Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin. Polyfosfáty v masné výrobě Bakalářská práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin Polyfosfáty v masné výrobě Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Michal Mihok, PhD Vypracovala: Barbora Březinová Brno 2015

ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem práci: Polyfosfáty v masné výrobě vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.... podpis

PODĚKOVÁNÍ Chtěla bych tímto poděkovat vedoucímu své bakalářské práce Ing. Michalu Mihokovi, PhD. a Ing. Haně Šulcerové, Ph.D. za jejich odborné vedení, cenné rady, připomínky a komentáře v průběhu psaní mé práce a také za čas, který mi věnovali během konzultací. Dále pak MVDr. Nicole Březinové za pomoc při vyhledání potřebných literárních zdrojů.

ABSTRAKT Tato bakalářská práce se zabývá problematikou polyfosfátů (fosforečnanů) používaných v technologii masné výroby a jejich účinky na organismus člověka. První část práce je zaměřena na historii a postupný vývoj využívání polyfosfátů v masném průmyslu. Je zde vysvětleno, co jsou polyfosfáty, jaké jsou jejich vlastnosti a jaké funkce plní v potravinářství, zejména v masné výrobě. Ve druhé, hlavní části jsou popsány vlastnosti jednotlivých polyfosfátů, jejich charakteristika a účely, k jakým jsou v masném průmyslu využívány. V poslední části jsou popsány metody stanovení fosforečnanů v masných výrobcích, které nám pomáhají kontrolovat hladinu fosfátů ve finálních výrobcích. Klíčová slova: polyfosfát, fosforečnan, fosfát, přídatné látky, vlastnosti, fosfor, masné výrobky. ABSTRACT This Bachelor thesis deals with the issue of polyphosphates (phosphates) used in the technology of meat production and with their impacts on human organism. The first part of the thesis focuses on history and gradual development in use of polyphosphates in the meat-processing indusrty. It explains what the polyphosphates and their qualities are and what functions they perform in the food processing industry, meat production in particular. The second part, the main one, describes properties of individual polyphosphates, their characteristics and purposes of their use in the meat-processing industry. The last one cover the methods of determination of phosphates in meat products, which help us control the level of these substances in final products. Key words: polyphosphate, phosphate, additive substances, properties, phosphorus, meat products.

OBSAH 1 ÚVOD... 8 2 CÍL PRÁCE... 9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 10 3.1 Historie a důvody používání polyfosfátů v masném průmyslu... 10 3.2 Polyfosfáty... 11 3.2.1 Vlastnosti foforečnanů a jejich využití v potravinářství... 12 3.2.2 Vaznost masa... 15 3.2.2.1 Vliv polyfosfátů na vlastnosti masa... 16 3.2.3 Antimikrobiální působení fosforečnanů... 17 3.3 Stabilizátory na bázi kyseliny fosforečné... 18 3.3.1 Rozdělení fosforečnanů podle zbytku kyseliny fosforečné... 18 3.3.1.1 Difosforečnany... 18 3.3.1.2 Trifosforečnany a polyfosforečnany... 18 3.3.1.3 Trifosforečnany... 20 3.3.1.4 Polyfosforečnany... 21 3.4 Označování přídatných látek... 22 3.5 Fosfor v těle a jeho působení na lidské zdraví... 23 3.5.1 Přirozený obsah fosforu v mase... 24 3.6 Zastoupení fosforečnanů v potravinách a masných výrobcích... 24 3.6.1 Přehled jedn. fosforečnanů, které se nachází v masných výrobcích... 26 3.6.1.1 Dihydrohenfosforečnan sodný... 27 3.6.1.2 Hydrogenfosforečnan sodný... 27 3.6.1.3 Pyrofosforečnan sodný... 28 3.6.1.4 Trifosforečnan sodný... 28 3.6.1.5 Hexametafosforečnan sodný... 29 3.6.1.6 Kyselý pyrofosforečnan sodný... 29 6

3.6.1.7 Hydrogenfosforečnan draselný... 30 3.6.1.8 Pyrofosforečnan draselný... 30 3.6.1.9 Dihydrogenfosforečnan draselný... 31 3.6.1.10 Tripolyfosforečnan draselný... 31 3.7 Metody stanovení fosfátů a poylfosfátů... 32 3.7.1 Klasické metody... 32 3.7.2 Elektromigrační metody... 33 3.7.3 Chromatografické metody... 33 3.7.3.1 Stanovení polyfosfátů metodou kruhové chromatografie... 34 4 ZÁVĚR... 37 5 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 38 6 SEZNAM OBRÁZKŮ... 43 7

1 ÚVOD Maso je bezpochyby jednou z nejzákladnějších potravin, která je konzumována již po staletí. Ovšem od dob, kdy byla jediným konzervačním a dochucovacím prostředkem sůl, se mnohé změnilo. Postupně se pro zlepšení chuti, textury, barvy a jiných vlastností začalo používat čím dál více bylin, koření a jejich směsí. Tyto látky se časem začaly začleňovat do určitých skupin a jednotlivé látky získávaly svá označení, která jsou v potravinářském průmyslu využívána i dnes. Lidé si zvykali na tyto látky, které různým způsobem vylepšovaly senzorické a technologické vlastnosti masných výrobků a záměrně je do masných výrobků přidávali. Proto také v dnešní době nesou název přídatné látky neboli aditiva. Všechna jsou označována specifickým způsobem a je kontrolován jejich obsah v masných výrobcích. Tato kontrola je stanovena legislativou. V České republice se touto problematikou zabývá Národní referenční laboratoř pro aditiva v potravinách při Státním zdravotnickém ústavu (SZÚ). Státní zemědělská a potravinářská inspekce (potraviny rostlinného původu) a Státní veterinární správa ČR (potraviny živočišného původu) jsou pověřeny kontrolou dodržování českých a evropských předpisů pro používání přídatných látek. Každá látka schválená těmito úřady prochází přísnými testy na zdravotní nezávadnost. V masném průmyslu jsou aditiva velmi žádána a na trhu je celá škála přídatných látek. Díky tomu máme možnost vyrábět široké spektrum masných výrobků, které se v některých případech liší pouze poměrem látek, recepturou nebo technologickým postupem při zpracování masa. V současné době je využívání aditivních látek v masném průmyslu velice žádoucí a předpokládá se, že v budoucnu se bude stále zvyšovat. Jednou z takto využívaných skupin látek jsou i polyfosfáty, které se používají do masných výrobků především, proto, že aktivují svalové bílkoviny a tím zvyšují vaznost masa a také snižují ztrátu vody varem. Kromě těchto vlastností mají i jiné velmi důležité schopnosti, které ve výsledku pozitivně ovlivňují finální masný výrobek. 8

2 CÍL PRÁCE Cílem mé bakalářské práce bylo nalézt a prostudovat dostupnou literaturu a seznámit se s problematikou týkající se přídatných látek používaných v technologii masné výroby, konkrétně polyfosfátů. Dalším cílem bylo vypsání jednotlivých druhů fosforečnanů, jejich charakteristika a popsání vlivu těchto látek na senzorické a technologické vlastnosti masných výrobků. Následně byly do práce uvedeny příklady stanovení přidaných polyfosfátů v masných výrobcích a postup konkrétní metody. 9

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Historie a důvody používání polyfosfátů v masném průmyslu Na počátku 20. století nastala změna podmínek průmyslového chovu jatečných zvířat a byly zavedeny nové chovné metody. Zvířata reagují v těchto podmínkách citlivěji na stres, čímž se přírodní fosfát ATP (adenosintrifosfát) předčasně odbourává. Funkce ATP jako stabilizátoru vaznosti vody v mase tedy tímto končí. Tato skutečnost a později, v padesátých letech, rozvoj průmyslové výroby potravin postupně dovedla výrobce k používání minerálních potravinářských fosforečnanů jako náhrady za přírodní fosfát ATP. Ve své době to byl jeden z významných kroků ve změně potravinářských technologií, který se projevil zejména využíváním fosforečnanů u masných výrobků. Nastala éra používání aditiv ve formě směsí. Zpočátku se takovéto řešení úbytku technologicky ztracené vody z masa jevilo jako výhodné i proto, že v závislosti na složení fosforečnanů mají přidaná aditiva pozitivní vliv na stabilitu ph, barvy a také bakteriologické a antioxidační vlastnosti masného výrobku. Toto byly původní důvody, které vedly výrobce k používání minerálních potravinářských fosforečnanů, jako náhrady za přírodní fosfát ATP. Postupem času se však objevily problémy z pohledu zdravotnického: čistota základních surovin, ze kterých se fosforečnany vyrábí, spolupůsobení fosforečnanů s vápníkem v dětské výživě, kdy se tvorbou nerozpustného komplexu chelátového fosforečnanu vápník v dětském organismu nevyužije, postupné zneužívání fosforečnanů falšování masných výrobků záměrným vyvazováním vody pomocí použitých fosforečnanů. Vnímání fosforečnanů v masném průmyslu, můžeme tedy v horizontu posledních dvaceti let rozdělit do tří pohledů. Zpočátku byly vnímány jako pozitivum, protože se jejich využíváním řešil úbytek vody z masa. Současně, za použití přesně zvolené směsi fosforečnanů, bylo dosahováno pozitivního vlivu na technologické vlastnosti masného výrobku, tedy na stabilitu hodnoty ph, přiměřenou vaznost vody, barvu, bakteriologické vlastnosti a antioxidační vlastnosti. Dále se zajistilo zlepšení senzorické kvality, konzistence, šťavnatosti a vzhledu na řezu (textura, struktura). Přídavek polyfosfátů měl i přímý technologický dopad na zvýšenou rozpustnost bílkovin, zlepšení vazby vody 10

a tuku v salámovém díle, snížení ztrát při tepelném opracování a antioxidační účinek na dílo. Později byly vnímány částečně jako negativum, protože byly zjištěny problémové účinky používání fosforečnanů z pohledu zdravotního a výživového, přičemž na toto téma bylo vypracováno množství studií a připomínek odborníků z oblasti a výživy. Dnes je nezanedbatelným faktem falšování výrobků úmyslným navázáním vody s využitím vlastností fosforečnanů. Protože vnímání využití polyfosfátů jak z pohledu spotřebitelů, tak zejména z pohledu výrobců potravin se liší, odpovědné státní orgány průběžně monitorují jejich obsah zejména v masných výrobcích. (Fašiangová a kol., 1987). Podrobné požadavky na používání přídatných látek stanoví vyhláška č. 304/2004 ve znění vyhlášky č. 152/2005 Sb., vyhlášky č. 431/2005 Sb. a její poslední úprava č. 4/2008 Sb. Potravinářské přídatné látky mohou být použity při výrobě potravin pouze tehdy, je-li to nezbytně nutné z technologických důvodů. 3.2 Polyfosfáty Souhrnným názvem polyfosfáty, přičemž dalším používaným názvem jsou fosforečnany, označujeme soli, které jsou odvozeny od kyseliny trigydrogenfosforečné (H 3 PO 4 ). Obrázek 1: Kyselina fosforečná (Zdroj: http://www.restauro-online.com/phosphoricacid-85-pure-h3po4) Tyto soli tvoří skupinu sloučenin, jejímž společným znakem je to, že obsahují anion (PO 4 ) 3-. Soli kyseliny fosforečné mající pouze jednu skupinu (PO 4 ) 3- nazýváme orthofosforečnany. Při vysoké teplotě může dojít k odpařování vody dvěma sousedními hydroxylovými skupinami dvou různých orthofosforečnanů a k jejich kondenzaci. Vzniká nám tedy polymer. Pyrofosforečnan je dimer, vzniklý ze dvou monomerů. Vedle samotných orthofosforečnanů se polymerace mohou zúčastnit také delší řetězce fosforečnanů, a tím vznikají polymery s více než dvěma fosfory uvnitř molekuly (polyfosforečnany). Jelikož každá skupina (PO 4 ) 3- může sdílet až tři své atomy kyslíku s dalšími třemi (PO 4 ) 3- skupinami, může dojít jak ke vzniku lineárních řetězců 11

polyfosforečnanů, tak k tvorbě tzv. třídimenzionálních struktur (ultrafosforečnany) nebo uzavřených cyklů (metafosforečnany). (Molins, 1991) Polyfosfáty neboli deriváty kyseliny fosforečné jsou řazeny mezi přídatné látky zvané aditiva, která mohou být přidávána do potravin za účelem zlepšení jejich technologických vlastností dle nařízení ES č. 1333/2008. Polyfosfáty se do potravin přidávají zejména kvůli jejich účinku na bílkoviny svalových vláken zvířat. Díky těmto aditivům jsme schopni zvýšit rozpustnost myofibrilárních bílkovin, které zajišťují vaznost vody. Tato schopnost je užitečná při obnovování ztrát vlhkosti z masa např. při zpracování zmražených a rozmražených masných výrobků a ryb. (Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2014) V podmínkách rozvinuté tržní ekonomiky je na výrobce vyvíjen tlak s cílem maximálně snížit cenu, za kterou jsou schopni masné výrobky produkovat, aby bylo možno nabídnout co nejnižší cenu spotřebitelům. Je proto potřeba si uvědomit, že bez použití daných aditiv a nezbytných ingrediencí na posílení stabilizace díla mělněných masných výrobků se dnešní masný průmysl neobejde. Stabilizací díla pomocí přidaných plyfosfátů můžeme významně přispět ke standardizaci jakosti finálních masných výrobků. Mezi ingredience řadíme z hlediska legislativy látky či suroviny, které jsou samy o sobě potravinou a běžně jsou součástí daného výrobku. Jako aditiva nebo přídatné látky jsou označovány takové látky, které jsou povoleny a schváleny a přidávají se do potravin za konkrétním technologickým účelem. Přídatné látky jsou označovány písmenem E a trojicí čísel, přičemž takové označení je mezinárodně uznáváno. Byl vypracován a zaveden do praxe důmyslný a promyšlený kontrolní, bezpečnostní a hygienický systém založený právě na používání E-čísel. V současné společnosti, která se stále více zajímá o původ a kvalitu potravin je trendem vyžadovat potraviny s co nejnižším množstvím přídatných látek. Různými pseudoodborníky a internetem poučení spotřebitelé tedy studují složení potravin a žádají takové potraviny, které mají co nejnižší počet E-čísel uvedených na obalu, protože se často mylně domnívají, že veškeré látky označené E-číslem jsou zdraví škodlivé. V ojedinělých případech tak může dojít k poškození poctivých výrobců, kteří dodržují stanovené legislativní předpisy a technologické postupy. (Budig a kol., 2007) 3.2.1 Vlastnosti fosforečnanů a jejich využití v potravinářství Polyfosfáty neumí samy o sobě vázat vodu. Zásadní vliv však mají na aktivaci myofibrilárních bílkovin, které poté váží vodu lépe a celkově také přispívají 12

ke stabilizaci hotových masných výrobků. Základní principy funkčnosti polyfosfátů můžeme shrnout do následujících bodů: Úprava ph mluvíme o schopnosti ph zvyšovat efekt s pozitivním dopadem na vaznost vody a dále zvyšovat výtěžnost finálních masných výrobků a také o schopnosti ph naopak snižovat efekt s pozitivním účinkem na barvu finálních výrobků (pomocí kyseliny pyrofosforečné), maso a masné výrobky jsou charakteristické téměř výhradně alkalickým prostředím, ph ve vnitřním prostředí masných výrobků roste při aplikaci do mírně kyselého prostředí, kyselejší prostředí též zvyšuje schopnost proteinů vázat vodu, zvýšení ph také způsobuje posun od izoelektrického bodu a nárůst elektrostatických sil, (Budig a kol., 2007) Substituce ATP (chelátový) chapadlový efekt je způsoben tzv. vyvázáním především Ca 2+ iontů v rozkládající (disperzní) soustavě salámového díla a následný rozklad (disociace) příčných chemických vazeb ve stavbě svalové tkáně. V zásadě dojde k výraznému zvýšení vodovaznosti a zlepšení stabilizačních a emulgačních schopností, (Budig a kol., 2007) Kovové ionty a jejich štěpení proběhne navázání iontů Ca2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+ v mase a vytvoří se komplexní sloučeniny, zvýšení vaznosti masa a masných výrobků je umožněno odštěpováním a následným navazováním kovových iontů, zachovávají měkkou konzistenci masa a masných výrobků, udržují stabilní barvu, Změna polarity prostředí fosforečnany jsou polyelektrolyty, polyelektrolyty jsou schopné měnit distribuci různě nabitých iontů, přídavek fosfátů zvyšuje iontovou sílu, Rozpustnost rozpustnost jednotlivých fosfátů je rozdílná, 13

většina fosfátů je těžko rozpustná ve slaných roztocích, difosfáty jsou považovány za nejvíce funkční fosfáty, Bakteriostatický účinek růst některých druhů grampozitivních bakterií se zpomaluje, u grampozitivních bakterií, které tvoří spóry, vykazují fosforečnany inhibiční účinek na jejich klíčení, oproti tomu účiny na růst plísní jsou minimální, (Suárez a kol., 2005) Antioxidační efekt ten zajišťuje stabilizaci díla a také hotového výrobku proti nežádoucím oxidačním přeměnám v průběhu doby skladování a spotřeby. (Budig a kol., 2007) Fosforečnany redukují nepříznivý dopad snížené hladiny soli na masné výrobky a bez nutnosti zvýšit hladinu sodíku zlepšují senzorické a technologické vlastnosti masa. Na snížení bakteriálních kolonií v masných výrobcích mají vliv fosfáty, které zlepšují texturní vlastnosti, jako jsou žvýkatelnost, gumovitou, přilnavost, tvrdost a pevnost. Fosfáty také podporují stabilizaci senzorických vlastností, barvy a chuti v masných výrobcích. (Ünal a kol., 2004) Deriváty kyseliny fosforečné tzv. fosforečnany obsažené v potravinách významně ovlivňují především vlastnosti myofibrilárních proteinů, a to tím, že upravují podmínky v prostředí (změna ph, odštěpení kationů, změna iontové síly roztoku apod.). Polyfosfáty uplatňují své schopnosti také pomocí chemických reakcí, při kterých se fosforečnany naváží na daný protein a tak změní jeho vlastnosti jako např. schopnost hydratace, tvorby gelu, bobtnání apod. Fosforečnany mají také schopnost navázat na sebe z okolního prostředí monovalentní a polyvalentní kationy kovů. Tato schopnost závisí u fosforečnanů na celé řadě různých faktorů například: konkrétní kation kovu fosforečnany nemají tak vysokou afinitu ke kovům alkalické povahy jako ke kovům alkalických zemin. Zde je nutno zdůraznit, že i v rámci jednotlivých skupin kationů se objevují rozdíly (např. sodík bude přitahován silněji než draslík), počet monomerů v molekule pokud stoupá počet fosforečných atomů uvnitř molekuly, navenek se to projeví větší afinitou ke kationům, teplota - ve chvíli, kdy vzroste teplota, zvýší se i schopnost vazby kationů. 14

Další z velmi důležitých vlastností fosforečnanů je i stabilizace ph k okolním vlivům, neboli pufrovací schopnost. Molins (1991) uvádí, že s rostoucí délkou lineárního řetězce fosforečnanů dochází ke snižování jejich pufrovací kapacity. Jedinečnou a velmi důležitou vlastností fosforečnanů je působit na tvorbu gelu. Jednotlivé fosforečnany se ale v této vlastnosti velmi liší. Kupříkladu lineární polyfosforečnany mají v molekule značný počet atomů fosforu, a proto jsou označovány spíše za inhibitory tvorby gelu. Naopak nízkomolekulární polyfosforečnany velmi přispívají k zesítění matrice gelu. Nejvíce tuto schopnost vykazují dimery a trimetry fosforečnanů. (Awad a kol., 2002, Mizuno a Lucey, 2005) Jak bylo výše uvedeno, polyfosfáty mají značný vliv na zadržování vody v masných výrobcích, a díky tomu se při tepelném opracování zamezuje hmotnostním ztrátám. Podobně jako tavící soli v tavených sýrech, mají polyfosfáty ve vyšších dávkách značný účinek na vylučování vápníku z těla ven. Díky jejich schopnosti rozkládat myofibrilární bílkoviny a vázat na ně vodu, můžeme tvrdit, že do určité míry je kvalita masných výrobků ovlivněna množstvím bílkovin ve svalovině. Občas je ale potřeba jejich obsah v masných výrobcích zvýšit, a proto bylo rozhodnuto o vhodném řešení. Bílkoviny se do masa přidávají. Nejčastěji je použito živočišných zdrojů, používají se ale i zdroje rostlinné jako pšenice, sója, hrách, rýže nebo lupina. Dodáním živočišných nebo rostlinných proteinů do masa se jejich obsah postupně zvyšuje. To ve výsledku znamená, že se zvýší i přídavek polyfosfátů a tudíž i vaznost masa. (Budig a kol., 2007) 3.2.2 Vaznost masa Vaznost masa může být ovlivňována různými faktory. Především je to složení masa, stupeň jeho rozmělnění, stupeň zralosti masa, obsah rozpustných myofibrilárních bílkovin, teplota, ph, množství solí nebo intravitální vlivy (pohlaví, věk, ustájení zvířete). Tyto faktory je možno více či méně ovlivnit s cílem dosažení požadované vodovaznosti. Dále lze vaznost masa ovlivnit také množstvím jiných přídatných látek, které jsou v masné výrobě běžně používány. Těmi myslíme přísady, jež jsou samy schopny vázat vodu například škrobnaté látky (mouka) nebo bílkovinné látky a přísady používané díky vlastnosti rozpouštět svalové bílkoviny (polyfosfáty). (Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2014) 15

3.2.2.1 Vliv polyfosfátů na vlastnosti masa Hlavním úkolem polyfosfátů je dosáhnout lepší vaznosti a tím snížit hmotnostní ztráty při tepelném zpracování. Využívají se však i díky dalším pozitivním účinkům na jakost masných výrobků. Zvyšují šťavnatost a křehkost masa, zlepšují jeho chuť díky tomu, že zabraňují vytékání šťávy, která obsahuje extraktivní látky. Dále umožňují zpomalit oxidaci tuků a snížit viskozitu mělněného masa, což vede ke snížení mechanické práce při míchání. Úspěšně také oslabují tepelnou odolnost mikrobů. Díky těmto vlastnostem se bílkoviny udržují v rozpustném stavu a zlepšuje se emulgace lipidů. Negativní dopad se ale projevuje na vybarvení výrobku kvůli zvýšenému ph. Dihydrogendifosfát disodný však maso naopak okyseluje, a tím ovlivňuje rychlost vybarvení. Účinek polyfosfátů je spojen také s vazbou vápenatých (Ca 2+ ) iontů (souhrnně vícemocných kationů kovů), přičemž dochází k tzv. disociaci příčných vazeb uvnitř struktury svalových vláken. Dojde k uvolnění pevné vazby mezi aktinem a myosinem a jednotlivá filamenta se od sebe mohou oddalovat. Takto narůstá podíl imobilizované vody neboli vaznost. Vaznost se zvyšuje také díky ph, které polyfosfáty zvyšují až do oblasti vzdálené od izoelektrického bodu. Tím, že do masa přidáme polyfosfáty, můžeme dosáhnout stejné vaznosti jaká je v teplém mase. Na polyfosfáty se váží také některé stopové prvky, jež jsou katalyzátory oxidace, z toho důvodu je jejich účinek antioxidační. Polyfosfáty se používají v rozličných fázích výroby a podle toho se zvolí vhodný derivát. Difosfát tetrasodný je používán nejčastěji. Dále pak trifosfát, tetrafosfát a dihydrogendifosfát, hexametafosfát sodný a jiné. Jednotlivé fosfáty mají vliv na disociaci aktinomyosinu. Zatímco difosfáty vyvolávají tento rozklad přímo, trifosfáty a více kondenzovabé fosfáty až poté, kdy se rozloží na difosfát. Polyfosfáty jsou hydrolyzovány fosfatázami, které jsou obsaženy v tepelně neopracovaném mase nebo i působením tepla. Během takovéto enzymové degradace se tripolyfosfáty degradují na orthofosfáty v průběhu kratší doby, než bude dosaženo teploty, jež inaktivuje tripolyfosfatázu. Jako meziprodukt zde vznikají pyrofosfáty. V tepelně opracovaných masných výrobcích jsou tedy obsaženy pouze orthofosfáty. Rezidua polyfosfátů mohou v lidském těle působit nepříznivě. Jejich účinky mohou v organismu konzumenta vyvazovat vápenaté i jiné ionty, a tím ochuzovat lidský organismus o vápník. Proto je jejich přídavek do masných výrobků z hygienického hlediska omezován. V některých zemích jsou polyfosfáty jako přídatné látky do masných výrobků zcela zakázány nebo jako např. u nás je jejich používání 16

definováno v legislativních normách, které jsou v souladu s legislativou Evropské unie. (Pipek 1998) V rámci Evropské unie se stanovením limitů přídatných látek zabývá Směrnice evropského parlamentu a rady číslo 95/2, podle níž je nejvyšší povolené množství fosforečnanů přidaných do masných výrobků 5g/kg, označuje se jako P2O5. Běžně se u tepelně opracovaných masných výrobků používá dávkování v rozpětí 2-3g/kg masa a tuku. (Směrnice 95/2/ES EU, 1995) 3.2.3 Antimikrobiální působení fosforečnanů Antimikrobiální působení fosforečnanů na mikroorganismy je prokázáno především u grampozitivních bakterií, některých kvasinek a mikromycet. (Loessner a kol., 1997, Suarez a kol., 2005, 2007) V dostupné literatuře se s popisem účinků polyfosfátů na gramnegativní bakterie setkáváme pouze ojediněle. Ovšem inhibiční efekt byl v laboratorních podmínkách zjištěn na bakterii Aeromonas hydrophila. (Velazquez a kol., 2001). Tento inhibiční účinek je u grampozitivních bakterií závislý hlavně na tzv. kondenzačním stupni neboli délce řetězce fosforečnanů. Na délce tohoto řetězce záleží proto, že fosforečnany, které mají delší řetězce, mívají lepší inhibiční efekt než řetězce s kratšími řetězci. Na tento inhibiční účinek má vliv také teplota prostředí, přídavek iontů kovů, prvotní populace mikroorganismů nebo ph prostředí, které je více citlivé při hodnotě ph vyšší než 7,4. (Jen a Shelf, 1986, Lee a kol., 1994) Základním principem působení polyfosfátů s dlouhými řetězci je v první řadě chelatace divalentních iontů Ca 2+ a Mg 2+, jež je důležitá pro udržení celistvosti buněčné stěny grampozitivních bakterií. Toho se docílí tím, že se vytvoří příčné můstky mezi jednotlivými molekulami teichoových kyselin v buněčné stěně. (Lee a kol., 1994) Vedle zkoumání vlivu polyfosforečnanů na různé mikroorganismy ve specializovaných laboratořích byly také sledovány jejich účinky, které mají fosforečnany na mikroorganismy v reálných potravinách. (Molins a kol. 1985) uveřejnili fakt, že přídavek polyfosfátů má vliv na bakterie rodu Clostridium sporogenes a dokáže snížit jejich počet ve skladovaných masných výrobcích. (Suarez a kol. 2005) sledovali inhibiční účinky běžně používaných fosforečnanů na mikromycety získané z prostředí potravinářských provozů a zjistili, že mikromycety mají citlivost k fosforečnanům druhově různou a je taktéž odlišná podle délky polyfosforečnanového řetězce. Bylo zjištěno, že přídavkem fosforečnanů do masných výrobků, lze zpomalit nebo zcela zamezit růstu nežádoucích bakterií, které tvoří spory. Jde především o bakterie rodu 17

Clostridium botulinum, které jsou většinou příčinou kažení potravin a masných výrobků tvorbou kyseliny máselné, plynu nebo produkcí toxinů. (Borch a Lycken, 2007, Briozzo a kol., 1983, Eckner a kol., 1994, Loessner a kol., 1997; Varga, 2005) 3.3 Stabilizátory na bázi derivátů kyseliny fosforečné Jedná se o skupinu stabilizátorů, která má v masné technologii zásadní roli. Působí na dvě důležité svalové bílkoviny, aktin a myosin, takovým způsobem, že disociuje aktomyosinový komplex, podobně jako energetická látka buňky ATP (adenosintrifosfát). Aktomyosinový komplex vzniká spojením aktinu a myosinu, a to při svalové kontrakci nebo při posmrtných pochodech. Skupinu látek odvozených od kyseliny fosforečné (E 338, E 339, E 340, E 341, E 343, E 450, E 451 a E 452) je povoleno podle vyhlášky č. 4/2008 Sb. přidávat do potravin až do nejvyššího přípustného množství vyjádřeného jako P 2 O 5. Svalová bílkovina přirozeně obsahuje určité množství fosforečnanů. Pro zjištění množství přidaného fosfátu do masného výrobku, vypočítáváme obsah přirozeného P 2 O 5 podle obsahu bílkovin. Vysoké dávky fosfátu mohou narušit rovnováhu mezi vápníkem a fosforem v těle v neprospěch vápníku. Při sledování stavu pokusných zvířat byly zjištěny nežádoucí účinky způsobené podáváním vysokých dávek difosforečnanů, které souvisely právě s nevyváženým příjmem fosforu a vápníku. Nicméně v malých dávkách jsou difosforečnany považovány za bezpečné látky. V roztoku i v mase se difosforečnany, trifosforečnany a polyfosforečnany postupně disociují na monofosforečnany. (Střelcová a kol., 2009) 3.3.1 Rozdělení fosforečnanů podle zbytku kyseliny fosforečné 3.3.1.1 Difosforečnany E450 Charakteristika: Pod označení E450 mohou spadat následující sloučeniny: difosforečnan disodný, difosforečnan trisodný, difosforečnan tetrasodný, difosforečnan didraselný, difosforečnan tetradraselný, difosforečnan divápenatý (dříve E540), dihydrogendifosforečnan vápenatý. 18

V potravinách mají obdobné účinky, lze je proto souhrnně označit jako difosforečnany. Z hlediska použití v potravinách nenajdeme velké rozdíly mezi jednotlivými difosforečnany, proto výrobci často neuvádějí, o jakou sloučeninu přesně jde, ale uvádějí pouze kód E 450. Mezi difosforečnany sodnými a draselnými není velký rozdíl ani z hlediska funkčnosti v masných výrobcích co se týká rozpustnosti. Difosforečnany sodné a draselné jsou považovány za nejúčinnější aktivátory masných bílkovin. Oproti tomu vápenaté difosforečnany jsou ve vodě nerozpustné, proto se cíleně do masných výrobků nepřidávají. Užívají se jako protispékavá látka. (Střelcová a kol., 2009) Difosforečnany se v těle se rozkládají na fosforečnany a představují tak zdroj fosforu. Mají schopnost zadržovat a vázat vytékající masnou šťávu při výrobě masných výrobků, například šunky a také zabraňovat nežádoucím reakcím přítomných kovů. V malých dávkách jsou difosforečnany považovány za bezpečné látky. Dihydrogendifosforečnan sodný lze v omezeném množství použít do potravin pro děti jako součást kypřícího prostředku. V USA jsou difosforečnany rovněž povoleny. Vysoké dávky jsou nepříznivé pro organismus. Nežádoucí účinky způsobené podáváním vysokých dávek difosforečnanů pokusným zvířatům souvisely s nevyváženým příjmem fosforu a vápníku. (Vrbová, 2011) Výroba: Jednotlivé výše uvedené difosforečnany lze připravit přesně stanovenou specifickou reakcí, za použití kyseliny fosforečné. Použití: Jejich schopnosti zahrnují bránění nežádoucím reakcím přítomných kovů a vázání šťáv při výrobě masných výrobků. Lze je proto nalézt v uzeninách a produktech masné výroby. Kromě využití v masných výrobcích se difosforečnany používají jako regulátory kyselosti, emulgátory, stabilizátory, kypřící látky a tavící soli v tavených sýrech a mají využití i v pekařských výrobcích nebo práškových směsích pro výrobu čokoládových nápojů. Nežádoucí účinky: Opět zde při nadměrných dávkách hrozí riziko nepoměru vápníku a fosforu, čímž dochází ke zdravotním obtížím. 3.3.1.2 Trifosforečnany (E 451) a polyfosforečnany (E 452) Jsou používány, protože mají schopnost vázat kationy Ca2+ v masných výrobcích, a tím umožňují disociaci aktomyosinového komplexu. Nejčastěji 19

se používají v kombinaci s difosforečnany, případně s dalšími fosforečnany v kutrovacích nebo nastřikovacích směsích fosfátů. Fosforečnany draselné (E 340 orthofosforečnany nebo monofosforečnany) a fosforečnany sodné (E 339) se používají jako regulátory kyselosti a také zabraňují nežádoucím reakcím kovů, které jsou ve stopových množstvích přítomny v potravinách. Regulují účinnost dalších fosfátů používaných při výrobě masných výrobků tím, že upravují ph. Fosforečnany vápenaté (E 341) zabraňují nežádoucím reakcím kovů přítomných v potravinách a účinkují jako stabilizátory, kypřící a protispékavé látky (např. protispékavá látka ve směsi koření). Používají se například v pekařských výrobcích, zavařeninách, desertech, soli, koření, živočišných tucích a v želé. Nebyly prokázány žádné nežádoucí účinky, fosforečnany vápenaté se tedy považují za bezpečná aditiva. Podle platných zákonných norem se v České republice fosforečnany vápenaté mohou používat při výrobě potravin pouze v dávkování nezbytně nutném pro dosažení požadovaného technologického efektu. Fosforečnany vápenaté lze rovněž používat při výrobě dětských pokrmů. (Střelcová a kol., 2009). 3.3.1.3 Trifosforečnany - E451 Pod označení E451 mohou spadat následující sloučeniny: trifosorečnan pentasodný ( trifosforečnan sodný) trifosforečnan pentadraselný (trifosforečnan draselný) Charakteristika: Trifosforečnany mají podobně jako difosforečnany schopnost vázat a udržovat vodu, proto se nejčastěji používají v masných výrobcích. Dále jsou využívány jako regulátory kyselosti nebo tlumivé roztoky rozpustné ve vodě. Další využívanou vlastností trifosforečnanu sodného je jeho schopnost zabraňovat nežádoucím reakcím přítomných kovů. Trifosforečnany tvoří pro lidské tělo zdroj fosforu a v organismu se rozkládají na fosforečnany. Nejrozšířenější a nejčastěji vyráběný je trifosforečnan sodný. Trifosforečnany jsou povolenou přídatnou látkou jak v České republice, tak ve Spojených státech amerických (USA). Trifosforečnan sodný je označen jako látka GRAS (Generally Recognized as Safe). Jedná se o frázi používanou v USA úřadem FDA (Food and Drug Administration) která znamená, že je látka experty všeobecně považována za bezpečnou. Látky označené GRAS jsou vyňaty z obvyklých požadavků zákona FFDCA (Federal Food, Drug, and Cosmetic Act) na potravinářská aditiva. 20

