UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra analytické chemie Stanovení kyseliny D,L-glycerové pomocí kapilární elektroforézy s hmotnostní spektrometrií Autor práce: Studijní obor: Bc. Lucie Klásková Analytická chemie Vedoucí diplomové práce: RNDr. Vítězslav Maier, Ph.D. Olomouc 2011

Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Vítězslava Maiera, Ph. D. a s použitím uvedené literatury. Souhlasím s tím, že práce je prezenčně zpřístupněna v knihovně Katedry analytické chemie, Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci. V Olomouci dne 22. 4. 2011..

Děkuji RNDr. Vítězslavu Maierovi, Ph. D. za odborné vedení mé diplomové práce, za obětavou spolupráci, cenné připomínky, poskytnuté rady a za čas, který mi věnoval při konzultacích.

Shrnutí Diplomová práce se zabývá vývojem separace enantiomerů D,L-glycerové kyseliny s využitím vankomycin chloridu jako chirálního selektoru kapilární elektroforézou s hmotnostní spektrometrií V teoretické části diplomové práce byly popsány základy chirálních separací. Byl uveden přehled chirálních selektorů používaných v kapilární elektroforéze a podstatná část byla věnována makrocyklickým antibiotikám, hlavně skupině glykopeptidů. Dále bylo popsáno spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní detekcí, výhody a nevýhody tohoto spojení. Byla popsány obecné vlastnosti glycerové kyseliny, její biologické působení v organismu, a uveden přehled dosud publikovaných metod zabývajících se stanovením glycerové kyseliny. V experimentální části byla provedena optimalizace systému CE-ESI-MS pro chirální separaci standardů DL-glycerové kyseliny. Pozornost byla věnována především složení a ph základního elektrolytu a koncentraci vankomycinu jako chirálního selektoru. Pomocí statistického softwaru byly vyhodnoceny základní parametry pro stanovení obsahu enantiomerů glycerové kyseliny. Byly provedeny stanovení D- a L- glycerové kyseliny ve vzorcích moči po jejich předcházející úpravě a zakoncentrování.

Summary This diploma thesis deals with development of separations enantiomers glyceric acid with usage of vancomycin chlorid as a chiral selector for capillary electrophoresis with mass spectrometry. In the theoretical part of diploma paper the principle of chiral separations was described. There was intoduced a list of chiral selectors used in capillary electrophoresis. A major part was devoted to macrocyclic antibiotik and in the main glycopeptides. There was described a connection between capillary electrophoresis and mass spektrometry, advantages and disadvantages of this connection too. There was described a general characteristics of glyceric acid, its biological incidence in a organism and preceded the list of till this time Publisher method of determination of glyceric acid was made too. In the experimental part was optimized a system of CE-ESI-MS for chiral separation of standard of DL-glyceric acid. There was given care to composition and ph of buffer, and a concentration of vankomycin, which was used to as a chiral selektor. There was evaluated a basic parametrs for determination of content enantiomers of glyceric acid. The enantiomers was determined in urine next to preparation and prekoncentration.

Obsah 1 ÚVOD... 7 2 TEORETICKÁ ČÁST... 8 2.1 CHIRÁLNÍ SEPARACE... 8 2.1.1 CHIRÁLNÍ SELEKTORY POUŽÍVANÉ V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE... 9 2.1.2 MAKROCYKLICKÁ ANTIBIOTIKA JAKO CHIRÁLNÍ SELEKTORY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE... 10 2.1.2.1 Ansamyciny... 10 2.1.2.2 Polypeptidy a aminoglykosidy... 13 2.1.2.3 Glykopeptidy... 13 2.2 SPOJENÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY S HMOTNOSTNÍ DETEKCÍ... 25 2.2.1 ROZHRANNÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE... 26 2.2.1.1 Rozhraní s přídavnou kapalinou ( Sheath-flow )... 26 2.2.1.2 Rozhraní bez přídavné kapaliny ( Sheathless )... 27 2.2.2 ZDROJ IONIZACE... CHYBA! ZÁLOŽKA NENÍ DEFINOVÁNA. 2.2.3 ANALYZÁTOR... 29 2.2.4 POUŽITÍ CE-ESI-MS PŘI CHIRÁLNÍCH SEPARACÍCH... 30 2.3 GLYCEROVÁ KYSELINA... 32 3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 36 3.1 PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ... 36 3.2 CHEMIKÁLIE A POMŮCKY... 36 3.3 POSTUP POKRÝVÁNÍ KAPILÁR... 36 3.4 EXPERIMENTÁLNÍ PODMÍNKY... 37 4 VÝSLEDKY A DISKUSE... 39 4.1.1 VÝBĚR ZÁKLADNÍHO ELEKTROLYTU... 39 4.1.2 VÝBĚR KONCENTRACE VANKOMYCINU... 40 4.1.3 KALIBRAČNÍ DATA... 41 4.1.4 ANALÝZA REÁLNÝCH VZORKŮ... 43 5 ZÁVĚR... 46 6 SEZNAM ZKRATEK A SYMBOLŮ... 47 7 POUŽITÁ LITERATURA... 49 6

1 Úvod Kapilární elektroforéza je moderní analytickou separační technikou, která nachází uplatnění v mnoha vědách jako medicína, farmacie, proteomika, ale i vědách environmentálních. Vyniká množstvím technik provedení, vysokou účinností, rychlostí analýzy, vysokou opakovatelností a citlivostí, nízkou spotřebou vzorku a činidel k analýze. Kapilární elektromigrační techniky dovolují stanovovat jak biomakromolekuly jako proteiny, peptidy, fragmenty DNA aj, tak i jednoduché organické a anorganické ionty, aminokyseliny, optické izomery. Chirální separace látek kapilární elektroforézou je zajímavou metodou pro obory jako farmacie, životní prostředí, zemědělství aj. V mnoha případech jeden z enantiomerů poskytuje žádoucí aktivitu, ale druhý izomer může být neaktivní nebo může vykazovat nežádoucí účinky a případně způsobovat nepříznivé poruchy a defekty. Pro kapilární elektroforézu existuje velké množství výběru chirálních selektorů, ty jsou ale velmi často limitovány svou rozpustností a detekčním charakterem. Jednou ze skupin jsou makrocyklická antibiotika, která jsou relativně novou třídou chirálních selektorů využívaných v separačních technikách. Mají množství sterogenních center a funkčních skupin, které jim umožňují rozmanité interakce s chirálními molekulami jako jsou tvorba vodíkových můstků, hydrofobní interakce, π-π interakce, dipól-dipól interakce aj. Nejvíce používanými a také nejúspěšnějšími makrocyklickým antibiotiky jsou glykopeptidy, hlavně vankomycin. Chirální 2-hydroxykyseliny jsou známy jako důležité biochemické indikátory vrozených poruch metabolismu. Pro rozpoznání těchto vrozených metabolických onemocnění je právě důležité určení úplné konfigurace produktů metabolismu. Optické izomery těchto kyselin často vznikají rozdílnou metabolickou cestou a právě metabolické vyšetření může odhalit případný nedostatek enzymů a vrozené metabolické vady. 7

