Vývoj postupu extrakce pro izolaci pravastatinu a jeho metabolitu z biologického materiálu pomocí SPE

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Vývoj postupu extrakce pro izolaci pravastatinu a jeho metabolitu z biologického materiálu pomocí SPE RIGORÓZNÍ PRÁCE Autor práce Mgr. MARTINA RABATINOVÁ Vedoucí práce Doc. PharmDr. LUCIE NOVÁKOVÁ, Ph.D. Vedoucí katedry Prof. RNDr. PETR SOLICH, CSc. Datum HRADEC KRÁLOVÉ 2012

Abstrakt Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Mgr. Martina Rabatinová Školitel: Doc. PharmDr. Lucie Nováková, Ph.D. Název rigorózní práce: Vývoj postupu extrakce pro izolaci pravastatinu a jeho metabolitu z biologického materiálu pomocí SPE Statiny jsou skupinou léčiv používaných ke snižování hladin cholesterolu. Jde o inhibitory 3-hydroxy-3-metylglutaryl-koenzym A reduktázy. Tato práce se zabývá vývojem metody pro kvalitativní a kvantitativní analýzu pravastatinu a pravastatinu laktonu v potkaní moči. Metoda byla využita pro farmakokinetickou studii. Extrakce z biologického materiálu byla provedena na SPE kolonce Discovery DSC-18. Promývací i eluční činidla byla složena z vhodných poměrů acetonitrilu a 10 mm pufru octanu amonného, ph 4,5. Množství extrakčních kroků bylo optimalizováno tak, aby došlo k eliminaci většiny matricových nečistot. Jako separační a detekční technika byla využita ultravysokoúčinná kapalinová chromatografie ve spojení s hmotnostně spektrometrickým detektorem typu trojitého kvadrupólu. Separace byla provedena na koloně BEH C18 2, 1 100 mm s částicemi o velikosti 1, 7 µm. Jako mobilní fáze byla vybrána směs acetonitrilu a 0, 5 mm roztoku octanu amonného o ph 4,0. Analýza probíhala při podmínkách gradientové eluce s celkovým časem analýzy 6 minut včetně ekvilibrace. Ionizační technikou byla ionizace elektrosprejem. Při měření bylo využito možnosti přepínání polarity. Pro správnou kvantifikaci bylo využito SRM módu a vnitřního standardu v podobě deuteriem značeného pravastatinu. Sledovanými iontovými přechody byly hmoty 422,9 321,1 pro pravastatin, 407,1 183,2 pro pravastatin lakton; 424,2 407,3 pro amonný adukt pravastatinu laktonu a 425,9 321,1 pro vnitřní standard. Metoda byla validována. Standardní kalibrační křivka se SIL IS byla lineární v rozmezí hodnot 5 10 9 1 10 6 mol/l. Matricová kalibrační křivka se SIL IS vykazovala linearitu v rozmezí 5 10 9 5 10 7 mol/l. Průměrný korelační koeficient byl 0,9999. Limit detekce pro sledované analyty u obou křivek byl 1, 5 10 9 mol/l, limit kvantifikace byl 5 10 9 mol/l. Výtěžnost pravastatinu se pohybovala v rozmezí 94-96% a pravastatin laktonu 94-97%. Při analýze se projevily pozitivní matricové efekty do 27%. Validovaná metoda byla výchozím postupem pro extrakci MEPS, která byla v praxi použita pro měření biologických vzorků potkaní moči. Klíčová slova pravastatin, pravastatin lakton, potkaní moč, UHPLC-MS/MS, ESI, validace metody

Abstract Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Mgr. Martina Rabatinová Supervisor: Doc. PharmDr. Lucie Nováková, Ph.D. Title of Rigorous Thesis: The development of SPE extraction procedure for isolation of pravastatin and its metabolite from biological matrix Statins are a class of drugs used to lower cholesterol levels. Statins have an inhibitory activity against 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. The main purpose of this work was to develop and validate a quantitative method for sensitive analysis of pravastatin and pravastatin lactone. The analytes were extracted from rat urine by a solid phase extraction method. In this method urine samples were prepared on C18 Discovery DSC-18. Washing and elution agents consisted of a mixture of acetonitrile and 0.01 M ammonium acetate buffer, ph 4.5. Number of extraction steps were optimized to eliminate most of matrix effects. The method involved use of ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Chromatography was carried out on a BEH C18 1.7 µm, 2.1 100 mm column. A mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile and 0.5 mm ammonium acetate solution, ph 4.0. Linear gradient conditions were used. Total run time of this analysis was 6 minutes including equilibration. Monitored components were ionized by the electrospray ionization. Subsequently they were detected by a highly selective triple quadrupole mass spectrometer in the SRM mode. A deuterium labeled pravastatin was used as the stable isotopically labeled internal standard. The SRM ion transitions monitored were 422.9 321.1 for pravastatin, 407.1 183.2 for pravastatin lactone, 424.2 407.3 pravastatin lactone amonium adduct iont and 425.9 321.1 for internal standard. The method was validated. It provided excellent linearity in range 5 10 9 1 10 6 mol/l for standard calibration curve and 5 10 9 5 10 7 mol/l for matrix calibration curve. The limit of quantitation was 5 10 9 mol/l for both pravastatin and pravastatin lactone. The limit of detection was 1.5 10 9 mol/l. The average correlation coefficient was 0.9999. Positive matrix effects were lower than 27%. Recoveries for pravastatin were 94-96% and for pravastatin lactone 94-97%. Validated method was the starting procedure for the MEPS extraction. It was used in practice for measuring biological samples of rat urine. Keywords pravastatin, pravastatin lactone, rat urine, UHPLC-MS/MS, ESI, method validation