Výroba: Trifosforečnan sodný se vyrábí dvěma způsoby a to kalcinací směsi hydrogen- a dihydrogenfosforečnanu sodného a dále reakcí hydroxidu sodného nebo draselného s kyselinou tri-polyfosforečnou. Použití: Trifosforečnany se nejčastěji přidávají do masných výrobků, pro svou schopnost vázat a udržovat v nich vodu. Můžeme jé nalézt též v cukrovinkách, majonézách, salátových zálivkách nebo sladových výtažcích. Mimo potravinářskou výrobu se používají například pracích prostředcích nebo v detergentech. Nežádoucí účinky: V malých dávkách jsou trifosforečnany považovány za látky pro lidské tělo bezpečné, ve vyšších dávkách mohou však způsobit nerovnováhu mezi fosforem a vápníkem, tedy nedostatek vápníku. 3.3.1.4 Polyfosforečnany (sodný, draselný a vápenatý ) - E452 Mezi polyfosforečnany (někdy též metafosforečnany) zahrnované pod označení E452 patří: polyfosforečnan sodný (zvaný Grahamova či Madrellova sůl), polyfosforečnan draselný (Kurrolova sůl), polyfosforečnan sodnovápenatý, polyfosforečnan vápenatý. Charakteristika: Povrchovou konzervaci masa lze provést jak obyčejnou kuchyňskou solí, tak i pomocí polyfosforečnanů, které však mají tu výhodu, že maso žádným způsobem neochucují. V České republice, stejně jako v USA, jsou polyfosforečnany povolenou přídatnou látkou. Stejně jako u výše zmíněných látek může nadměrné požívání polyfosforečnanů způsobit nerovnováhu mezi vápníkem a fosforem. Výroba: Volně v přírodě se ložiska Grahamovy soli vyskytují běžně pod povrchem země, synteticky je však možné polyfosforečnany vyrobit rekrystalizací nasycených vodných roztoků. Použití: Polyfosforečnany se přidávají hlavně do masných výrobků a ryb, díky jejich schopnosti vázat a udržovat v nich vodu a také zabraňovat nežádoucím reakcím 21

obsažených kovů. Uplatňují se i jako tavící soli v tavených sýrech a využívají se jako živná půda pro růst kvasinek. Používají se také při výrobě smetan v prášku nebo šlehačkách ve spreji. (Zdravá potravina, 2014) Nežádoucí účinky: Jako u ostatních fosforečnanů je zde při vysokých dávkách možné riziko nerovnováhy mezi ionty fosforu a vápníku či hořčíku. 3.4 Označování přídatných látek Seznam povolených přídatných látek a příslušných E kódů používaných v České republice je uveden ve vyhlášce Ministerstva zdravotnictví ČR č. 4/2008 Sb., ze 3. ledna 2008, kterou se stanoví druhy a podmínky použití přídatných látek a extrakčních rozpouštědel při výrobě potravin a v přílohách II a III nařízení (ES) č. 1333/2008 o potravinářských přídatných látkách. (Vyhláška č. 4/2008). Na obalu každé potraviny, která je v na českém trhu k dispozici, musí být uveden seznam přídatných látek použitých při výrobě. U potravin, které jsou prodávány bez originálního obalu, například na váhu nebo na kusy, musí být tato informace dostupná u prodejce, výrobce je tedy také nucen tyto informace uvádět. Přítomnost přídatné látky udává uvedením názvu nebo číselného kódu E, složeného z písmena E a trojmístného čísla. Trojmístné číslo definuje kategorii, do níž přídatná látka patří. Jsou definovány následující kategorie: želírující látky, modifikovaný škrob, antioxidanty, konzervanty, kyseliny, regulátory kyselosti, tavící soli, kypřící látky, barviva, protispékavé látky, náhradní sladidla, látky zvýrazňující chuť nebo aroma, zahušťovadla, stabilizátory, emulgátory, odpěňovače, látky zlepšující mouku a leštící látky. Název příslušné kategorie musí být uveden vždy spolu s názvem přídatné látky nebo kódu E. Existují přídatné látky, které podle účelu použití patří do několika kategorií, uvádí se však pouze název kategorie odpovídající účelu, pro nějž je látka v potravině použita. Jsou-li známy nepříznivé účinky použitých přídatných látek na lidské zdraví, má výrobce povinnost tuto skutečnost na obalu vyznačit. E číslo je označení, pro identifikaci přídatné látky, která nese mezinárodní uzanci a tento kód je úplně stejný jako jinde ve světě. Podobné číselné uspořádání má Evropská unie i INS Kodex Alimentarius, který vychází ze systému EU. (Babička, 2012) 22

3.5 Fosfor v těle a jeho působení na lidské zdraví Polyfosfáty se používají v potravinářském průmyslu již několik desetiletí, a to nejen v České republice, ale také ve světě. Přidáváním polyfosfátů, tedy derivátů kyseliny fosforečné se zvyšuje obsah fosforu nad jeho přirozenou hladinu. Veškeré přídatné látky, které jsou používány v potravinářském průmyslu, jsou zkoumány z hlediska toxikologického. V České republice jsou zákonem povolena pouze aditiva, u nichž je prokázána jejich dlouhodobá neškodnost a také technologická nevyhnutelnost. Polyfosfáty se spolu s dalšími povolenými přídavnými látkami v potravinách (kyselina fosforečná E 338, fosfáty E 339, E 340, E 341, E 343, E 451) podílejí na udržení optimálního obsahu fosforu v lidském organizmu. Kyselina fosforečná obsažená ve fosforečnanech je pro lidské tělo zdrojem fosforu. Fosfor je druhým nejdůležitějším minerálním prvkem zastoupeným v lidském těle a podílí se na řadě pro život nezbytných pochodů. Hraje významnou úlohu při stavbě kostí a zubů, podílí se na procesu využívání energie z potravin, které konzumujeme. Běžná pestrá strava zajišťuje člověku dostatečný příjem fosforu a jeho klinicky zjištěný nedostatek je poměrně raritní. Zdravotní komplikace způsobuje jak nedostatek, tak i přebytek fosforu. Větší riziko je spojeno s nadbytkem fosforu v těle a to z toho důvodu, že fosforečnany se z těla vylučují jako fosforečnan vápenatý. Přijímá-li člověk krátkodobě nadměrné dávky fosforu v potravinách po dobu krátkého období, může to způsobit trávicí potíže, například průjmy, bolesti žaludku nebo střev. Dlouhodobý zvýšený příjem fosforu může snížit schopnost těla absorbovat vápník, což může vést u člověka k rachitidám a ke větší náchylnosti ke zlomeninám, dále k usazování vápníku v tkáních a některých orgánech, což je poškozuje, také se může projevit nepravidelné dýchání, podrážděnost, nevolnost, snížení krevního tlaku. U dětí byla pozorována hyperaktivita a poruchy zažívání. Při předávkování fosforem může poklesnout krevní tlak a naopak vzrůst tělesná teplota. Fosforečnany snižují schopnost lidského těla vstřebávat železo, proto zejména vegetariáni a vegani, přijímající železo výhradně z rostlinných zdrojů musí mít tuto skutečnost na paměti. Je li strava nevyvážená ve smyslu optimálního příjmu ostatních minerálních látek, mohou být následky nadměrného příjmu fosforečnanů závažnější. (Theobald, 2005, Cerklewski, 2005, Kessenich, 2007, Takeda, 2012) Nedostatek fosforu vede zejména ke svalové slabosti a k poruchám mineralizace kostí a zubů, dále se může projevit ztuhlost a bolest kloubů, 23

