UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie Dehydrosilybin jako protonofor: vztah struktury k biologické aktivitě DIPLOMOVÁ PRÁCE Autor: Hana Popelková Studijní program: N1406 Biochemie Studijní obor: Biochemie Forma studia: Prezenční Vedoucí práce: doc. Mgr. Martin Modrianský, Ph.D. Termín odevzdání práce: duben 2011
Prohlašuji, že jsem předloženou diplomovou práci vypracovala samostatně za použití citované literatury. V Olomouci dne... - 2 -
Chtěla bych na tomto místě poděkovat svému školiteli doc. Mgr. Martinovi Modrianskému Ph.D. za rady a pomoc při vypracování mé diplomové práce, Ing. Evě Gabrielové Ph.D. za cenné rady a poskytování buněk na experimenty. Mgr. Martinovi Jabůrkovi za významnou pomoc a odborné rady při práci s oxygrafem a Ing. Radkovi Gažákovi, Ph D. za poskytnuté deriváty dehydrosilybinu. Dále bych také chtěla poděkovat všem pracovníkům Ústavu lékařské chemie a biochemie LF UP Olomouc za to, že mi umožnili vypracovat diplomovou práci na svém pracovišti. Tato práce vznikla za finanční podpory výzkumného záměru MSM6198959216 a grantu LF_2010_022. - 3 -
Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora Bc. Hana Popelková Název práce Dehydrosilybin jako protonofor: vztah struktury k biologické aktivitě Typ práce Diplomová Pracoviště Ústav lékařské chemie a biochemie Univerzity Palackého v Olomouci Vedoucí práce doc. Mgr. Martin Modrianský, Ph.D. Rok obhajoby práce 2011 Abstrakt Dehydrosilybin je jedním z flavonolignanů obsažených v extraktu ze semen ostropestřce mariánského, který vykazuje významné cytoprotektivní účinky. Tyto jsou přisuzovány schopnosti flavonolignanů působit jako antioxidanty. Dehydrosilybin snižuje produkci kyslíkových radikálů v mitochondriích, přičemž vykazuje účinky podobné odpřahovačům oxidativní fosforylace spíše než jednoduché vychytávání radikálů. Naše data naznačují, že dehydrosilybin není skutečným ionoforem podobně jako CCCP, ale podobné účinky zřejmě souvisí s jeho interakcí s mitochondriálními proteiny. V této interakci jsou důležité hydroxylové funkční skupiny přítomné v molekule dehydrosilybinu, naše data poukazují na obzvláštní důležitost -OH skupiny v pozicích 3 a 7. Na základě těchto dat je vytvořena hypotéza o přenosu H + iontů přes mitochondriální membránu s pomocí dehydrosilybinu. Klíčová slova Liposomy, mitochondrie, kardiomyocyty, dýchací řetězec, polyfenoly, odpřažení, reaktivní kyslíkové formy Počet stran 77 Počet příloh 0 Jazyk Český - 4 -
Bibliographical identification: Author s first name and Bc. Hana Popelková surname Title Dehydrosilybin as a protonophore: structure activity relationship. Type of thesis Diploma Department Department of Medical Chemistry and Biochemistry of University Palacky in Olomouc Supervisor doc. Mgr. Martin Modrianský, Ph.D. The year of presentation 2011 Abstract Dehydrosilybin is one of flavonolignans present in the Silybum Marianum seed extract, which displays significant cytoprotective activity. This cytoprotective activity is linked to the tentative antioxidant activity of flavonolignans. Dehydrosilybin lowers the production of oxygen radicals in mitochondria while it shows uncoupler-like activity rather than simple radical scavenging. Our data shows that dehydrosilybin is not a true ionophore resembling CCCP, but its uncoupler-like activity is probably linked to its interaction with mitochondrial proteins. Important role in this interaction play hydroxyl groups present in the dehydrosilybin molecule, our data point to a particular role of OH groups in positions 3 and 7. Based on the data a hypothesis on H + ions transfer across mitochondrial membrane mediated by dehydrosilybin is presented. Keywords mitochondria, respiratory chain, polyphenol, uncoupling, reactive oxygen species Number of pages 77 Number of appendices 0 Language Czech - 5 -
OBSAH 1 CÍLE PRÁCE...- 7-2 ÚVOD...- 8-3 TEORETICKÁ ČÁST...- 9-3.1 Mitochondrie...- 9-3.2 Elektrontransportní řetězec a oxidativní fosforylace...- 11-3.2.1 Komponenty dýchacího řetězce...- 11-3.2.2 ATP-synthasa a chemiosmotická teorie...- 18-3.3 Produkce reaktivních kyslíkových radikálů mitochondriemi...- 19-3.4 Endogenní enzymatická ochrana buňky proti ROS...- 24-3.5 Endogenní neenzymatická ochrana buňky proti ROS...- 26-3.6 Exogenní neenzymatická ochrana buňky proti ROS...- 28-3.6.1 Vitamíny...- 28-3.6.2 Polyfenoly...- 29-3.6.3 Odpřahovače (uncouplery)...- 31-3.7 Patologie ischemicko-reperfuzniho poškození...- 32-4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST...- 35-4.1 Materiály...- 35-4.1.1 Biologický materiál...- 35-4.1.2 Kultivační média, roztoky, pufry a sonda...- 35-4.1.3 Silybin, 2,3-dehydrosilybin a jeho deriváty...- 36-4.2 Metody...- 37-4.2.1 Příprava malých unilamelárních liposomů...- 37-4.2.2 Zhodnocení potenciálu na membráně liposomů...- 37-4.2.3 Izolace srdečních mitochondrií...- 38-4.2.4 Stanovení bílkovin metodou Bradfordové...- 38-4.2.5 Zhodnocení mitochondriálního transmembránového potenciálu...- 39-4.2.6 Respirometrie s vysokým rozlišením (HRR)...- 41-4.2.7 Kultivace buněčných linií...- 41-4.2.8 Stanovení počtu buněk...- 41-4.2.9 Zhodnocení membránového potenciálu na celých buňkách...- 42-4.3 Výsledky...- 43-4.3.1 Zhodnocení potenciálu na membráně liposomů...- 43-4.3.2 Zhodnocení mitochondriálního transmembránového potenciálu...- 44-4.3.3 Respirometrie s vysokým rozlišením (HRR)...- 48-4.3.4 Zhodnocení membránového potenciálu na celých buňkách...- 53-5 DISKUZE...- 59-6 ZÁVĚR...- 61-7 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK...- 65-8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...- 67 - - 6 -
1 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE 1.1 Shrnout základní poznatky o dýchacím řetězci mitochondrií a tvorbě reaktivních kyslíkových forem v mitochondriích 1.2 Shrnout poznatky o endogenní a exogenní ochraně buňky a antioxidační aktivitě polyfenolů 1.3 Otestovat, zda je dehydrosilybin pravým protonoforem 1.4 S využitím methylovaných derivátů 2,3-dehydrosilybinu zjistit, která OH skupina této sloučeniny je odpovědná za její chování podobné protonoforům - 7 -
