Metody používané v MB analýza proteinů, nukleových kyselin
Proteiny analýza a manipulace Izolace, purifikace (rozdělovací metody) Centrifugace Chromatografie Elektroforéza Blotting (identifikace, western blott) Strukturní analýza (MALDI-TOF, X-ray crystallography, NMR)
Centrifugace - frakcionace buněčných lyzátů
Figure 8-10 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
chromatografie
Figure 8-13b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Figure 8-13c Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
ELEKTROFORÉZA Princip dělení nabitých částic na základě různých elektroforetických pohyblivostí Použití analytické i preparativní
Parametry separace náboj velikost tvar Koncentrace gelu nižší dělení pouze podle náboje vyšší nebo gradient dělení také podle velikosti a tvaru Vliv ph - ovlivňuje náboj, stabilitu, aktivitu "kyselá" (kyselé ph): "alkalická" (alkalické ph): + + Směr migrace závisí na pi proteinů všechny nemusí "putovat gelem"
ELFO na PAGE v přítomnosti SDS (Sodium Dodecyl Sulphate dodecylsíran sodný) SDS se váže na proteiny, uděluje jim uniformní záporný náboj SDS-PAGE
Vyhodnocení
2D elektroforeza - Isoelektrická fokusace (IEF) - SDS-PAGE
2D elektroforeza IEF + SDS-PAGE
2D separace Kombinace: isoelektrická fokusace/sds PAGE
WESTERN BLOTTING 1. elektroforéza rozdělení proteinů, např. SDS-PAGE 2. blotting přenos na membránu, např. elektroforeticky 3. detekce (většinou imunodetekce)
- Specifické protilátky - SDS PAGE - 2D elfo
Sekvenční analýza proteinů (primární struktura) Edmanovo odbourávání hmotnostní spektrometrie (MALDI TOF) Bioinformatika (geno(mo)vé databáze)
hmotnostní spektrometrie (mass spectrometry) MALDI -TOF
Struktura proteinu Rentgenostrukturní analýza (X-ray crystallography) NMR (z roztoků)
Nukleové kyseliny analýza a manipulace Restrikční štěpení (manipulace s DNA, identifikace specifických sekvencí) Elektroforéza (délka fragmentů, čistota, kvantifikace) Hybridizace (identifikace specifických sekvencí) Amplifikace DNA (PCR) klonování Sekvenace DNA
Restrikční štěpení Restrikční endonukleásy štěpení specifické sekvence tupé/kohezní konce Figure 8-31 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Restrikční endonukleasy - příklady
o rozdělení makromolekul dle mobility v elektrickém poli o DNA záporně nabitá o vizualizace interkalační činidla, fluorofory (Et-Br excitace UV, toxický!) o Marker : DNA o známé mol. Hmotnosti o Nosič: agaroza Elektroforeza separace galaktóza a 3,6-anhydrogalaktóza
1 3 2 4
Příklady: Barvení ET-Br Parciální štěpení PFGE
Hybridizace - detekce specifických sekvencí
Northen/Southern Blotting hybridizace elektroforeticky separovaných molekul RNA/DNA
Proba specificky značená radioaktivně (32P), chemicky (digoxygenin), protilátkou
Hybridizace - detekce specifických sekvencí In situ- Lokalizace genů na chromosomech
PCR (polymerase chain reaction) Namnožení specifického úseku DNA analýza genu (přítomnost, mutace) genové exprese (RT PCR) kvantifikace DNA (qpcr) 3 kroky: 1) denaturace rozpad dvoušroubovicové str. - ssdna 2) annealing - nasednutí primerů na specifická místa ssdna 3) polymerace - syntéza DNA (termostabilní DNA polymeraza) Např. 30 cyklů (z 1 původní molekuly DNA lze získat po 32 cyklech až 1 miliardu kopií)
(thermo)cycler
Klonování Produkce specifických proteinů Příprava knihoven (DNA, cdna)
Figure 8-40 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
DNA and cdna library Figure 8-41 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Figure 8-42 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Figure 8-43 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Figure 8-44 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Basic components of a plasmid cloning vector that can replicate within an E. coli cell. Plasmid vectors contain a selectable gene such as ampr, which encodes the enzyme - lactamase and confers resistance to ampicillin. Exogenous DNA can be inserted into the bracketed region without disturbing the ability of the plasmid to replicate or express the ampr gene. Plasmid vectors also contain a replication origin (ORI) sequence where DNA replication is initiated by host cell enzymes. Inclusion of a synthetic polylinker containing the recognition sequences for several different restriction enzymes increases the versatility of a plasmid vector. The vector is designed so that each site in the polylinker is unique on the plasmid.
DNA cloning in a plasmid vector permits amplification of a DNA fragment. A fragment of DNA to be cloned is first inserted into a plasmid vector containing an ampicillin-resistance gene (ampr). Only the few cells transformed by incorporation of a plasmid molecule will survive on ampicillincontaining medium. In transformed cells, the plasmid DNA replicates and segregates into daughter cells, resulting in formation of an ampicillin resistant colony.
Figure 8-46 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Produkce specifických Proteinů Rekombinantní proteiny
Fingerprinting RFLP délka restrikčních fragmentů VNTR délka repetic (variabilní počet tandemových repetic - VNTR) STR délka krátkých tandemových repetic
Figure 8-47a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Sekvenování DNA
Tkáňové kultury kmenové buňky o Složení media (hormony, růstové faktory) vliv na diferenciaci
Tkáňové kultury in vitro o Vitamíny, aminokyseliny, glukosa, minerály o Sérum hormony, růstové faktory o Vhodný podklad o Kontaktní inhibice konfluentní vrstva
Tkáňové kultury růstová křivka o Lag fáze o Log fáze o Plató (stacionární fáze) vyčerpání média, kontaktní inhibice
pasážování o Prodloužení proliferace (vyšší počet buněk) o Některé linie omezený počet pasáží X permanentní linie
A mouse fibroblasts B chick muscle cells C rat nerve cells D tobaco cells (in liquid culture) Figure 8-4 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Table 8-1 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)
Příprava protilátek monoklonální polyklonální
polyklonální protilátky
Monoklonální protilátky
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay