Jiří Pazourek MODERNÍ ELEKTROFORETICKÉ ANALYTICKÉ METODY (přednášky pro magisterské studium) 1. ÚVOD...3 1.1. Význam kapilární elektroforézy...3 1.2. Historický vývoj...5 1.3. Různá prostředí pro elektroforézu...7 1.4. SDS-Polyakrylamidová Gelová Elektroforéza proteinů (SDS-PAGE)...10 1.5. Zpracování gelu po separaci. Vybarvování stříbrem nebo organickými barvivy...12 1.6. Blotting (Southern blotting + Nothern blotting + Western blotting)...15 1.7. 2D-elektroforéza (Two-Dimensional Electrophoresis)...18 1.8. Elektroforéza v kapiláře = kapilární elektroforéza (capillary elecrophoresis)...19 2. ANALYTY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE...21 2.1. Typy molekul, které lze analyzovat kapilární elektroforézou...21 2.2. Proteiny = polypeptidy. Náboj polypeptidů...22 2.3. Elektroforetická titrační křivka...23 3. TEORETICKÝ POPIS ELEKTROFORÉZY...25 3.1. Základní fyzikální principy elektroforézy elektroforetická pohyblivost µ...25 4. ELEKTROOSMOTICKÝ TOK...26 4.1. Elektroosmotická pumpa...26 4.2. Animace endoosmotického toku. Animace kapilární elektroforézy...28 4.3. Modifikátory elektroosmotického toku (EFM) tenzidy neboli surfaktanty...33 5. ZÁKLADY INSTRUMENTACE...34 5.1. Pracovní podmínky...36 5.2. Nepřímá detekce v CE...38 6. SEPARAČNÍ MÓDY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE...40 6.1. Kapilární zónová elektroforéza (CZE)...41 6.2. Izotachoforéza (ITP)...47 6.3. Kapilární gelové elektroforéza (CGE)...56 6.4. Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC)...57 6.5. Kapilární elektrochromatografie (CEC)...61 6.6. Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF)...64 6.7. Diskontinuální elektroforéza...65 6.8. CE v nevodném prostředí (NON-AQUEOUS CE)...66 7. OMEZENÍ ROZMÝVÁNÍ ZÓN V CE. OPTIMALIZACE...67 7.1. Odvod Joulova tepla...67 7.2. Elektroosmotický tok...67 7.3. On-capillary detekce...68 7.4. Molekulární difúze...68 7.5. Rozmytí zón způsobené dávkováním...69 8. VYHODNOCOVÁNÍ DAT KAPILÁRNÍ ZÓNOVÉ ELEKTROFORÉZY...73 8.1. Detekční limit...73 8.2. Validace v CE...74 9. KLINICKÉ A FARMACEUTICKÉ APLIKACE...77 9.1. Chirální separace - Separace optických izomerů kapilární elektroforézou...79 9.2. Spojení CE a laserem indukované fluorescence (LIF). Kompetitivní immunoassay bílkovin...80 9.3. SDS-CGE proteinů...82 9.4. Separace sacharidů pomocí MEKC s derivatizací...84 9.5. CE-MS...85 9.6. Sekvenování DNA. PCR...86 9.7. Miniaturizace...88 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 2
1. ÚVOD 1.1. Význam kapilární elektroforézy Pojmem kapilární elektroforéza, resp. vysokoúčinná kapilární elektroforéza (High- Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) je dnes označována celá rodina elektromigračních separačních metod realizovaných v kapilárním instrumentálním formátu: zónová elektroforéza (CZE), izotachoforéza (CITP), izoelektrická fokusace (CIEF), elektroforéza v síťovacích prostředích, klasických agarosových i polyakrylamidových gelů (CGE) i v kapalných síťovacích mediích (SDS-elektroforéza bílkovin), bioafinitní elektroforéza a dále též kombinované elektromigrační a chromatografické techniky, elektrokinetická chromatografie (MEKC) a kapilární elektrochromatografie (CEC). Pro svou účinnost dosahující stovek tisíc až miliónů teoretických pater a citlivost na úrovni femtomol-zeptomol (10-15 -10-21 mol) analytu v nanolitrových objemech analyzovaných vzorků, jsou HPCE techniky považovány za nejúčinnější a nejperspektivnější analytické separační metody. Stávají se stále více uznávaným protějškem, resp. doplňkem dosud nejrozšířenějších separačních metod - různých variant vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). I když analytické využití HPCE metod výrazně převládá, lze tyto techniky použít též pro mikropreparaci (na úrovni nanomol / pikomol) a fyzikálně chemickou charakterizaci separovaných látek. Podle charakteru vzorku a účelu separace můžeme rozlišit následující typy aplikací: Analýza (kontrola čistoty nebo kvality) syntetických nebo z přirodního materiálu izolovaných preparátů, např. chemikálií, barviv, léčiv, vitamínů, enzymů a hormonů. Analýza komplexních směsí: stanovení biologicky nebo chemicky významných analytů, např. metabolitů, léčiv, jedů, škodlivin, aditiv a polutantů v biologických tekutinách (sérum, plazma, moč), tkáňových extraktech, potravinách, odpadních vodách a reakčních směsích. Sledování biologických a chemických přeměn, např. chemických a enzymatických reakcí a přeměn metabolitů, léčiv a chemikálií. Fyzikálně-chemické charakterizace analytů: stanovení elektroforetických pohyblivostí, relativních molekulových hmotností, efektivních nábojů, disociačních a asociačních konstant, difúzních koeficientů a jiných charakteristik. HPCE nachází široké uplatnění ve výzkumu i v praxi mnoha oblastí chemie, biochemie, molekulární biologie, klinické chemie, biotechnologie, zemědělství, v chemickém, farmaceutickém a potravinářském průmyslu, v ekologii apod. Nejmasovější využití elektroforézy je dnes spojeno s analýzami proteinů a nukleových kyselin (Projekt lidského genomu, medicinské vužití detekce genetického polymorfismu, PCR, DNA čipy). Odkazy http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/electrophoresis/contents.html http://www.ceandcec.com http://ntri.tamuk.edu/ce/ce.html http://mobilise.com Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 3 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 4