2 ÚVOD Diplomová práce se zabývá biologickými účinky dehydrosilybinu, polyfenolu, který snižuje produkci kyslíkových radikálů a ovlivňuje membránový potenicál mitochondií. Za použití tří systémů: liposomů, mitochondrií a celých buněk jsme se pokusili navrhnout hypotézu mechanismu, kterým dehydrosilybin dovoluje přenos H + iontů přes vnitřní mitochondriální membránu a popsat důležitost hydroxylových skupin dehydrosilybinu, které jsou v tomto procesu zapojeny. Mitochondrie jsou významným fyziologickým zdrojem reaktivních kyslíkových radikálů (ROS), které způsobují oxidační poškození biolomekul, mají vliv na stárnutí buněk a jsou jednou z možných příčin vzniku a rozvoje mnoha onemocnění typu Parkinsonovy choroby, Alzheimerovy choroby, revmatických onemocnění, aterosklerozy, diabetes mellitus a ischemických chorob srdečních. Kardiomyocyty ve velké míře využívají mitochondrie jako zdroj energie pro neutuchající kontrakce srdečního svalu. Jsou tedy vystaveny poškozujícím účinkům ROS, především během reperfuze. Ischemická choroba srdeční je příčinou takřka třetiny úmrtí v České republice. Další příčinou úmrtí jsou kardiovaskulární komplikace, provázející řadu kardiochirurgických výkonů. Ochrana srdce proti ischemicko-reperfuznímu poškození může být zajištěna pre- nebo post-conditioningem, ve kterém hrají důležitou roli právě ROS. Modulovat tvorbu ROS je možné v podstatě dvěma mechanismy, a to slabým odpřažením buněčného dýchání nebo inhibicí dýchacího řetězce. Flavonolignany silybin a dehydrosilybin, které patří mezi polyfenoly, vykazují antioxidační vlastnosti. Dehydrosilybin snižuje tvorbu ROS a v kardiomyocytech působí jako slabý odpřahovač. Chemické odpřažení v podstatě napodobuje ischemický preconditioning. Nízké koncentrace polyfenolů dosažené v krevní plazmě na základě konzumace potravin s potřebným obsahem polyfenolů mohou vyvolat stejné kardioprotektivní účinky jako syntetické odpřahovače oxidativní fosforylace dinitrofenol (DNP) nebo fluorofenylhydrazon (FCCP). - 8 -
3 TEORETICKÁ ČÁST 3.1 Mitochondrie Mitochondrie (Obr. 1) jsou organely, které byly poprvé popsány na konci 19. století. Vyskytují se téměř ve všech typech buněk rostlin i živočichů (u člověky jsou vyjímkou např. erytrocyty), a téměř u všech eukaryotních mikroorganismů. Velikost a tvar mitochondrií je proměnlivý a značně závislý na jejich původu a metabolickém stavu. Obvykle mají elipsoidní tvar a délka se pohybuje v rozmezí 0,5-10 µm. (Voet & Voetova, 1995) Uvnitř buňky vytvářejí mitochondrie dynamickou síť a pomocí speciálních proteinů je regulována rovnováha mezi spojováním (fusion) a dělením (fission) mitochondrionu v závislosti na momentálním stavu buňky. (Benard et al., 2007) Počet mitochondrií v buňce je také velmi rozdílný, od 20 do 0,5 milionu. (Vodrážka, 2007) Orgány bohaté na mitochondrie jsou např. srdce a játra. Mitochondrie jsou vytvořeny z vnitřní a vnější membrány, které mají klíčovou roli v mitochondriálních dějích. Tyto membrány vytvářejí dva oddělené prostory v mitochondrii, velký vnitřní prostor zvaný matrix a užší mezimembránový prostor. Přibližně polovina mitochondriálních proteinů je tkáňově specifická (Mootha et al., 2003) Vnější mitochondriální membrána je tvořena z 50 % fosfolipidy a z 50 % proteiny. Je charakteristická velkým množstvím kanálotvorného proteinu porinu a vyznačuje se vysokou permeabilitou pro všechny molekuly až do velikosti okolo 5000 daltonů, je tedy téměř chemicky ekvivalentní cytosolu. Dalšími proteiny, které se vyskytují ve vnější membráně, jsou enzymy mitochondriální syntézy lipidů a enzymy, které přeměňují lipidy na formy, které jsou pak metabolizovány v matrix. Vnější membrána je nepropustná pro proteiny. Pro přenos proteinů do mezimembránového prostoru mitochondrie jsou zde TOM a SAM komplexy. Oproti tomu vnitřní mitochondriální membrána je tvořena z fosfolipidů jen asi z 24 % a proteiny z 76 %. Vnitřní membrána vytváří početné vchlípeniny nazývané kristy, které výrazně zvětšují její povrch (Alberts et al., 2002). Charakteristickým lipidem vnitřní mitochondriální membrány je kardiolipin (bisfosfatidylglycerol), který představuje asi 20 % z celkového množství lipidů. Na vnitřní mitochondriální membráně jsou lokalizovány proteiny transportu elektronů, dále ATP-synthasa a transportní proteiny umožňující transport metabolitů mezi matrix a cytosolem (Voet & Voetová 1995). - 9 -
Vnitřní membrána je selektivně propustná pouze pro některé látky, jejichž vstup zajišťují specifické přenašeče. Např. pro transport proteinů jsou známé TIM 23 a TIM 22 komplexy, které zajišťují transport proteinů z cytosolu pocházející z jaderné DNA a jejich zabudování do vnitřní membrány mitochondrie, a OXA komplex, který zabudovává do vnitřní membrány proteiny syntetizované v matrix mitochondrie z mitochondriální DNA (mt-dna). Matrix mitochondrie obsahuje vysoce koncentrovanou směs enzymů, z nichž důležitou roli v metabolismu zaujímají enzymy oxidace pyruvátu a mastných kyselin a enzymy katalyzující reakce citrátového cyklu. Dále je v matrix v několika kopiích lokalizovaná mitdna, kódující u člověka sekvenci dvou rrna, 22 trna genů a 13 genů kódujících proteiny, které jsou podjednotkami proteinů dýchacího řetězce. Jsou to: cytochrom c oxidasa, NADH-dehydrogenasa, koenzym Q a ATP-synthasa. Mitochondrie jsou místem oxidačního metabolismu eukaryot. Buňka prostřednictvím oxidativní fosforylace získává asi 90 % energie potřebné pro metabolické pochody. Na rozdíl od glykolýzy, kterou se produkuje asi jen 10 % energie. Oxidativní fosforylace je sice vývojově mladší děj, zato více účinný. Mitochondrie hrají důležitou roli i z hlediska programované buněčné smrti. Jsou také místem produkce volných kyslíkových radikálů, které významně ovlivňují stárnutí a délku buněčného života (Skulachev, 2007). Vnější membrána Vnitřní membrána matrix Kristy Mezimebránový prostor Obrázek 1. Reprezentační elektronový fotomikrograf neporušené mitochondrie. (Upraveno podle (Chuang, 2010)). - 10 -
3.2 Elektrontransportní řetězec a oxidativní fosforylace Život vyšších organismů je absolutně závislý na přísunu kyslíku. Kyslík je využíván při respiraci, což je děj, při němž buňky získávání energii ve formě ATP (Murray et al., 2002). Složky elektrontransportního řetězce (ETCH) jsou zanořeny do vnitřní mitochondriální membrány, která musí být neporušená. Elektrony do dýchacího řetězce jsou přinášeny molekulami NADH a FADH 2, které pocházejí z citrátového cyklu, kde dochází k jejich redukci. Elektrony pak řadou oxidačně-redukčních reakcí procházejí ETCH a jsou přeneseny na molekulární kyslík, který redukují na vodu. Energie, která se uvolňuje při tomto ději, je využita na čerpání protonů do mezimembránového prostoru. Takto je vytvořen protonový gradient, který je využit jako pohon pro tvorbu ATP pomocí ATP-synthasy (Luzikov, 2009). Požadavky na spřažení transportu protonů a elektronů s oxidativní fosforylací byly vysloveny ve 2. polovině 20. století v chemiosmotické teorii (Mitchell, 1961). Respirační řetězec savčích mitochondrií je sestaven z více než dvaceti samostatných nosičů elektronů, které jsou seskupeny do čtyř polypeptidových komplexů. Tři z nich I., III. a IV. komplex fungují jako protonová pumpa ženoucí protony během postupu redukčních ekvivalentů ve směru zvyšujícího se redoxního potenciálu. Sekvence a struktura těchto komplexů je již objasněna (Nicholls & Ferguson, 1992). 3.2.1 Komponenty mitochondriálního dýchacího řetězce Elektrony v dýchacím řetězci jsou přenášeny mezi komplexy směrem od nižších k vyšším standardním redukčním potenciálům v rozsahu 1,1 V, a to z páru NAD + /NADH na pár O 2 /H 2 O. Většina reakcí v dýchacím řetězci je reversibilní. Aktuální potenciál E h redoxního páru musí mít přibližně stejnou hodnotu jako standardní potenciál E m. Počáteční transfer elektronů z citrátového cyklu do ETCH zprostředkovává kofaktor NADH/NAD +, který je dostatečně mobilní a může tedy pendlovat mezi matrixovými dehydrogenasami citrátového cyklu a respiračním řetězcem ukotveným na vnitřní mitochondriální membráně. E m redoxního páru je -320 mv. Některé dehydrogenasy, jako sukcinátdehydrogenasa, s,n-glycerolfosfát dehydrogenasa a elektrony-transferující flavoprotein, mají standardní potenciál blízký 0 mv. Přímá redukce NAD + není z termodynamického hlediska možná a tyto enzymy přenáší elektrony do dýchacího řetězce přímo a z toho důvodu musejí být ukotveny v membráně. (Obr. 2) Redoxní přenašeče ETCH jsou: flavoproteiny, ty mají vázané jako prostetickou skupinu FAD a FMN a podstupují (2H + + 2e - ) redukci. Cytochromy s porfyrinem jako prostetickou skupinou podstupují jednoelektronové redukce stejně jako Fe-S proteiny - 11 -
(nehemové železo), ubichinon, volný, v tucích rozpustný kofaktor, podstupuje v ETCH redukci (2H + + 2e - ) a v poslední řadě proteinově vázaná měď je redukována z Cu 2+ na Cu + (Nicholls & Ferguson, 1992). Elektrony v ETCH se pohybují od negativnějších potenciálů k pozitivnějším ve sledu redoxních systémů a energie je uvolňována postupně, po částech. Část energie je využita k syntéze ATP, zbytek se uvolňuje ve formě tepla. Postupného uvolňování energie je dosaženo průchodem elektronů a protonů přes enzymové komplexy oxidoreduktas, které mají stoupající hodnoty redoxního potenciálu od hodnoty -0,32 V (vstup aktivovaných atomů kyslíku) po hodnotu + 0,82 V (redoxní potenciál kyslíku) (Voet & Voetová 1995). Tyto komplexy označujeme jako: - komplex I (NADH-UQ oxidoreduktasa) - komplex II (sukcinátdehydrogenasa) - komplex III (UQ-cytochrom c oxidoreduktasa) - komplex IV (cytochrom c oxidasa) Tyto čtyři enzymatické komplexy jsou pevně zakotveny ve vnitřní mitochondriální membráně. Volně pohyblivé přenašeče v ETCH jsou ubichinon (UQ), redukovaná forma ubichonol (QH 2 ) též nazývaný koenzym Q (u savčích mitochondrií UQ 10 ) a ve vodě rozpustný cytochrom c pohybující se v mezimembránovém prostoru (Nicholls & Ferguson, 1992). Obrázek 2. Schéma mitochondriálního řetězce transportu elektronů znázorňující přenos elektronů (červeně) a pumpování protonů (modře). NAD + a FAD + jsou redukovány v citrátovém cyklu na NADH a FADH 2 (nevyobrazeno). V procesu oxidativní fosforylace, procházejí elektrony z NADH (a FADH 2) elektron-transportním řetězcem na koncový akceptor kyslík, který redukují na vodu. Při transportu elektronů je generován gradient protonů přes vnitřní mitochondriální membránu, který je využit k pohonu tvorby ATP pomocí ATP-synthasy. QH 2 a Q označují ubichinol a ubichinon (Upraveno podle (Sun et al., 2005)) - 12 -
Komplex I (NADH-UQ oxidoreduktasa, EC 1.6.5.3) Komplex I je největší a nejméně prostudovaná komponenta mitochondriálního dýchacího řetězce, skládá se ze dvou domén ve tvaru L. Hydrofobní doména je zakotvena v membráně a je orientována paralelně, jeho hydrofilní část zasahuje do matrix. Komplex I je složen z více než třiceti polypeptidů a redoxní centrum obsahuje jednu molekulu flavinu FMN a až sedm Fe/S center (Chen et al., 2009). Komplex I katalyzuje přenos dvou elektronů z NADH, které pochází z citrátového cyklu, na ubichinon v reakci, která je spjatá s translokací protonů přes membránu. Stechiometrie translokace je 4H+/2e -. Tento přenos je inhibován rotenonem a piericidinem A. Čtyři Fe/S centra, označována jako N-1, N-2, N-3 a N-4, byla objevena v mitochondriích hovězího srdce a vláknité plísně Neurospora crassa. N-1 je 2Fe/2S, zbylé tři jsou 4Fe/4S centra. Standardní redoxní potenciál centra N-2 je v rozmezí od - 20 do 160 mv (v závislosti na zdroji komplexu), ostatní jsou více negativní: -330mV (N-1), -230 mv (N-3) a -300 mv (N-4) (naměřené hodnoty pro N. crassa). Vzhledem k naměřeným hodnotám E m by mohl být tok elektronů v pořadí NADH FMN N- 1 N4 N3 N2 UQ N4 N3 N2 UQ. (Brand et al., 2004). (Obr. 3) Obrázek 3. Topologické zobrazení mitochondriálního komplexu I se znázorněním toku elektronů. Obrázek znázorňuje tok elektronů mitochondriálním komplexem I z NADH přes FMN a Fe/S centra (N1- N6) na ubichinon (CoQ) (Převzato od(lenaz & Genova, 2010)). - 13 -
Komplex II (sukcinátdehydrogenasa, EC 1.3.5.1) Kromě komplexu I jsou elektrony na UQ přenášeny ještě dalšími třemi cestami. Jednou z nich je komplex II, který přebírá elektrony ze sukcinátu; druhou je ETF (electron-transfering flavoprotein) dodávající elektrony z FADH 2, vzniklého při β-oxidaci mastných kyselin a třetí způsob transportu elektronů je prostřednictvím enzymu snglycerolfosfátdehydrogenasy. První dvě cesty jsou lokalizovány na matrixové straně membrány, poslední z nich se nachází na cytosolové straně membrány. Standardní redoxní potenciál elektronů v těchto třech případech je blízký 0 mv a z termodynamického hlediska tak nedochází k translokaci protonů (Nicholls & Ferguson, 1992). Komplex II je opět sestaven z několika polypeptidů. Dva největší představují dimer sukcinátdehydrogenasy. Další menší podjednotky obsahují kovalentně vázaný FAD, jedno centrum 2Fe/2S, jedno centrum 4Fe/4S a jedno 3Fe/4S. Na menší polypeptid je asociován cytochrom b 560 v ekvimolárním množství s FAD. Předpokládan postup elektronu je ve směru FADH 2 2Fe/2S 4Fe/4S 3Fe/4S cyt b UQ (Chen et al., 2009).(Obr.4) Obrázek 4. Struktura mitochondriálního komplexu II. se znázorněním toku elektronů Stužkový model komplexu II je navrstven na poloprůhledném molekulárním modelu tohoto komplexu. Modře je znázorněn FAD vazebný protein (Fp), béžově je zobrazen Fe-S protein, oranžově a růžově jsou znázorněny transmembránové proteiny CybL a CybS. Část komplexu zanořená do membrány je znázorněna šedým páskem. Na pravé straně je zobrazen tok elektronů od FAD přes [2Fe-2S], [4Fe-4S], [3Fe-4S] centra a hem b na ubichinon (UQ) spolu se vzdálenostmi a redoxním potenciálem. Tok elektronů je naznačen šipkami (Převzato od (Sun et al., 2005)). - 14 -
Komplex III (cyt bc 1 komplex nebo UQ-cytochrom c oxidoreduktasa, EC 1.10.2.2) Komplex III katalyzuje transfer elektronů z UQ na cytochrom c a reakce je spojena s translokací protonu. Komplex III byl nalezen rovněž v mnoha bakteriích a je v mnoha ohledech podobný plastochinol-plastocyanin-oxidoreduktase nebo cytochrom bf komplexu. Cyt bc 1 komplex je složen ze tří polypeptidových řetězců nesoucích redoxní skupiny, Fe-S proteiny, zvané Rieskeho protein po jeho objeviteli, dále cyt c 1 a cyt b. Rieskeho protein obsahuje 2Fe/2S klastr připojený k polypeptidu chelatací jednoho Fe ke dvěma cysteinovým residuím a druhého Fe ke dvěma histidinovým residuím. Cytochrom c 1 a Rieskeho protein jsou lokalizovány na cytosolové straně membrány. Cytochrom b je transmembránový protein a váže dva hemy. Jeden hem b 566, E m -100 mv, je lokalizován na cytosolové straně membrány. Druhý hem b 560, E m +50 mv, je umístěn na matrixové straně membrány. Komplex III katalyzuje přenos elektronů z ubichinolu na cytochrom c, spojený s translokací protonů dějem zvaným Q cyklus. Pro vysvětlení můžeme Q cyklus rozdělit do tří kroků. Krok 1: oxidace UQH 2 na radikál UQ - (Q o ) První elektron z UQH 2 je transferován na Rieskeho protein, 2 protony jsou uvolněny do cytoplasmy a vzniká semichinonový radikál UQ na vazebném místě Q o v blízkosti cytosolové strany membrány. Druhý elektron je transferován na hem b 566 na cytosolové straně. Elektron přijatý Rieskeho proteinem je předán na cyt c 1, cyt c a cytochrom oxidasu. Krok 2: redukce UQ na UQ - (Q i ), E m pro UQ - /UQ je -160 mv Hem b 566 (E m -100 mv, cytosolová strana) odevzdá elektron na hem b 560 (E m +50 mv, matrixová strana) navzdory protikladnému membránovému potenciálu Ψ 150 mv. Druhé chinonové vazebné místo, Q i, je v blízkosti hemu b 560. Váže UQ, který přijímá elektron z redukovaného hem b 560 za tvorby semichinonového radikálu UQ -. Vzhledem k hodnotě E m redoxního páru UQ.-/UQ se tento děj jeví termodynamicky neuskutečnitelný. Afinita vazebného místa pro UQ - je však vyšší než pro UQ, 300x násobný rozdíl ve vazebné energii posunuje aktuální redox potenciál U UQ - /UQ do pozitivnější hodnoty. Krok 3: redukce UQ - na UQH 2 (Q i ) Případ, kdy je obsazené místo semichinonovým radikálem v vazebném místě Q i. ve druhé části cyklu (Obr. 5) je druhá molekula UQH 2 oxidovaná v Q o vazebném - 15 -
místě a opakuje se Krok 1 (jeden elektron na cyt c 1 a druhý na hem b 560 prostřednictvím hemu b 566 ). Tento druhý elektron dokončuje redukci UQ - na UQH 2 a z matrix přijímá dva protony a UQH 2 se vrací do chinonového poolu a cyklus je dokončen (Trumpower, 1990). Obr.5 Q-cyklus. Komplex III se skládá z Fe-S proteinů a dvou typů cytochromu b: b L a b H. V modelu Q- cyklu jsou vyznačena dvě vazebná místa pro ubichinon, Q o ( cytosolová strana) a Q i (matrixová strana). První elektron je přenesen z ubichinolu přes Fe-S protein na cytochrom c, druhý elektron je přenesen nejprve na cytochrom b L z, něj na cytochrom b H a poté na ubichinon (Q), nebo semiubichinonový aniont UQ - (nevyznačen) na vazebném místě Q i. Během jednoho kompletního Q cyklu se oxiduje jedna molekula ubichinolu na ubichinon, dvě molekuly cytochromu c se redukují, dva protony jsou zpotřebovány z mytrixové strany a do mezimembránového prostoru jsou uvolněny čtyři protony. (Upraveno podle (Mulkidjanian, 2005)). - 16 -
komplex IV (cytochrom c oxidasa, EC 1.9.3.1) Komplex III přenáší elektrony na cyt c. Cyt c je periferní protein lokalizovaný na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány. Obsahuje jeden asymetricky uložený hem, který je větší částí skryt v hydrofobní štěrbině a jeden jeho kraj je exponovaný do roztoku, kde se nachází skupina lysinových residuí (konkrétně 13, 86 a 87), která jsou zodpovědná za transfer elektronu jak na, tak z hemu. U mitochondrií je cyt c redukován bc 1 komplexem a oxidován cytochrom c oxidasou. Finálním krokem elektron-transportního řetězce v mitochondriích je transfer čtyř elektronů z redukovaného cyt c na pool O 2 za vzniku H 2 O, který je katalyzován enzymem cytochrom c oxidasou: O 2 + 4e - + 4H + 2H 2 O Cytochrom c oxidasa (Obr. 6) pracuje jako protonová pumpa o stechiometrii 1H + /e -. Struktura cytochrom c oxidasy je velice komplikovaná. Obsahuje spektrálně odlišné hemy a, hem a a hem a 3 a alespoň dva atomy mědi Cu A a Cu B. Enzym je složen z více než deseti podjednotek, přičemž tři největší z nich jsou kódovány mitdna. Elektron je nejprve přenesen z cyt c na první redukční centrum Cu A lokalizované poblíž cytosolové strany membrány, další centra hem a 3 a Cu B jsou lokalizovány v blízkosti matrixové strany, kde dochází k redukci O 2. Na vazebné místo pro kyslík se také snad vážou ligandy jako CO, CN - a N - 3, které tímto způsobem inhibují respiraci. (Babcock & Wikstrom, 1992) Obrázek 6. Struktura mitochondriálního komplexu IV. Čtyři elektrony z cytochromu c vážou molekulu kyslíku za vzniku vody. Přenos elektronů na kyslík kovovými ionty navázanými na protein. (Upraveno podle (Karu & Afanas'eva, 1995)). - 17 -
3.2.2 ATP-synthasa a chemiosmotická teorie Transfer elektronů dýchacím řetězcem je spojen s pumpováním protonů komplexy I, III a IV přes vnitřní mitochondriální membránu z matrix do mezimembránového prostoru. Tok protonů má za následek: 1. generování ph gradientu přes vnitřní mitochondriální membránu, ph v matrix je vyšší než ph v cytosolu, kde je ph obvykle blízké 7. 2. generování gradientu elektrického napětí (membránový potenciál) přes vnitřní mitochondriální membránu, kde uvnitř je negativní potenciál a venku pozitivní potenciál. ph gradient ( ph) žene H + zpět do matrix, tím zesiluje efekt membránového potenciálu ( Ψ), který táhne protony zpět přes komplex ATP-synthasy. Součet ph a Ψ, čili protonmotivní síla (PMF, p) může být měřena v milivoltech (mv). U typické buňky je PMF respirující mitochondrie v rozmezí hodnot 180 až 190 mv a je tvořena z membránového potenciálu 160 až 170 mv a ph gradientu okolo 0,3 až 0,5 jednotek (Alberts et al., 2002). Chemiosmotická teorie byla vytvořena profesorem Petrem Michellem v roce 1961. Mitochondriální F 1 F 0 -ATP synthasa je membránový protein, skládající se z hlavové části, zvané F 1 ATPasa, a transmembránového přenašeče protonů, zvaného F 0. Obě části, F 1 i F 0 jsou složeny z několika podjednotek. Rotující stopka je ukotvena k rotoru, složeného z 10 14 podjednotek v membráně. Stator je otočen do matrix mitochondrie