorek č. 2 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 24 hod v lednici.... 26 Obr. 11: Vzorek č. 2 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 24 hod v mrazicím boxu.... 26 Obr. 12: Vliv uchovávání při snížené teplotě (5 ºC nebo -16 C) na velikost nanočástic vz. 1 až 3. Měřeno po 2 hodinách a po 24 hodinách v lednici nebo mrazicím boxu.... 27 Obr. 13: Vz. 0/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 90 min. míchání.... 29 Obr. 14: Vz. 0/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 130 min. míchání.... 29 Obr. 15: Vz. 0/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 170 min. míchání.... 29 Obr. 16: Vz. 0/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 210 min. míchání.... 30 Obr. 17: Vz. 0/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 250 min. míchání.... 30 2

Obr. 18: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 0 % terbinafinu, 5 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8.... 31 Obr. 19: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 0 % terbinafinu, 15 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8.... 32 Obr. 20: Vz. 21/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 90 min. míchání.... 33 Obr. 21: Vz. 21/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 250 min. míchání.... 33 Obr. 22: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 21 % terbinafinu, 5 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8.... 34 Obr. 23: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 21 % terbinafinu, 15 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8.... 35 3

3. Seznam zkratek BT CET EMK Pdl PEG PLA PLGA terbinafin cetrimid ethylmethylketon index polydisperzity polyethylenglykol polymléčná kyselina kopolymer kyseliny glykolové s kyselinou DL-mléčnou PS polysorbát 20 T HCl T3 Z Ave terbinafin hydrochloridu termopolymer kyseliny DL-mléčné, kyseliny glykolové a tripentaerytritolu střední intenzitní průměr velikosti částic 4

4. Úvod Nanotechnologie je vědní obor zabývající se vývojem, výzkumem a použitím materiálů, které jsou aspoň v jednom rozměru v měřítku nanometrů (1-100 nm). Základními stavebními prvky nanotechnologie jsou molekuly a dokonce i atomy [1]. V posledních letech se nanotechnologie s poměrně velkým úspěchem využívá i ve farmaceutické technologii. Nanotechnologie se zaměřuje na formulaci účinné látky do biokompatibilní nanostruktury jako jsou nanočástice, nanokapsle nebo micelární systémy. Ty mohou představovat přímo vlastní léčivou látku nebo mohou tvořit nosiče pro distribuci klasického léčiva v organizmu nemocného. Jedna z hlavních výhod, kterou tato technologie nabízí, je cílené uvolňování léčiv. Dále se použitím nanočástic ve farmakoterapii může dosáhnout zlepšení rozpustnosti léčiv ve vodě, zmírnění nežádoucích účinků a zvýšení účinnosti terapie [2]. K bezpečnému a efektivnímu použití nanomateriálů v organismu, musí být tyto materiály důkladně studovány. Zvláštní důraz je kladen na jejich biokompatibilitu. Důkladné zhodnocení faktorů, které mají vliv na biokompatibilitu nanočástic, je rozhodujícím krokem pro jejich použití v praxi [3]. Je dobře známo, že stupeň biokompatibility určuje jak fyzikální a chemické vlastnosti nanočástic (př. tvar, velikost), tak i prostředí, ve kterém dojde ke kontaktu s tkání. Způsob podání materiálu do těla také způsobí různou imunitní odpověď, což může vést ke snížení biologické dostupnosti léku a ke zvýšení jeho toxicity. To vše zdůrazňuje význam studia vlastností nanočástic, které mají být použity v organismu [4]. 5

5. Zadání práce Cíl předložené diplomové práce byl formulován v návaznosti na dosud získané výsledky v rámci formulace nanočásticových systémů s terbinafinem v těchto dílčích bodech: A. Připravit částice, co nejmenší velikosti za použití dvou z hlediska náboje odlišných emulgátorů a ze dvou koncentrací odlišných roztoků zadaného polyesterového nosiče. Do tohoto roztoku případně inkorporovat bázi terbinafinu. Využít metodu rozdělování rozpouštědla z vnitřní fáze emulze typu o/v při různé koncentraci vnitřní fáze B. Z hlediska různých parametrů velikosti a distribuce velikosti částic vyhodnotit vliv použitého emulgátoru, vliv koncentrace polyesterového nosiče ve vnitřní fázi a vliv koncentrace emulze C. Sledovat případné změny granulometrických parametrů po dobu několika hodin po přípravě částic D. Vyzkoušet a vyhodnotit možnosti stabilizace velikosti nanočástic po jejich přípravě ve vodném prostředí uchováváním při snížené teplotě a ve zmraženém stavu 6

6. Teoretická část 6.1 Biokompatibilita Biokompatibilita poprvé upoutala pozornost vědců v letech 1940 až 1980 v souvislosti s reakcí těla na chirurgický implantát. Teprve v posledních dvou desetiletích se tento termín definuje jako schopnost materiálu vyvolat vhodnou reakci v biologickém prostředí. V rámci této definice hraje důležitou roli fakt, že materiál má vykonávat zamýšlenou funkci a nebýt pouze přítomen v tkáni. Musí se brát v úvahu, že charakter reakce na konkrétní materiál a jeho vhodnost mohou být v každém prostředí odlišné [5]. Obecně platí, že vysokého stupně biokompatibility je dosaženo, pokud materiál reaguje s tělem bez nepřijatelné toxické, imunitní, trombogenní a karcinogenní reakce (Obr. 1). Je několik významných faktorů, které musí být zváženy k hodnocení biokompatibility. Za prvé, je biokompatibilita anatomicky velmi závislá, což vede k tomu, že reakce na konkrétní materiály se liší od jednoho místa k druhému. Za druhé, vnitřní charakteristika biomateriálu výhradně neurčuje, zda je konkrétní materiál biokompatibilní a nebo ne. Například PLGA nanočástice, které mají rychlou clearance, obvykle nezpůsobí peritoneální adheze. Zatímco PLGA mikročástice, které v peritoneální dutině zůstávají déle, mohou způsobit peritoneální srůsty. Proto je poločas doby expozice dalším faktorem, který si zaslouží pozornost. Posledním faktorem je nedostatek údajů o biologických procesech organismu při reakci na cizí materiály [3]. Imunokompatibilita je podkategorie biokompatibility, která studuje imunitní odpovědi na biomateriály, protézy ale i lékařské nástroje. Nanočástice mají potenciál jak stimulovat, tak i potlačit imunitní systém. Tato vlastnost nanočástic může pozitivně nebo negativně ovlivnit konkrétní aplikaci nanočástic. 7