Prohlášení Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a jsou v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové dne 10. července 2012 Mgr. Martina Rabatinová Poděkování Můj velký dík patří skvělé kolegyni Mgr. Haně Vlčkové, Ph.D., která mne při vypracování této rigorózní práce zodpovědně vedla a byla mi výborným poradcem. Tuto práci jsem mohla sepsat na základě cenných rad, postřehů a zkušeností o něž se se mnou podělila má školitelka Doc. PharmDr. Lucie Nováková, Ph.D. Tímto bych oběma za vše chtěla velmi poděkovat. Mé poděkování patří i Katedře analytické chemie, která mi umožnila pracovat na systému UHPLC-MS. V neposlední řadě bych s radostí vyjádřila velký dík svým rodičům, kteří mne vždy bezmezně podporovali a motivovali. A člověk, kterému jsem vděčná ze všech nejvíce, je můj skvělý přítel, který mi byl rádcem i trpělivou oporou. Můj dík patří všem, kteří mne během mého studia podporovali.

Obsah 1 Seznam použitých zkratek 7 2 Úvod 9 3 Cíl a popis zadání práce 10 4 Teoretická část 11 4.1 Bioanalytické metody.............................. 11 4.1.1 Extrakce z kapaliny do kapaliny, LLE................. 13 4.1.2 Extrakce na tuhé fázi, SPE...................... 13 4.1.3 Mikroextrakce tuhým sorbentem, MEPS............... 16 4.2 Trendy v kapalinové chromatografii...................... 18 4.2.1 Ultravysokoúčinná kapalinová chromatografie, UHPLC....... 18 4.2.2 Monolitické kolony........................... 20 4.2.3 Kolony s částicemi obsahujícími porézní slupku........... 21 4.2.4 Hydrofilní interakční kapalinová chromatografie, HILIC....... 21 4.2.5 Vysokoteplotní kapalinová chromatografie, HTLC.......... 22 4.3 Trendy ve spojení LC-MS........................... 23 4.3.1 Hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením, HRMS...... 23 4.3.2 Využití HRMS v praxi......................... 25 4.4 Validace analytických metod.......................... 26 4.5 Lipidy...................................... 28 4.5.1 Struktura lipidů............................. 28 4.5.2 Hyperlipoproteinemické stavy..................... 29 4.5.3 Terapie poruch metabolismu lipidů.................. 31 4.6 Statiny...................................... 32 4.6.1 Molekulární úroveň........................... 35 4.6.2 Klinické použití statinů......................... 35 4.6.3 Nežádoucí účinky statinů........................ 36 4.7 Pravastatin................................... 38 4.7.1 Výhody pravastatinu.......................... 38 4.7.2 Analytické hodnocení pravastatinu.................. 39 5 Experimentální část 42 5.1 Použité chemikálie a přístroje......................... 42 5.1.1 Standardní látky............................ 42 5.1.2 Rozpouštědla.............................. 42 5.1.3 Další látky................................ 43 5