a je složen z transmembránových podjednotek, spojených s ostatními podjednotkami prodlouženým ramenem. Hlava ATP-synthasy je složena ze šesti podjednotek. Tři z nich obsahují vazebné místo pro ADP a anorganický fosfát. Přeměna na ATP je řízena změnou mechanické energie na energii chemické vazby způsobenou změnami v proteinové konformaci rotující části komplexu. (Alberts et al., 2002). Pro translokaci protonů přes vnitřní membránu byly navrženy dva mechanismy: redoxní smyčka a protonová pumpa. Mechanismus redoxní smyčky byl původně navržený Peterem Mitchellem (Mitchell, 1961). Principielně je tento mechanismus založen na redukci redoxního centra přenašeče, který přenáší jak elektrony, tak protony na matrixové straně membrány a jeho reoxidace následujícím centrem za uvolnění protonů na cytosolové straně membrány. Takovýmito přenašeči jsou v dýchacím řetězci FMN a CoQ. Mechanismus protonové pumpy je založen na změně konformace proteinu spojené s redoxní reakcí. Na matrixové straně membrány dojde k navázání n protonů na postranní řetězce aminokyselin, což způsobí konformační změnu. Reoxidací na cytosolové straně membrány dojde k uvolnění protonů do - 18 -
mezimembránového prostoru s opětnou změnou konformace pumpy. (Voet & Voetová 1995) 3.3 Produkce reaktivních kyslíkových radikálů mitochondriemi Volné radikály jsou atomy, molekuly nebo ionty schopny samostatné existence, které obsahují jeden nebo více nepárových elektronů ve valenčním orbitalu. Radikály reagují s neradikálními komponenty buňky v reakcích typu: (1) X + HY HX + Y (2) X + Y [ X Y] Volné radikály se pak mohou chovat jako iniciátoři a propagátoři řetězové reakce. Biologickým příkladem je lipidová peroxidace (Evans & Halliwell, 1999). V těle savců je produkována řada reaktivních radikálů kyslíku a dusíku (tab. 1) (Evans & Halliwell, 1999). Důležitým zdrojem kyslíkových reaktivních částic (ROS) je právě dýchací řetězec mitochondrií. První zmínka v literatuře o tom, že mitochondrie produkují ROS, pochází již z roku 1966. Průlomovou se stala práce Brittona Chance a jeho spolupracovníků, ve které poukazují na produkci peroxidu vodíku izolovanými mitochondriemi (Chance et al., 1979). Reaktivní kyslíkové částice přispívají k řadě patologických procesů zahrnujících stárnutí, apoptosu nebo buněčné poškození během ischemie a reperfuse. Elektrontransportní řetězec je hlavním zdrojem ROS u normálně metabolizující buňky, přičemž rychlost produkce ROS mitochondriemi se zvyšuje při různých patologických stavech jako je hypoxie, ischemie, reperfuse a chemická inhibice mitochondriální respirace. (Chen et al., 2003) ROS jsou látky, které obsahují kyslík a mají silné redukční vlastnosti. Jak již bylo řečeno, důležitým zdrojem ROS je dýchací řetězec mitochondrií, kde primárně vzniká superoxidový radikál (O - 2 ) a sekundárně peroxid vodíku (H 2 O 2 ) a také vysoce reaktivní hydroxylová radikál HO (Fridovich, 1986). - 19 -
Tabulka 1. Přehled některých reaktivních forem kyslíku a dusíku v lidském těle. (upraveno podle (Darley-Usmar & Halliwell, 1996)) Volné radikály REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU Látky které nejsou volnými radikály Superoxid, O 2 - Peroxid vodíku, H 2 O 2 Hydroxylový radikál, HO Kyselina chlorná, HOCl Peroxyl, ROO Ozon, O 3 Alkoxyl, RO Singletový kyslík, 1 O 2 Hydroperoxyl, HO 2 REAKTIVNÍ FORMY DUSÍKU Oxid dusnatý, NO Kyselina dusitá, HNO 3 Oxid dusičitý, NO 2 Nitrosylový kation, NO + Nitrosylový anion, NO - Oxid dusitý, N 2 O 3 Peroxynitrit, ONOO - Alkylperoxynitrit, ROONO - Superoxid vzniká jednoelektronovou redukcí molekulárního kyslíku O 2. V literatuře se uvádí, že v lidském těle mohou být vyprodukovány až 2 kg superoxidu za jeden rok, u atletů a lidí s chronickými infekcemi dokonce ještě více. Kromě mitochondrií je superoxid produkován ještě i aktivovanými fagocyty jako neutrofily, monocyty a eosinofily jako součást mechanismu, kterou zneškodňují cizorodé částice napadající tělo (Evans & Halliwell, 1999). Superoxid je v buňce rychle enzymaticky redukován na peroxid vodíku enzymem superoxiddismutasou (SOD), nebo spontánní disproporcionací (Fridovich, 1986). H 2 O 2 není radikál a s biomolekulami reaguje poměrně pomalu. V buňce je redukován enzymy katalasou nebo glutathionperoxidasou na vodu. V přítomnosti přechodných kovů (např. Fe 2+ nebo Cu + ) je však rychle redukován na vysoce reaktivní hydroxylový radikál HO (Camello-Almaraz et al., 2006) mechanismem známým jako Fentonova reakce (Cantu et al., 2009). V přítomnosti Fe 3+ a superoxidového radikálu dochází k Haber-Weissově reakci: - 20 -
mechanismus Haber-Weissovy reakce (Khan & Kasha, 1994): (3) O 2 - + H 2 O 2 HO + OH - + O 2 (4) Fe 3+ + O 2 - Fe 2+ + O 2 mechanismus Fentonovy reakce (Evans & Halliwell, 1999): (5) Fe 2+ + H 2 O 2 HO + OH - + Fe 3+ V literatuře se uvádí, že na tvorbu ROS neúplnou redukcí je spotřebováno 0,1 4 % kyslíku, který se vyskytuje v dýchacím řetězci (Richter, 1988). Mitochondrie dospělého člověka pojmou denně přibližně 400 litrů O 2 a přemění ho na vodu čtyřelektronovou redukcí v dýchacím řetězci. Když je pouhých 0,1% z tohoto množství kyslíku přeměněno chemicky jednodušší jedno-elektronovou redukcí, vyprodukuje mitochondrie 0,4 litru superoxidového radikálu (Skulachev, 2007) (Obr. 7) Jako hlavní producenti superoxidového radikálu jsou v literatuře uváděny komplexy I (NADH-UQ oxidoreduktasa) a III (UQ-cytochrom c oxidoreduktasa). Ty produkují malé množství O - 2 jako vedlejší produkt oxidativní fosforylace (Camello-Almaraz et al., 2006). Superoxid produkovaný komplexem I je uvolňován do matrix mitochondrie. Komplexem III je produkován jak částečně do matrix, tak i do mezimebránového prostoru. Velikost produkce kyslíkových radikálů komplexy dýchacího řetězce je závislá na druhu tkáně a na metabolickém stavu mitochondrie. (Boveris & Chance, 1973). Například u plně respirující mitochondrie ze srdečního svalu (která je charakterizovaná prudkým tokem elektronů, rychlou syntézou ATP, částečnou depolarizací a zmenšením poměru NADH/NAD +, odpovídá energetickému stavu 3) je převládajícím producentem superoxidu komplex III a generace superoxidu je závislá na rychlosti toku elektronů (Camello-Almaraz et al., 2006). Komplex I produkuje u normálně respirující mitochondrie, kde jsou elektrony přenášeny z NADH přímo na substráty a poměr NADH/NAD + je relativně malý, pouze velmi malé množství superoxidu. Ke zvýšení produkce dochází při inhibici dýchacího řetězce následkem poškození, mutace, ischemie, ztrátě cytochromu c nebo vlivem nahromadění NADH, způsobené nízkou spotřebou ATP. Vlivem nízké respirační rychlosti se zvýší poměr NADH/NAD + -, který vede ke zvýšené produkci O 2 (energetický stav 4) (Murphy, 2009). Druhý mechanismus, kterým je produkováno velké množství O 2 - je během RET (reverzního elektronového transportu). RET nastává při nízké respiraci a nízké produkci ATP, kdy jsou v přítomnosti vysoké - 21 -