Obr. 1: Biokompatibilita. Když nanočástice reagují s organismem, může docházet k celé řadě reakcí, které se liší typem nanočástic. Nanočástice zlata budou reagovat jinak než polymerní nanočástice [6]. 6.1.1 Pegylace Pegylace je proces zavedení polyethylenglykolu (PEG) kovalentní vazbou do molekuly léčiva. Obr. 2: PEG (polyethylenglykol) http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/42/polyethylene_glycol.png 8

PEG řetězce existují v různých geometrických uspořádáních. Na povrchu upoutané polymerní řetězce mohou mít typ molekulární konformace buď Mushroom" nebo Brush". Mushroom režim nastává, pokud je vzdálenost mezi sousedními řetězci s větší než dvojnásobek poloměru polymeru. Brush je režim, kdy dochází s <2r a polymerní řetězce z povrchu jsou ve výšce L. Obr. 3: Konformace PEG: Mushroom versus Brush http://www.beilstein- journals.org/bjnano/single/articlefulltext.htm?vt=f&publicid=2190-4286-1-2&tpn=0&bpn=singlevolume&vn=1 Bylo prokázáno, že pegylace zvyšuje poločas rozpadu léčiva v těle a optimalizuje farmakokinetiku. Dále prodlužuje aktivitu léku, a tím snižuje frekvenci dávkování. Schopnost PEG prodloužit životnost nosiče je připsána hlavně jeho fyzikálním vlastnostem. Je prokázáno, že pegylace zvyšuje stabilitu koloidního nosiče in vivo díky sterickému efektu [7]. Pegylace může kontrolovat fyzické a biologické chování nanonosičů a v důsledku toho podstatně změnit jejich biokompatibilitu. Pegylace výrazně snižuje imunitní odpověď organismu na povrch materiálu, shlukování krevních destiček, aktivaci neutrofilů, hemolytickou aktivitu a koagulaci [8]. Nicméně pegylace nese také několik nevýhod, které musí být zváženy. Překážkou jsou možné vedlejší účinky, vytvoření PEG-specifických protilátek a neúplná pegylace [9]. 9

6.1.2 Biodegradace Biodegradabilní nanočástice jsou biologicky odbouratelné částice. Jsou často upřednostňovány před biologicky neodbouratelnými částicemi, neboť nevyžadují budoucí odstranění z těla. Biodegradabilní nanočástice mohou být připraveny z různých materiálů, jako jsou proteiny, polysacharidy a syntetické biodegradabilní polymery. Nejčastěji používané biodegradabilní polymery pro přípravu nanočástic jsou PLGA, PLA, chitosan a želatina. Výběr základního polymeru je závislý na mnoha faktorech: velikost požadovaných nanočástic vlastnosti léčiva (rozpustnost ve vodě, stabilita) povrchové vlastnosti a funkce stupeň biodegradability a biokompatibility profil uvolňování léčiva z konečného produktu [10] 6.2 Nanočástice jako nosiče léčiv Nanočástice používané jako nosiče léčiv jsou submikronové částice o velikosti v rozmezí 100-1000 nm. Cristina Buzea definovala nanočástice jako částice s alespoň jedním rozměrem menším než 1 mikron a potencionálně tak malé, jako atomy a molekuly (~ 0,2 nm) [11]. 6.2.1 Význam velikosti částic Submikronová velikost nanočástic nabízí před mikročásticemi mnoho výhod. Nanočástice díky své malé velikosti mohou efektivně pronikat přes bariéry malých kapilár do jednotlivých buněk, což umožňuje efektivní akumulaci léku v cílovém místě. Nanočástice mohou být podávány do krevního oběhu bez problémů částečné agregace nebo ucpání krevních kapilár [12]. Shrnutí výhod nanočástic: zvýšená rozpustnost ve vodě ochrana léčiva od degradace umožnění prodlouženého uvolňování léku 10

zlepšení biologické dostupnosti léku umožnění cílového podání léku snížení toxických vedlejších účinků léku nabízí vhodnou formu pro všechny cesty podání [13] 6.3 Typy nanočástic Obr. 4: Různé typy nanočástic [6]. 6.3.1 Polymerní nanočástice Mezi polymerní nanočástice patří syntetické, přírodní (př. proteiny) a polosyntetické polymery (př. syntetické peptidy). Většina polymerních nanočástic je biodegradabilní a biokompatibilní. 11

V závislosti na použité metodě přípravy mohou vzniknout nanočástice, nanosféry nebo nanokapsle. Nanosféry mají micelární strukturu, kde mohou být účinné sloučeniny pevně adsorbované nebo zachycené na povrchu micely anebo mohou být přímo rozpuštěné v matrici. Nanokapsle mají polymerní obal a vnitřní jádro. V tomto případě, je obvykle účinná látka rozpuštěná v jádru, ale může také být adsorbována na jejím povrchu [14]. Typ polymeru určuje fyzikálně-chemické vlastnosti nosiče, rychlost uvolňování léčiva a biodistribuci. Polydisperzní charakter polymeru (definován jako heterogenní kombinace řetězců upravené délky) má zvláštní význam pro biologické vlastnosti, které jsou závislé na molární hmotnosti. Bylo zjištěno, že polymery jsou schopné zajistit trvalé a cílené uvolňování léčiv a chrání léčiva od enzymatického poškození. Kromě toho mohou být použity pro překonání nízké rozpustnosti ve vodě některých léčiv, například chemoterapeutik. Protože jsou polymery často vychytávány imunitním systémem, musí být jejich imunokompatibilita a jejich použití v organismu pečlivě zváženo [15]. Bylo prokázáno, že polyanionty jsou méně cytotoxické než polykationty, ale přes to mohou zvýšit antikoagulační aktivitu a uvolnění cytokinů. Polykationty nemusí být pouze cytotoxické, ale mohou také vyvolat hemolýzu a aktivaci komplemetu [16]. 6.3.3 Uhlíkové polymery Polymery na bázi uhlíku představují významnou oblast výzkumu nanočástic. Patří sem polymery, jako jsou fullereny, uhlíkové tečky, nanodiamanty, atd. Nejstabilnější známý fulleren se skládá ze šedesáti atomů uhlíku. Uhlíkové nanotrubice jsou jednoduché vrstvy grafitu válcované v trubkovité formě. Jsou používány ke strukturálnímu posílení stávajících materiálů a k cílenému transportu léčiv. S ohledem na biokompatibilitu, uhlíkové nanotrubice aktivují komplementový systém klasickou i alternativní cestou. Dále bylo zjištěno, že uhlíkové nanotrubice mohou v některých případech přestimulovat komplementový systém, což vede k zánětu a k tvorbě granulomů [9]. Další faktory, které mohou bránit použití uhlíkových nanotrubic u člověka, jsou oxidační stres, apoptóza, toxicita kovových zbytků ze 12