5.1.4 Přístrojové vybavení a sorbenty.................... 43 5.2 Pracovní postup................................. 45 5.2.1 Příprava roztoku pro ředění zásobních roztoků............ 45 5.2.2 Příprava zásobních roztoků...................... 45 5.2.3 Příprava pracovních roztoků...................... 45 5.2.4 Stabilita analytů............................ 45 5.2.5 Potkaní moč............................... 46 5.2.6 Příprava aditiv mobilní fáze...................... 46 5.2.7 Příprava roztoků pro SPE extrakci.................. 46 5.2.8 Optimalizace UHPLC podmínek.................... 47 5.2.9 Optimalizace podmínek pro MS detekci................ 47 5.2.10 Optimalizace SPE podmínek...................... 47 5.2.11 Validace analytické metody...................... 48 5.2.12 Biologické vzorky............................ 49 6 Výsledky a diskuze 50 6.1 Optimalizace UHPLC podmínek........................ 50 6.1.1 Stacionární fáze............................. 50 6.1.2 Volba optimální mobilní fáze...................... 50 6.1.3 Nastavení nejvhodnějších podmínek pro UHPLC........... 53 6.2 Optimalizace hmotnostní spektrometrie.................... 54 6.2.1 Optimalizace v MS módu....................... 54 6.2.2 Optimalizace v MS/MS módu..................... 56 6.3 Optimalizace SPE podmínek.......................... 61 6.3.1 Volba SPE podmínek pro roztok směsi standardů.......... 61 6.3.2 Volba SPE podmínek pro obohacenou potkaní moč......... 64 6.4 Validace metody pro obohacenou potkaní moč................ 71 6.4.1 Opakovatelnost nástřiku, SST..................... 71 6.4.2 Linearita a citlivost metody...................... 71 6.4.3 Správnost metody............................ 71 6.4.4 Přesnost metody............................ 72 6.4.5 Matricové efekty............................ 72 6.5 Biologické vzorky................................ 73 7 Závěr 76 Literatura 77 6

Kapitola 1 Seznam použitých zkratek Zkratka Název ACN Acetonitril APCI Chemická ionizace za atmosférického tlaku AmAc Octan amonný BEH Hybridní částice s ethylovými můstky CHMP Vědecký výbor pro léčivé přípravky pro humánní použití CRP C-reaktivní protein CYP Cytochrom P450 CYP1A2 Cytochrom P450 rodina 1, podrodina A, polypeptid 2 CYP2A6 Cytochrom P450 rodina 2, podrodina A, polypeptid 6 CYP2C9 Cytochrom P450 rodina 2, podrodina C, polypeptid 9 CYP2D6 Cytochrom P450 rodina 2, podrodina D, polypeptid 6 CYP2E1 Cytochrom P450 rodina 2, podrodina E, polypeptid 1 CYP3A4 Cytochrom P450 rodina 3, podrodina A, polypeptid 4 DAD Detektor diodového pole ELISA Enzymová imunoanalýza EMA Evropská léková agentura ESI Ionizace elektrosprejem GC Plynová chromatografie HDL Lipoproteiny vysoké hustoty HILIC Hydrofilní interakční kapalinová chromatografie HMG-CoA 3-hydroxy-3-metylglutaryl-koenzym A HPLC, LC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HRMS Hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením HTLC Vysokoteplotní kapalinová chromatografie IDL Lipoproteiny střední hustoty ICH International conference on harmonisation ICHDK Ischemická choroba dolních končetin ICHS Ischemická choroba srdeční ICR Iontová cyklotronová rezonance IL-6 Interleukin 6 LDL Lipoproteiny nízké hustoty LLE Extrakce z kapaliny do kapaliny LLME Mikroextrakce z kapaliny do kapaliny LOD Limit detekce LOQ Limit kvantifikace ME Matricový efekt MeOH Metanol MEPS Mikroextrakce tuhým sorbentem MIP Molekulárně vtištěné polymery 7

Mr MS MS/MS m/z NCI PP PV PV d3 PVL PVL d3 PVL NH 4 QqQ RAM RSD SCORE SIL IS SIM SPE SPME SRM SST S/N TOF UHPLC UV VLDL WHO Relativní molekulová hmotnost Hmotnostní spektrometrie Tandemová hmotnostní spektrometrie Poměr hmoty a náboje Negativní chemická ionizace Srážení proteinů Pravastatin Pravastatin deuteriem značený Pravastatin lakton Pravastatin lakton deuteriem značený Pravastatin lakton amonný adukt Trojitý kvadrupól Materiál s omezeným přístupem Relativní směrodatná odchylka Odhad rizika ICHS podle WHO Stabilní izotopicky značený vnitřní standard Fixní mód, monitorování vybraného iontu Extrakce na tuhé fázi Mikroextrakce na tuhé fázi Monitorování vybrané reakce Test způsobilosti systému Poměr signálu a šumu Analyzátor doby letu Ultravysokoúčinná kapalinová chromatografie Ultrafialový Lipoproteiny velmi nízké hustoty Světová zdravotnická organizace 8