nebo nespecifické příznaky jako je únava a nechutenství. Výrazný nedostatek fosforu může vyvolat chudokrevnost. (Kolda a kol., 1997, ŠVPS SR, 2006) 3.5.1 Přirozený obsah fosforu v mase Fosfor je jednou z velmi významných složek v mase a jeho obsah se průměrně pohybuje mezi 1200 až 2500 mg.kg -1. Sloučeniny fosforu jsou nezbytnou součástí procesu energetického metabolismu. Jejich zásadní funkcí je udržovat energii v podobě ATP, GTP, kreatinfosfátu a fosfoenolpyruvátu. Důležitou součástí biologických struktur tvoří sloučeniny fosforu s lipidy (fosfolipidy), které jsou součástí biomembrán. (Pipek, 1995) Fosfor je označován za minerální nutriet. V kostní tkáni lidského těla je ho obsaženo přibližně asi 85% (především kosti a zuby) v podobě hydroxyapatitu, fosforečnanu draselného, fosforečnanu sodného a fosforečnanu vápenatého. (Phosphates facts, 2014). V kostech se obsah fosforu pohybuje v množství přibližně 700g, kde je v poměru 1:2 doprovázen vápníkem. (Jirák, 2005). V měkkých tkáních a tělních tekutinách je uloženo přibližně 10-15% fosforu. Ten přijímáme do lidského organismu ve dvou formách, a to ve formě organické a anorganické. Fosfatidy, fosfoproteinyy a nukleoproteiny spadají do formy organické. Doporučená denní dávka je 1,2g. (Ritz a kol., 2012). Fosforečnany lze využívat při výrobě doplňků stravy a lze jejich prostřednictvím obohacovat potraviny o minerály např. hořčíku, vápníku, sodíku, draslíku, manganu či železa. V potravinářství jsou fosforečnany jako přídatné látky do potravin povoleny, avšak v omezeném množství tak, aby celkový příjem nepřesáhl přijatelné hodnoty a zamezilo se tak škodlivým účinkům. Denně přijímáme ve stravě přibližně 1000mg fosforu. V tenkém střevě se z přijaté potravy resorbuje až 80% fosforu, rychlost jakou se dostane do trávicího traktu je závislá na tom, jaký je jeho obsah v konzumované potravině. (Babička, 2012, Ritz a kol., 2012) 3.6 Zastoupení fosforečnanů v potravinách a masných výrobcích Polyfosfáty na našem trhu obsahují tyto kategorie potravinářských výrobků: masové výrobky, sušené potraviny v prášku (kromě sušeného mléka), pomazánky kromě másla, obilné snídaně, snacky, těstoviny, 24

aromatizované sirupy do koktailů a mražených smetanových krémů a obdobné výrobky jako jsou polevy nebo sirupy na palačinky, povrchová vrstva (glazúra) na masové výrobky a zeleninové výrobky, cukrovinky, cukrová poleva, třená těsta, čokoládové a sladové nápoje na bázi mléka, mražené a hluboce zmrazené filety z nezpracovaných ryb, mrazené a hluboko zmrazené filety z korýšů, pasty z ryb a korýšů, konzervované výrobky z korýšů, zpracované bramborové výrobky včetně mražených, hluboko zmražených, chlazených a sušených, předsmažené mražené a hluboko zmražené brambory, vodné emulzní spreje na povrchové potírání plechů, aromata, nápoje na bázi kávy pro automaty, alkoholické nápoje (kromě vína a piva). (ŠVPS SR, 2006) Působením potravinářských aditiv na bázi solí kyseliny trihydrogenosforečné nebo solí polyfosforečnanových kyselin může být obsah fosforu v některých potravinách vyšší, než je jeho přirozená hodnota. Fosforečnany se využívají nejen při výrobě tepelně opracovaných masných výrobků, ale také při výrobě zvláštních konzervovaných výrobků z vařeného masa. V porovnání s ostatními složkami běžně přidávanými do masných výrobků působí fosforečnany zcela odlišně. Rozeznáváme deset fosforečnanů schválených k použití v masných výrobcích, z nichž každý působí v mase svým specifickým způsobem. Každý fosfát má několik různých názvů, což může působit jisté potíže při jejich identifikaci. K získání bakteriostatického efektu je běžné dávkování pro masné výrobky nedostatečné. Fosforečnany nepovažujeme za přímé konzervační látky, nicméně jsou využívány, protože mají schopnost předávat některé své žádoucí vlastnosti. Pokud jsou vhodně kombinovány se správnými složkami potravin, jako je NaCl nebo dusitany a dusičnany, mohou inhibovat grampozitivní a některé gramnegativní bakterie. Za zbytečné se považuje přidání fosforečnanů do trvanlivých salámů. (Vrbová, 2011, Čechová a kol., 2007, Knipe, 2004) 25

Tabulka: Přehled anorganických fosforečnanů, které se využívají v masných výrobcích Zdroj: (Knipe, 2004, Petrželová, 2013) Sumární vzorec Název fosforečnanu Zkratky fosforečnanů NaH 2 PO 4 Dihydrohenfosforečnan sodný MSP Na 2 HPO 4 Hydrogenfosforečnan sodný DSP Na 2 P 2 O 7 Pyrofosforečnan sodný TSPP Na 5 P 3 O 10 Trifosforečnan sodný STPP,STP (NaPO 3 ) 13 Hexametafosforečnan sodný HMP Na 2 H 2 P 2 O 7 Kyselý pyrofosforečnan sodný SAPP K 2 HPO 4 Hydrogenfosforečnan draselný DKP K 4 P 2 O 7 Pyrofosforečnan draselný TKPP KH 2 PO 4 Dihydrogenfosforečnan draselný MKP K 5 P 3 O 10 Tripolyfosforečnan draselný KTPP 3.6.1 Přehled jednotlivých fosforečnanů, které se nacházejí v masných výrobcích V praxi jsou využívány sodné soli fosforečnanů a polyfosforečnanů. Fosforečnanové tavící soli se dodávají ve formě směsí orthofosforečnanů, difosforečnanů a polyfosforečnanů v různém kondenzačním stupni. (Čechová a kol., 2007). U čerstvých bílkovin živočišného původu je běžný přirozeně nízký obsah sodíku ve výši 50-70mg ve 100g. Producenti vepřových, hovězích a drůbežích výrobků často přidávají do svých produktů při technologickém zpracování složky obsahující sodík. Nejčastěji se jedná o chlorid sodný a fosforečnany sodné, které jsou do masných výrobků dodávány s cílem zlepšit chuť, funkčnost a výnos. Jedná se zejména o masné výrobky zpracované různými postupy jako luncheon meat, salámy a párky. (Veterinářství, 2012). Polyfosforečnany jsou pro své vlastnosti nejvíce využívány při výrobě konzervovaných dušených šunek a jiných masných výrobků. (Davídek a kol., 1983). 3.6.1.1 Dihydrohenfosforečnan sodný (MSP) - NaH2PO4 Dihydrohenfosforečnan sodný má bílou barvu a vytváří krystalické granule. Je to nehořlavá a sypká látka, která je bez zápachu a není agresivní. MSP je lehce rozpustný ve vodě, ale není rozpustný v ethanolu. Má uplatnění v různých odvětvích průmyslu. V potravinářském průmyslu je hojně využíván jako víceúčelová přísada. 26

Používá se jako stabilizátor výrobků z vajec, projímadlo, činidlo pro úpravu pitné vody, přísada do zubních past a hlavně působí jako pufr. Konkrétní E kód, kterým jej značíme je E 339. (Ronghong chem). Zdroj: http://rhphos.en.alibaba.com/productshowimg/1902 538244-219347735/price_of_MSP_NaH2PO4 _nh2o_98_purity.html Obrázek 2: Dihydrogenfosforečnan sodný 3.6.1.2 Hydrogenfosforečnan sodný (DSP) - Na2HPO4 Hydrogenfosforečnan sodný je sypký bílý prášek. Obsahuje v přepočtu asi 49% P2O2. Tento fosforečnan je hygroskopický, dá se velmi dobře ředit vodou a má vysokou pufrační schopnost. V potravinářském průmyslu se často využívá jako víceúčelová přísada. Běžně se přidává do práškových smetan do kávy a cukrářských směsí, kde funguje jako stabilizátor a zabraňuje zde koagulaci bílkovin. Uplatňuje se též jako hnojivo pro svůj zdroj dusíku a fosforu, nebo v lékařské laboratorní praxi při růstu bakterií. Konkrétní E kód, kterým jej značíme je E 340. (Ronghong chem, Firma Fosfa). Zdroj: http://www.ecplaza.net/monosodium-phosphatemonohydrate--everything.html Obrázek 3: Hydrogenfosforečnan sodný 27