syntézy nanotrubic, peroxidace lipidů, mitochondriální dysfunkce, změny v morfologii buněk a agregaci krevních destiček. Předpokládá se, že modifikace uhlíkových nanotrubic potlačí nežádoucí účinky a umožní jejich rozšíření jako transportních lékových systémů. Grafen je materiál strukturou podobný grafitu. Díky své chemické struktuře a svým vnitřním vlastnostem, může být grafen použit multifunkčně v oblasti biomedicíny. Používá se například jako biosenzor, pro oční aplikaci, pro aktivní i pasivní targeting v protinádorové terapii [17]. 6.3.4 Dendrimery Dendrimery jsou dobře definované vysoce větvené polymery, jejichž tvar, velikost, délka větvení, hmotnost, a povrch můžeme řídit [18]. Jsou charakteristické poměrně značným počtem funkčních skupin na jejich povrchu a velkým prostorem uvnitř dendrimeru. Tyto uzavřené struktury umožňují fyzické zachycení nebo zapouzdření léčiv. Kromě toho, se negativně nabité látky mohou připojit prostřednictvím elektrostatických interakcí s aminoskupinami. Dále mohou být léky chemicky vázány na skupiny na povrchu polymerní struktury. Jsou známy korelace mezi vlastnostmi dendrimerů a jejich funkčností a biologickou kompatibilitou. Například, velikost ovlivňuje rozpustnost i cytotoxicitu [18]. Dendrimery, stejně jako většina nanočástic, jsou používány k cílenému podávání léčiva a mají za cíl zmírnit jeho toxické účinky. K otázce toxicity nemohou být dendrimery kvalifikované jako trvale bezpečné nebo nebezpečné. Výzkum naznačuje, že dendrimery musí být hodnoceny případ od případu, aby se klasifikovala jejich konkrétní biokompatibilita. Dendrimery mají protinádorové, antivirové a antibakteriální vlastnosti [18]. 6.3.5 Lipidové nanočástice Lipozómy představují další kategorii populárních transportních medií pro přenos léků, které svou velikostí přesahují měřítko nanotechnologií (obvykle průměr 1 2 μm). Lipozóm je uzavřený váček tvořený fosfolipidovou membránou a vnitřním vodným prostorem. Toto uspořádání umožňuje zapouzdření léčiva do vnitřního prostředí váčku. 13

Studiemi se ukázalo že, je patrná menší cytotoxicita zapouzdřených cytostatik v lipozómech při srovnatelné terapeutické účinnosti. Řada lipozómů se používá pro léčbu rakoviny, infekce a meningitidy s budoucím uplatněním jako terapeutické vakcíny, která je v současné době ve vývoji [19]. 6.3.6 Kovové nanočástice Kovové nanočástice mají potenciál pro použití jak v terapeutické diagnostice, tak v cíleném podávání léčiv. Tyto nanočástice jsou často podávány v pevné koloidní formě. Mají za cíl zvýšit terapeutický index protinádorových léčiv prostřednictvím pasivního nebo aktivního targetingu, současně se zmírněním toxických účinků omezením doby expozice léku. Kovové částice mohou nést velké terapeutické dávky. Použití koloidního zlata v medicíně lze vysledovat až do roku 1920, kdy se používalo k léčbě tuberkulózy. Od té doby byly koloidní nanočástice zlata široce zkoumány pro použití jako transportního média pro léčiva a geny. S ohledem na biokompatibilitu bylo prokázáno že, buňky reagují na příjem nanočástic zlata bez cytotoxických účinků. Jsou snadno zjistitelné v mikromolárních koncentracích, což je výhodné pro jejich použití v diagnostice. 6.4 Biodegradabilní polymery PLGA a PLA Jak už bylo zmíněno, hlavní výhodou použití nanočástic pro cílený transport je jejich malá velikost. Nanočástice vstupují do buněk a tím umožňují efektivní akumulaci léku v cílovém místě. Biologicky odbouratelné materiály, použité pro vytváření nanočástic, umožňují trvalé uvolňování léčiva v místě terapeutického působení po dobu několika dnů nebo dokonce týdnů. K přípravě nosičů se často využívají částice tvořené kopolymerem PLGA nebo kyselinou polymléčnou (PLA). Polyester PLGA je kopolymer polymléčné kyseliny (PLA) a polyglykolové kyseliny (PGA). PLGA je nejlépe definovaný biomateriál pro podávání léků s ohledem na jeho vzhled i chování. Polymléčná kyselina obsahuje asymetrický uhlík, který je obvykle popisován jako D nebo L stereochemizomer. PLGA je obecně zkratka pro kopolymer kyseliny glykolové s kyselinou DL-mléčnou, které 14

jsou v poměru 50:50. PLGA nanočástice jsou obecně připravovány odpařením rozpouštědla [20]. Obr. 5: PLGA - Poly (D,L-lactide-co-glycolide): n je počet jednotek kyseliny mléčné, m je počet jednotek kyseliny glykolové Makadia HK, Siegel SJ. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers. 2011; 3(3):1377-1397. Tyto polymery byly testovány v rozsáhlých studiích na zvířatech kvůli toxicitě a bezpečnosti. V současné době se používají u člověka jako vstřebatelné šicí materiály, kostí implantáty a šrouby nebo jako antikoncepční implantáty [21]. Léčivo zachycené v PLGA matrici se uvolňuje nepřetržitým tempem prostřednictvím difuze léku v polymerní matrici a její degradací. Degradace polymerní matrix se může měnit složením kopolymeru a změnou jeho molární hmotnosti, a tím může být uvolňování prodlouženo z dní na měsíce. V porovnání s PLGA polymery nejsou PLA polymery široce používány k cílenému podávání léčiv, kvůli jejich pomalému rozkladu. V praxi se používají modifikované PLA mikrosféry, které ukázaly lepší protinádorový účinek a zvýšenou nosnou kapacitu oproti nezměněnému PLA [22]. 6.4.1 Biodegradace PLGA Stejně jako přírodní polyestery, jsou tyto polymery v těle hydrolyzovány. Nejprve dochází k náhodnému štěpení řetězce a dochází ke snižování molární hmotnosti polymeru. Poté vznikají rozpustné oligomery a polymery a dochází k rychlé ztrátě hmotnosti. Polymerní biodegradační produkty vznikají velmi pomalu, a tedy nemají vliv na normální funkci buněk. Jestli se biodegradace PLGA účastní enzymy, zatím není jasné. 15