Kapitola 2 Úvod Příprava biologických vzorků je nepostradatelnou součástí analytických metod pro farmaceutický průmysl i pro medicínu. Reálné vzorky, jakými jsou např. plazma a moč, jsou složitými komplexními matricemi. Účelem těchto stanovení je sledování farmakokinetiky, hledání nových nadějných molekul, dále stanovování individuálního dávkovacího schématu a další. Jde o vysoce náročnou problematiku. Různorodou matrici se směsí analytů nelze použít přímo pro vlastní analýzu na citlivých přístrojích. Z tohoto důvodu separaci většinou předchází příprava vzorku neboli sample preparation. Poté může následovat vlastní separace a detekce. Potřeba intenzivního screeningu velkého množství různých biologických procesů vyžaduje vývoj spolehlivých, rychlých, ekologických a levných technik. Proto jde současný trend přípravy vzorků směrem automatizace, miniaturizace a on-line zapojení přímo na vybranou separační techniku. Jednou ze skupin léčiv, u níž je vyžadován intenzivní bioanalytický screening, jsou statiny, které jsou v současnosti nejúčinnější hypocholesterolemickou léčbou. Jedná se o inhibitory 3-hydroxy-3-metylglutaryl-koenzym A reduktázy. Z jater pocházející cholesterol je hlavním zdrojem hypercholesterolémie, která je významným rizikovým faktorem rozvoje kardiovaskulárních onemocnění. Nástup inhibitorů HMG-CoA reduktázy znamená převrat nejen v léčbě hypercholesterolémie, ale i v terapii zcela odlišných onemocnění jako jsou Alzheimerova choroba či diabetes mellitus. Ačkoliv jsou statiny dobře tolerovány většinou pacientů, mohou se u některých projevit vedlejší účinky související s myotoxicitou, které se musí věnovat dostatečná pozornost. Velmi nebezpečná je statiny způsobená rabdomyolýza, která může vést až k úmrtí. Bylo zjištěno, že rizikovými zástupci statinů jsou především lipofilní molekuly. Zatímco statiny s hydrofilní molekulou, jako např. pravastatin, mají nižší myotoxický potenciál. A právě dobrá znalost molekulární úrovně účinku a interakcí statinů napomůže zvýšit bezpečnostní profil při jejich používání a rozšířit jejich klinické využití. 9

Kapitola 3 Cíl a popis zadání práce Cílem rigorózní práce byly vývoj a validace extrakční, separační a detekční techniky pro analýzu pravastatinu a pravastatinu laktonu z biologického materiálu. Tyto molekuly patří do skupiny velmi významných hypolipidemik, tzv. statinů. Pravastatin je jedním z hydrofilních zástupců. Požadavkem bylo vyvinout optimální metodu kvantitativního vyhodnocení hladin sledovaných analytů v moči pro farmakokinetickou studii prováděnou na potkanech. Smyslem bylo získat rychlou, citlivou, přesnou a nákladově nenáročnou analytickou metodu. Pro tuto úlohu byl zvolen přístroj UHPLC s hmotnostním spektrometrem typu trojitého kvadrupólu. Kvantifikace byla provedena pomocí SRM módu. Snahou operátora bylo odstranit interferující matrici biologického materiálu v co největší míře. Pro stanovení látek bylo nutné vyvinout spolehlivý postup extrakce na tuhé fázi pomocí vhodně zvolených promývacích a elučních kroků. 10

Kapitola 4 Teoretická část 4.1 Bioanalytické metody Cílem analytických metod je získat informace o složení vzorku. V současné době je vynakládáno obrovské úsilí na vývoj nových, rychlejších, přesnějších, správnějších a méně nákladných analytických technik. Existuje široká škála jednotlivých analytických specializací. Jednou velmi významnou skupinou je obor medicíny. Bioanalytické metody zahrnují metody používané při sledování léčiv v biologickém materiálu. Takové metody mají různé účely: vyhodnocování farmakokinetiky nebo objevování nových struktur jako potenciálních kandidátů léčivých molekul. Používají se dále k porovnání farmakokinetických profilů nově vyvinutých generických léků, odhalení interindividuální metabolické variability a stanovení vhodného dávkování za účelem snížení výskytu nežádoucích účinků a k odhalení léčiv a jejich metabolitů ve forenzní toxikologii. Ve farmaceutickém průmyslu a medicíně jsou bioanalytické metody zcela nepostradatelné. Navíc se nedávno zvýšilo sledování farmaceutických reziduí v životním prostředí a tak se i toto zaměření stalo významným analytickým odvětvím [1, 2]. Potřeba masivního screeningu různých biologických procesů vyžaduje vývoj rychlých, spolehlivých a levných analytických postupů. Požadavek pro takové metody je často doprovázen zvyšujícím se počtem biologických vzorků vyžadujících rychlou kvantitativní analýzu. A proto jsou nutné vhodně designované, rychlé, účinné a citlivé bioanalytické metody. Rychlejší proces měření urychlí schvalování léčiva regulačním orgánem. Spolehlivá bioanalytická metoda, která je vhodná pro zamýšlený účel splňuje požadavky validace, včetně správnosti, přesnosti, selektivity, citlivosti, opakovatelnosti a stability [1, 3, 4]. Stanovování léčiv je multidisciplinární otázkou [2]. Sledovaný analyt či směs se nachází v komplexu složité biologické matrice. Nejčastěji jde o plazmu či moč. Mezi další lze zařadit například sputum, pot, mozkomíšní mok, stolici a další. Jedná se často o makromolekulární látky organického či anorganického původu [3]. Bioanalytická metoda zahrnuje několik kroků. Všechny jsou nezbytné pro získání spolehlivých výsledků [1, 5]. Obrázek číslo 4.1 znázorňuje rozložení jednotivých fází při organické stopové analýze v závislosti na časové náročnosti a úsilí pro něj vynaložené. Přes 60% celkového času zabírá příprava vzorku, zatímco sběr vzorku a vlastní analýza trvají minimální čas a to necelých 13% z celkové doby. Relativně náročné je zpracování a vyhodnocování naměřených dat. Z toho plynou potenciální chyby, které mohou negativně ovlivnit výsledky. Je zřejmé, že chyba vytvořená v některém z prvních kroků není opravitelná žádnou ze sofistikovaných přístrojových metod. Proto důležitost a významnost prvních kroků nesmí být podceňována. Stopová analýza navíc vyžaduje dokonalejší přípravu vzorků [2, 5, 6, 7]. 11