2 Teoretická část 2.1 Chirální separace Chiralita se projevuje existencí dvou konstitučně identických molekul, které mají stejný sumární vzorec, ale liší se prostorovým uspořádáním atomů či skupin, nejčastěji na tzv. chirálním atomu uhlíku. Tyto dvě molekuly jsou navzájem zrcadlové obrazy a označují se jako enantiomery [1]. V mnoha oblastech života se setkáváme s množstvím chirálních molekul, ať již v přírodě s L-aminokyselinami a D-cukry, u léčiv, kdy enantiomery mohou mít různé účinky na lidské zdraví, u potravin, kdy mohou ovlivňovat vůni a chuť nebo u zemědělských chemikálií [1]. Chirální molekuly mají stejné fyzikální vlastnosti a v achirálním prostředí vykazují i stejné chemické vlastnosti, proto je dělení obtížné. Pro separaci je možno využít různé analytické metody, jako plynovou chromatografii, kapalinovou chromatografii, elektromigrační metody [1-4]. Tyto techniky můžeme dělit na přímé a nepřímé. U přímých metod se využívá tvorby přechodných diastereomerních komplexů mezi enantiomery a chirálním selektorem vázaným na stacionární fázi nebo přidaným do mobilní fáze. Vzniklé diastereomerní komplexy se již liší v chromatografických a elektroforetických vlastnostech. U nepřímých metod se chirální molekula derivatizuje chirálním činidlem a poté je již separována v achirálním prostředí [1-3]. V kapilárních elektromigračních technikách se využívá především přímých metod. Výhodou takovýchto chirálních separací kapilární elektroforézou oproti jiným chromatografickým metodám spočívá v téměř neomezeném výběhu chirálních selektorů, v jejich nižší spotřebě a možnosti změny koncentrace a samotného chirálního selektoru. 8

2.1.1 Chirální selektory používané v kapilární elektroforéze Jak již bylo uvedeno v kapitole 2.1, má kapilární elektroforéza oproti dalším jiným chromatografickým metodám výhodu v téměř neomezeném výběru chirálních selektorů. Mezi nejpoužívanější chirální selektory patří cyklodextriny a jejich deriváty [1-3,5-7]. Jsou to neutrální přírodní cyklické oligosacharidy skládající se ze šesti (α- CD), sedmi (β-cd) nebo osmi (γ-cd) glukopyranozových jednotek. V prostoru zaujímají tvar komolého kužele, vnější povrch je hydrofilní a kavita je relativně hydrofobní s vysokou elektronovou hustotou, která umožňuje vytvářet inkluzní komplexy s nepolárními analyty. Enantioselektivita CD je dána asymetrickými uhlíky glukózy a hydroxylovými skupinami, které jsou schopné derivatizace. Obrázek 1: Struktury α-cd, β-cd, γ-cd [3] Mezi další, mnohem méně používaní chirální selektory, se řadí lineární neutrální a nabité sacharidy [4,5,7] a crown-ethery, které jsou používané především pro separace aminokyselin a léčiv obsahující primární aminoskupiny [4-7]. Velké skupinou, používanou nejen v kapilární elektroforéze, ale také ve vysoce účinné kapalinové chromatografii a v tenkovrstevné chromatografii jsou makrocyklická antibiotika (více viz kapitola 2.1.2) [8]. Chirální selektory musí splňovat několik základních podmínek. Měly by být stereoselektivní a tvořit diastereomerní komplexy s každým z dvojice enantiomerů, 9

kinetika tvorby těchto komplexů by měla být rychlá. Chirální selektory by měly být v pracovním elektrolytu dobře rozpustné a chemicky stabilní a neměly by interferovat při detekci [3]. 2.1.2 Makrocyklická antibiotika jako chirální selektory v kapilární elektroforéze Makrocyklická antibiotika se jako chirální selektory požívají v technikách jako CE, HPLC nebo TLC [8,10,11]. Díky těmto chirálním selektorům se podařilo rozdělit stovky chirálních směsí obsahujících např. nesteroidní protizánětlivá léčiva, hydroxykyseliny, herbicidy, aminokyseliny. Tuto obsáhlou skupinu sloučenin můžeme rozdělit do několika skupin, které se liší strukturou, a to na: glykopeptidy, ansamyciny, polypeptidy a aminoglykosidy [5,10]. Ačkoliv aminoglykosidy (kanamycin, fradiomycin) nejsou považovány za vyloženě makrocyklická antibiotika, jsou to antibiotika používaná při chirálních separacích v kapilární elektroforéze. V CE se využívají především glykopeptidy, které mají ale i značné využití v HPLC, kde se používají jako vázané chirální stacionární fáze [2-3,8,10]. Ve struktuře makrocyklických antibiotik se nachází několik sterogenních center a funkčních skupin, které se účastní rozmanitých interakcí s chirálními molekulami analytu. Interakce mezi molekulou antibiotika a analytu mohou být různé povahy. Primárně jde o interakce nábojů selektoru a analytu nebo interakce iontů, dále hydrofobní interakce, přes dipól dipól a π π interakce, po vodíkové vazby a sterické odpuzování [5,8-10,12]. Molekuly antibiotik také obsahují hydrofilní skupiny stejně jako množství ionizovatelných skupin, díky nimž se stávají velmi dobře rozpustné ve vodných roztocích [9,10,12]. 2.1.2.1 Ansamyciny Ansamyciny [6,9], rifamycin B a rifamycin SV, mají pro kapilární elektroforézu především historický význam. Byly to první chirální selektory použité v kapilární elektroforéze dříve než v HPLC [10]. Ansamyciny mají charakteristickou ansa strukturu, skládající se z kruhové konstrukce nebo chromoforu, které jsou překlenuty alifatickým mostem [13]. 10

Všechny rifamyciny mají tento alifatický řetězec vysoce substituovaný, a jeden od druhého se odlišují typem a umístěním substituentů na jejich naftohydrochinonovém kruhu. Rifamycin B se od rifamycinu SV liší skupinou vázanou na naftohydrochinonovém kruhu v pozici 9. U rifamycinu SV to je hydroxyl (-OH), zatím co u rifamycinu B oxyoctová kyselina (-OCH 2 COOH) [9,13]. Alifatický řetězec rifamycinu B a rifamycinu SV je na uhlíku C 21 obsazen ethylesterem a na uhlíku C 23 methyletherem [9,10,12]. Struktura těchto antibiotik je zobrazena na obrázku 2. Rifamycin B je enantioselektivní pro kationové sloučeniny a rifamycin SV enantioselektivní pro neutrální a aniontové sloučeniny [10]. Rifamycin B a rifamycin SV silně absorbují v UV a viditelné oblasti spektra díky naftohydrochinonovém kruhu. Každá ze sloučenin má absorpční maxima okolo 220, 304 a 425 nm a absorpční minima okolo 275 a 350 nm [10,12]. Rifamycin B je rozpustný ve vodě, jeho rozpustnost se zvětšuje v acetonu a v alkoholech s krátkým řetězcem [8]. Rifamycin B a rifamycin SV tvoří žluté až oranžové roztoky v závislosti na ph a organických spolurozpouštědlech [9,13]. Rifamycin B je dvojsytná kyselina s pk a 2,8 a 6,7 [9,10]. Fyzikální a chemické vlastnosti ansamycinů jsou shrnuty v tabulce 1. V tabulkách 2 a 3 je uveden výběr publikovaných pracích zabývajících se chirální separací s použitím rifamycinu B a rifamycinu SV jako chirálních selektorů v CE. Tabulka 1: Fyzikální a chemické vlastnosti ansamycinů [2,10,14] vlastnost rifamycin B rifamycin SV Typ analytů kationty anionty molekulová hmotnost 755 698 počet stereogenních center 9 9 počet hydroxylových skupin a 4 (2) 5 (3) počet aromatických kruhů 2 2 počet amido skupin 1 1 počet methoxy skupin 2 2 počet karboxylových skupin 1 0 počet methoxy-ester skupin 1 1 produkováno Norcardia mediterranei Norcardia mediterranei použití v HPLC, CE CE a číslo v závorce uvádí počet fenolických skupin 11