1.2. Historický vývoj Historie elektroforézy http://hendrix.pharm.uky.edu/che626/electrophoresis/electrophoresis.html http://www.geocities.com/bioelectrochemistry/tiselius.htm vybarvování gelů, immunoelektroforetické techniky, dvourozměrná elektroforéza a různé blotting-techniky. ČASOVÉ MILNÍKY KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY: Koncept elektroforézy jako techniky využívající elektrického pole, které způsobuje pohyb nabitých částic v matrici, byl vyvíjen ve dvacátém století. První vědecká elektroforetická aparatura byla vyvinuta Tiseliem v roce 1937. Tiselius obdržel za svůj příspěvek k analýze proteinů Nobelovu cenu o 11 let později. Tiselius popsal metodu "pohyblivého rozhraní" (moving boundary), která je dnes známá jako zónová elektroforéza, a použil ji k separaci sérových proteinů (1). Elektroforéza se začala vyvíjet až v padesátých letech, kdy byla použita i pro aminokyseliny a dokonce anorganické ionty. Objevily se i další elektroforetické techniky: izoelektrická fokusace a izotachoforéza. Tyto tři metody jsou založeny na poněkud odlišných principech a mohou být pro praktické účely kombinovány. Rozdíl mezi těmito metodami lze vidět i podle prostředí, která se v nich historicky používala: polymerní gel, papír a kapilára. Papír byl používán v začátcích elektroforézy k separaci látek, protože byl levný a lehce použitelný (nemusel se zvláštně připravovat). Smithies použil škrobový gel jako médium pro elektroforézu v roce 1955 (2). O dva roky později Kohn použil pro elektroforézu acetát celulózy jako nosič (3). V roce 1959 Ornstein a Davis (4) a Raymond s Weintraubem (5) použili polyakrylamidový gel. Gelový nosič se stále používá k separaci proteinů (slab-gel electrophoresis), i v kapilárním měřítku (CGE). Kapiláry byly do elektroforézy zavedeny Jorgensonem a Lukacsem (6,7) na začátku devadesátých let dvacátého století. Detekční techniky se v průběhu let také vyvíjely. Většina separovaných složek je prostému oku neviditelná. Proto byly vyvíjeny vizualizační a kvantifikační techniky, jako první experimenty v U trubicích: F. von Reuss (1808), G. Wiedeman (1856), H. Buff (1858), O. Lodge (1886), W. Whetham (1893) 1897F. Kohlrausch odvodil rovnici pro migraci iontů v roztoku elektrolytu 1.pol. 20.stol. gelová elektroforéza a isoelektrické fokusování na gelových deskách 1958 S. Hjertén ZE v rotujících trubicích 1-3 mm 1965 A. Tiselius ZE v 3 mm trubicích 1970 F. Everaerts ITP na vlastním přístroji 1974 R.Virtanen CZE v 200-500 µm skleněných kap. 1974 V. Pretorius EOF mobilní fáze sorbentem 1979 F. Mikkers CZE v 200 µm teflonových kapilárách 1981 J. Jorgenson, K. Lukacs CZE v 75 µm kapilárách 1983 S. Hjertén CGE pro biologické látky 1984 S. Terabe MEKC pro neutrální látky 1985 S. Hjertén CIEF pro biologické látky 1987 J. Knox, I. Grant CEC v 50 µm kapilárách s ODS 1987 B. Karger, A. Cohen vysoká účinnost CGE pro DNA 1988 dostupnost prvního komerčního přístroje (Beckman Instruments) Literatura: 1. Tiselius, A., A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures, Trans. Faraday. Soc., 33, 524, 1937. 2. Smithies, O., Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal human adults, Biochem. J., 61, 629, 1955. 3. Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis, Clin. Chim. Acta, 2, 297, 1957. 4. Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis, Distillation Products Industries (Division of Eastman Kodak Co.), 1959. 5. Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis, Science, 130, 711, 1959. 6. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Anal. Chem., 53, 1928, 1981. 7. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Science, 222, 266, 1983. Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 5 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 6