6.4.2 Faktory ovlivňující degradaci K posílení žádoucích vlastností PLGA, je důležité pochopit faktory, které ovlivňují jeho degradaci. A podle těchto faktorů navrhnout způsob podávání léků, které by bylo efektivnější a účinnější. Vliv složení polymeru Polymerní kompozice je nejdůležitějším faktorem ke stanovení hydrofilního charakteru, který má vliv na rychlost degradace polymeru. Systematické studium složení polymeru ukazuje, že zvýšení procenta kyseliny glykolové v oligomeru urychluje úbytek hmotnosti polymeru. PLGA polymer ve složení 50:50 (PLA/PGA) podléhá rychlejší degradaci než PLGA 65:35, v důsledku preferenčního rozkladu hydrofilní kyseliny glykolové. Obdobně polymer obsahující poměr kyseliny mléčné a kyseliny glykolové 65:35 je hydrolyzován rychleji než polymer obsahující podíl 75:25. Tedy absolutní hodnota rychlosti rozkladu se zvyšuje s podílem kyseliny glykolové. Množství kyseliny glykolové je rozhodující parametr při přípravě hydrofilní matrice, kterým můžeme ovlivnit degradaci a rychlost uvolňování léčiva [23]. Vliv krystalinity Složení kopolymeru ovlivňuje také důležité vlastnosti, jako je teplota skelného přechodu a krystalinita, které mají nepřímý vliv na rychlost rozkladu. V současné době existují protichůdné informace o vlivu krystalinity na degradaci polymeru. Studie prokázaly snížení rychlosti rozkladu s nárůstem krystalinity vzorku [24]. Vliv průměrné molární hmotnosti (M w ) Polymery s vyšší molární hmotností obecně vykazují pomalejší degradaci. Molární hmotnost má přímý vztah k velikosti řetězce polymeru. Polymery s vyšší molární hmotností mají delší řetězce, což vyžaduje více času na degradaci v porovnání s polymery s kratšími řetězci. Vliv typu léčiva Mechanismus degradace matrice (polymer-léčivo) a parametry uvolňování léčiva se liší v závislosti na typu léčiva. Přítomnost léčiva může měnit mechanismus a rychlost degradace. Také se výrazně liší profilem uvolňování léčiva, který je definován časem potřebným na 100% uvolnění, a rychlostí dosažení ustáleného stavu. Nicméně, je 16

jasné, že musíme zvážit efekt chemických vlastností léčiva na vysvětlení mechanismu uvolňování léčiv určitého systému používáním biodegradabilních polymerů. Vliv velikosti a tvaru matrice Poměr povrchu k objemu se ukázal být významným faktorem pro degradaci rozměrných lékových forem. Vyšší poměr plochy vede k rychlejší degradaci matrice. Bylo zjištěno, že u PLGA je objemová degradace rychlejší než povrchová, což umožňuje rychlejší uvolňování léčiva ze struktury s vyšším povrchem vzhledem k objemu [24]. Vliv ph Biodegradace (hydrolýza) PLGA in vitro ukázala, že jak alkalické tak silně kyselé prostředí urychlí rozklad polymeru. Rozdíl mezi mírně kyselým a neutrálním prostředím je málo výrazný v důsledku autokatalýzy koncových karboxylových skupin. Vliv enzymů Ve většině studií je tvrzení, že enzymatická aktivita nehraje žádnou roli v degradaci PLGA. Ale existují i takové studie, které potvrzují přítomnost enzymů v procesu biologického odbourávání PLGA. Vliv obsahu účinné látky Množství účinné látky v matrici má významný vliv na rychlost a dobu trvání uvolňování léčiva. Z matric, které mají vyšší obsah účinné látky, se tyto látky rychleji uvolní, než z těch matric, které mají nižší obsah léčiva [25]. 6.5 Nanočástice v medicíně 6.5.1 Terapie Jak bylo už dříve zmíněno, nanočástice mají široké využití v cíleném transportu léčiva do místa účinku. Jejich použití je velmi rozmanité, od antimikrobního účinku, přes nádorovou léčbu až ke genové terapii. Mnoho cytostatik jako jsou karboplatina, paklitaxel a doxorubicin byly úspěšně inkorporovány do nanočástic, což umožnilo 17

cílený transport cytotoxické látky do ložiska nádoru s minimálním ovlivněním okolních tkání [26]. 6.4.2 Diagnostika Nanotechnologie může nabídnout citlivé, rychlé a ekonomicky efektivní řešení pro stanovení diagnózy v moderní klinické laboratoři. Nanočástice jsou stále více aplikovány v molekulární diagnostice a několik dalších technologií je ve vývoji. Nejrozšířeněji jsou používány nanočástice zlata a kvantové tečky. Polovodičové kvantové tečky jsou nanočástice s intenzivní a stabilní fluorescencí, která umožní detekci desítek až stovek nádorových biomarkerů z rozboru krve nebo biopsie tkání. Nanočástice zlata se také používají jako diagnostický marker. Dokáží detekovat biologické molekuly již při nízkých koncentracích, díky unikátní kombinaci fyzikálních a chemických vlastností [27]. 18

7. Experimentální část 7.1 Použité přístroje Analytické váhy Kern, max 220 g, d = 0,1 mg Váhy Kern 440-35N, max 400 g, d = 0,01 g Homogenizátor Diax 900 Heidolph, 8000-26000 ot. / min., 6 pásem Magnetická míchačka IKA WERKE RT, 100 1000 ot./min Zetasizer ZS, Malvern Instruments, UK Zetasizer ZS 90 Vakuová sušárna Memmert Ubbelohdeho kapilární viskozimetr typ I a 0a 7.2 Použité chemikálie Cetrimid (N- cetyl- N, N, N- trimethylammoniumbromid), Merck Čištěná voda FaF UK, čištěná reverzní osmózou Dichlormethan (CH 2 Cl 2 ), Penta a.s. Ethylmethylketon (EMK), Lachema a.s., Neratovice Kyselina dusičná 65%, Lach- Ner, s.r.o., Neratovice Kyselina chlorovodíková 35%, Lachema a.s., Neratovice Lecithin hydrogenovaný, Stern A.G. Polysorbát 20, Dr. Kulich Pharma, s. r. o., Hradec Králové Terbinafin hydrochlorid, dar od firmy Zentiva a.s. Terpolymer kyseliny DL- mléčné, kyseliny glykolové a tripentaerytritolu ( T3), syntéza na KCHT 19