3.6.1.3 Pyrofosforečnan sodný (TSPP) - Na2P2O7 Pyrofosforečnan sodný je dodáván ve formě bílého prášku, který je ve vodě velmi dobře rozpustný. Vytvoříme-li z tohoto fosforečnanu vodný roztok, bude alkalický. Obsahuje v přepočtu asi 51,5% P 2 O 2. Sypná hmotnost TSPP je 640-800kg/m3. Jeho hlavní úlohou je uvolnění aktinomyosinového komplexu v mase, kdy se rozpadá na jednotlivé části na aktin a myosin. (Knipe, 2004). Běžně se používá jako texturizant, emulgátor nebo pufr v průběhu zpracování masa, ryb nebo sýrů. Uplatňuje se taktéž jako želírující činidlo v dezertech a instantních pudincích. Konkrétní E kód, kterým jej značíme je E 450. (Ronghong chem, Firma Fosfa) Zdroj: http:// www.ecplaza.net/sodiumpyrophosphate--everything.html Obrázek 4: Pyrofosforečnan sodný 3.6.1.4 Trifosforečnan sodný (STPP, STP) - Na5P3O10 Trifosforečnan sodný má opět bílou barvu. Je nehořlavý, není agresivní a je dobře rozpustný ve vodných roztocích. Sypná hmotnost se pohybuje v rozmezí od 550-700 kg/m3. Jde o anorganickou, povrchově aktivní látku. V potravinářském průmyslu je hojně využíván jako víceúčelová přísada. Využívá se jako emulgační činidlo nebo působí jako pufr. Uplatňuje se v potravinářském průmyslu při zpracování masa, ryb a také v mlékárenském průmyslu. STPP bývají hydrolyzovány fosfatázou na pyrofosforečnanovou formu, která má další využití. Konkrétní E kód, kterým jej značíme je E 451. (Knipe, 2004, Ecpaza) Zdroj: http:// www.ecplaza.net/sodiumpyrophosphate--everything.html Obrázek 5: Trifosforečnan sodný 28

3.6.1.5 Hexametafosforečnan sodný (HMP) - (NaPO3)13 Hexametafosforečnan sodný je velmi jemný, volně tekoucí prášek se sypnou hmotností 1100 1500 kg/m3. HMP má bílé zbarvení a je bez zápachu. Má hygroskopické vlastnosti a velmi snadno se rozpouští ve vodě. V potravinářském průmyslu má velké uplatnění v technologickém zpracování masa a mělněných masných výrobků. Obsahuje v přepočtu asi 68% P 2 O 2. Tento fosforečnan má mnohem větší hygroskopicitu než kuchyňská sůl. Proto musíme dbát zvýšenému dohledu pokud HMP skladujeme delší dobu, aby bylo zabráněno styku s vlhkým vzduchem a vodou. Konkrétní E kód, kterým jej značíme je E 452. (Knipe, 2004, Ecpaza). Zdroj: http://beijing.all.biz/cs/hexametafosforecnansodny-g295251#.vt068zmxato Obrázek 6: Hexametafosforečnan sodný 3.6.1.6 Kyselý pyrofosforečnan sodný (SAPP) - Na2H2P2O7 Kyselý pyrofosforečnan sodný je bílá semigranulovaná látka. Je bez zápachu, má hořkou chuť a je nehořlavý. Dobře serozpouští ve vodě,ale je nerozpustný v ethanolu. Nejvýznamnějšími vlastnostmi kyselého pyrofosforečnanu sodného jsou kyselé reakce a umí velmi účinně navazovat vápník a jiné dvojmocné kationy, dle toho se také dále určuje jeho využití. Je využíván především jako polotovar pro výrobu potravinářských aditiv a využívá se při výrobě kypřícího prášku do pečiva. Taktéž se používá kyselých reakcí soli ve výrobě smažených bramborových lupínků. Konkrétní E kód, kterým jej značíme je E 450. (Ecplaza, Firma Fosfa) Zdroj: http://beijing.all.biz/cs/hexametafosforecnansodny-g295251#.vt068zmxato Obrázek 7: Kyselý pyrofosforečnan sodný 29

3.6.1.7 Hydrogenfosforečnan draselný (DKP) - K2HPO4 Hydrogenfosforečnan draselný je znám jako bílý a sypký prášek, který je hygroskopický a dobře rozpustný ve vodě. V potravinářském průmyslu je hojně využíván jako víceúčelová přísada. Běžně se přidává do práškových smetan do kávy a cukrářských směsí a zabraňuje zde koagulaci bílkovin. Obsahuje v přepočtu asi 39,4% P 2 O 2. Využívá se hlavně jako pufr, zdroj dusíku a fosforu v hnojivech a v běžné laboratorní praxi pro růst mikroorganismů. Konkrétní E kód, kterým jej značíme je E 340. (Ecplaza, Firma Fosfa) Zdroj: http:// www.ecplaza.net/sodium-pyrophosphate- -everything.html Obrázek 8: Hydrogenfosforečnan draselný 3.6.1.8 Pyrofosforečnan draselný (TKPP) - K4P2O7 Pyrofosforečnan draselný je bílý prášek. Velice dobře se rozpouští ve vodě. Sypná hmotnost TKPP se pohybuje v rozmezí od 550-570 kg/m3. Využívá se jako pufr při technologickém zpracování masa, sýrů a ryb. Pyrofosforečnan draselný se ve vodě rozpouští lépe než tripolyfosforečnan sodný, ten je ale více rozpustný než pyrofosforečnan sodný. Obsahuje v přepočtu asi 39,4% P 2 O 2. Využíváme jej i jako želatinové činidlo v dezertech a instantních pudincích. Konkrétní E kód, kterým jej značíme je E 450. (Ecplaza, Firma Fosfa). Zdroj: http:// www.ecplaza.net/sodiumpyrophosphate--everything.html Obrázek 9: Pyrofosforečnan draselný 30

3.6.1.9 Dihydrogenfosforečnan draselný (MKP) KH2PO4 Dihydrogenfosforečnan draselný je bílý prášek, který obsahuje malé krystaly. Velmi dobře se rozpouští ve vodě. Využití nachází především ve potravinářském a farmaceutickém průmyslu. Obsahuje v přepočtu asi 52% P 2 O 2. Konkrétní E kód, kterým jej značíme je E 340. (Alibaba, Firma Fosfa) Obrázek 10: Dihydrogenfosforečnan draselný Zdroj: http://www.alibaba.com/product-detail/supplier- MKP-KH2PO4-fertilizer-monopotassiumphosphate_1995691897/showimage.html/ 3.6.1.10 Tripolyfosforečnan draselný (KTPP) - K5P3O10 Tripolyfosforečnan draselný je prášek, který má bílou barvu, není agresivní ani hořlavý. Jeho sypká hmotnost se pohybuje kolem 550-700 kg/m3. V potravinářském průmyslu je hojně využíván jako víceúčelová přísada. Používá se jako emulgační činidlo nebo pufr. Dále nachází využití při technologickém zpracování masa, ryb, ale i při úpravě krmiv pro domácí zvířata. Konkrétní E kód, kterým jej značíme je E 451. (Knipe, 2004), Ecplaza, Firma Fosfa) Obrázek 11: Tripolyfosforečnan draselný Zdroj: http://www.alibaba.com/trade/search?fsb=y&i ndexarea=product_en&catid=&searchtext= monopotassium-phosphate Byly prováděny testy účinků difosforečnanu sodného (SPP), tripolyfosforečnanu sodného (STPP), hexametafosforečnanu sodného (SHMP), difosforečnanu kyseliny sodné (SAPP) a jejich směsí v různých úrovních (0,3, 0,5 a 0,7%) spolu s 2% chloridu sodného na stanovených kvalitativních parametrech buvolího masa a karbanátků. Směsi 31