http://hendrix.pharm.uky.edu/che626/electrophoresis/matrix.html 1.3. Různá prostředí pro elektroforézu Papír Agarosa Polyakrylamid Kapilára Dnes je elektroforéza převážně používána pro biologické a jiné polymerické vzorky (komerčně), např. DNA analýza pro kriminalistické a vědecké účely, dále pro proteinovou a enzymovou analýzu - v těchto případech se nejčastěji jedná o elektroforézu v gelu (Projekt lidského genomu). Gel síťovým efektem zpomaluje pohyb nabitých molekul na základě jejich velikostí resp. velikosti pórů gelu. Elektroforéza na papíře paperelectrophoresis2.swf Papír napuštěný elektrolytem byl používán pro první elektroforetické separace, protože byl levný a laboratorně používaný pro filtrace resp. papírovou chromatografii (Whatman 3MM (0.3 mm) a Whatman No.1 (0.17 mm). Papír také obvykle nenese náboje, které by nežádoucím způsobem interagovaly s analytem. Vzorek se nanáší přímo na plochu papíru, který leží na chladící desce a jehož konce jsou ponořeny do elektrolytových rezervoárů, do nichžjsoutaképonořeny konce elektrod. Ke sledování migrace jsou používány společně se vzorkem ionizovaná barviva a standardy. Aplikovaná napětí jsou větší než v případě gelů, protože elektrický odpor papíru je větší. Nevýhodou papírové elektroforézy je fakt, že póry papíru (velikost, kvalita) nejsou uživatelem přímo kontrolovatelné a tudíž tato technika není příliš citlivá ani reprodukovatelná. Elektroforéza v gelu Efekt omezené difúze : Ačkoli elektroforéza může být prováděna nejjednodušeji ve volném roztoku (CZE), konvekční pohyb kapaliny v důsledku tepla přirozeně uvolňovaného průchodem elektrického proudu může separaci narušit, případně zónu analytu úplně rozmýt. Tato úvaha vedla v elektroforéze k zavedení gelu jako separačního prostředí. Tímto gelem je obvykle agarosa (polysacharid z mořských řas) nebo synteticky připravovaný polyakrylamid (chemicky síťovaný polymer, CH 2 =CHCONH 2 ). Agarosový gel Ředěné agarosové gely jsou dostatečně rigidní a jednoduché pro přípravu v nízkých koncentracích, proto se typicky používají k separaci velkých makromolekul, jako např. velkých bílkovin nebo DNA (až 20 kbp). Polyakrylamidové gely se typicky používají k separaci nukleových kyselin do 2 kbp (ale v určitých modifikacích i pro větší fragmenty). Agar se isoluje z červené řasy rodu Rhodophycae, je tvořen dvěma komponentami - agarosou a agaropektinem. Agarosa je vhodná jako elektroforetická matrice, protože je takřka nenabitá. Agarosa je řetězec opakujících se jednotek D-galaktózy a 3,6-anhydro-L-galaktózy jak je vidět na obrázku s bočním řetězcem 6-methyl-D-galaktózy: http://tutor.lscf.ucsb.edu/instdev/sears/biochemistry/tw-exp/paperelectrophoresis.htm Agarosa je schopna utvořit třírozměrnou strukturu šroubovice s trojnásobně zalomenou osou, která vytváří dutinu dostatečně velkou pro přijetí vody (agarosový gel může obsahovat až Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 7 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 8
1.4. SDS-Polyakrylamidová Gelová Elektroforéza proteinů (SDS-PAGE) SDS, sodium dodecylsulfate, je také známý jako sodium lauryl sulfáte. Hydrofobní konec molekuly SDS silně interaguje s proteinovým řetězcem. Počet molekul SDS, které se váží na protein je úměrný délce proteinu. Neredukované (viz dále) proteiny váží 0,9-1,0 gram SDS na gram proteinu. Každá molekula SDS přispívá negativním nábojem a samozřejmě překrývá případný náboj proteinu. To dovoluje separovat vzorek pouze podle molekulové hmotnosti (velikosti), nikoli podle náboje, protože konečný náboj proteinu po asociaci s SDS je vždy negativní a úměrný VELIKOSTI proteinu (poměr náboj/velikost, který je v zónové elektroforéze klíčový a pro dosažení separace nutně různý, je v SDS-PAGE konstantní). SDS také ruší terciální strukturu proteinů (denaturace). Použijeme-li při přípravě vzorku navíc β-merkaptoethanol, který přerušuje disulfidické vazby v proteinu, vzniknou tzv. redukované proteiny, které pak na sebe váží 1.4 gramu SDS na gram proteinu. SDS-PAGE tedy spojuje výšeuvedený efekt omezené difúze molekul analytu a size exclusion mechanismus (podobný gelové filtraci/permeační chromatografii). Mechanismus Protože elektroforetická mobilita je definovaná jako vzdálenost uražená za určitý čas, vsds-page tedy můžeme psát Nebo použijeme-li tzv. relativní mobilitu Rf definovanou jako elektromigrační dráha neznámé bílkoviny Relativní mobilita (Rf ) = ---------------------------------------------------- celková délka elektroforézy Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 10
Kalibrační závislost log MW = f (Rf) 1.5. Zpracování gelu po separaci. Vybarvování stříbrem nebo organickými barvivy Po separaci v gelové elektroforéze je obvykle analyt prostým okem neviditelný. Pro kvantifikaci (určení množství analytu v zóně) používáme často metody vybarvování gelu (angl. staining, alternativou je radiografie, pokud byl analyt radioaktivně značen, viz dále): pozn.: vyjímkami v tomto chování jsou velmi hydrofobní (membránové) proteiny a glykosylované proteiny. Závěr (SDS-PAGE): Elektroforéza v přítomnosti SDS = SDS PAGE je jednoduchá a rychlá metoda pro charakterizaci a srovnání bílkovin. Tato metoda separuje bílkoviny na základě rozdílné relativní molekulové hmotnosti. SDS se zde váže na bílkovinný řetězec v poměru 1.4 g SDS na 1g bílkoviny, přičemž délka komplexu SDS + bílkovina je úměrná jeho molekulové hmotnosti. Na základě srovnání relativních mobilit neznámé bílkoviny a standardů je pak možné určit její relativní molekulovou hmotnost. Vybarvování (Staining) Vybarvování proteinů je běžně prováděno třemi možnými reagenciemi: Amido Black, Coomassie Brilliant Blue G-250 nebo stříbrem. Amido black není příliš citlivá, reaguje s proteiny, které jsou snadno přístupné, např. které byly přeneseny z gelu na nitrocelulózový papír. Coomassie Blue a stříbro interagují s více proteiny a jsou více citlivé. Coomassie Blue, používaná pro agarosové a polyakrylamidové gely, je 5x citlivější (0.3 ug/zónu) než Amido black. Vybarvování stříbrem je 100x citlivější (1 ng/zónu) než Coomassie Blue a používá se převážně pro polyakrylamidové gely. Toto vybarvování se používá v případech malého množství proteinu nebo chceme-li detekovat co možná nejvíce zón. příklad: Detekce bílkovin stříbrem krok roztoky čas 1. 