Příprava vzorku,, Sběr vzorku,, Vlastní analýza Zpracování dat Obrázek 4.1: Porovnání náročnosti jednotlivých kroků analytické metody. Ve většině případů různorodou matrici se směsí analytů nelze přímo použít pro separaci na velmi citlivých analytických přístrojích. Proto je zapotřebí několika kroků přípravy vzorků (sample preparation), po níž následují separace a detekce [3]. Vhodný proces přípravy vzorků dokáže vyizolovat sledované analyty z komplexní matrice při odstranění endogenních interferujících látek. Jde často o časově velmi náročný krok a zároveň kritický krok celé analýzy [1, 5]. Kroky s nimiž se běžně setkáváme jsou zobrazeny v následujícím schématu: Homogenizace Extrakce Zakoncentrování Přečištění Extrakční krok je součástí přípravy vzorků. Dále dochází k zakoncentrování látky v extraktu. V případě, že množství rozpouštědla není velké a analyt je netěkavý, rozpouštědlo může být odpařeno mírným proudem dusíku. Pokud je zapotřebí odpařit velké množství rozpouštědla, výše zmíněný postup již není efektivní a proto se používá rotační vakuová odparka. Když je potřeba odpařit velmi malé množství rozpouštědla, tedy méně než 1 ml, používá se koncentrátor Kuderna-Danish. Přečištění vzorku (clean-up) je důležité pro analytickou separaci jakou je např. plynová chromatografie (GC), kapalinová chromatografie (LC) nebo elektroforéza. Mnohé pevné matrice, jakými jsou biologický materiál a rostlinné extrakty, mohou obsahovat stovky různých sloučenin, které by tvořily komplexní chromatogramy, kde by bylo velmi obtížné identifikovat analyt. To platí především tehdy, pokud je sledovaná látka v mnohem nižší koncentraci než interferující látky. Vysoce kontaminované vzorky mohou vyžadovat hned několik po sobě jdoucích čistících kroků. Na druhou stranu vzorky pitné vody jsou relativně čisté a nevyžadují žádný čistící krok [5]. Příprava vzorků běžně probíhá formou srážení proteinů (PP), extrakce z kapaliny do kapaliny (LLE) či extrakce na tuhé fázi (SPE). Manuální operace spojené s těmito konvenčními procesy jsou finančně i časově nákladné a jsou složeny z mnoha kroků. Z tohoto důvodu bylo během posledního desetiletí vyvinuto velké množství různých technik pro přípravu vzorků. Mezi moderní extrakční metody patří materiál s omezeným přístupem (RAM), molekulárně vtištěné polymery (MIP), mikroextrakce na tuhé fázi (SPME), mikroextrakce z kapaliny do kapaliny (LLME), mikroextrakce tuhým sorbentem (MEPS) a mnoho dalších [1, 7]. Jakmile je příprava vzorku kompletní, může být analýza vykonána na vybraném přístroji [5]. Kapalinová chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) se nepochybně stala metodou volby [1, 2]. V dnešní době je trendem minimalizovat proces přípravy vzorku a urychlit analýzu jak jen je to nejvíce možné. Příprava 12