difosforečnanu sodného a tripolyfosforečnanu sodného výrazně zvýšily emulgační kapacitu, množství zadržované vody, ph, extrahovatelnost solných rozpustných proteinů a zlepšily barvu mletého masa. Byla zaznamenána snížená ztráta vody vařením a zlepšená stabilita emulze. Oproti tomu difosforečnan kyseliny sodné a hexametafosforečnan sodný měl výrazně menší vliv na zlepšení kvality masa a karbanátků. Podle účinnosti na sledované parametry lze fosforečnany řadit od nejúčinnějšího difosforečnanu sodného, přes triforsforečnan sodný po méně účinný hexametafosforečnan sodný. Ze směsí dvou polyfosfátů byly ty, které obsahovaly 90% SPP + 10% SHMP a 75% SPP + 25% STPP relativně účinnější. Směs fosfátů skládající se ze 65% SPP, 17, 5% STPP a 17, 5% SAPP byla stejně účinná jako SPP kde přispěla ke zlepšení funkčnosti chlazeného masa a měl tu výhodu, že snížila množství sodíku o 3%. (Anjaneyulu a kol., 1989) Nejčastěji se používají směsi difosfátu (pyrofosfátu), trifosfátu a tetrafosfátu. Z těchto tří fosfátů pouze difosfát vyvolává disociaci aktinu a myosinu přímo, zatímco trifosfát a více kondenzované fosfáty plní tuto funkci až po enzymovém rozkladu na difosfát (Hamm a Neraal, 1977). V tepelně neopracovaném mase jsou přítomny enzymy trifosfatáza a pyrofosfatáza, které mají různou citlivost na změnu teploty, přičemž trifosfatáza je méně závislá. Tohoto se využívá při volbě složení směsí polyfosfátů, protože rozdílný poměr mezi obsahem trifosfátu a difosfátu ovlivňuje průběh reakcí v mase. Trifosfáty se rozkládají na difosfát během kratší doby, než je při tepelném opracování dosaženo teploty, při které dojde k inaktivaci trifosfatázy. Proto lze v tepelně opracovaných masných výrobcích nalézt společně s fosfátem pouze difosfát. 3.7 Metody stanovení fosfátu a polyfosfátů Každou známou látku, která byla do masa nebo masných výrobků záměrně přidána lze detekovat různými způsoby. (Awad a kol., 2002,; Mizuno a Lucey, 2005) 3.7.1 Klasické metody Klasické analytické metody, jako je gravimetrie a spektrofotometrie, jsou využívány ke sledování a kontrole obsahu fosforu v potravinách. Při gravimetrickém určování celkového obsahu fosforu je ze vzorku fosfor vysrážen ve formě komplexu chinolin fosfomolybdenanu. (International Organization for Standardization, 1974) Metoda spektrofotometrie je založena na reakci fosfátu s molybdenanem sodným s kyselinou askorbovou sloužící jako redukční činidlo reakce, a vzniku 32

modrého komplexu [(MoO 2.4MoO 3 )2.H 3 PO 4 ] a dále na měření jeho absorbance při vlnové délce λ = 823 nm. (Pulliainen a Wallin, 1994, Pulliainen a Wallin, 1996) Jiní autoři (Cattaneo a Balzaretti, 1997) používají jako redukční činidlo hydrazin při vlnové délce maximální absorbance komplexu λ = 600 nm. Pulliainen (Pulliainen a Wallin, 1994) uvedl, že spektrofotometrické stanovení fosforu je možno aplikovat pro všechny druhy potravin. Vzorek je nutno nejprve mineralizovat na suché nebo mokré cestě, což platí u obou metod. Tato metoda umožňuje pouze stanovení celkového obsahu fosfátu, tedy přirozeně přítomného i přidaného a neumožňuje rozlišit jeho původ. 3.7.2 Elektromigrační metody Mezi elektromigrační metody, které jsou nejvhodnější ke stanovení polyfosfátů v masných výrobcích, patří kapilární izotachoforéza (CITP), dále kapilární zónová elektroforéza (CZE) a kapilární gelová elektroforéza (CGE). (Heiger, 2000). Jako první používanou metodou v praxi byla z výše uvedených kapilární izotachoforéza. Ovšem použití kapilární zónové elektroforézy k analýze anorganických iontů se již dlouho aplikuje v praxi. (Jorgenson a Lukacs, 1981). Jelikož ale polyfosfáty nejsou schopny absorpce v UV oblasti, články týkající se separace polyfosfátů byly poprvé publikovány poněkud později. (Stover a Keffer, 1993) 3.7.3 Chromatografické metody Velice často se chromatografické metody používají také k analýze kondenzovaných fosfátů. V minulosti již byla popsána metoda (Krzynowek, 1995) detekce fosforečnanů v mase mořských ryb pomocí metody tenkovrstvé chromatografie (TLC). Metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) je však nejpoužívanější. Tato metoda je vhodná pro stanovení jak lineárních a cyklických polyfosfátů, tak i pro určení délky jejich řetězce. Z různých typů kapalinových chromatografií je ke stanovení polyfosfátů nejvíce využívaná metoda iontové chromatografie. K určení polyfosfátů se však používá i jiných metod: spektrofotometrická post-kolonová detekce s molybdenanem (Linares a kol., 1991, Halliwell a kol., 1996) či s FeCl 3 a kyselinou sulfanilovou (Matsunaga a Oozumi, 1990); nepřímá UV detekce (Shamsi a Danielson, 1993, Svoboda a Schmidt, 1997) vodivostí detekce (Stover a kol., 1994; Baluyot a Hartforf, 1996; Cui a kol., 2000, Sekiguchi a kol. 2000). 33

3.7.3.1 Stanovení polyfosfátů metodou kruhové chromatografie Pomůcky: Petriho miska (průměr min. 12cm) Chromatografický papír Whatmann 1 Mikropipety (10 μl) Kružítko Bavlněný knot (7cm) 2x ruční laboratorní rozprašovač na detekční činidlo I. a II. Digestoř, fén, sušárna Chemikálie: Vyvíjecí směs pro papírovou chromatografii 20 ml 20% trichloroctové kyseliny smícháme se 70 ml isopropanolu, 0,3 ml koncentrovaného amoniaku a 10 ml destilované vody Detekční činidlo I 15 g molybdenanu amonného rozpustíme ve 100 ml destilované vody, přidáme 52,2 ml koncentrované kyseliny dusičné a vzorek doplníme na objem 200 ml. Roztok promícháme a necháme stát do dalšího dne, pak zfiltrujeme. Detekční činidlo II 0,05 g benzidinu se rozpustí v 5 ml 99% kyseliny octové, mírně zahřejeme a doplníme destilovanou vodou na objem 100 ml. Pak roztok přelijeme do tmavé láhve a přidáme 10 ml koncentrovaného amoniaku. Postup: V třecí misce musí být důkladně rozetřeno 50g homogenizovaného vzorku s 10g pevné kyseliny trichloroctové. Extrakt vzniklý v třecí misce musí být filtrován až do získání čirého filtrátu, který je následně použit ke chromatografickému stanovení polyfosfátů. Filtráty z jednotlivých vzorků musí být naneseny na pásek chromatografického papíru. Asi 30 µl každého vzorku se aplikuje na start takovým způsobem, aby nanesené stopy byly co nejmenší. Standardy nanášíme současně se vzorkem. Chromatogram se vloží do skleněné kyvety a vyvíjecí soustava je zakryta skleněným víčkem. Po ukončení procesu vyvíjení se chromatogram vyjme a usuší. Po usušení se chromatogram postříká detekčním činidlem I (molybdenové činidlo) pomocí rozprašovače. Činidlo I reaguje s přítomnými fosfáty za vzniku žlutě zbarveného fosfomolybdenanu amonného. V dalším kroku se chromatogram znovu 34

usuší a postříká se detekčním činidlem II (benzidinové činidlo). (Veterinární a farmaceutická univerzita, 2015) Změna barvy skvrn obsahujících polyfosfáty Místa bez polyfosfátů jsou zbarveny žlutě Obrázek 11: Kruhová chromatografie (Zdroj: CZ.1.07/2.2.00/28.0287, 1.7.2012-30.6.2015) Celkový obsah fosforu lze stanovit pomocí vážkové metody za použití chinolinu, ze vzorků popelovin získaných z rybích filetů, které jsou nejdříve mineralizovány suchou cestou v muflové peci za teploty 550 C. Obsah celkového fosforu přítomného ve zmineralizovaném vzorku se převede na orthofosforečnan a vysráží jako chinolinfosfomolybdenan. Množství polyfosfátů lze vypočítat z celkového obsahu fosforu, obsahu bílkovin a počáteční navážky vzorku před mineralizací v peci v několika krocích: Krok 1: Celkový obsah fosforu (COF) lze vypočítat dle vzorce: kde: 0,014.gravimetrický faktor a.hmotnost sraženiny v g ze vzorku b.hmotnost sraženiny v g ze slepého pokusu c.počáteční navážka vzorku v g na stanovení obsahu popelovin. Krok 2: Obsah fosforu přidaného z polyfosfátů (OFP) v % lze vypočítat dle vzorce: OFP = COF (d 0,0106) OFP.fosfor v % přidaný polyfosfáty COF. celkový obsah fosforu v % d. obsah bílkovin 0,0106.korekční faktor pro obsah fosforu v proteinech svaloviny 35