60 ml 50 % acetonu, 1.5 ml 50 % TCA, 25 µ l 37 % HCHO 5 min 2. opláchněte 3x deionizovanou vodou 3 x 5 s 3. promytí deionizovanou vodou 5 min 4. opláchněte 3x deionizovanou vodou 3 x 5 s 5. 60 ml 50 % acetonu 5 min 6. 100 µ l 10 % Na 2 S 2 O 3 v 60 ml deionizované vody 1 min 7. opláchněte 3x deionizovanou vodou 3 x 5 s 8. 0.8 ml 20 % AgNO 3, 0.6 ml 37 % HCHO, 60 ml H 2 O 8 min 9. opláchněte 2x deionizovanou vodou 2 x 5 s 10. 60 ml 2 % Na 2 CO 3,25 µ l 37 % HCHO, 25 µ l 10 % Na 2 S 2 O 3 10-20 s 11. 1 % HAc 30 s 12. promytí deionizovanou vodou 10 s Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 11 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 12
Po té, co byl gel vybarven, mohou být proteiny kvantifikovány densitometricky. Gel může být fotografovány nebo skenovány, intenzita zabarvení je srovnána s kalibrační křivkou standardů. Všechny uváděné procesy vybarvování jsou poměrně dlouhé: např. vybarvování stříbrem může zabrat až několik hodin. Navíc takováto barvení jsou obtížně reverzibilní a většina proteinů nemůže být neporušeně získáná zpět (pro další analýzu). Jinou modifikací detekce je autoradiografie. Radioaktivní vzorek separovaný v gelu je s gelem vysušen na papíře a přenesen na rentgenový film, který je radioktivími atomy exponován. Radioaktivní zóny jsou tedy na výsledném snímku světlé a film je opět densitometricky vyhodnocen. objektivní vyhodnocování: schéma optického densitometru Stupeň zesíťování monomeru určuje velikost pórů gelu, čili rozsah molekulových hmotností, při kterých bude gel účinný. Tento pracovní rozsah nastavíme procentuálním obsahem síťovadla ve směsi. Složení výsledného polymeru můžeme vyjadřovat 2 způsoby: %T nebo %T, %C: %T je hmotnostní procento celkového monomeru (akrylamid + síťovadlo) Např. 15% gel znamená obsah 15% w/v akrylamidu a bisakrylamidu. Platí, že čím větší %T, tím menší póry (propustnost) gelu. U způsobu %T, %C přidáváme ještě informaci o procentuálním zastoupení síťovadla %C. 15%T, 5%C-bis říká, že kromě celkové koncetrace 15% w/v akrylamid + bisakrylamid je bisakrylamidu 5% celkové hmotnosti gelu. Takto lze také nastavovat velikost pórů: pro jakékoli %T, 5% C tvoří nejmenší póry. Zvětšení nebo zmenšení %C zvětší póry gelu. Na rozdíl od agarosového gelu, polymerace akrylamidu vyžaduje aditiva. Běžný iniciátor je peroxodisulfát amonný (NH 4 ) 2 S 2 O 8 a tetramethylendiamin (TEMED) funguje jako katalyzátor. TEMED vytváří z peroxodisulfátu volné radikály, které způsobují vlastní polymeraci. Polyakrylamidový gel je univerzální gel, běžně používaný pro elektroforézu proteinů a nukleových kyselin. Elektroforéza v polyakrylamidu Polyakrylamidový gel separuje většinu proteinů a malých oligonukleotidů, vzorků, které jsou sami menší než v případě agarosového gelu. Polyakrylamidové gely jsou tvořeny z monomeru akrylamidu (CH 2 =CHCONH 2 ), který je polymerizován (síťován) do dlouhých řetězců kovalentně tzv. crosslinkerem. Nejpoužívanější crosslinker je N,N'-methylenbisakrylamid [(CH 2 =CHCONH) 2 CH 2 ] NH 2 O O NH NH O Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 13 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 14
1.6. Blotting (Southern blotting + Nothern blotting + Western blotting) Blotting je technika, kdy proteiny jsou z gelu přeneseny do jiné matrice, např. nitrocelulózový papír, protože by síť gelu bránila jiným velkým molekulám, např. bílkovinným protilátkám nebo jiným reagentům s proteiny rychle a kvantitativně reagovat, což je právě proces, který využíváme k citlivé detekci. Po přenesení je papír podroben této inkubační reakci: v Southern blotting je papír inkubován s radioaktivní DNA komplementární k DNA, kterou stanovujeme. Northern blotting používá obdobný postup, ale s RNA. Ješte lze využít immunologickou detekci, kde papír s přeneseným analytem reaguje se specifickou protilátkou (= western blotting), případně k přenosu analytu místo toku kapaliny využít mobilizaci elektroforeticky. Možnost reakce s analytem dává i možnost citlivější detekce densitometricky, případně chemiluminiscenčně nebo fluorescenčně (s fluorescenčně aktivním reagentem). http://www.dnalc.org/resources/biologyanimationlibrary.htm Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 15