(A) (B) Obrázek 2: Chemická struktura, číslování a jednoduché schéma pro rifamycin B (A) a rifamycin SV (B) [10] Tabulka 2: Přehled prací používajících rifamycin B jako chirální selektor v CE analyt Terbutalin, Isoproterenol, Bametan, Metaproterenol, Synephrin, Metanephrin, Salbutamol, Epinefrin, Norfenyleprin, Oktopamin, Norepinefrin, Normetanefrin, Metoprolol, Alprenolol, Atenolol, Oxprenolol, Efedrin, Pseudoefedrin Indolol, Propranolol, Amphetamin Alprenolol, Epinefrin, Metaprolol, Norepinefrin, Normetanefrin, Oktopamin, Oxprenolol, Pindolol koncentrace rifamycinu B 25 mm 25 mm 25 mm složení pufru, detekce 0,1 M fosfát ph 7, propan-2-ol (60:40 v:v), přímá UV 254 nm 0,1 M fosfát ph 7, propan-2-ol (70:30 v:v), přímá UV 254 nm 0,1 mm fosfát ph 7, propan-2-ol (70:30 v:v), nepřímá UV 350 nm citace [15] [16] [16] 12

Tabulka 3: Přehled prací používajících rifamycin SV jako chirální selektor v CE analyt Glutethimid, Hexobarbital, Dansylasparagová kyselina 2.1.2.2 Polypeptidy a aminoglykosidy koncentrace rifamycinu SV 25 mm složení pufru, detekce 0,1 M fosfát ph 7, 40 % propan-2-ol, nepřímá UV 350 nm citace [16] Další skupinou makrocyklických antibiotik používanou v chirálních separacích, především v HPLC, jsou polypeptidy [5,10]. Do této skupiny řadíme sloučeninu thiostrepton. Mezi aminoglykosidy řadíme antibiotika: Kanamycin, streptomycin a fradiomycin [5,8,10]. Jejich struktura se skládá několika glykosidických kruhů, tři u kanamycinu a streptomycinu a čtyři u fradiomycinu. pk a hodnoty byly určeny 7,8 pro fradiomycin, 7,2 pro kanamycin a 8,7 pro streptomycin. Všechny jsou neomezeně rozpustné ve vodě, ale prakticky nerozpustné v alkoholech a nepolárních rozpouštědlech [10,17,18]. Aminoglykosidy (3% kanamycin nebo 3% fradiomycin) byly použity při separaci 1,1 -Binaftyl-2,2 -dikarboxykyselin v 20 mm fosfát-borátu ph 7,5 9 s přídavkem 30% MeOH [19]. 2.1.2.3 Glykopeptidy Makrocyklická antibiotika skupiny glykopeptidů jsou k dnešnímu datu nejúčinnější chirální selektory [10,20,21]. Řadíme sem avoparcin, ristocetin A, teicoplanin, vankomycin a dva derivatizované analogy vankomycinu. Všechny tyto sloučeniny jsou složeny z části aglykonu, která je tvořena spojenými makrocyklickými kruhy, které mají charakteristický tvar basketbalového koše a částí sacharidů připojených na cyklus aglykonu [9,10]. Koš aglykonu se skládá z 3 nebo 4 makrocyklických kruhů složených z navzájem spojených aminokyselin a substituovaných fenolů [9]. Sacharidová část antibiotika se skládá z jednoho nebo více neutrálních sacharidů a jednoho nebo více monosacharidů [13]. Tato antibiotika se pak liší typem a množstvím vázaných sacharidových jednotek a substituentů. Sacharidové skupiny vázané na koš aglykonu jsou volně otáčivé a mohou zaujímat rozmanité orientace [10]. Rozdíly ve struktuře antibiotik jsou shrnuty v tabulce 4 a jednotlivá antibiotika zobrazena na obrázku 3. 13

Tato antibiotika silně absorbují v UV oblasti. V kyselých roztocích absorbují silně pod 250 nm a kolem 260 nm vykazují malé absorpční minimum. Ačkoliv takto silně absorbují, dá se díky nízkých používaným koncentracím (1-5 mm) v základním elektrolytu, použít přímá detekce právě okolo absorpčního minima 260 nm [10,12]. Makrocyklická glykopeptidická antibiotika jsou rozpustná ve vodě, pufrech a kyselých vodných roztocích, méně v neutrálních roztocích. Částečně rozpustná v polárních aprotických rozpouštědlech (DMSO a DMF) a nerozpustná ve většině nepolárních organických rozpouštědlech [9,12]. Tabulka 4: Fyzikálně-chemické vlastnosti glykopeptidických antibiotik, avoparcinu, ristocetinu A, teicoplaninu a vankomycinu [9,10,14] vlastnost avoparcin a ristocetin A b teicoplanin c vankomycin relativní molekulová hmotnost α = 1907,6 β = 1942 2066 1877 1449 počet stereogenních center 32 38 23 18 počet makrocyklů 3 4 4 3 počet sacharidových zbytků 5 6 3 2 počet aromatických kruhů d 7 (α=1,β=2) 7 7 (2) 5 (2) počet hydroxyskupin 16 (4) 21 (4) 15 (4) 9 (3) počet amidů ve vazbách 6 6 7 7 počet amino skupin 3 2 1 2 počet sekundárních aminů 1 0 0 1 pi 7,5 7,5 4,2; 6,5 7,2 produkováno bakteríi Streptomyces Norcardia Actinoplanes Streptomyces candidas lurida teicomyceticus orientalis použití v CE HPLC,CE HPLC, CE HPLC, CE, TLC a Avoparcin existuje jako směs dvou úzce spojených komponent přibližného složení: 67 % β-avoparcin a 33% α-avoparcin. b Ristocetin A existuje ve dvou formách, které se od sebe liší počtem uhlíkových atomů vázaných na jeden z cukrů. c Teicoplanin existuje jako směs pěti podobných sloučenin, které se mezi sebou liší v počtech atomů uhlíků a substituovaných skupin na masných kyselinách postranního řetězce vázaných na amin cukru. d Číslo v závorce odpovídá počtu chlorovaných skupin vázaných na aglykon. e Číslo v závorce značí počet fenolových skupin. 14

Obrázek 3: Chemické struktury makrocyklických glykopeptidických antibiotik: (A) Vankomycin, (B) Teicoplanin, (C) Avoparcin, (D) Ristocetin A [10] Glykopeptidy jsou amfoterní, ve struktuře obsahují kyselé i zásadité skupiny a množství ionizovatelných skupin, které kontrolují jejich náboj a ovlivňují interakce s chirálními analyty. Náboj antibiotika je pak řízen ph základného pufru. Obrázek 4 zobrazuje, jak se elektroforetická mobilita mění s ph v 0,1 M fosfátovém pufru. 15