protonmotivní síly hnány elektrony z CoQH 2 zpět na komplex I, kde mohou redukovat NAD + na NADH. Tento děj je pozorován např. u mitochondirí, které využívají sukcinát, jako substrát komplexu II. Rotenon, známý inhibitor dýchacího komplexu I. inhibuje komplex ve vazebném místě pro CoQ. V případě prvního mechanismu, dochází po inhibici rotenonem k zvýšení produkce superoxidu. V případě druhého mechanismu naopak k zastavení tvorby (Murphy, 2009). V matrix je superoxidový anion okamžitě přeměněný enzymem Mn-SOD (superoxiddismutasa) na H 2 O 2 a v mezimembránovém prostoru enzymem Zn- nebo Cu-SOD (Turrens, 2003). Výše popsané mechanismy byly stanoveny na základě výsledků experimentů ze studií s izolovanými mitochondriemi. Obrázek 7. Hlavní mechanismus tvorby reaktivních kyslíkových forem (ROS) v mitochondrii. Redukované substráty syntetizované metabolickými drahami přenášejí elektrony (e - ) na komplexy I a II elektron-transportního řetězce. Hlavními centry produkce superoxidového radikálu (O 2 - ) jsou komplexy I a III, ačkoliv malé množství vzniká i na komplexech II a IV. Ubichinon (Q) je redukován na ubichinol (QH 2) za současného přenesení elektronu na cytochrom c (Cy c). Vznikající semiubichinonový radikál (Q * ) je oxidován zpět na ubichinon cytochromem b (Cy b). V tomto místě může dojít k přenosu elektronů na kyslík za vzniku O 2 -. Inhibicí myxothiazolem (Myx) dojde ke snížení produkce O 2 -, protože se zamezí vzniku Q *, zatímco inhibicí antimycinem A (Ant A) se jeho produkce zvýší, zvýšením hladiny Q *. Rotenon inhibuje tok elektronů z komplexu I na komplex III a zvyšuje produkci O 2 -. Vyobrazená je pouze vnitřní mitochondriální membrána. (Převzato od (Camello-Almaraz et al., 2006)) Mezi produkcí reaktivních kyslíkových radikálů a antioxidační ochranou existuje v buňce rovnováha. Při nedostatku antioxidantů nebo vlivem velké nadprodukce ROS dojde k porušení této rovnováhy a buňka je vystavena oxidačnímu stresu, kdy obecně dochází k poškození buňky ve třech základních typech, a to: peroxidace lipidů (LPO), oxidace proteinů a mutace DNA, resp. mitdna. Nejcitlivějším místem pro atak radikálu v molekule mastné kyseliny je -CH 2 - skupina obklopená z obou stran dvojnou vazbou. Z toho důvodu často podléhají LPO polynenasycené mastné kyseliny, které jsou - 22 -
součástí fosfolipidové buněčné membrány (Bokov et al., 2004). Iniciátorem LPO je vysoce reaktivní hydroxylová radikál, který vzniká z peroxidu vodíku v přítomnosti Fe 2+ (reakce č.5 - Fentonova reakce) (Aruoma et al., 1989). LPO je řetězová reakce, po iniciaci radikálem následuje propagace a zakončena je terminací, tedy vytvořením neradikálového produktu, např. účinkem antioxidantů (vitamin E) (Schneider, 2009). Produkty lipidové peroxidace jsou mutagenní epoxidy, hydroxyperoxidy, lipidové alkoxyly a peroxylové radikály (Ames et al., 1993). Vzniklé lipidové hydroperoxidy mohou poškozovat buňku dvěma způsoby. Buď mohou narušit fluiditu membrány a funkci membránových proteinů, což může ohrozit funkci celé buňky, nebo může dojít ke vzniku reaktivních aldehydů jako je 4-hydroxynonenal (4-HNE) a malondialdehyd (MDH) (Girotti, 1998), který může napadnout další buněčné makromolekuly jako proteiny a DNA (Ran et al., 2007). Cílem ROS u proteinů jsou téměř všechny aminokyseliny, přičemž methionin a cystein jsou extrémně náchylné k oxidačnímu stresu (Bokov et al., 2004). Oxidativním poškozením DNA dochází ke zlomům vlákna, DNA-DNA a DNA-protein crosslink nebo změnu báze DNA, což má za následek syntézu poškozených proteinů, které mohou mít vliv na funkčnost buňky. mitdna je vzhledem ke své lokalizaci a nedostatku histonů citlivější na oxidativní poškození než jaderná DNA. Studie zabývající se Alzheimerovým onemocněním uvádějí jako marker oxidativního poškození DNA 8-hydroxy-2-deoxyguanosin, který vzniká hydroxylací C8 guaninu (Markesbery & Lovell, 2007). Oxidační poškození biopolymerů reaktivními kyslíkovými částicemi hraje podle Harmanové hypotézy volných radikálů hlavní roli v oslabování vitálních funkcí se stárnutím. S tím se shodují nálezy zvýšené produkce hladiny oxidativně poškozené DNA, proteinů a lipidů a zároveň snížení hladiny antioxidační ochrany v závislosti na stáří (Skulachev, 2007). - 23 -
Tabulka 2. Komponenty buňky poškozené reaktivními kyslíkovými částicemi. (Zadak et al., 2009) Komponenty buňky poškozené reaktivními kyslíkovými částicemi Lipidy peroxidace polynenasycených mastných kyselin v organele peroxidace lipidů (cholesterol) v buněčné membráně peroxidace (modifikace) low density lipoprotein (LDL) rozvoj atherosklerosy Proteiny oxidativní poškození skupin -SH (oxidace enzymů s obsahem -SH), inaktivace enzymů oxidativní poškození apolipoproteinu B - rozvoj atherosklerosy Uhlovodíky depolymerizace polysacharidů Nukleové kyseliny hydroxylace bazí cross-linkage štěpení vláken DNA Důsledky mutace, inhibice proteinů, syntézy nukleotidů a mastných kyselin 3.4 Endogenní enzymatická ochrana buňky proti ROS Buňka má vyvinutý obranný mechanismus přirozené detoxikace nebo zhasnutí volného radikálu, který je v těle vyprodukován. Do endogenní enzymatické ochrany buňky spadají tyto enzymy: superoxiddismutasa (SOD) (Fridovich, 1986), katalasa, glutationperoxidasa (GPx) a glutationreduktasa (GRd). (Tab. 2) SOD katalyzuje dismutaci O 2 - na H 2 O 2 v reakci: (6) O - 2 + O - 2 + H + H 2 O 2 + O 2 popsanou McCordem a Fridovichem před více než 25 lety (McCord & Fridovich, 1969). V současnosti jsou u savců známy tři isoformy SOD. Pro mitochondriální matrix je typická SOD obsahující mangan, Mn-SOD, označovaná také jako SOD2 (Weisiger & Fridovich, 1973). SOD1 (CuZn-SOD) se vyskytuje převážně v cytoplasmě a v oblasti jádra (Crapo et al., 1992) a SOD3 (EC-SOD) je převládající extracelulární antioxidační enzym (Marklund et al., 1982). Protože SOD produkuje H 2 O 2, pracuje ve spojení s enzymy, které peroxid vodíku odstraňují. Tím je například hemoprotein katalasa, - 24 -