ENZYME-ASSISTED IMMUNOELECTROBLOTTING 1.7. 2D-elektroforéza (Two-Dimensional Electrophoresis) (IEB neboli WESTERN BLOTTING) Dvourozměrná elektroforéza používá dvě posoběnásledující elektroforetické metody: izoelektrickou fokusaci a SDS-Page elektroforézu. Izoelektrická fokusace je prováděna nejdříve v jednom směru (rozměru), kdy jsou separovány látky dle svých isoelektrických bodů (pi) a následuje SDS-PAGE ve směru kolmém, kdy dělíme podle molekulových hmotností. Takto lze odlišit i proteiny lišící se o jediný náboj. Vzniklé dvourozměrné mapy lze po skenování (snímkování) katalogizovat a použít jako identifikační nástroj. Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 17 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 18
1.8. Elektroforéza v kapiláře = kapilární elektroforéza (capillary elecrophoresis) Charakteristika, výhody, problémy: Kapilární elektroforéza probíhá v křemenné kapiláře o vnitřním průměru 20-200 µm a je naplněna elektrolytem nebo gelem. Výhodou provádění elektroforézy v kapiláře je její relativně velký povrch vůči objemu. Proto nutně vznikající Jouleovo teplo, které je omezujícím faktorem u elektroforézy na ploše, může být proto velmi účinně odváděno (okolním vzduchem, případně chladící kapalinou). Na druhé straně kapilární rozměry tohoto separačního systému přináší problémy s dávkováním, čištěním povrchu kapiláry a detekcí. Množství vzorku musí být přizpůsobeno velikosti separační kapiláry: typický objem kapiláry je 1-10 ul, objemy vzorku nepřekračují 0.1-1% této hodnoty. Protože se většinou používá on-line (on-column) detektory, musejí být citlivé, aby takováto malá množství detekovaly. Nejběžnější je detektor optický (UV-VIS nebo fluorescenční), případně vodivostní. Stav povrchu kapiláry (elektroosmotický tok, interakce se vzorkem) představuje stále oříšek bránící kapilární elektroforéze stát se vážným konkurentem HPLC v oblasti kvantitativní analýzy. Protože separační kapilára není určena na jedno použití, po každé analýze musí být její vnitřní povrch vyčištěn, resp. uveden do opakovatelného stavu. Jedním z možných řešení je modifikace vnitřního povrchu (coating) buď dynamicky, adsorbcí nebo kovalentní chemickou vazbou. Tento problém je samozřejmě eliminován u kapilár plněných gelem. Na druhé straně, existenci elektroosmotického toku u nemodifikovaní křemenné kapiláry, který mobilizuje celý objem kapaliny v kapiláře ke katodě, lze výhodně využít i k detekci aniontů, jejichž výsledný pohyb směřuje také ke katodě. Výhodami kapilární elektroforézy je jednoduchost přípravy vzorku i separační aparatury, efektivní chlazení a eliminace off-line densitometrického vyhodnocování na ploše gelu, protože signál získáváme přímo z on-column detektoru. Je důležité pochopit, že kapilára je z taveného křemene. Křemen na rozdíl od skla neobsahuje příměsi kationtů silně absorbující světlo v UV oblasti, je to prakticky čistý oxid křemičitý. Když mluvíme o taveném křemeni, odkazujeme na kapiláru. Z některých obrázků se sice může zdát, že tavený křemen je uvnitř kapiláry, ale tavený křemen je kapilárou. Tavený křemen není nic jiného než křemen zbavený nepravidelností krystalové struktury. Přetavený křemen je lépe propustný pro UV záření. Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 19 Nejjednodušší zařízení pro kapilární elektroforézu Srovnání kapiláry a slab-gelu Souhrn: separace se typicky uskutečňuje v kapiláře z taveného křemene vně pokryté polyimidem (jiná možnost je teflonová kapilára nebo skleněná kapilára) případně plněná gelem Křemenná kapilára je 5-100 cm dlouhá s vnitřním průměrem 25-100 µm. hydroxylové skupiny křemene mohou disociovat a nabíjet tak vnitřní stěnu kapiláry negativně malý objem kapiláry vyžaduje malé objemy dávkovaného vzorku (1-10 nl) on-column detekce na kapiláře vyžaduje citlivý detektor Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 20
2. ANALYTY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE Migrace molekul v CE závisí na velikosti a náboji molekuly a na elektroosmotickém toku. Obvykle předpokládáme, že elektroosmotický tok je během experimnetu konstantní. 2.1. Typy molekul, které lze analyzovat kapilární elektroforézou Aplikační možnosti kapilárních elektromigračních metod jsou neobyčejně široké. Lze je využít pro separaci a analýzu všech typů rozpustných ionogenních nízko- i vysokomolekulárních látek, např. anorganických i organických kyselin a bází, kovových iontů, aminokyselin, peptidů, bílkovin, sacharidů, nukleosidů, nukleotidů a nukleových kyselin, syntetických polymerů a též pro separaci nabitých (bio)částic, např. virů, buněk a buněčných organel. Kromě toho v režimu elektrokinetické chromatografie a elektrochromatografie mohou být separovány i látky neionogenní, např. alifatické a aromatické uhlovodíky a jejich deriváty (alkoholy, aldehydy, ketony, aminokyseliny a peptidy s chráněnými ionogenními skupinami aj.). Vysoké separační účinnosti HPCE technik se využívá též při separaci