Struktura a funkce biomakromolekul KBC/BPOL 5. Metody určování struktury proteinů Ivo Frébort
3D struktury
Smysl určování 3D struktur Pochopení funkce proteinů, mechanismu enzymových reakcí, design nových léčiv, atd. Experimentální vyřešení struktury je velmi obtížné. PDB Genebank ~80.000 proteinových struktur ~10.000.000 proteinových sekvencí Z 80.000 struktur, 8.000 tvoří proteiny s méně než 30% identity sekvence a jen 1.100 je unikátních, reprezentuje proteiny, které jsou výrazně strukturně odlišné
PDB Protein Data Bank (PDB) - založena 1971 http://www.rcsb.org/pdb/ 3D strukturní data makromolekul Data pocházejí z rentgenostrukturní krystalografie nebo NMR Celkový počet struktur 116.258 (25/02/2016)
Vývoj obsahu PDB
Nárůst nových typů struktur v PDB
Informační portál PDB
Struktury membránových proteinů 25.2. 2016 Unique proteins in database = 595 Number of coordinate files in database = 1882 http://blanco.biomol.uci.edu/membrane_proteins_xtal.html
Strukturní databáze virů v PDB
Možnost stanovení struktury komplexu ES/EI Cytokinin dehydrogenasa + substrát ip/ip9g
Určení funkčních domén proteinu IMUNOGLOBULIN-G
Určení struktury neproteinových složek STRUKTURY MYOGLOBINU A HEMOGLOBINU
Rentgenová krystalografie proteinů Je nutný extrémně čistý proteinový vzorek Protein musí tvořit relativně velké a kvalitní krystaly. Obvykle největší problém Řadu proteinů není možno zkrystalovat vůbec (např. membránové proteiny)
Odpovídá krystalová struktura skutečnosti? Krystaly enzymů vykazují katalytickou aktivitu Proteinové krystaly obsahují velký podíl vody, ~50% Výsledky získané chemickou modifikací a proteinovým inženýrstvím většinou potvrzují krystalové struktury Metody pracující s proteiny v roztoku, zejména NMR potvrzují krystalové struktury
Krystalografie proteinů Krystaly lidského insulinu Rentgenokrystalografický experiment
MAX FERDINAND PERUTZ (1914-2002) 1962 Nobelova cena za chemii za studium struktury globulárních proteinů
Braggův zákon 2d.sin = n. Fourierova transformace: řešení matematického vztahu mezi elektronovou hustotou a difrakcí rentgenova záření F(h) odraz na krystalové mřížce v bodě h, f(x) rozptylová funkce elektronové hustoty v bodě x. F(h) je komplexní číslo (vektor) skládající se z amplitudy a fáze odrazu. Integrace je možná pouze na úrovni celé krystalové jednotky. Každý atom tedy přispívá k amplitudě a fázi každého individuálního odrazu, ale různým způsobem (závisí na počtu elektronů atomového obalu). Tedy i částečná data dávají informaci o kompletní proteinové struktuře. Elektronová hustota ρ(x) v bodě x je dána sumou všech odrazů v krystalové jednotce. Ke získání kvalitní mapy elektronové hustoty (s dobrým rozlišením) je třeba kompletní data.
Difrakční záznam proteinového krystalu
Princip řešení fáze pomocí metody isomorfní výměny Je možné změřit pouze amplitudu!!!
Zařízení pro rentgenovou difrakci Detektor Kapalný dusík se používá ke zmražení a stabilizaci krystalu.
Krystalizační kity a metodiky Hanging drop Sitting drop Microdialysis
Činidla kitu Crystal screen Hampton Research
Molecular Dimensions Mosquito Robot http://www.moleculardimensions.com
Zdroj záření - synchotron Synchrotronové záření je vyzářeno elektronem letícím téměř rychlostí světla, když je jeho dráha ohýbána magnetickým polem (obj. 1947)
Nejvýznamnější synchotrony
www.spring8.or.jp
SPring-8 10 9 x silnější RTG záření než konvenční zdroje
SPring-8 Linac akcelerátor urychluje elektrony generované elektronovým dělem na energii 1 GeV pomocí vysokofrekvenčního elektrického pole. Synchrotron je kruhový akcelerátor, který dále urychluje elektrony na energii 8 GeV přenáší je do zásobního okruhu. Zásobní okruh elektrony s energií 8 GeV cyklují a jsou používány k produkci synchotronního záření, které je vyvedeno do jednotlivých výzkumných pracovišť. 1 km světelná dráha slouží ke studiu koherentní optiky rentgenova záření, např. vliv gravitace na světlo.
Linac Synchotron Storage ring Experimental station
Mapa elektronové hustoty Řešení proteinové struktury Modelování Optimalizace Isomorfní výměna Molekulární výměna Řešení fáze Struktura Validace Publikace Zpracování dat Porovnání s PDB Purifikace Záznam dat Krystalizace Synchotron
Mapa elektronové hustoty a tvorba modelu
Validace struktury - Ramachandránův diagram 3: CORE (dark green), 2: ALLOWED (light green), 1: GENEROUS (yellow), 0: OUTSIDE (red) Morris A L, MacArthur M W, Hutchinson E G & Thornton J M (1992). Stereochemical quality of protein structure coordinates. Proteins, 12, 345-364.
Nukleární magnetická resonance NMR lze použít pro řešení struktury malých proteinů (do 20 kda)
Určení proteinové struktury pomocí NMR Triple resonance experiments
NMR vs. krystalové struktury NMR model Proteinový krystal
Struktura vyřešená pomocí NMR priony PrP and PrP* R Riek, S Hornemann, G Wider, M Billeter, R Glockshuber & K Wuethrich: NMR structure of the mouse prion protein domain PrP(121-231). Nature 382, 180-182 (1996).
Teoretické předpovědi proteinové struktury Sekvence obsahuje všechny informace o struktuře Existuje nepřeberné množství možných konfigurací peptidového řetězce Ab initio modelování zatím neuskutečnitelné Homologní modelování na základě podobnosti aminokyselinové sekvence (nad 25% identity)
Literatura Garett, R. and Grisham, C.: Biochemistry 2 nd ed., Harcourt Brace & Company, Orlando, FL, USA 1999. Jones, C., Mulloy, B., and Sanderson, M. R.: Crystallographic methods and protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 56, Humana Press, Totowa, NJ, USA 1996. Spring-8 web page (www.spring8.or.jp) and other Internet resources