7.3 Postup přípravy 7.3.1 Příprava terbinafinu Bylo naváženo 8,0 g terbinafinu hydrochloridu (T-HCl). Ten byl za stálého míchání při maximální teplotě 40 C rozpuštěn v 1992,0 g destilované vody. Vzniklý 0,4% roztok T-HCl vykazoval mírnou opalescenci. Po úplném rozpuštění byl k roztoku za stálého míchání přidáván 10% amoniak až do dosažení ph 7-8 (skutečné ph bylo 7,2). Hodnoty ph byly kontrolovány pomocí ph indikačních papírků. Ve vzniklé suspenzi se vysrážela báze terbinafinu. Poté byl přidán dichlormethan a celá soustava byla třepána v dělící nálevce. Terbinafin se rozpustil v organické fázi. Fáze byly odděleny pomocí dělící nálevky a organická fáze s rozpuštěným terbinafinem byla umístěna na Petriho misky, na kterých se postupně odpařilo organické rozpouštědlo. K urychlení postupu byla využita vakuová sušárna. Takto připravený terbinafin byl následně využíván k přípravě nanočástic. 7.3.2 Příprava vnější fáze Navážka potřebného množství emulgátoru byla rozpuštěna v předepsaném množství čištěné vody. Roztoky vnější fáze byly připravovány v koncentraci 0,20 % tenzidu ve vodě. Byly použity tyto emulgátory: cetrimid a polysorbát 20. Na všechny vzorky se shodně potřebovalo 50,0 g vnější fáze. 7.3.3 Příprava vnitřní fáze Na vahách bylo naváženo potřebné množství polymeru T3, které se za míchání rozpustilo v ethylmethylketonu. Byly připravovány 1% a 3% roztoky polymeru v organickém rozpouštědle. Na analytických vahách byl navážen terbinafin v koncentraci 0 %, 1 %, 3 % a 21 % a byl rozpuštěn v roztoku. Aby se zabránilo vytěkání ethylmethylketonu, byl tento roztok před dalším krokem uchován v 25ml lahvičkách s uzávěrem. Na všechny vzorky se shodně připravovalo 10,0 g vnitřní fáze. 7.3.4 Příprava nanočástic Kádinka s 50 g vnější fáze byla umístěna pod homogenizátor tak, aby konec turbíny byl ponořen cca 0,5 cm ode dna kádinky. Postupně byly na homogenizátoru zvyšovány otáčky až na maximum (stupeň 6). Při tomto stupni byl najednou a rychle 20

přidán celý objem (10 g) vnitřní fáze s terbinafinem. Po 60 s při nejvyšších otáčkách se pomalu snižovala intenzita míchání až do úplného vypnutí homogenizátoru. Přesný čas byl měřen na stopkách. Vzniklá suspenze nanočástic byla přemístěna na 2 hodiny na magnetickou míchačku. Po uplynutí této doby byla měřena velikost nanočástic. Některé vzorky byly umístěny na 24 hodin do lednice nebo mrazicího boxu a poté se měření opakovalo. 7.4 Parametry měření velikosti nanočástic Pro měření velikosti částic byl použit přístroj Zetasizer ZS, který měří velikost metodou dynamického rozptylu světla DLS. Tato metoda spočívá v měření Brownova pohybu částic, ze kterého je poté odvozena jejich velikost. Zatímco velké částice se pohybují pomalu, malé se pohybují rychle. Brownův pohyb se měří osvětlením částic laserem a analýzou fluktuací intenzity v rozptýleném světle. Vztah mezi velikostí a pohybem částic je definovaný Stokes-Einsteinovou rovnicí. Oddíl s výsledky obsahuje tři základní charakteristiky. Zeta průměr (Z-Ave) je střední průměr velikosti částic ve vzorku. Index polydisperzity (Pdl) charakterizuje variabilitu velikostí částic ve vzorku. Pdl nabývá hodnot od 0 do 1. Když je roven nule, tak všechny částice ve vzorku jsou řádově stejně velké. Píky zobrazují střední velikost částic ve vzorku a jejich procentuální zastoupení [28]. Do kyvet bylo odebráno dané množství vzorku. Kyveta byla vložena do přístroje a bylo provedeno měření. Zetasizer ZS byl nastaven na tři opakovaná měření a, b, c. 7.5 Výsledky měření 7.5.1 Parametry nanočástic. Vliv použitého tenzidu, koncentrace terbinafinu. Na přípravu vzorků byl shodně použit 3% polymer T3 jako vnitřní fáze. Jako vnější fáze byl použit buď 0,2% roztok cetrimidu ve vodě a nebo 0,2% roztok polysorbátu 20 ve vodě. Koncentrace terbinafinu byla 1% nebo 3%. Vzorky byly míchány 60 s při nejvyšším stupni homogenizace a po dvou hodinách míchání byla měřena velikost nanočástic. Opakovanou přípravou byly připraveny dva shodné vzorky a přístroj u každého z nich provedl tři měření- a, b, c. 21

Tab. 1: Velikost nanočástic. 0,2% CET, 1% terbinafin. Pk 1 Pk 2 Pk 3 Peak 3 Area ensity Pk 1 Pk 2 vzorek Z-Ave PdI Area Area d.nm d.nm d.nm d.nm % % % 4a 471,1 0,534 1159 230 5374 56 41,9 2,1 4b 481,3 0,538 739,9 183,7 0 68,5 31,5 0 4c 449,4 0,579 915,1 212,8 0 54,5 45,5 0 8a 471,2 0,517 779,5 199,5 5455 64 34 2 8b 406,7 0,464 335,6 2814 0 65,6 34,4 0 8c 360,9 0,538 246,3 812,1 4986 59,5 31,6 8,9 Tab. 2: Velikost nanočástic. 0,2% CET, 3% terbinafin. Pk 1 Pk 2 Pk 3 Peak 3 Area ensity Pk 1 Pk 2 vzorek Z-Ave PdI Area Area d.nm d.nm d.nm d.nm % % % 5a 443,8 0,488 241,9 1501 4859 49,1 46,8 4,1 5b 471,1 0,525 943,3 210,3 0 51,2 48,8 0 5c 439,5 0,586 228,4 1120 5418 51,8 45,6 2,6 9a 491,3 0,553 243,4 1440 5560 55,4 43,4 1,1 9b 421,8 0,482 267,8 1567 5171 70,2 22,1 7,6 9c 394,8 0,44 311,6 3763 0 76,2 23,8 0 Tab. 3: Velikost nanočástic. 0,2% PS, 1% terbinafin. Pk 1 Pk 2 Pk 3 Peak 3 Area ensity Pk 1 Pk 2 vzorek Z-Ave PdI Area Area d.nm d.nm d.nm d.nm % % % 6a 644,1 0,844 1221 219,2 5560 60,4 37,3 2,3 6b 658,8 0,765 2427 231,7 0 69,7 30,3 0 6c 669,4 0,76 958,4 203 5560 65 32 3 10a 595,3 1 507,3 0 0 100 0 0 10b 572,2 1 499,5 0 0 100 0 0 10c 552 0,999 495 0 0 100 0 0 22