polohových a optických izomerů biologicky aktivních látek. Náboj Typ molekuly Migrační rychlost - malý anion -1 4* - velký anion -1 3 = malý anion -2 2 = velký anion -2 1 o malá molekula 0 6 o velká molekula 0 5 + malý kation +1 8 + velký kation +1 7 + + malý kation +2 10 + + velký kation +2 9 *největší číslo znamená nejrychlejší molekulu. Molekuly s identickým nábojem migrují podle své velikosti. Detekce separovaných proteinů (podrobněji viz výše): Coomassie blue Fluoreskamine Autoradiografie Immunoblotting (otisk) 2.2. Proteiny = polypeptidy. Náboj polypeptidů Náboj polypeptidu při třech ph Rychlost proteinu při elektroforetickém experimentu je přímo úměrná náboji a nepřímo úměrná velikosti molekuly a viskozitě elektrolytu (viz dále). Typ použitého pufru a jeho ph jsou tedy zásadní, poněvadž určují celkový náboj proteinu. Náboj proteinu závisí na stupni ionizace kyselých (COOH) a zásaditých skupin (NH 2) proteinu, což je právě funkcí ph obklopujícího média. Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 21 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 22
2.3. Elektroforetická titrační křivka ETK poskytuje informaci o pi (elektroforetické mobilitě) je prováděna na vertikální ploše s použitím velkoporézní gelové matrice, jako např. agarosa nebo nízkosíťovaný polyakrylamid. Na této ploše je předem vytvořen horizontální gradient ph (pomocí patřičných amfolytů (Ampholinů). Na obrázku je vzorek (směs proteinů) po vpravení do středové jamky a aplikaci napětí. Příklad Crotalus viridis (chřestýš zelený) Titrační křivka provedená na IEF 3-9 PhastGelu. Vzorkem byl nasbíraný jeden pík jedu chřestýše oddělený na katexu LC. Pík byl dialyzován, lyofylizován a rozpuštěn ve vodě. Bylo naneseno cca 87.5 µg proteinu. K vybarvování byla použita stříbrná sůl. Náčrt experimentálního stanovení elektroforetické titrační křivky Běhen elektroforézy se pohybují proteiny buď ke atodě nebo k anodě nebo, pokud se ph rovná jejich izoelektrickému bodu, se nepohybují vůbec. Rychlost tohoto pohybu závisí na rozdílu ph-pi. Po proběhnutí elektroforézy je obvykle gel "vybarvován" a posuzuje se vznilá titrační křivka. Typická sada takto získaných křivek je na dalším obrázku. Podle největší vzdálenosti mezi křivkami usoudíme na ph, které je optimální pro separaci např. pro eluci v iontové chromatografii. Elektroforetické titrační křivky isoenzymů laktát dehydrogenasy Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 23 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 24
3. TEORETICKÝ POPIS ELEKTROFORÉZY 3.1. Základní fyzikální principy elektroforézy elektroforetická pohyblivost µ Působí-li síla F (např. elektrická) na hmotnost m, bude tato hmota urychlována zrychlením a (Newton, 1667, F = m * a). Zrychlení je definováno jako rychlost změny rychlosti, jak ukazuje rovnice 1: v v0 a = (1) t a = zrychlení, v = rychlost dosažená v čase t, v0 = počáteční rychlost v čase 0. 4. ELEKTROOSMOTICKÝ TOK 4.1. Elektroosmotická pumpa Obrázek: Kapilára = ENDOOSMOTICKÁ PUMPA 1/kapilára z taveného křemene s obnaženými hydroxylovámi skupinami Zrychlení kulové molekuly nesoucí elektrický náboj v kapalině bude nulové, pokud se odporová (zadržovací) síla okolní kapaliny bude rovnat této urychlující síle F(a) (rovnice 2) F a = F d (2) což je případ kapilární zónové elektroforézy (obrázek, ion je zdržován iontovou atmosférou). Pak se bude molekula pohybovat rovnoměrným pohybem s konstantní rychlostí. Urychlující elektrická síle se rovná součinu síly elektrického pole (ve V/m) a náboje molekuly (v Coulombech) (rovnice 3). 2/ Disociace hydroxylových skupin zanechá na vnitřním povrchu negativní náboj F a = E * Q E = U/d (3) U = napětí, d = vzdálenost, Q = náboj Odporová síla F(d) je funkcí velikosti a tvaru molekuly a viskozity okolní kapaliny podle Stokesovy rovnice, která pro kulovou molekulu má tvar F(d) = 6 * π * η * r * v ef (4) r = poloměr molekuly,η = viskosita, v ef = rychlost Protože F(a) = F(d), pak E * Q = 6 * π * η * r * v ef Dostaneme důležitou veličinu zvanou elektroforetické mobilita µ: 3/ Zapnutím napětí se začně kapalina pohybovat ke katodě - je mobilizována endoosmotickým tokem! µ = v ef /E = Q / 6 * π * η * r (5) a rychlost pohybu je tedy v = µ E (6) pozn.: mobilita (µ) např. proteinuje úměrná náboji (Q) a nepřímo úměrná velikosti molekuly a viskozitě elektrolytu. Druh elektrolytu a jeho ph jsou proto důležité, neboť celkový náboj proteinu je dán ph elektrolytu (pufru). Jinými slovy, celkový náboj proteinu závisí na stupni ionizace kyselých a zásaditých skupin na proteinu, který je závislý na ph prostředí. Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 25 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 26