Obrázek 4: Efekt ph na elektroforetickou mobilitu vankomycinu, ristocetin A a teicoplaninu v 0,1 M fosfátu [8] Křivky závislosti elektroforetické mobility v závislosti na ph pro ristocetin A a vankomycinu mají podobný průběh. Z těchto křivek lze pro dané podmínky vyčíst hodnoty izoelektrických bodů (pi), pro vankomycinu 7,2 a pro ristocetin A 7,5. Z toho vyplývá, že ionizovatelné skupiny jsou při ph nižších než 7,5 pozitivně nabité. Křivka pro teicoplanin je mezi hodnotami ph 3 a 6,5 docela rovná a pro hodnoty vyšší než 4,5 není možné získat teicoplanin kladně nabitý. Odlišné elektroforetické chování teicoplaninu od vankomycinu a ristocetinu A je závislé především na dvou strukturních vlastnostech teicoplaninu. Ve struktuře chybí volná amino skupina na cukru (obě aminoskupiny jsou N-acetylované) a za druhé je to schopnost teicoplaninu tvořit micely [8-10]. Struktura všech glykopeptidů je tvořena volnými amino skupinami, které mají tendenci interagovat se stěnami kapiláry. Nejsilnější interakce a adsorpce chirálního selektoru na stěnu kapiláry se uskutečňuje v případě avoparcinu se třemi volnými amino skupinami, následován je vankomycinem s dvěmi skupinami. Z toho důvodu jsou separace s těmito glykopeptidy delší než při použití teicoplaninu a ristocetin A, jejichž interakce tak silná není [9]. Jelikož struktura glykopeptidy obsahuje ionizovatelné skupiny, má na použití těchto antibiotik jako chirálních selektorů značný vliv i ph základního elektrolytu. Obecně, snižující se ph základního elektrolytu zvyšuje enantioseparaci testovaných látek [9]. ph má vliv i na stabilitu glykopeptidů, které při ph nižším než 4 a ph vyšším než 9 nejsou v roztoku stabilní. U většiny enantioseparací, používajících vankomycin, 16

avoparcin a ristocetin A jako chirálních selektorů, jsou hodnoty ph použitých pufrů mírně pod hodnotou jejich pi. Při použití teicoplaninu jsou to hodnoty nad jeho pi. Maxima enantioselektivity je nejčastěji dosaženo, když elektromigrace chirálního selektoru a chirálního analytu jsou opačné [9,22-24]. Efekt přídavku organických přísad na separaci je pro vankomycin, avoparcin a ristocetin A většinou malý. Mnohdy je enantioseparace horší než před přídavkem organické přísady. U většiny separací s teicoplaninem je však požadováno alespoň malé množství acetonitrilu k dosažení lepších separací, někdy k dosažení separace vůbec. Tento malý přídavek acetonitrilu způsobí inhibici samoagregace teicoplaninu do micel, která někdy může bránit chirální separaci [9]. Všechny makrocyklická antibiotika skupiny glykopeptidů podléhají s časem ve vodném roztoku degradaci. Rozklad glykopeptidických antibiotik je rychlejší při vysokých a nízkých ph, tj. při ph nižší než 4 a ph vyšší než 8, a se zvyšující se teplotou. Degradace má většinou za následek zvýšení migračních časů, šum základní linie a snížení rozlišení enantiomerů [9,13]. Rozklad se často projevuje žloutnutím a tvorbou sraženiny (v závislosti na složení pufru) [9]. Stabilita glykopeptidy se odvíjí od počtu sacharidových skupin [12]. Vankomycin s 2 sacharidy ve struktuře je nejméně stabilní. Roztoky v rozmezí ph 5 a 7, i když jsou chlazeny na 4 C, se během 6 až 7 dní degradací znehodnotí [12]. Teicoplanin je za stejných podmínek stabilnější, po dobu 2-3 týdny vykazují roztoky stejné rozlišení dvojice enantiomerů. Mezi hydrolyticky nejstabilnější makrocyklická antibiotika se řadí ristocetin A a avoparcin, jejichž roztoky mohou být používány až 4 týdny [9,22]. 17

2.1.2.3.1 Vankomycin Struktura vankomycinu je tvořena třemi makrocyklickými kruhy tvořící aglykon a připojeného disacharidu skládajícího se z D-glukozy a vankosaminu [12]. Vankomycin obsahuje několik funkčních skupin, jako hydroxylové, amino, chloro, amidokarboxylové a aromatické a celkově 18 stereogenních center [12,18]. Vankomycin je rozpustný ve vodě a některých polárních rozpouštědlech jako dimetylsulfoxid a dimetylformamid a méně rozpustný nebo nerozpustný ve vyšších alkoholech [8]. Struktura vankomycinu obsahuje množství ionizovatelných skupin. pk a hodnoty pro vankomycin byly určeny na 2,9, 7,2, 8,6, 9,6, 10,5 a 11,7 [12,18]. Isoelektrický bod je okolo hodnoty 7,5. Vankomycin pod 250 nm silně absorbuje, čímž je limitováno jeho použití jako chirálního selektoru v CE [25]. Pomocí vankomycinu byly rozseparovány látky jako např. nesteroidní protizánětlivá léčiva, antineoplastická léčiva, pesticidy, N-derivatizované aminokyseliny, di- a tri- peptidy a jiné. Tabulka 5 uvádí přehled prací používajících vankomycin jako chirální selektor v CE. Tabulka 5: Přehled prací používajících vankomycin jako chirální selektor v CE analyt koncentrace složení pufru poznámka citace Trans, trans-abscisová kyselina 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 UV 254 nm [26] N-acetyl-tryptofan 2 mm 0,1 M fosfát ph 7 UV 254 nm [26] N-t-Boc-tryptofan 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 UV 254 nm [26] Indol-3-mléčná kyselina 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 UV 254 nm [26] N-CBZ-tryptofan 2 mm 0,1 M fosfát ph 7 UV 254 nm [26] Chinolinkarboxylové kys. 5 mm 0,1 M acetát ph 4 UV 300 nm [27] S-karboxymethylcystein 5 mm nepřímá UV 10 mm sorbát His 254 nm, pokrytá ph 5 kapilára [28] N-acetamidokarboxycystein DDB a analogy DDB N-acetyl-aminokyseliny Loxoglumid 5 mm 6 mm 2,5 nebo 5 mm 3 mm 10 mm sorbát His ph 5 40 mm fosfát Tris ph 6, 0.001% HDB acetát amonný ph 5 50 mm fosfát ph 6 nepřímá UV 254 nm, pokrytá kapilára pokrytá kapilára HDB UV 195 nm, pokrytá kapilára UV 205 nm, pokrytá kapilára [28] [29] [30] [31] 18

Tabulka 5: Přehled prací používajících vankomycin jako chirální selektor v CE (pokračování) analyt koncentrace složení pufru poznámka citace Herbicidy (mecoprop, fenoprop, dichlorprop, flamprop, haloxyfop, fluazifop, diclofop, fenoxaprop) Nesteroidní protizánětlivá léčiva (ketoprofen, suprofen, carprofen, flurbiprofen, naproxen, indoprofen) Aminokyseliny Aminokyseliny Aminokyseliny Nesteroidní protizánětlivá léčiva (ibuprofen, indoprofen, ketoprofen, flurbiprofen, suprofen, caprofen, naproxen, cicloprofen) 6 mm 2 mm 2 mm 0,1 5 mm 0,1 1,5 mm 2,5 nebo 5 mm 75 mm Britton- Robinson ph 5 50 mm fosfát ph 7, 21-103 mm SDS 50 mm fosfát ph 7, 21-103 mm SDS 20 mm MOPS Tris ph 7 20 mm MOPS Tris ph 7 75 mm Britton- Robinson ph 5 205 nm, pokrytá kapilára, částečné plnění kapiláry [32] UV 254 nm [33] Dansyl- pokrytá kapilára, AQC [33] [34] AQC [35] UV 205 nm, pokrytá kapilára (polyakrylamid) Mléčná kyselina 10 mm 5 mm oxalát L- vodivostní His ph 4,5 detekce [37] Nesteroidní protizánětlivá 50 mm fosfát Tris léčiva (fenoprofen, 2 mm dynamické ph 6 ketoprofen) pokrytí PDMA [38] Aminokyseliny 2 mm UC 254 nm, 50 mm fosfát Tris FMOC, ph 6 dynamické [38] pokrytí PDMA Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 N- acetylované [24] Aminokyseliny 5 mm 0,1 M fosfát ph 4,9 nebo 7 AQC [24] Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 AQC [24] Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 N- nebo 7 benzoyl [24] Aminokyseliny 1 mm 0,1 M fosfát ph 6 karboxybenzoyl [24] Aminokyseliny 5 mm 0,1 M fosfát ph 4,9 nebo 6 dansyl [24] Aminokyseliny 5 mm 0,1 M fosfát ph 7 DNB [24] Aminokyseliny 5 mm 0,1 M fosfát ph 7 DNP [24] [36] 19

