Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 6 - Gradientové systémy V případě separace složitých vzorků musí být složení mobilní fáze v průběhu analýzy měněno. Změna složení spočívá v postupném zvyšování eluční síly mobilní fáze tak, aby se eluovaly i látky, které by jinak byly eluovány po dlouhé době nebo by se neeluovaly vůbec. Podle konstrukce se rozlišují dva typy gradientových systémů, které se označují jako nízkotlaký a vysokotlaký gradient, podle toho, jestli jsou solventy míchány před nebo za vysokotlakým čerpadlem. Nízkotlaký gradientový systém (obrázek nahoře) může sestávat z dvou nebo více zásobníků solventů spojených s proporcionálním ventilem a směšovací komůrkou/mixérem 1
(objem < 1 ml) vybavenou magnetickým míchadlem. Zásobníky solventů obsahují kapaliny s odlišnou eluční silou. Ventil se otevírá po různou dobu, a tak umožňuje měnit složení mobilní fáze. Čerpadlo dopravuje smíchanou mobilní fázi do dávkovače a na kolonu. V tomto případě ke směšování solventů dochází na straně nízkého tlaku a takový systém se označuje jako nízkotlaký gradient. Je poměrně levný i přesto, že směšovací ventil musí být velmi kvalitní. Jeho vnitřní objem může být dost velký a mohou být potíže v souvislosti se vznikem bublin v kapalině při jejich míšení. Vysokotlaký gradientový systém (obrázek dole) vyžaduje dvě nebo tři vysokotlaká čerpadla, každé pro čerpání jednoho solventu (ty musí být samozřejmě mísitelné). Na začátku separace čerpá především čerpadlo obsahující solvent s malou eluční silou a postupně čerpá více i čerpadlo se solventem s větší eluční silou. Průtoky na čerpadlech jsou řízeny tak, aby změna složení byla lineární v čase nebo nelineární. Elektronické řízení musí zabezpečit, aby celkový průtok byl neměnný. V uvedeném případě se míchání solventů provádí až za čerpadly na straně vysokého tlaku, proto se takové uspořádání označuje jako vysokotlaký gradientový systém. Protože na každý solven je nutné samostatné vysokotlaké čerpadlo, je tento typ gradientu dražší než nízkotlaký gradient. Zpoždění gradientu (dwell volume) je menší než u nízkotlakého gradientu. Dwell volume je objem mezi místem míchání mobilní fáze a vstupem na kolonu. Pro nízkotlaký systém se skládá z objemu proporčního ventilu, mixeru, hlavy čerpadly, dávkovače a spojovacích kapilár. Pro vysokotlaký gradientový systém je menší, protože je tvořen jenom mixerem, dávkovačem a kapilárami. Velký dwell volume je nevýhodný. Zpožďuje a deformuje (vyhlazuje) gradient a potřebuje delší ekvilibrační čas před následující analýzou. Velký dwell volume není vhodný pro nízké průtoky. Kapiláry Kapiláry s vnějším průměrem 1/16 palce (1.6 mm) jsou pro spojovaní komponent HPLC používány nejběžněji. Pokud jde o vnitřní průměry jsou k dispozici kapiláry různých rozměrů, 0.18, 0.25, 0.50 a 1.0 mm (tj. 0.007, 0.01, 0.02 nebo 0.04 palce), ale i další. Pro všechny spoje, které nejsou v kontaktu se vzorkem je doporučován vnitřní průměr 0,5 mm. Tyto kapiláry se neucpávají na generuje se na nich jen malý tlak. Jejich vnitřní objem je poměrně malý. Pro kritické spoje, kde je nutné snížit objem kapilár, např. mezi dávkovačem a kolonou nebo kolonou a detektorem, je nutné používat kapiláry s menším vnitřním průměrem většinou 2