Jednoduché vysvětlení elektroosmotického toku Povrch křemenné kapiláry obsahuje negativně nabité funkční skupiny, které přitahují pozitivně nabité protiionty. Pozitivně nabité ionty migrují k negativní elektrodě a unáší molekuly rozpouštědla stejným směrem. Tento celkový pohyb kapaliny je nazýván elektroosmotický tok. Během separace se neutrální molekuly pohybují stejným směrem jako elektroosmotický tok (s nepatrnou vzájemnou separací). Positivně nabité ionty jsou elektroosmotickým tokem urychlovány, negativně nabité naopak zpomalovány. Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 27
Stěny taveného křemene obsahují silanolové skupiny, které mohou ionizovat při vyšším ph roztoku elektrolytu. Tato disociace produkuje negativně nabitou stěnu. Vrstva kovových kationtů proto u stěny kompenzuje náboj, aby byla zachována elektroneutralita. Když zapneme napětí, tyto kationty a jejich solvatační obaly vody migrují ke katodě. Tento pohyb je zdrojem pohybu celé kapaliny. Tento toko vlastně pumpuje ionty vzorku ale i celou kapalinu a může být považován za "elektricky-řízenou pumpu". Při nízkém ph jsou silanoly nedisociované a proto elektroosmotický tok je mnohem slabší, při velmi nízkých ph skoro nulový. Jedním z důsledků existence EOF je možnost detekce kationtů aaniontů v jednom experimentu v případěch, kdy velikost EOF je vyšší než elektroforetická mobilita aniontů (např. při ph>7), protože tok kapaliny unáší všechny látky ke katodě, kde je detektor. Disociace silanolových skupin Velikost elektroosmotického toku je závislá na náboji kapiláry, viskozitě elektrolytu a elektrické permitivitě elektrolytu: µ(eo) = ε ζ / η r µ(eo) = "EOF mobilita" (rychlost EOF), η = viskozita, ζ = zeta potenciál (elektrostatický potenciál vzniklý v důsledu náboje na povrchu kapiláry), r = poloměr kapiláry, ε - permitivita elektrolytu. Všimněme si, že ε ζ je náboj (v Coulombech) podobně jako µ=q/6πηr. Obrázek 4: Pohyb aniontů a kationtů v kapiláře z taveného křemene po aplikaci elektrického pole.dva (+) resp.( ) označují větší náboj, krychle a kužele neutrální látky. Velikost EOF je značně závislá na ph elektrolytu, poněvadž zeta potenciál je řízen ionizací silanolových skupin. Do ph=4 je ionizace malá, a nad ph=9 jsou již prakticky všechny skupiny ionizované (horní modrá křivka v obrázku). Nejdůležitější praktické důsledky: Pozitivní a negativní i neutrální molekuly se budou pohybovat amohou být detekovány, tedy i separovány!!! elektrolyt je pumpován od anody ke katodě (situaci lze analogicky obrátit, je-li povrch kapiláry nabitý pozitivně) Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 29 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 30
Pohyb (migrace) závisí na elektroforetickém pohybu nabitých molekul. V některých případech elektroforézy s nemodifikovanou kapilárou, je endoosmotický tok větší než elektroforetický pohyb. Proto se jak kationty, tak anionty pohybují směrem ke katodě. JAK VZNIKÁ ELEKTROFEROGRAM rychlost zóny : POČÍTÁNÍ POHYBLIVOSTÍ t mig,i, t eof l d, l c, U Čas t, který potřebuje analyt, aby přemigroval délkou kapiláry L, je nepřímo úměrný jeho celkové rychlosti, která je (vektorovým) součtem rychlosti elektroforetické a té, kterou přispívá EOF: L r v EO v ef t = ( r + ) znamená to, že při výpočtu skutečné elektroforetické mobility z experimentálně změřeného času, musíme příspěvek elektroosmotického toku vektorově odečítat. m ef,i > 0 pro kationty m ef,i < 0 pro anionty m poz,i > 0 pro oboje, pokud Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 31 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 32
4.3. Modifikátory elektroosmotického toku (EFM) tenzidy neboli surfaktanty 5. ZÁKLADY INSTRUMENTACE Bližší pohled na surfaktanty Surfaktanty jsou známé povrchově aktivní látky, např. mýdla. Molekula surfaktantu má oddělenou polární a nepolární část. Při malých koncentracích tvoří běžné (pravé) roztoky, při vysokých však již nejsou v kapalině homogeně rozptýlené. Zásadní vlastností surfaktantů je jejich zakoncentrovávání se na mezifázích. Vpřípadě systému křemenná kapilára roztok může dojít k navázání surfaktantů nejen adsorpcí, ale i elektrostatickými silami. V případě kationogenních tenzidů lze tímto způsobem elektroosmotický tok zmenšit, dokonce i obrátit jeho směr, jak je znázorněno na obrázku. MEKC Je-li koncentrace surfaktantu vyšší než tzv. kritická micelární koncentrace, vytvoří se micely. Micely jsou shluky, které mají (ve vodném prostředí) hydrofobní jádro a navenek obnaženy hydrofilní části molekul (micelární fáze). Analyty tak při pohybu v elektrolytu, kde se vyskytuje micelární fáze, mohou být distribuovány mezi elektrolyt a micely (podle své chemické afinity k micele) a tím měnit svoji celkovou rychlost pohybu kapilárou. Tato změna rychlosti je obvykle zvýšena tím, že sama micela nese náboj a proto se v elektrickém poli sama pohybuje. Surfaktanty jsou používány k separaci malých velmi málo nabitých nebo nulově nabitých molekul surfaktant v nadkritické micelární koncentraci tvoří micely a tomuto módu elektroforézy se říká Micelární elektrokinetická chromatografie (MECC nebo MEKC) 5.1. Pracovní podmínky Křemenná kapilára (I.D. 10-100 um) Řada známých elektrolytů s tlumícími schopnostmi Vysoké napětí (5-30 kv) Proud (1-200 ua) 5.2. Dávkování vzorku Elektrokinetické Hydrostatické Hydrodynamické (pneumatické) 5.3. Módy detekce UV/Vis detektor Fluorescenční detektor Vodivostní detektor Elektrochemický detektor Hmotnostní (MS, Mass spectrometry) Radioaktivní detektor (s beta zářičem) Post column dervatizační detekce Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 33 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 34