Tabulka 5: Přehled prací používajících vankomycin jako chirální selektor v CE (pokračování) analyt koncentrace složení pufru poznámka citace Aminokyseliny 5 mm 0,1 M fosfát ph 7 DNP yr [24] Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 N- formyl [24] Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 PHTH [24] Karboxylové kyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 UV 254 nm [24] Nesteroidní protizánětlivá léčiva (caprofen, fenoprofen, flurbiprofen, ibuprofen, indoprofen, ketoprofen, naproxen, suprofen Peptidy Peptidy Aminokyseliny Aminokyseliny Aminokyseliny 5-(4-hydroxyfenyl)-5- fenylhydantoin Bromacil Coumachlor warfarin 5 mm 0,1 M fosfát ph 7 UV 254 nm [24] 0,5 mm 0,5 mm 2 mm 2 mm 1 nebo 2 mm 2 mm 2 mm 2 mm 2 mm 50 mm fosfát ph 7,5, 0-10 % propan-2-ol 50 mm fosfát ph 7,5, 0-10 % propan-2-ol 50 mm fosfát ph 7,5; 0 nebo 10 % propan-2-ol 50 mm fosfát ph 7,5; 0 nebo 10 % propan-2-ol 50 mm fosfát ph 7,5; 0 nebo 10 % propan-2-ol 50 mm fosfát ph 7, 50 mm SDS 95 % 50 mm fosfát ph 7, 5% MeOH a 25 mm SDS 90 % 50 mm fosfát ph 7, 10 % ACN a 50 mm SDS 50 mm fosfát ph 7, 25 mm SDS Aminokyseliny 1 nebo 2 mm 0, 1 M fosfát ph 6 Nesteroidní protizánětlivá léčiva 1 nebo 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 AEOC FMOC AEOC dansyl FMOC [39] [39] [39] [39] [39] UV 254 nm [40] UV 254 nm [40] UV 254 nm [40] UV 254 nm [40] pokrytá kapilára, dansyl pokrytá kapilára [41] [41] 20

Tabulka 5: Přehled prací používajících vankomycin jako chirální selektor v CE (pokračování) Peptidy Peptidy analyt koncentrace složení pufru poznámka citace 25 mm HEPES 1 mm ph 7,6; 0 nebo 25 [42] FMOC nebo 50 mm SDS Nesteroidní protizánětlivá léčiva (fenoprofen, methotrexát) Nesteroidní protizánětlivá léčiva (Ketoprofen) 1 mm 50 mm fosfát ph 7,6 FMOC [42] 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 UV 254 nm [25] 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 SDS [25] Fenoxykyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 UV 254 nm [25] Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 N- acetylované [25] Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 FMOC [25] Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 AQC [25] Aminokyseliny N- 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 benzoyl [25] Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 dansyl [25] Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 DNP [25] Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 PHTH [25] Hydroxykyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 UV 254 nm [25] různé organické kyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 UV 254 nm [25] 2.1.2.3.2 Teicoplanin Teicoplanin je dalším antibiotikem ze skupiny glykopeptidů používaný jako chirální selektor v CE [2,25]. Vzniká fermentací Actinoplantes teichomiceticus jako směs 5-ti analogických sloučenin obsahující rozdílné řetězce masných kyselin (C 10 a C 11 ) vázané na aminu 2-amino-2-deoxy-β-D-glukopyranozylové skupině [8]. Díky tomuto hydrofobnímu řetězci je teicoplanin povrchově aktivní a tvoří micely, na rozdíl od dalších glykopeptidických antibiotik. Kritická micelární koncentrace je okolo 0,18 M v nepufrovaných vodných roztocích [18] a tato tvorba micel je podporována nízkým ph [9,10]. Stejně jako vankomycin obsahuje množství funkčních skupin, které mohou přispívat k rozlišení chirálních sloučenin. Teicoplanin obsahuje ve své molekule sacharidy D-glukosamin a D-mannozu a rezidua masných kyselin, která jsou vázaná na aminoskupinu glukosaminu [12]. Teicoplanin obsahuje jednu volnou amino skupinu 21

a jednu volnou karboxylovou skupinu, izoelektrický bod je pi je 3,8 [12]. Stejně jako vankomycin, teicoplanin silně absorbuje v oblasti UV spektra pod 250 nm. Na rozdíl od vankomycinu se neabsorbuje na stěnu kapiláry [10]. U teicoplaninu je nejvíce zřetelný vliv přídavku organických rozpouštědel na rozlišení chirálních analytů. Organická rozpouštědla mohou změnit a/nebo bránit samoagregaci teicoplaninu do micel [9]. Teicoplanin se hodí hlavně pro separace negativně nabitých sloučenin. V tabulce 6 je uveden přehled prací používajích teicoplanin jako chirální selektor v CE, mezi nejčastěji rozseparované látky touto sloučeninou patří nesteroidní protizánětlivá léčiva, N-blokované aminokyseliny. Tabulka 6: Přehled prací používajících teicoplanin jako chirální selektor v CE analyt koncentrace složení pufru poznámka citace Trans, trans-abscisová 0,1 M fosfát ph 6, 5 mm kyselina 10 % ACN UV 254 nm [26] N-acetyl-tryptofan 5 mm 0,1 M fosfát ph 6, 30 % ACN UV 254 nm [26] N-t-Boc-tryptofan 5 mm 0,1 M fosfát ph 6, 20 % ACN UV 254 nm [26] N-CBZ-tryptofan 2 mm 0,1 M fosfát ph 6, 20 % ACN UV 254 nm [26] Indolin-2-karboxylová 0,1 M fosfát ph 6, 5 mm kyselina 30 % ACN UV 254 nm [26] N-(3-Indolylacetyl)- 0,1 M fosfát ph 6, 5 mm aspartová kyselina 20 % ACN UV 254 nm [26] Aminokyseliny 2 mm 0, 1 M fosfát ph 6 N- (0-10 % ACN) acetylované [43] Aminokyseliny 2 mm 0, 1 M fosfát ph 6 (0-30 % ACN) AQC [43] Aminokyseliny 2 mm 0, 1 M fosfát ph 6 N- (0-20 % ACN) benzoyl [43] Aminokyseliny 2 mm 0, 1 M fosfát ph 6 (0-10 % ACN) karboxybenzoyl [43] Aminokyseliny 2 mm 0, 1 M fosfát ph 6 (10-30 % ACN) DNB [43] Aminokyseliny 2 mm 0, 1 M fosfát ph 6 (0-30 % ACN) Dansyl [43] Aminokyseliny 5 mm 0, 1 M fosfát ph 6 DNP [43] Aminokyseliny 2 mm 0, 1 M fosfát ph 6 (0-30 % ACN) DNP [43] Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 (0-30 % ACN) FMOC [43] 22