vzorků je často vykonávána off-line a stává se limitujícím krokem rychlé bioanalýzy. Zavedení on-line přípravy vzorků značně zrychlí celou analýzu. Množství vzorků navíc zvyšuje spotřebu rozpouštědel [3]. Současným trendem požadavků na přípravu vzorků je automatizace, miniaturizace, spotřeba malého objemu rozpouštědel, krátký čas a on-line propojení jednotky vykonávající přípravu vzorků, separaci i detekci [1, 3]. 4.1.1 Extrakce z kapaliny do kapaliny, LLE Základní princip metody LLE je snadný. Principem je přechod sledované látky z původní kapaliny do kapaliny druhé s co nejvyšším stupněm selektivity [5, 6]. Celý proces závisí na rozdělovacím koeficientu. Podmínkou extrakce je tedy vzájemná nemísitelnost obou kapalin. V praxi je jedna fáze obvykle vodná, zatímco druhá je organické rozpouštědlo. Jako organická fáze může být použit například dichlormetan. Extrakce je vhodná, pokud má sledovaný analyt dostatečnou rozpustnost ve zvoleném organickém rozpouštědle. Upravením ph matrice na nižší či vyšší hodnotu se může cílová látka stát elektricky neutrální a tak může získat větší rozpustnost právě ve druhé kapalině [6]. Extrakce z kapaliny do kapaliny byla jednou z prvních technik přípravy vzorků a zůstala dosud široce používanou technikou pro oblast bioanalýzy. Avšak některé nedostatky, jakými jsou vznik emulzí, časová náročnost, používání velkého objemu rozpouštědel, toxická organická rozpouštědla, tvorba velkého objemu odpadu a škodlivost pro životní prostředí, nutí laboratoře hledat nové a modernější metody. Jinou nevýhodou LLE je její nevhodnost pro hydrofilní sloučeniny. Jedním z pozitiv je možnost automatizace [1, 6, 7]. 4.1.2 Extrakce na tuhé fázi, SPE Jde o přečišťovací metodu, která je široce používána při přípravě biologických, klinických a environmentálních vzorků [5, 6]. Výraz "solid-phase extraction"(spe) byl poprvé použit v roce 1982 [5]. Metoda dosahuje relativně selektivní extrakce a zakoncentrování cílových analytů z libovolné tekuté matrice na vhodnou pevnou fázi tedy sorbent [6]. Vývoj této metody má mnoho společného s LC [1]. SPE je dnes nejběžnější technikou využívanou pro přípravu vzorků [3]. Tato technika nalezla uplatnění především ve spojení s chromatografickými metodami [1]. SPE sorbenty Výběr tuhé fáze je klíčovým faktorem celého procesu. Volba významně závisí na analytu a jeho fyzikálně-chemických vlastnostech, které definují interakce s vybraným sorbentem. Úspěšná SPE extrakce musí splňovat následující požadavky: za prvé, navázání vysokého a reprodukovatelného množství analytu na sorbent a za druhé, jeho snadné a dostatečné vymytí. Celý sorpční proces musí být reverzibilní. Kromě toho by SPE sorbent měl být porézní s velkou povrchovou plochou [1, 5]. Sorbenty jsou jak s normální, tak s reverzní fází. Jako nosič je používán silikagel, který se skládá ze siloxanových můstků -Si-O-Si- a silanolových skupin -Si-OH. Porézní silikagel je anorganický polymer používaný jako sorbent sám o sobě a zároveň pro přípravu dalších skupin sorbentů. Jeho polární skupiny jsou obměňovány polárními i nepolárními funkčními skupinami. Mohou být navázány například aminopropylové, kyanopropylové, diolové, fenylové nebo oktadecylové funkční skupiny [5]. Široká škála SPE sorbentů dovoluje různorodou selektivitu [1]. Interakce mezi analytem a sorbentem jsou ovládány polárními silami včetně vodíkových vazeb, interakcí dipól-dipól a π-π interakcí. Částice používané pro SPE sorbenty jsou tvarovány nesouměrně, mají 40 60 µm v průměru. Zatímco silikagelové částice používané pro sorbenty kolon ve vysokoúčinné kapalinové 13