Obr. 6: Vzorek č. 10 - intenzitní průměr nanočástic- frekvenční křivka. 0,2% PS, 3% T3, 1% terbinafin. Tab. 4: Velikost nanočástic. 0,2% PS, 3% terbinafin. Pk 1 Pk 2 Pk 3 Peak 3 Area ensity Pk 1 Pk 2 vzorek Z-Ave PdI Area Area d.nm d.nm d.nm d.nm % % % 7a 1332 0,561 772,7 0 0 100 0 0 7b 2454 1 475,6 168,4 0 74,2 25,8 0 7c 1800 0,986 962,2 184,6 0 75,8 24,2 0 11a 4216 0,275 1044 0 0 100 0 0 11b 2985 0,204 2679 0 0 100 0 0 11c 1660 0,238 1844 0 0 100 0 0 Obr. 7: Vzorek č. 11 - intenzitní průměr nanočástic- frekvenční křivka. 0,2% PS, 3% T3, 3% terbinafin. 23

Obr. 8: Vliv použitého tenzidu a koncentrace terbinafinu na velikost částic. Byly připravovány dva shodné vzorky. 3500 3000 2500 2000 1500 1. vzorek 2. vzorek 1000 500 0 0,2% CET, 3% T3, 1% BT 0,2% CET, 3% T3, 3% BT 0,2% PS, 3% T3, 1% BT 0,2% PS, 3% T3, 3% BT 7.5.2 Vliv snížené teploty na stabilitu nanočástic Na přípravu vzorků byl použit 0,2% roztok cetrimidu ve vodě jako vnější fáze a 1% nebo 3% roztok polymeru T3 jako vnitřní fáze. Vzorky neobsahovaly terbinafin. Vzorky byly míchány 60 s při nejvyšším stupni homogenizace. Byly měřeny po 2 hodinách míchání a následně po 24 hodinách v lednici (5 C) nebo v mrazicím boxu (-16 C). 24

Tab. 5: Vliv uchovávání při snížené teplotě (5 ºC nebo -16 C) na velikost nanočástic. 3% T3, 0% terbinafin. měřeno po 2 hod míchání po 24 hod v lednici po 24 hod v mrazicím boxu Z- Pk 1 Pk 2 Pk 3 Pk 1 Pk 2 Peak 3 Area vz. Ave PdI Area Area d.nm d.nm d.nm d.nm % % % 1a 735,7 0,356 1007 160,9 0 90,8 9,2 0 1b 660,8 0,477 1827 399,4 0 60,9 39,1 0 1c 629,8 0,518 2096 330,9 0 58,8 41,2 0 1a 770 0,415 1395 290 5106 75,4 22,6 2 1b 716,5 0,51 1604 279,3 0 76,8 23,2 0 1c 709,2 0,505 1573 275,5 0 77,4 22,6 0 1a 6247 0,704 720,1 0 0 100 0 0 1b 6846 0,859 303 0 0 100 0 0 1c 7551 1 43,72 0 0 100 0 0 Tab. 6: Vliv uchovávání při snížené teplotě (5 ºC nebo -16 C) na velikost nanočástic. 1% T3, 0% terbinafin. měřeno po 2 hod míchání po 24 hod v lednici po 24 hod v mrazicím boxu Z- Pk 1 Pk 2 Pk 3 Pk 1 Pk 2 Peak 3 Area vz. Ave PdI Area Area d.nm d.nm d.nm d.nm % % % 2a 527,1 0,706 392,6 4550 0 71,7 28,3 0 2b 437,2 0,587 256,9 789,3 5434 57,2 39,4 3,4 2c 375,9 0,407 619,3 194 5230 55,4 40,3 4,4 2a 327,1 0,18 353 0 0 100 0 0 2b 322,5 0,133 349,9 0 0 100 0 0 2c 315,1 0,193 311,8 5414 0 98,8 1,2 0 2a 1955 0,531 739,5 0 0 100 0 0 2b 1774 0,597 1173 0 0 100 0 0 2c 2004 0,674 1243 0 0 100 0 0 25

Obr. 9: Vzorek č. 2 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 2 hod míchání. Obr. 10: Vzorek č. 2 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 24 hod v lednici. Obr. 11: Vzorek č. 2 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 24 hod v mrazicím boxu. 26

Z-Ave [nm] Tab. 7: Vliv uchovávání při snížené teplotě (5 ºC nebo -16 C) na velikost nanočástic. 3% T3, 0% terbinafin. měřeno po 2 hod míchání po 24 hod v lednici po 24 hod v mrazicím boxu Z- Pk 1 Pk 2 Pk 3 Pk 1 Pk 2 Peak 3 Area vz. Ave PdI Area Area d.nm d.nm d.nm d.nm % % % 3a 553,6 0,553 678,4 211,3 5396 74,9 21,5 3,6 3b 553,6 0,409 802,5 218,4 5196 71,6 24,1 4,3 3c 581,6 0,536 2218 343,2 89,9 53,2 46,4 0,5 3a 408,2 0,413 640,7 4373 0 94,4 5,6 0 3b 400,6 0,355 495 4734 0 94,6 5,4 0 3c 386,1 0,324 450,4 112,1 5214 90,6 6,5 2,9 3a 2501 1 206,9 0 0 100 0 0 3b 2136 1 282,3 0 0 100 0 0 3c 2192 0,921 750 0 0 100 0 0 Obr. 12: Vliv uchovávání při snížené teplotě (5 ºC nebo -16 C) na velikost nanočástic vz. 1 až 3. Měřeno po 2 hodinách a po 24 hodinách v lednici nebo mrazicím boxu. 8000 7000 6000 5000 4000 po 2 hod po 24 hod v lednici po 24 hod v mrazicím boxu 3000 2000 1000 0 vzorek 1 vzorek 2 vzorek 3 7.5.3 Porovnání vlastností nanočástic vůči času Vzorky byly připravovány při maximálním stupni homogenizace po dobu 60 s. Jako vnější fáze byl použit 0,2% roztok cetrimidu ve vodě. Jako vnější fáze byl použit 1% polymer T3 v koncentracích 5 % a 15 %. Vzorky byly připraveny dle rozpisu 27