0.12 mm až 0.25 mm. Mimokolonový objem je podstatně menší u kapilár o menším vnitřním průměru, např. 0.18 mm (23 µl m -1 ), a musí být filtrována mobilní fáze i vzorky, aby se kapilára neucpala. Kapiláry s vnitřním průměrem 0.25 mm (50 µl m -1 ) nejsou na ucpání tak náchylné, ale pokud kolona poskytuje velmi úzké píky, měly by se používat užší kapiláry. Kapiláry bývají zhotoveny z netezové ocele, teflonu nebo polymeru označovaného PEEK. Nerezová ocel je tlakově odolná a obecně nekoroduje. Není ovšem vždy biokompatibilní se vzorkem a někdy může docházet např. k sorpci bílkovin. Teflon je jen poměrně málo odolný vůči vyšší teplotě a tlaku, a tak nemůže být používán pro všechny aplikace. PEEK (polyether ether keton) je schopen do jisté míry nahradit nerezovou ocel pokud jde o chemickou a tlakovou odolnost, je ale potřeba vzít v úvahu, že PEEK není dlouhodobě odolný vůči dichlormethanu, tetrahydrofuranu, dimethyl sulfoxidu, koncentrované dusičné a sírové kyselině. Je ovšem vysoce biokompatibilní. Horní tlakový limit je kolem 200 bar, ovšem někteří dodavatelé garantují i 350 bar. PEEK kapiláry jsou barevně kódovány: 0.18 mm žlutá, 0.25 mm modrá, 0.5 mm oranžová, 1.0 mm šedá. Ultrapek a Carbon PEEK mají mírně odlišná složení a vyšší odolnost vzhledem k chemikáliím a tlaku. Je doporučováno používat plastové kapiláry s plastovými fitinky. Kombinace kovovu s plastem může vést ke zničení plastových částí při dotažení součástek. Teflon a PEEK je možno snadno uříznout žiletkou nebo speciálním nástrojem, který je komerčně dostupný. Nerezová ocel se řeže daleko obtížněji a je riziko, že dojde ke zmenšení vnitřního průměru kapiláry při řezání. Je vhodné použít nástroj dodávaný firmou, od které jsou koupeny kapiláry a řídit se příslušnými instrukcemi. Pokud není k dispozici speciální nástroj, lze použít malý pilníček a naříznout kapiláru po celém obvodu a pak pomocí dvojích kleští a ohnutím kapiláru v místě řezu zlomit. Čerstvě uříznutou kapiláru je dobré zapojit tak, aby nově vzniklý konec byl na konci systému a nejprve je vhodné tuto kapiláru promýt a teprve pak připojit k dalším dílům sestavy, aby nedošlo k ucpání případnými prachovými částicemi. Spojovací díly/fitinky Všechny malé součástky potřebné pro spojení částí HPLC systému jsou označovány jako spojovací materiál/fitiky. Obvykle vedou kapiláru do kolony nebo přístroje. 3
Možný způsob spojení je ukázán na obrázku, ale jsou možná i jiné typy spojení. Výraz fitink je často užíván pro pohyblivé díly umístěné na kapiláře, zde průchozí šroub samec. Může být zhotoven z oceli nebo plastu (Kel-F ketonový polymer). Nerezové fitinky mívají separátní ferule. Někdy existují i dvoudílné ferule, kroužek a delší konický díl. V okamžiku jejich instalace dojde k jejich permanentní fixaci na kapiláru. Nelze je pak již odstranit ani posunout. I když je možno nerezové ferule umístit i na teflonové a PEEK kapiláry, není to vhodné, protože jejich přílišným dotažením může dojít k deformaci kapiláry. V každém případě je třeba k dotažení použít klíč. Plastické fitiky bývají jedno nebo dvou dílné, tzn. šroub a ferule nebo jeden kus. Stlačení po dotažení je menší a spoje jsou rozebíratelné. Jsou vhodné pro všechny typy plastových kapilár, ale i pro kapiláry nerezové. K jejich instalaci není třeba nástroj/klíč, jsou utažitelné ručně. Instalace musí být provedena podle návodu dodavatele. Je nutné se vyhnout přílišnému utažení a spojování přes závit. Nejvhodnější je spoj dotáhnout jen lehce a překontrolovat jeho těsnost. Pokud je třeba, více jej dotáhnout. Přílišné utažení může zničit kapiláru i průchozí šroub, ty mohou být používány opakovaně, ale ne mnohokrát. Plochy, které na sebe dosedají musí být naprosto čisté bez strop silikagelu a jiných mechanických nečistot. Existuje celá spousta typů spojovacích dílů různých výrobců. Produkty odlišných výrobců se většinou nedají kombinovat! Jsou odlišné jak pokud se jedná o sklon, tak o hloubku součástek, od 0.1700 place 4.32 mm (Rheodyne) po 0.0800 palce = 2.03 mm (Valco). Obvykle jsou závity podle US nebo britské normy, ale také délka závitu je u každého výrobce 4
odlišná. Pokud je hloubka malá, vzniká mimokolonový prostor, když je příliš velká může dojít k poškození frity kolony. Označení 1/16 palce na spojovacím dílu znamená, že náleží ke kapiláře s tímto vnitřním otvorem. Šroub mívá šířku 5/16 palce. 5