chromatografii (HPLC) jsou kulovité částečky o průměru 3 µm až 5 µm. Kvůli rozdílu ve velikostech i tvaru jsou SPE sorbenty mnohem méně nákladné než sorbenty pro HPLC [5]. Existují 3 rozdílné formáty pro SPE extrakci: kolonky, disky a platíčka [3]. Popis typické SPE kolonky je uveden na obrázku 4.2. Každá kolonka se skládá z těla, frit a SPE sorbentu. Objem těla je variabilní podle potřeb. Mezi fritami je umístěno definované množstvím sorbentu [5]. tělo sorbent frity Obrázek 4.2: Popis SPE kolonky se sorbentem. Výsledky extrakce závisí na typu matrice a na její interakci s vybraným sorbentem. Silikagelové sorbenty mohou vykazovat nestabilitu při ph < 2 nebo > 8. Přítomné silanoly mohou být příčinou nevratného navázání některých skupin, jakými jsou například tetracyklíny [1]. Metodologie SPE techniky Při SPE jsou analyty rozděleny mezi pevnou fázi a kapalnou fázi. Analyty musí vykazovat mnohem vyšší afinitu k pevné fázi nežli k původní matrici vzorku. Retence zahrnuje nepolární, polární i iontové interakce [1]. SPE je několikastupňový proces, avšak s mnoha kroky stoupá bohužel i riziko vzniku chyby [6]. Obecně SPE postup zahrnuje 4 kroky [5]: 1. Kondicionace, aktivace sorbentu Kondicionace sorbentu je součástí extrakce. Je nezbytná před každou aplikací vlastního vzorku. Zajišťuje opakovatelnost záchytu sledované látky. Jedná se o připravení sorbentu pro přijmutí vzorku. Aktivačním činidlem bývá acetonitril nebo metanol. Základní pufr se používá pro ustálení ph podmínek, které jsou blízké sledovanému vzorku. 2. Retence analytu V tomto kroku dochází k nanesení vzorku na SPE kolonku. Vzorek postupně smáčí částice sorbentu. Prostup kapaliny kolonkou je urychlován použitím podtlaku. Analyt spolu s velkým množstvím částic matrice jsou adsorbovány na sorbent, kde zůstávají zachyceny. 3. Promývání sorbentu Promývací krok má za úkol odstranit ze sorbentu adsorbovanou nežádoucí matrici. Promývací činidlo bývá nanášeno na kolonku v několika krocích po sobě. Toto činidlo musí být vybráno tak, aby mělo co nejvyšší afinitu k matrici a nikoliv k molekulám sledovaného analytu. V tomto kroku nesmí docházet k vymývání analytu. Cílem je 14

odstranit co největší množství matrice, která by kontaminovala eluát a způsobila nežádoucí matricový efekt. 4. Eluce analytu Tento krok spočívá ve vymytí analytu [3]. Analyty jsou získávány ze sorbentu vhodným elučním činidlem, které je selektivní pro danou chemickou látku [5]. Eluát je dále podroben vlastní analýze vybranou analytickou metodou. Kroky SPE metody jsou vyobrazeny na obrázku 4.3. Při všech krocích je s výhodou využíván podtlak, který urychluje prostup kapaliny sorbentem. Jednotlivé kapaliny musí vždy být aplikovány ihned za sebou. Přesušení by mohlo mít negativní vliv na výtěžnost. Avšak dnes již existují i takové sorbenty, u nichž může k přesušení dojít. Kondicionace sorbentu Aktivační činidlo Aplikace vzorku na SPE kolonu Vzorek x kroků promývání Promývací činidlo Eluce Eluční činidlo Suchý sorbent Podtlak Aktivovaný sorbent Podtlak Podtlak Smáčení sorbentu Podtlak Zachycení vzorku na sorbentu Podtlak Podtlak až do vysušení Podtlak Podtlak až do vysušení Odpad Odpad Eluát Krok 1 Krok 2 Krok 3 Krok 4 Obrázek 4.3: Popis SPE metody v jednotlivých krocích. Klady a zápory SPE metody V současné době je SPE jednoznačně vedoucí metodou přípravy vzorků v rutinních bioanalytických laboratořích. Extrakce může být provedena buď v on-line nebo off-line zapojení. Možnost automatizace procesu SPE, která byla vyvinuta během poslední dekády, zvyšuje produktivitu analytického procesu. Současně poskytuje jak vysokou výtěžnost, tak dobré chromatografické záznamy. V porovnání s LLE má tato technika mnoho přínosů [1, 5, 7]. I přes svou popularitu má SPE technika řadu nedostatků v porovnání s nově vyvinutými extrakčními technikami. SPE je časově náročná, protože zahrnuje více kroků. Vyžaduje relativně velký objem organických rozpouštědel. Obrovským nedostatkem je, že náplně jsou pouze pro jedno použití, což zvyšuje finanční nákladnost. Avšak ani tyto nevýhody nezabránily tomu, aby se SPE rozšířila v rutinních laboratořích [5]. Její široké využití dosud nebylo překonáno jinou modernější extrakční technikou. 15