obsahující čtyři hemové skupiny, která rozkládá peroxid vodíku (Maehly & Chance, 1954) v reakci: (7) H 2 O 2 H 2 O + O 2. Dalším důležitým enzymem, který vystupuje v antioxidační ochraně buňky před reaktivními kyslíkovými radikály je glutathionperoxidasa (GPx). Tento selenoenzym katalyzuje redukci H 2 O 2 a lipidových hydroperoxidů reakcí typu: (8) ROOH + 2GSH ROH + H 2 O + GSSG, a tím ochraňuje biomembrány a další důležité kompartmenty buňky proti oxidačnímu poškození (Little & O'Brien, 1968). Jsou známy čtyři typy glutathionperoxidasy, které nesou ve své molekule selen. Nejhojnější je GPx1, která je exprimována ve všech buňkách. GPx2 je exprimována v gastrointestinálním traktu a GPx3 v plazmě. GPx4 je známá jako glutathionperoxidasa fosfolipidových hydroxyperoxidů. Je exprimována plošně a je klíčovým enzymem detoxifikace lipidových hydroxyperoxidů (Girotti, 1998). Všechny čtyři typy GPx mohou redukovat peroxid vodíku, alkylové peroxidy a hydroperoxidy mastných kyselin. Avšak pouze GPx4 je schopna redukovat hydroperoxidy v lipoproteinech a lipidových komplexech odvozených od cholesterolu, cholesterylových esterů a fosfolipidů (Brigelius-Flohe, 1999). GPx4 má malou velikost a velký hydrofobní povrch, který jí umožňuje interagovat s komplexy lipidů v membráně, a tím detoxikovat lipidové hydroxyperoxidy. Dalším způsobem odstraňování lipidových hydroxyperoxidů z fosfolipidových hydroperoxidů v membráně je přes spřaženou reakci s fosfolipasou A 2 (PLA 2 ) a GPx1. PLA 2 nejprve odtrhne hydroxyperoxid mastné kyseliny z fosfolipidového hydroxyperoxidu v membráně a GPx1 poté redukuje hydroperoxid mastné kyseliny na alkohol a vodu. Z pohledu kinetiky, má však GPx4 vyšší afinitu k membránovým fosfolipidovým hydroperoxidům než PLA 2 (Antunes et al., 1995). Z toho důvodu je GPx4 považována za primární enzymatický obranný systém proti oxidačnímu poškození buněčných membrán (Brigelius-Flohe, 1999). Glutathion (GSH) je z disulfidu glutathionu (GSSG) regenerován působením enzymu glutathionreduktasy, který je závislí na dostupnosti NADPH (Meister, 1988). Tabulka 3. Přehled enzymů endogenní ochrany buňky proti ROS. Upraveno podle (Evans & Halliwell, 1999) Enzym Katalyzovaná reakce Superoxiddismutasa 2O - 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Glutathionperoxidasa 2GSH + H 2 O 2 GSSG + 2H 2 O Glutathionreduktasa GSSG + NADPH + H + 2GSH + NADP + Katalasa 2H 2 O 2 2 H 2 O+ O 2-25 -
3.5 Endogenní neenzymatická ochrana buňky proti ROS Kromě výše uvedených enzymů se na antioxidační ochraně buňky před nepříznivým vlivem volných kyslíkových radikálů podílejí i další endogenní neenzymatické komponenty buňky. Látky, které omezují aktivitu redikálů, zabraňují jeho vzniku nebo ho převádí do méně reaktivních, případně nereaktivních stavů, jsou obecně nazývány antioxidanty (Sies, 1997). Endogenní antioxidanty si organismus syntetizuje sám. Hlavním neenzymatickým antioxidantem v lidském těle, který hraje zásadní roli při udržování několika biochemických pochodů je koenzym Q (CoQ) nebo-li ubichinon. Je lokalizován ve všech tkáních a buňkách, a to především ve vnitřní mitochondriální membráně. Chemicky se jedná o 1,4-benzochinon s isoprenovým řetězcem. Lidský ubichinon obsahuje převážně 10 isoprenylových jednotek, je tedy označován jako CoQ 10. Důležitou fyziologickou funkci má CoQ v elektron-transportním řetězci, kde přenáší elektrony z komplexů I a II na komplex III. Zároveň však vystupuje jako v tucích rozpustný antioxidant a scavenger volných kyslíkových radikálů. V metabolismu buňky má ještě i další funkce (Turunen et al., 2004). Antioxidační účinek CoQ je zprostředkován především jeho redukovanou formou, tedy ubichinolem (Ernster & Dallner, 1995). Vzhledem k lokalizaci a lipofilitě látky spočívá jeho hlavní úloha v inhibici lipidové peroxidace (Bentinger et al., 2007). Primárně zabraňuje produkci lipidového peroxylového radikálu (LOO ) během iniciace přímou reakcí s LOO. Zároveň také regeneruje nejvýznamnější lipofilní antioxidant, vitamín E, z α- tokoferoxylového radikálu (podobně jako askorbát), a tím předchází propagaci lipidové peroxidace (Mukai et al., 1990). Na druhou stranu má CoQ také prooxidační vlastnosti, kdy ve formě semiubichinolového radikálu může vytvářet superoxidový radikál v dýchacím řetězci (viz kapitola 3.3). Glutathion (GSH) je tripeptid (γ-glutamylcysteinylglycin) a obecně se v buňce uplatňuje při detoxifikaci léků a xenobiotik, má tedy rozmanité funkce. Spolu s GSSG udržuje redoxní rovnováhu v buňce a díky redoxním vlastnostem páru GSH/GSSG se účastní regulace buněčného cyklu (Blokhina et al., 2003). Z pohledu antioxidační ochrany vystupuje jako kofaktor GSH-peroxidas, kde je během redukce peroxidu vodíku přeměněn na disulfid glutathionu (GSSG) (Kletzien et al., 1994). Dále je kofaktorem dehydroaskorbát reduktasy (DHA), což je enzym schopný regenerovat askorbát z oxidačního produktu dehydroaskorbátu, přičemž donorem elektronu je GSH. Dehydroaskorbát vzniká sledem reakcí askorbátu a volných radikálů. Tento mechanismus redukce oxidované formy zpět na kyselinu askorbovou umožňuje udržovat stálou hladinu askorbátu v buňce (Pompella et al., 2003). Dále reaguje neenzymově s peroxidem vodíku, singletovým kyslíkem, superoxidovým a - 26 -
hydroxylovým radikálem. Významnou funkcí glutathionu je udržování thiolových skupin enzymů v redukované formě, čímž zabraňuje jejich inaktivaci (Pompella et al., 2003). Dalším endogenním antioxidantem je indolamin melatonin, který působí jako vychytávač reaktivních radikálů a antioxidant, který má schopnost proniknout všemi morfofyziologickými bariérami a proniknout do všech částí buňky. Antioxidační kapacita melatoninu zahrnuje jak přímé zneškodnění toxického volného radikálu, tak nepřímé s využitím buněčného receptoru (Reiter, 2000). Při přímé reakci melatoninu s hydroxylovým radikálem vzniká poměrně nově objevený metabolit, a to cyklický 3- hydroxymelatonin. Ten je vylučován močí savců, v závislosti na množství melatoninu vzniklého endogenně nebo exogenně přijatého a na úrovni oxidativního stresu (Tan et al., 1998). Díky tomu by mohl být cenným biomarkerem tvorby hydroxylového radikálu in vivo, a zároveň i užitečným klinickým indexem oxidačního stavu jednotlivce nebo přítomnosti onemocnění způsobeného volnými radikály (Reiter, 2000). Tím však jeho antioxidační účinek nekončí. Je schopen neutralizovat také peroxid vodíku, singletový kyslík ( 1 O 2 ), nitroxid (NO ) a peroxynitritový anion (ONOO - ) (Pryor & Squadrito, 1995). Jak bylo uvedeno výše, melatonin působí na zneškodňování reaktivních radikálů také nepřímo, a to buď zvyšováním hladiny mrna nebo aktivity hlavních antioxidačních enzymů (SOD, GPx,...) Další skupinou neenzymových antioxidačních systémů jsou proteiny, které vážou ionty přechodných kovů. Železo je esenciální prvek nezbytný pro život, avšak jeho