5.1. Pracovní podmínky Typická napětí jsou v rozsahu 5-30 kv, aby produkovaly proudy v rozsahu 10-100 µa. Vyšší proudy mohou způsobovat nadměrný ohřev uvnitř kapiláry, který už nelze efektivně odvádět, což má za následek rozmývání zón a ztrátu rozlišeni (separace). kapiláry Kapiláry jsou obvykle z taveného křemene, na vnějším povrchu chráněné polyimidovým potahem, protože tavený křemen je velmi křehký (existují ale i kapiláry z UV propustného polymeru). Kvůli optické detekci, část ochraného potahu je sejmuta a toto okénko je centrováno do detektoru mezi dvě kulové čočky. Délka kapiláry je typicky 10-100 cm, vnitřní průměr 50 nebo 75 mikrometrů. Na komerčních zařízeních bývá kapilára upevněna v kazetě, aby se zabránilo přelomení případně pohybu kapiláry v optickém okénku. Vnitřní povrch kapiláry může být modifikován dynamicky (EFM, např. surfaktantem v základním elektrolytu) nebo chemicky kovalentní (např. PVA). regulace teploty Regulace teploty kapiláry je nutná pro zajištění dobrého rozlišení a reprodukovatelnosti. Uživatelem sestavované přístroje nebyly vybaveny termostatem (spoléhají na přirozené chlazení vzduchem), komerční přístroje jsou vybaveny chlazením kapiláry nucenou ventilací chlazeného bloku, ale např. fa Beckman má kazety s kapilárou neprodyšně uzavřenou a chlazenou chladící kapalinou. detektory Většina přístrojů CE používá optický UV detektor, případně vybavený diodovým polem, díky kterému je přístroj schopen velmi rychle (v průběhu analýzy) snímat celá spektra. Možností jsou i fluorescenční detektory s laserovou indukcí záření, které jsou vysoce citlivé, ale omezeny na fluoreskující látky. Třetí nejpoužívanější detektor je vodivostní, který má buď elektrody přímo v elektrolytu nebo je bezkontaktní, nasunut kolem kapiláry. Při napojení MS za kapiláru (vyžaduje speciální interface) lze hovořit o detektoru hmotnostním (CE-MS), který dává strukturní informace o separovaných zónách. Pro zvýšení citlivosti, což je jeden z problému CE, byly zkonstruovány tzv. bubble cells, kde je lokálně zvětšen vnitřní průměr kapiláry, nebo Z-cely, kde je kapilára přerušena, radiálně posunuta a optická dráha měrného paprsku je tak několikanásobně prodloužena (podobný princip jako u UV detektorů vlc). Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 35 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 36
Z-cela Detektory jsou běžně spojeny s počítačem, který řídí sběr dat a umožňuje pohodlnou kvantitativní analýzu. dávkování vzorku Roztok vzorku nuceně vniká do jednoho konce kapiláry, typicky vzdálenějšího od detektoru. Typické dávkované objemy jsou mezi 10-100 nl (objemy kapiláry jsou 1-2 µl). Je-li kapilára volně v prostoru, lze použít hydrostatické dávkování zvednutím dávkovacího konce kapiláry nad úroveň druhého konce (sifonový efekt). Většinou se ale používá aplikace přetlaku na nádobku u injekčního konce kapiláry nebo podtlaku na nádobku u detektorového konce. To samozřejmě vyžaduje pneumaticky uzavřený systém nádobky-kapilára. Třetí možností je dávkování aplikovaným napětím, kdy na dávkovacím konci kapiláry je nádobka se vzorkem. Tento poslední způsob je např. jediný možný u gelové kapilární elektroforézy, ale má nevýhodu, že dávkuje přednostně mobilnější ionty na úkor méně mobilních či neutrálních (nedávkujeme reprezentativní vzorek) 5.2. Nepřímá detekce v CE Nepřímá detekce představuje možnost, jak získat nejběžnějším UV-VIS detektorem signál analytů, které samy v této oblasti neabsorbují (tzn. nemají vhodný chromofor, což je celé řada malých anorganických kationtů i aniontů). Principem nepřímé detekce je použití elektrolytu, který sám absorbuje; putující zóny představují pro optický detektor zóny zředění, čili poklesu signálu (viz obrázek). Při výběru absorbujícího elektrolytu musíme mimo optické vlastnosti zvažovat i znaménko a velikost elektroforetické pohyblivosti absorbujících iontů. Dávkování vzorku v CE - + Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 37 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 38
6. SEPARAČNÍ MÓDY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE CZE (FSCE) CGE CIEF CITP CEC MEKC (MECC) Diskontinuální elektroforéze (Discontinous Electrophoresis) CE v nevodném prostředí Capillary Zone Electrophoresis Capillary IsoElectric Focusing Capillary IsoTachoPhoresis CZE CIEF CITP Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 39 Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.2003 40