Tabulka 6: Přehled prací používajících teicoplanin jako chirální selektor v CE (pokračování) analyt koncentrace složení pufru poznámka citace Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 (0-30 % ACN) DNP yr [43] Aminokyseliny 5 mm 0, 1 M fosfát ph 6 DNP yr [43] Aminokyseliny 2 mm 0, 1 M fosfát ph 6 PHTH [43] Karboxylové kyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 (0-30 % ACN) UV 254 nm [43] Nesteroidní protizánětlivá léčiva (Indoprofen, Caprofen, Ketoprofen, Suprofen, Fenoprofen) Aminokyseliny 2 mm 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 (0-20 % ACN) 0,1 M fosfát ph 6 (ACN 0-30 %) Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 Peptidy 2.1.2.3.3 Ristocetin A 1,2 mm 25 mm fosfát Tris ph 6,25, 40 % ACN UV 254 nm [43] dansyl [33] N- formyl [44] UV 254 nm [45] Struktura ristocetinu A se skládá z části aglykonu, na němž jsou připojeny 4 makrocyklické kruhy, a na nich kovalentně vázány některé cukry (arabinoza, glukoza, mannoza a rhamnoza) [2, 25, 44]. Stejně jako u předcházejících antibiotik obsahuje molekula ristocetinu A několik funkčních skupin, jako ester, hydroxy, amid, primární amin a aromatické skupiny. Množství stereogenních center této molekuly je 38 [8]. Ristocetin A je amfoterní sloučenina, která je docela rozpustná v kyselých vodných roztocích a polárních rozpouštědlech jako dimethylsulfoxid a dimetylformamid. Ristocetin neabsorbuje záření ve viditelné oblasti spektra, ale intenzivně absorbuje v UV oblasti pod 250 nm [25]. Díky objemnější vázané skupině cukrů se ristocetin A méně váže na stěnu kapiláry než vankomycin, což se projevuje v kratších časech analýz a větší stabilitou v roztoku než u zmíněného vankomycinu [10]. Tabulka 7 uvádí přehled prací používajících ristocetin A jako chirální selektor v CE. 23

Tabulka 7: Přehled prací používajících ristocetin A jako chirální selektor v CE analyt koncentrace složení pufru poznámka citace N-t-Boc-tryptofan 2 mm 0,1 M fosfát ph 6, 20 % MeOH UV 254 nm [26] Indol-3-mléčná kyselina 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 UV 254 nm [26] Cis, trans-abscisová kyselina 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 UV 254 nm [26] Indolin-2-karboxylová kyselina Aminokyseliny Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 UV 254 nm [26] 2 mm 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 nebo 7, 0-30 % propan-2-ol 0,1 M fosfát ph 7, 0-10 % propan-2-ol Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 7, 0-30 % pronan-2-ol Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 nebo 7 Aminokyseliny 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 Aminokyseliny Karboxylové kysleiny Nesteroidní protizánětlivá léčiva (Flurbiprofen, Indoprofen, Carprofen, Ketoprofen, Suprofen, Fenoprofen, Naproxen) 2 mm 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 nebo 7, 0-10 % propan-2-ol 0,1 M fosfát ph 6 nebo 7, 0-10% propan-2-ol AQC FMOC Dansyl DNP PHTH N-benzoyl N-formyl N-acetylované karboxybenzoyl [46] [46] [46] [46] [46] [46] [46] [46] [46] DNP yr [46] 254 nm [46] 2 mm 0,1 M fosfát ph 6 254 nm [46] 24

2.2 Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní detekcí Díky jednoduchosti online zapojení je UV-Vis detekce nejrozšířenější detekcí používanou v kapilární elektroforéze. Kapiláry používané v CE mají ale malý vnitřní průměr, a tím je i snížena citlivost UV-Vis z důvodu krátké optické dráhy, a minimální měřitelná množství se pak pohybují okolo µg/ml. Mnoho farmaceutických a biologických látek je ale ve směsích obsaženo v menších koncentracích, často ani neobsahují vhodné skupiny chromoforů a následná derivatizace může být, pro jejich stanovení UV-Vis detekcí, nutná. K tomu dochází i při použití fluorescenční detekce, zvláště při použití laserem indukované fluorescence (LIF), kdy pouze malé počty látek fluoreskují při vhodné vlnové délce laseru. Další možnou technikou detekce ve spojení s CE jsou elektrochemické detektory. Jejich nevýhodou je ale složité rozhraní mezi CE a detektorem a použití je omezeno pouze pro elektroaktivní látky. U všech těchto metod detekce pak můžeme identitu jednotlivých píků odhadnout pouze na základě migračních časů, což je často nedostačující pro přesné potvrzení totožnosti zvláště u složitějších vzorků [3]. Použití hmotnostní spektrometrie (MS) jako detektoru pro kapilární elektroforézu nám poskytuje možnost rychlých, účinných a citlivých analýz. Získáváme také možnost identifikace analytů, informace o molekulové hmotnosti a fragmentací informace o možné struktuře., což je důležité pro identifikaci a potvrzení analytů ve složitých směsích [46]. Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní detekcí má ale i své překážky, které musíme vzít v úvahu. Typické průtoky v CE kapilárách (pod 100 nl/min) nejsou kompatibilní s konvenčním rozhraním používaným v LC-MS, proto je nutná miniaturizace rozhraní a elektrospreje nebo použití pomocné kapaliny [47]. Další možnou překážkou mohou být aditiva přidávána do základního elektrolytu pro zvýšení selektivity. Tyto látky mohou být v mnoha případech netěkavé a to může vést ke kontaminaci iontového zdroje a analyzátoru [3,48]. 25

2.2.1 Spojení kapilární elektroforéza hmotnostní spektrometrie Na rozdíl od tradičních spektrofotometrických detektorů je propojení kapilární elektroforézy s hmotnostním spektrometrem tvořeno tzv. otevřeným módem. Konec separační kapiláry není ve výstupní elektrolytové nádobce, ale je umístěn před vstup do MS. Toto rozhraní musí být provedeno tak, aniž by došlo k rozmývání zón migrujících analytů a změně účinnosti separace a byl zachován průchod elektrického proudu potřebný k elektroforetické separaci a ionizaci v MS. První typ spojení CE s MS je založen na přívodu pomocné kapaliny ( sheath-flow ), zatímco druhý spočívá v miniaturizaci rozhraní bez potřeby přídavných kapalin ( sheathless ) [3]. 2.2.1.1 Rozhraní s přídavnou kapalinou Díky tokům kapaliny v CE, které jsou v rozsahu nl/min, probíhá proces odpařování docela snadno. Avšak na špičce kapiláry se mohou tvořit kapičky, které mohou vést k nestabilnímu toku do iontového zdroje hmotnostního spektrometru. Použitím přídavných kapalin se tomu dá ale předcházet. Zatímco realizace tohoto systému s přídavnou kapalinou je relativně jednoduchá, optimalizace operačních parametrů (průtok pomocné kapaliny a její složení, poloha špičky kapiláry), k získání stabilního a opakovatelného spreje, je docela komplikovaná. Používají se dva typy rozhranní s přídavnou kapalinou: s přídavným tokem kapaliny [49-53] (sheath-liquid interface) a s vodivým kapalným spojením [51-53] (liquid junction interface). Rozdíl je mezi začlenění pomocné kapaliny do uspořádání spojení. U spojení s přídavným tokem je pomocná kapalina vedena podél separační kapiláry do vstupu MS, u druhého typu spojení je pomocná kapalina přechodem mezi separační a sprejovací kapilárou. U spojení s přídavným tokem je CE kapilára umístěna ve středu spreje [49,50]. Pomocná kapalina, v rozsahu µl/min, je vedena nerezovou kapilárou, která obklopuje separační CE kapiláru (obrázek 5). Na konci je pomocná kapalina mísena s eluátem z CE kapiláry. Díky tomuto obklopení CE kapiláry pomocnou kapalinou se eliminuje vznik nepravidelných kapiček. Vnější, krajní kapilárou, také z nerezové oceli, je do tohoto systému veden zmlžující plyn, který napomáhá utváření spreje. Toto spojení 26