nadbytek působí toxicky. Ionty železa se účastní vzniku volných kyslíkových radikálů v Haber-Weissově (Fe 3+ Fe 2+ ) a následně ve Fentonově reakci (Fe 2+ Fe 3+ ) (kapitola 3.3). Vazbu iontů železa ve formě Fe 3+ a jeho transport na místo potřeby zajišťuje transferrin, glykoprotein syntetizovaný v játrach. Intracelulární zásobu železa představuje ferritin. Za jeden den je u člověka katabolisováno asi 20 ml červených krvinek, čímž se do těla uvolní asi 25 mg železa. Transferrin a ferritin toto volné železo váže a snižuje tím jeho potencionální toxicitu (Takami & Sakaida, 2011). Protein ceruloplazmin neenzymaticky oxiduje ionty Fe 2+ na Fe 3+ a umožňuje tak vazbu železitých iontů na transferrin (Yoshida et al., 2000). Některé studie uvádějí možnou souvislost mezi poklesem ceruloplazminu (Boll et al., 2008) s rozvojem Alzheimerovy a Parkinsonovy nemoci (Torsdottir et al., 2010), (Boll et al., 2008). Metalothioneiny tvoří rodinu malých proteinů bohatých na cystein. Buňku chrání proti oxidačnímu stresu a jako metalochaperony jsou zapojeny do udržování homeostázy zinku a mědi a (Sutherland & Stillman, 2011) zneškodňují superoxidový a hydroxylový radikál (Kumari et al., 1998). Kyselina močová je tradičně považovaná za inertní koncový metabolit degradace purinu u člověka. Avšak mnohé práce dokazují, že se jedná také o - 27 -
selektivní antioxidant, schopný reakce s hydroxylovým radikálem a kyselinou chlornou, za své přeměny na neškodný produkt (alantoin, glyoxylát, močovinu, oxalát) (Becker, 1993). α-lipoová kyselina, (vitamín B 13 ) vzniká v těle prostřednictvím metabolismu syntézy mastných kyselin. Působí jako koenzym některých mitochondriálních dehydrogenas (pyruvát dehydrogenasy a α-ketoglutarát dehydrogenasy). Její antioxidační účinky jsou známé již někdy z roku 1959 (Rosenberg & Culik, 1959). Kyselina lipoová se chová jako scavenger hydroxylového radikálu, radikálu kyseliny chlorné a singletového kyslíku. Také je schopna chelatovat přechodné kovy Cu 2+, Mn 2+ a Zn 2+ (Sigel et al., 1978). 3.6 Exogenní neenzymatická ochrana buňky proti ROS Látky podílející se na exogenní neenzymatické ochraně buňky se dostávají do organismu z vnějšího prostředí. Jedná se o velkou skupinu látek zahrnující např vitaminy, polyfenoly a odpřahovače (protonofory). 3.6.1 Vitaminy Kyselina askorbová (vitamín C), α-tokoferol (vitamín E) a karotenoidy (βkaroten provitamín A) hrají také důležitou roli v ochraně před poškozením způsobeným volnými radikály. Kyselina askorbová je jedním z nejdůležitějších ve vodě rozpustných antioxidantů buňky. Její antioxidační ochrana spočívá ve vychytávání (scavengingu) ROS jako jsou superoxidový a hydroxylový radikál a singletový kyslík. Zároveň je vitamin C považován za tak zvaný chain-breaking scavenger pro peroxylový radikál. Působí rovněž synergicky s vitamínem E. Vitamín C je schopný regenerovat α-tokoferol z tokoferolového radikálu, který vzniká reakcí s jinými (Halliwell, 1996). α-tokoferol je pro člověka nejdůležitější v tucích rozpustný chainbreaking antioxidant. Je lokalizován ve fosfolipidové dvouvrstvě buněčných membrán. Nejdůležitější funkcí vitaminu E jakožto antioxidantu je ochrana buňky před lipidovou peroxidací. Má totiž schopnost přímo zhášet peroxylový radikál, čímž zamezuje propagaci lipidové peroxidace během autooxidace. Zdá se tedy, že oba tyto vitamíny, C a E, snižují následky lipidové peroxidace nebo jí přímo zamezují (Halliwell, 1989). Karotenoidy jsou také velice silnými antioxidanty. Bývají spojovány se zhášením dvou ROS, a tím je singletový molekulární kyslík a peroxylový radikál. Početné epidemiologické studie odhalily, že se zvyšující se spotřebou stravy bohaté na kyselinu askorbovou, α-tokoferol a karotenoidy souvisí zmenšování rizika pro rozvoj některých - 28 -
degenerativních onemocnění, jako jsou různé typy karcinomu, kardiovaskulární nebo oftalmologická onemocnění (Anderson & Phillips, 1999), (Stahl & Sies, 2005). 3.6.2 Polyfenoly Polyfenoly jsou běžnou součástí stravy rostlinného původu a hlavní skupinou antioxidantů v potravě. Největším zdrojem polyfenolů je ovoce (Scalbert & Williamson, 2000) V potravě bylo identifikováno několik set různých polyfenolů. Rozdělují se na flavonoidy, fenolické kyseliny, stilbeny a lignany. Přírodní flavonoidy se nejčastěji vyskytují ve formě O-glykosidů, obsahují tedy ve své molekule necukernou součást (aglykon) a cukernou složku. Flavonoidy se dále rozdělují na flavony, flavonoly, flavanoly, flavanony, isoflavony, proanthokyanidiny a anthokyanidy (Manach et al., 2004). Biodostupnost polyfenolů se výrazně liší jeden od druhého, takže polyfenoly, které jsou nejvíce zastoupeny v dietě, nemusí nutně dosahovat nejvyšších koncentrací aktivních metabolitů v cílové tkáni. Metabolit přítomný v krvi se obvykle liší od původního polyfenolu, který prošel trávicím traktem a játry. Z různých studií zaměřených na kinetiku a rozsah vstřebávání u dospělých po podání čisté dávky rostlinného extraktu nebo celé potraviny vyplývá, že koncentrace celkového metabolitu v plazmě se pohybuje v rozmezí od 0 do 4 µmol/l s příjmem 50 mg aglykonového ekvivalentu. Nejlépe se vstřebávají isoflavony a kyselina gallová, za nimi následují katechiny, flavanony a glukosidy quercetinu. Hůře se vstřebávají proanthokyanidiny, gallolyované čajové katechiny a anthokyaniny (Manach et al., 2005). O polyfenolických antioxidantech v potravě je obecně známo, že mohou pomáhat snižovat výskyt různých druhů rakoviny, kardiovaskulárních a neurodegenerativních onemocnění a poškození DNA a dokonce mohou mít vlastnosti zpomalující stárnutí (Obrenovich et al.). Mechanismus účinku je pro různé polyfenolické antioxidanty odlišný. Mohou ovlivňovat rozmanité molekulární cíle přímou aktivací receptorů, které mohou být nezávislé na jejich antioxidační aktivitě. Mimo to mohou působit na signální transdukční dráhy (Romier et al., 2009). Kromě přímého zhášení ROS (Obr. 8) mohou některé polyfenoly chelatovat ionty přechodných kovů (Fe 2+, Cu + ), čímž také přispívají ke snížení oxidačního stresu (Kumamoto et al., 2001). Polyfenoly se dávají často do kontextu s tzv. Francouzským paradoxem. Francie a Itálie jsou dva hlavní evropští producenti vína a lidé žijící v těhcto zemích trpí relativně nízkým výskytem akutních srdečních příhod, navzdory jejich jídelníčku bohatému na nasycené tuky. Jedním vysvětlením pro Francouzský paradox může být v tom, že středomořská strava je bohatá na ovoce, vlákninu a vitamíny (Labinskyy et al., 2006). Dalším faktem však je, že červené víno obsahuje polyfenoly. A zejména flavonoidy - 29 -