v tabulce 8. Měření se prováděla po 90 minutách míchání (měření č. 1), a poté znovu po 130, 170, 210 a 250 minutách míchání (měření č. 2 až č. 5). Tab. 8: Složení vzorků pro testování změn velikosti částic v médiu po jejich přípravě. označení vzorku [% BT / % EM] terbinafin [mg] 1% T3 [g] CET 0,2% [g] 0/5 0 2,5 47,5 0/15 0 7,5 42,5 21/5 7,5 2,5 47,5 21/15 22,5 7,5 42,5 Tab. 9: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 0 % terbinafinu, 5 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8. Pk 1 Pk 2 Pk 3 Pk 1 Area Pk 2 Area vzorek číslo měření Z-Ave PdI Peak 3 Area ensity d.nm d.nm d.nm d.nm % % % 0/5 1a 447,5 0,383 291 0 0 100 0 0 0/5 1b 472,3 0,705 250,7 1160 5538 65,2 31,8 3 0/5 1c 547,9 0,589 833,9 168,7 0 52,3 47,7 0 0/5 2a 460,2 0,471 319,2 0 0 100 0 0 0/5 2b 460,6 0,559 436,5 98,67 0 85,8 14,2 0 0/5 2c 425,5 0,592 581,3 124,3 0 76,8 23,2 0 0/5 3a 454,8 0,558 383,1 83,22 0 89,4 10,6 0 0/5 3b 458,4 0,53 325,6 70,92 0 92,5 7,5 0 0/5 3c 398,6 0,309 273,8 0 0 100 0 0 0/5 4a 354,7 0,379 368,1 4608 0 88,2 11,8 0 0/5 4b 355,2 0,36 363,9 4757 0 90,2 9,8 0 0/5 4c 356,5 0,405 427,8 4638 0 90,4 9,6 0 0/5 5a 493,1 0,514 427 95,11 0 80,9 19,1 0 0/5 5b 430 0,656 364,1 96,03 0 85 15 0 0/5 5c 367,5 0,542 301,2 5560 0 98,5 1,5 0 28

Obr. 13: Vz. 0/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 90 min. míchání. Obr. 14: Vz. 0/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 130 min. míchání. Obr. 15: Vz. 0/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 170 min. míchání. 29

Obr. 16: Vz. 0/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 210 min. míchání. Obr. 17: Vz. 0/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 250 min. míchání. 30

Z-Ave [nm] Obr. 18: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 0 % terbinafinu, 5 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8. 600 500 400 300 200 po 90 min po 130 min po 170 min po 210 min po 250 min 100 0 vzorek 0/5 Tab. 10: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 0 % terbinafinu, 15 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8. Pk 1 Pk 2 Pk 3 Pk 1 Area Pk 2 Area Peak 3 Area ensity vzorek číslo měření Z- Ave PdI d.nm d.nm d.nm d.nm % % % 0/15 1a 360,5 0,411 443,7 4550 0 89,7 10,3 0 0/15 1b 352,6 0,4 261,3 865,5 4867 70,1 20 9,9 0/15 1c 355,9 0,387 388,3 4490 0 87 13 0 0/15 2a 368,8 0,186 386,6 0 0 100 0 0 0/15 2b 384 0,203 370,4 0 0 100 0 0 0/15 2c 382 0,24 362,3 0 0 100 0 0 0/15 3a 343,6 0,418 382,6 4249 0 86,7 13,3 0 0/15 3b 336,4 0,373 353,3 4858 0 91,6 8,4 0 0/15 3c 356,9 0,381 357,5 4996 0 91,4 8,6 0 0/15 4a 404,4 0,733 190,3 673,6 5465 52 43,8 4,3 0/15 4b 445,3 0,669 309,2 116,7 0 76,6 23,4 0 0/15 4c 404,1 0,519 310,7 65,61 0 93 7 0 0/15 5a 293 0,305 245,1 0 0 100 0 0 0/15 5b 297,7 0,275 317,9 5171 0 96,9 3,1 0 0/15 5c 298,4 0,269 310,7 5366 0 98 2 0 31

Z-Ave [nm] Obr. 19: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 0 % terbinafinu, 15 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8. 450 400 350 300 250 200 150 100 po 90 min po 130 min po 170 min po 210 min po 250 min 50 0 vzorek 0/15 Tab. 11: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 21 % terbinafinu, 5 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8. vzorek Pk 1 Pk 2 Pk 3 Pk 1 Area Pk 2 Area Peak 3 Area ensity číslo měření Z-Ave PdI d.nm d.nm d.nm d.nm % % % 21/5 1a 510 0,105 360,4 0 0 100 0 0 21/5 1b 470,4 0,665 584,1 138,5 0 79,2 20,8 0 21/5 1c 539 0,502 651,8 133,9 0 76,4 23,6 0 21/5 2a 587 0,472 390,6 50,96 0 95 5 0 21/5 2b 468,8 0,521 499 110,2 0 85,8 14,2 0 21/5 2c 514 0,577 630,1 143,7 0 72 28 0 21/5 3a 477,8 0,58 402,6 87,21 0 88,6 11,4 0 21/5 3b 480,5 0,46 350,1 0 0 100 0 0 21/5 3c 431,6 0,435 337,9 0 0 100 0 0 21/5 4a 588 0,593 454,2 112,2 0 79,6 20,4 0 21/5 4b 493,3 0,686 569 116,7 0 80 20 0 21/5 4c 482,2 0,463 347,4 0 0 100 0 0 21/5 5a 678,6 0,585 535,3 130,5 0 70,2 29,8 0 21/5 5b 497,9 0,764 416,1 120,5 0 77,7 22,3 0 21/5 5c 408,6 0,49 279,7 0 0 100 0 0 32

Obr. 20: Vz. 21/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 90 min. míchání. Obr. 21: Vz. 21/5 - intenzitní průměr nanočástic - frekvenční křivka. Vzorek měřen po 250 min. míchání. 33

Z-Ave [m] Obr. 22: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 21 % terbinafinu, 5 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8. 540 520 500 480 460 po 90 min po 130 min po 170 min po 210 min po 250 min 440 420 vzorek 21/5 Tab. 12: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 21 % terbinafinu, 15 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8. Pk 1 Pk 2 Pk 3 Pk 1 Area Pk 2 Area Peak 3 Area ensity číslo vzorek měření Z-Ave PdI d.nm d.nm d.nm d.nm % % % 21/15 1a 403,6 1 362,8 0 0 100 0 0 21/15 1b 397 0,103 405,1 0 0 100 0 0 21/15 1c 413,7 0,054 434,3 0 0 100 0 0 21/15 2a 516,1 0,632 931,4 216,5 5404 59,4 37,3 3,3 21/15 2b 514,1 0,684 888,8 229,3 5187 55,7 36,6 7,6 21/15 2c 492,8 0,482 366,9 1429 5087 67,4 25,2 7,5 21/15 3a 398,4 0,223 400 0 0 100 0 0 21/15 3b 434 0,107 459,6 0 0 100 0 0 21/15 3c 422,3 0,017 434,8 0 0 100 0 0 21/15 4a 415,1 0,394 489,8 3840 0 84,8 15,2 0 21/15 4b 416,2 0,416 282,5 1200 4446 53,7 38,8 7,4 21/15 4c 475,5 0,645 686,7 225,2 5369 55,2 39,3 5,5 21/15 5a 720,3 0,7 3022 367,3 0 60,2 39,8 0 21/15 5b 746,6 0,525 1065 3995 248,8 49,3 26,3 24,4 21/15 5c 734 0,551 1145 244,1 4280 59,2 22,5 18,3 34

Z-Ave [nm] Obr. 23: Velikost částic v různých časových intervalech po jejich přípravě 21 % terbinafinu, 15 % 1% polymeru T3. Podmínky přípravy vzorku v tab. 8. 800 700 600 500 400 300 200 po 90 min po 130 min po 170 min po 210 min po 250 min 100 0 vzorek 21/15 7.5.4 Viskozita jako parametr ovlivňující velikost částic Vzorek č. 2 byl připraven při maximálním stupni homogenizace, která trvala 60 s. Jako vnější fáze byl použit 0,2% roztok cetrimidu ve vodě, koncentrace polymeru T3 byla 1%. Vzorek neobsahoval terbinafin. Měření velikosti částic se provádělo po 2 hodinách míchání. Výsledky měření velikosti částic jsou uvedeny v tabulce č. 6. Viskozita byla měřena pomocí Ubbelohdeho kapilárního viskozimetru (typ I a 0a). Vzorek se nechal ve viskozimetru ponořeném ve vodní lázni temperovat 30 min na teplotu 20 ºC ± 0,5. Vlastní měření spočívalo v měření časového intervalu stopkami poklesu hladiny kapaliny mezi danými značkami na viskozimetru. Měření bylo opakováno třikrát. Z aritmetického průměru naměřených hodnot byla vypočítána kinematická viskozita. 35

Tab. 13: Viskozita. označení vzorku 12 typ viskozimetru k = konstanta viskozimetru (mm² * s ²) 1 0,01 0a 0,003 číslo měření naměřený čas (s) 1 57,79 2 57,32 1 182,84 2 189,63 3 182,43 3 229,51 t = průměrná doba průtoku zkoušené kapaliny (s) kinematická viskozita ν = k * t 184,967 0,55453 36

8. Diskuze 8.1 K zaměření práce Práce metodicky navazovala na řadu jiných diplomových a rigorózních prací, jejichž cílem bylo hledání optimálních podmínek pro přípravu biodegradabilních nanočástic s terbinafinem ve formě jeho báze. Nosičem byl terpolymer kyselin DL-mléčné a glykolové větvený na tripentaerytritolu rozpuštěný v 1% nebo 3% koncentraci. Byla zvolena emulzní metoda za rozdělování rozpouštědla z vnitřní olejové fáze, rozpouštědlem byl ethylmethylketon. Jednalo se o volbu vhodného nosiče, vhodné kompozice vnitřní fáze a vhodného složení vnější fáze. Hodnocenými parametry byly v této fázi vývoje možnosti dosažení co nejmenších rozměrů nanočástic při jejich co nejmenší polydisperzitě. Velmi důležitým parametrem je dostatečná robustnost metody, tedy malá citlivost k náhodným vlivům pocházejícím z limitovaných možností dodržení konstantních podmínek při dispergaci roztoku nosiče a při jeho solidifikaci. Problematika stabilizace nanodisperze pro dlouhodobé uchovávání bude předmětem dalších studií, stejně tak jako řešení enkapsulační efektivity a stability terbinafinu v nanočásticích při jejich přípravě a dalším zpracování. V předložené diplomové práci byla řešena problematika volby vhodného emulgátoru. Byl vybrán kationický cetrimid a neionický polysorbát 20. Koncentrace emulgátorů byly zvoleny stejné, tedy 0,20% na základě dříve realizovaných experimentů. Jako další technologický aspekt byla testována reprodukovatelnost z hlediska získání granulometricky stejných nanočástic při stejném postupu přípravy a také síla vlivu přísady báze terbinafinu v relativně malé koncentraci na velikost nanočástic. Kromě střední velikosti nanočástic a polydisperzity velikosti byl hodnocen podíl částic větších než jeden mikrometr. Pro další zpracování nanodisperzí je nutná jejich dostatečná stabilita po dobu několika hodin. Byla zvolena doba 24 hodin a teplota uchovávání byla 5 C a -16 C. 24 hodin je dostatečná doba pro zpracování nanodisperzí jejich lyofilizací nebo jiným vhodným způsobem. 37

8.2 K nanočásticím připraveným s kationickým a neionickým emulgátorem Výsledky měření velikosti částic jsou v tabulkách 1 až 4. Porovnáním výsledků měření částic s příměsí 1% terbinafinu a 3% terbinafinu (tab. 1a 2) s použitím cetrimidu je možno konstatovat, že byly získány produkty, které se z hlediska celkových charakteristik jen velmi málo lišily. Celkový průměr velikosti se pohyboval v rozmezí od 400 nm do 500 nm. Při podrobnějším zhodnocení rozložení velikosti měly větší rozptyl vzorky s 3% terbinafinem. Je možno konstatovat, že rozložení je trimodální s nejmenšími nanočásticemi kolen 250 nm, středními kolem 1500 nm a největšími s deklarovaným průměrem vyšším než 5000 nm, což je za hranicí měřitelnosti. Podíl těchto částic je malý, není známo, jaký podíl největších nanočástic byl za hranicí měřitelnosti. Totéž platí i o nanočásticích obsahujících 1% terbinafin. Nanočástice připravené za stejných podmínek s jedinou odlišností v použití neionického polysorbátu 20 byly větší, jejich průměr byl kolem 600 nm (tab. 3). Pozoruhodně odlišné byly nejen parametry velikosti v rámci opakovaného měření, ale také polydisperzity. Záznam měření vzorku č. 10 s nízkou polydisperzitou je na obr. 6. Po přidání 3% terbinafinu (tab. 4) byly připraveny značně větší nanočástice s unimodální distribucí velikosti (obr. 7). Z uvedeného vyplývá, že výhodnější je z granulometrického hlediska použití cetrimidu jako emulgátoru. Při použití polysorbátu je možno předpokládat jeho vyšší mísitelnost s vnitřní částí s možnou plastifikací polyesterového nosiče. Na obr. 8 jsou všechny výše uvedené vzorky srovnány z hlediska jejich středního intenzitního průměru. Velmi zřetelně se liší vzorek, který byl připraven emulgací ve vnější fázi s polysorbátem obsahující 3% bázi terbinafinu. 8.3 K vlivu uchovávání nanodisperzí Důvodem pro testování tohoto potenciálního vlivu na granulometrické parametry nanodisperze je snaha získat informaci o možnosti dalšího zpracování meziproduktu s časovou prodlevou v případě neočekávaných změn v technologickém procesu. V tabulce 5 jsou uvedeny vyhodnocené parametry nanočástic bez terbinafinu připravených z 3% roztoku polyesteru pomocí 0,20% cetrimidu. Byly získány mikročástice s menším podílem nanočástic v bimodálním rozdělení. Po 24 hodinách při 5 C se velikost částic mírně snížila. To znamená, že nad procesem rozdělování 38