je díky množství výhod používáno nejčastěji. Spojení je snadněji realizovatelné a dává vhodné podmínky pro ionizaci a odpařování. Separační kapilára Zdroj energie pro ESI Pomocná kapalina Zmlžující plyn Obrázek 5: Schematické znázornění spojení s přídavným tokem [54] U rozhranní s vodivým kapalným spojením [51-53] je spojení mezi kapilárami zajištěno pomocí nádržky, v níž je umístěna pomocná kapalina společně s elektrodou, která zajišťuje elektrické spojení kapilár (obrázek 6). Analyty se díky vlivu elektrického pole a sifonovému efektu zmlžujícího plynu pohybují směrem k detektoru. Tato mezera mezi kapilárami ale může mít vliv na rozšíření zón anylytu a na zmenšení separační účinnosti. Zdroj vysokého napětí Separační kapilára Nádržka s pomocnou kapalinou Zmlžující plyn Obrázek 6: Schematické znázornění rozhraní s vodivým kapalným spojením [54] 2.2.1.2 Rozhraní bez přídavné kapaliny Rozhraní bez přídavné kapaliny můžeme rozdělit do dvou typů. U prvního je separační kapilára přímo spojena s jehlou nanospreje, kdy tato jehla může být nahrazena nezávisle na separační kapiláře [55]. U druhého typu spojení je separační kapilára 27

použita přímo jako emitor použitím vodivé vrstvy (viz obrázek 7) [3,56] nebo vložením vodivého drátu do výstupu kapiláry [3]. Tyto rozhranní jsou velmi citlivé. Redukcí průtoku se obvykle zlepší ionizace analytů a generují se menší kapky. Důležitý je také poměr iontů, které se dostanou do hmotnostního analyzátoru. V tomto mají rozhraní bez přídavného toku kapaliny výhodu, protože špička nanospreje je umístěna blíže k vstupnímu otvoru do MS v porovnání s rozhraními s přídavným tokem kapaliny. Toto spojení je ale v důsledku odlupování vodivé vrstvy méně stabilnější. Také elektroforetické a ionizační proudy jsou díky nízkému průtoku eluátu hůře nastavitelné. Separační kapilára Zdroj energie pro ESI Pozlacená špička kapiláry Zmlžující plyn Obrázek 7:Schematické provedení rozhranní bez přídavné kapaliny [54] 2.2.2 Iontový zdroj Aby mohly být analyty separovány a detekovány pomocí hmotnostní spektrometrie, musí se ionizovat a desolvatovat. Oba procesy se uskutečňují díky množství ionizačních metod, jako jsou: ionizace za atmosférického tlaku (API), desorpce a ionizace laserem za asistence matrice (MALDI), ionizace induktivně vázaným plazmatem (ICP) [3]. Převládající ionizační metodou pro online CE-MS je nepochybně ionizace elektrosprejem (ESI). Je vhodná pro analýzy ionizovatelných a polárních sloučenin s hmotností 10 2 až 10 5 Daltonů. Vzorek, který je rozpuštěný v polárním těkavém rozpouštědle, je transportován skrze jehlu, na níž je umístěn vysoký negativní nebo pozitivní potenciál. Vysoký elektrický potenciál mezi špičkou jehly a tryskou (1 až 4 kv) způsobí vznik tzv. Taylorova kužele, jehož konec je obohacen kladnými nebo zápornými ionty (viz obrázek 8). Elektrickým polem jsou nabité ionty z Taylorova kužele uvolňovány [53,57]. Kapičky se díky odpařování zmenšují, odpařování 28

napomáhá také proud teplého dusíku. Ionty se tvoří za atmosférického tlaku, a postupně procházejí kuželovitými otvory až do hmotnostního analyzátoru, kde je vysoké vakuum [58,59]. Zmlžující plyn Tryska Taylorův kužel Tok kapaliny Zdroj vysokého napětí 2.2.3 Analyzátor Obrázek 8: Schematický princip elektrospreje [59] Mezi nejpoužívanější analyzátory používané při spojení CE-MS patří kvadrupólový analyzátor díky jeho relativně nízké ceně, menším rozměrům a snadné obsluze. Separační princip je založen na využití kombinace stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého napětí. Analyzátor je sestaven ze 4 paralelních kovových tyčí kruhového průřezu. Tyče jsou propojeny tak, že protilehlé jsou navzájem spojeny a připojeny ke zdrojům stejnosměrného a vysokofrekvenčního napětí. Na jednu dvojici tyčí je vkládáno kladné stejnosměrné napětí, na druhou dvojici záporné, na všechny je pak zároveň vkládáno vysokofrekvenční střídavé napětí [46,60]. Kvadrupól se chová jako hmotnostní filtr, v daném časovém okamžiku propouští pouze určitou hodnotu m/z a ostatní ionty se zachytí na tyčích kvadrupólu. Tento poměr m/z se nastaví změnou hodnot U (stejnosměrné napětí) a V (amplituda střídavého napětí) [60]. Plynulou změnou hodnot U a V, kdy poměr U/V zůstává vždy konstantní, jsou kvadrupólem propuštěny postupně všechny ionty. Tento skenovací mód není pro použití v CE-MS, díky velmi úzkým píků, vhodný. Častější je použití tzv. 29

selektivního záznamu spektra (SIM mód), kdy se již neměří hmotnostní spektrum, ale závislost intenzity daného iontu na času, což je vhodné pro kvantitativní analýzu látek se známou strukturou [3]. Na obrázku 9 je znázorněn schématicky kvadrupól a naznačeny dráhy iontů. Kvadrupól Detektor Zdroj napětí Zdroj iontů Obrázek 9: Schéma kvadrupólu a naznačenými dráhy iontů [60] 2.2.4 Využití CE-ESI-MS při chirálních separacích Spojení kapilární elektroforézy s hmotnostní detekcí pro chirální separace brání používaní netěkavých aditiv, v tomto případě hlavně chirálních selektorů, které může vést ke ztrátě efektivity ionizace a/nebo ke kontaminaci iontového zdroje. Za účelem vyvarování se těmto nežádoucím vlivům, se v chirální CE-MS používá technika částečného plnění kapiláry (PFT). Tato technika spočívá v naplnění kapiláry základním elektrolytem s chirálním selektorem pouze do určité části kapiláry, většinou z 90% v případě použití MS nebo po detekční okno v případě použití UV/VIS detektoru. Zbývající prostor kapiláry (blíž k detektoru) je pak vyplněn pouze základním elektrolytem. V zóně s chirálním selektorem pak dochází k separaci, enantiomery pak migrují do nechirální zóny a jsou detekovány bez zásahu chirálního selektoru. Pokud separujeme kyselé analyty za použití vankomycinu, potom je vhodné zvolit takové ph pracovního elektrolytu, aby vankomycin byl kladně nabitý a analyty záporně nabité a analýzu pak provádíme při obrácené polaritě [3,8,10,12]. Schématicky je proces částečného plnění kapiláry naznačen na obrázku 10. 30

A) Naplnění kapiláry základním elektrolytem bez chirálního selektoru B) Naplnění části kapiláry základním elektrolytem obsahující chirální selektor C) Nadávkování dvojice enantiomerů aniontů A a B D) Vložení napětí do systému a následná elektroforetická separace E) Detekce analytů bez přítomnosti chirálního selektoru Obrázek 10: Schéma elektroforetické separace dvojice enantiomerů aniontů použitím PFT [8] 31

2.3 Glycerová kyselina Glycerová kyselina (2,3-dihydroxypropionová kyselina) patří mezi aldonové kyseliny, které jsou produkty mírné oxidace aldóz. Vzniká také oxidací glycerolu a glyceraldehydu. Fyzikálně chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 8. Tabulka 8: Fyzikálně chemické vlastnosti glycerové kyseliny [14] vyskytuje se v D- a L- formě, bezbarvá sirupovitá kapalina, vlastnosti v bezvodém stavu bílý prášek rozpustnost dobře rozpustná ve vodě, alkoholu, acetonu estery a soli L- formy jsou levotočivé ([ ] =-14,6 ), soli D- formy optická otáčivost pravotočivé ([ ] =+14,5 ) pk a 3,55 (25 C) M r 106,08 V metabolismu savců se vyskytuje ve dvou enantiomerech, L- a D- (Obrázek 11). Oba tyto enantiomery jsou vylučovány ve stopových množstvích z těla močí, procentuální množství se u zdravého lidského jedince pohybuje v rozmezí 36 93 % L- glycerátu a 7 64 % D-glycerát [61]. Přítomnost jednoho z těchto enantiomerů v abnormální koncentraci může indikovat různé typy onemocnění. V moči zdravého jedince se množství DL-glycerátu pohybuje okolo 4,5 µmol/mmol kreatininu (0,00 9,00) [62] a v krevním séru 10,0 µm (0,0-24,0) [62]. Množství glycerátu je závislé na věku, jak je uvedeno v tabulce 9. U lidí s metabolickým onemocněním je množství vylučovaného glycerátu mnohonásobně vyšší, a to 1450 µmol/mmol kreatininu (1,2 2360,0) při primární hyperoxalurii II a 15000 µmol/mmol kreatininu (10000 20000) při D-glycerát aciduii [62]. Obrázek 11: Struktura L- a D- glycerové kyseliny 32

Tabulka9: Normální hodnoty koncentrací glycerové kyseliny v moči u člověka (µmol/mmol kreatininu) [62] Věková skupina Střední koncentrace Rozmezí normálních koncentrací (µmol/mmol kreatininu) (µmol/mmol kreatininu) 0-30 dní 21,6 0,5 91,1 0-1 roků 8,9 2,4 60,0 1-13 roků 5,3 0,1 37,3 13-18 let 3,5 0,1 8,0 18 a více let 4,5 0,0 9,0 Mezi onemocnění charakterizované zvýšenou tvorbou a vylučováním jednoho z optických izomerů glycerové kyseliny patří D-glycerát academie/acidurie a primární hyperoxalurie typu 2 (PH II) (také L-glycerát academie/acidurie). D-glycerátdehydrogenáza (D-GDH) katalyzuje vzájemnou přeměnu hydroxypyruvátu na D-glycerát, přítomnost D-GDH také řídí aktivitu glyoxylátredukrázy (GR), který redukuje glyoxylát na glykolát. Při genetickém nedostatku D-GDH není hydroxypyruvát metabolizován na D-glycerát, ale díky L- laktátdehydrogenáze (LDH) převeden na L- glycerátu, a glyoxylát je metabolizován LDH na oxalát. Tato metabolická porucha vede k nadměrnému vylučování oxalátu a L- glycerátu v krvi a moči. Při tomto onemocnění PH II se nadměrně tvoří močové kameny (urolitiáza a nefrokalcinóza), což může vést až k selhání ledvin [63,64,65] Zvýšené vylučování D-glycerátu je vysvětlováno nedostatkem D-glycerátkinázy, která metabolizuje D-glycerovou kyselinu na 3-fosfoglycerát. Na obrázku 12 jsou znázorněny metabolické dráhy enantiomerů glycerové kyseliny. 33

Obrázek12: Metabolické dráhy L- a D- glycerátu. Neodstatek D-glycerátdehydrogenázy/glyoxylát reduktázy D-GDH/GR (1) vede ke zvýšené tvorbě oxalátu prostřednictvím L-laktátdehydrogenázy (2). Mimoto D- glycerát nemůže být metabolizován na pyruvát, ale je redukován na L-glycerát L-laktátdehydrogenázou [65]. Tabulka 10 uvádí přehled prací stanovující glycerovou kyselinu a její enantiomery. Tabulka 10: Přehled prací stanovující glycerovou kyselinu analytická technika stanovení podmínky separace vzorek citace potenciometrie (EPME) enantiomery maltodextriny I, II, III sérum, moč [63] LC-MS-MS enantiomery MF: 0,1%triethylamin a 5% acerát ph 4,1 + MeOH (9:1 v/v), SF: moč [64] silikagel s ristocetinem A GC-MS enantiomery O-acetylované(+)-2-butyl estery nebo O-acetylované(-)-methyl estery; DB- moč [61] 5 GC-MS směs SP-1000 kolona moč [66] CE směs 300 mm borát ph 8,5 moč [66] CE směs 0,2 M fosfát ph 6 moč [67] CE-MS-MS směs 20 mm acetát amonný ph 8,5 moč [68] CE směs 234 mm fosfát ph 6,0 + 12 % (v/v) MeOH, pokrytá kapiláry stolice [69] 34

Tabulka 10: Přehled prací stanovující glycerovou kyselinu (pokračování) analytická technika stanovení podmínky separace vzorek citace GC-MS enantiomery O-trifluoroacetylované (S)-(+)-3- methyl-2-butylestery; DB-5 a DB-17 moč [70] kolony GC-MS směs DB-1 kolona moč [71] GC směs 10%OV-1 a 10%OV-17 kolony moč [72] GC-MS enantiomery O-trifluoroacetylované (-)- methylestery; DB-5 a DB-17 kolony moč [73] ITP směs vedoucí: 10 mm HCl ph 3,0 + β.alanin + 0,2% Triton X, koncový: oxidace hexóz [74] 5,6 mm acetát sodný Pd(II) GC-MS enantiomery O-acetylované methylestery moč, sérum [75] 35

3.1 Přístrojové vybavení 3 Experimentální část Všechny analýzy byly provedeny separací kapilární elektroforézou s hmotnostní spektrometrií jako detekcí. Použita byla ionizace elektrosprejem a jako hmotnostní analyzátor byl použit kvadrupól. CE-MS systém Agilent Technologies. Kapilární elektroforéza CE HP 3D (Agilent, Německo) s detektorem diodového pole a hmotnostním spektrometrem pracujícím na principu jednoduchého kvadrupólu (Agilent G6130), tok přídavné kapaliny byl zajišťován isokratickou pumpou pro kapalinovou chromatografii (Agilent G1310). 3.2 Chemikálie a pomůcky Byly použity chemikálie: octová kyselina (Sigma), mravenčí kyselina (Fluka), hydroxid amonný (Fluka), L-Glycerová kyselina (Sigma), DL-Glycerová kyselina (Sigma), deionizovaná voda, vankomycin chlorid (Sigma), methanol (Merck), amoniak (Fluka), hydroxid amonný (Sigma), kyselina dusičná (Sigma), ethanol (Sigma), 3- trimethylsilylpropylmethakrylát (Sigma), akrylamid (Sigma), N,N,N,N tetramethylendiamin (Sigma), peroxodisíran draselný (Sigma), 2-ethyl-2- hydroxymálesná kyselina, THF (Sigma), diethyletrher (Sigma), butylacetát (Sigma), ethylacetát (Sigma), kyselina chlorovodíková (Fluka). Všechny použité chemikálie byly p.a. čistoty. Reálné vzorky krevního séra a moči. Ultrazvuk ElmaSonic S4OH, Ultracentrifuga Thermo Electron Corporation MR23i, Filtry Millipore (průměr 25 µm) 3.3 Postup pokrývání kapilár Při separaci glycerové kyseliny byla použita pokrytá křemenná kapilára. Pokrytím došlo k potlačení elektroosmotického toku, a při daných separačních podmínkách vankomycin migroval jako kation směrem ke katodě, tj. od detektoru, a anionty glycerové kyseliny k anodě, tj. k detektoru. Postup použitého polyakrylamidového kovalentního pokrytí byl publikován Schützerem roku 1994 [76]. 36