4.1.3 Mikroextrakce tuhým sorbentem, MEPS Mikroextrakce tuhým sorbentem (MEPS) je novou technikou miniaturizace široce používané techniky SPE. MEPS byla relativně nedávno vynalezena a vyvinuta v laboratořích firmy Astra Zeneca [1]. Tato technika se liší od komerčního SPE v tom, že sorbent je umístěn přímo do stříkačky a nikoliv do oddělené kolonky [1, 7]. MEPS Obrázek 4.4: Typická stříkačka pro techniku MEPS. Typická stříkačka MEPS je vyobrazena na obrázku 4.4. Skládá se z těla stříkačky, jehly, barelu se sorbentem a pístu. Tato nová instrumentace může být popsána jako krátká LC kolona umístěná ve stříkačce. Zhruba 1 2 mg pevného plnícího materiálu (sorbentu) je vloženo do stříkačky o objemu 100 500 µl. Ukázka kolonky s náplní je uvedena na obrázku 4.5. Čištění vzorku se odehrává ve vrstvě sorbentu. Typickými stacionárními fázemi jsou silikagelové částice modifikované pomocí např. C2, C8, C18. Kolonku se sorbentem lze u této techniky použít opakovaně. MEPS může být zapojena on-line ke kapalinovému nebo plynovému chromatografu, aniž by musela být instrumentace upravována a modifikována. A proto není potřeba mít zvláštního robota, který by aplikoval vzorek na stacionární fázi, tak jako je tomu u konvenční SPE metody [1, 7]. jehla barel se stacionární fází jehla těsnění vstup mobilní fáze k tělu stříkačky sorbent Obrázek 4.5: Schematický popis barelu pro techniku MEPS. Metodologie techniky MEPS Postup MEPS se obecně skládá ze 4 kroků - nasátí vzorku, promývání, eluce a přímé dávkování do analyzátoru. Princip extrakčních kroků je shodný s technikou SPE, která byla popsána výše 4.1.2. Analyzovaný vzorek o objemu 10 1000 µl je ručně či robotickým dávkovačem natáhnut do stříkačky přes stacionární fázi umístěnou v kolonce. Pro vysokou výtěžnost je podstatný rovnoměrný pohyb pístu, který nasává vzorek [1, 7]. 16

Klady a zápory metody MEPS MEPS má mnoho pozitiv, díky kterým by se mohla stát trendem mezi extrakčními metodami. Je velmi jednoduchá, může být plně automatizovaná, vyžaduje nízké náklady a je rychlá v porovnání s předchozími metodami LLE a SPE. Naopak je velmi citlivá k zachování reprodukovatelnosti, s níž souvisí zajištění pomalého a plynulého pohybu pístu při manuální obsluze. Výčet předností a negativ konceptu MEPS je zachycen v tabulce 4.1. Tato technika již byla použita k extrakci velkého množství léčiv, jejich metabolitů a endogenních látek z biologických vzorků, jakými jsou plazma, moč a krev [1, 7]. Klady MEPS jednoduchost možnost plné automatizace napojení na LC a GC rychlost extrakce objemy vzorků 10 µl až 1000 µl nízká spotřeba rozpouštědel mnohonásobné použití sorbentu nízké náklady vhodné i pro složité matrice Zápory MEPS tvorba bublin udržení plynulé rychlosti pístu Tabulka 4.1: Klady a zápory techniky MEPS [1, 7]. 17

4.2 Trendy v kapalinové chromatografii Základní volbou pro bioanalýzu molekul léčiv se nepochybně stala separační technika HPLC spolu s různými typy detektorů ultrafialový, fluorescenční a hmotnostní [2, 8, 9]. Zůstává účinnou metodou volby, protože je schopná rozdělit komplikované směsi o vysoké i nízké molekulární hmotnosti, stejně tak jako směsi různých polarit a acidobazických vlastností v rozmanitých matricích [1]. GC-MS byla uvedena do klinické praxe před několika desítkami let [10]. Nyní je potlačována, protože vyžaduje derivatizační krok před vlastní analýzou za účelem získání těkavých derivátů molekul léčiv [2, 10]. Konvenční LC metoda bývá kompromisem mezi krátkým časem analýzy a vysokým rozlišením, avšak v posledních deseti letech postoupila významně vpřed [11]. Existují čtyři hlavní moderní přístupy v LC metodách, které umožňují snížení času analýzy bez kompromisů, tedy bez zhoršení rozlišení a separační účinnosti. Jedná se o monolitické kolony, vysokoteplotní kapalinovou chromatografii, kolony s částicemi obsahujícími porézní slupku a ultravysokoúčinnou kapalinovou chromatografii se sub-2-mikronovým sorbentem. Jiným moderním bioanalytickým přístupem, který se stal před několika lety velmi populárním, je hydrofilní interakční kapalinová chromatografie. Léčiva a jejich metabolity jsou často velmi polární molekuly a HILIC je vhodným řešením právě pro analýzu takových molekul [1, 12]. Metoda LC-MS/MS se stala důležitou metodou volby v bioanalytických a environmentálních rozborech. Za účelem získání vyšší selektivity a citlivosti využívá tandemová hmotnostní spektrometrie specifické SRM podmínky (monitorování vybrané reakce), jež jsou vhodné především pro bioanalytické aplikace. Nemusí být proto problém stanovit metabolity, dokonce ani když nejsou dostatečně rozděleny chromatograficky [2]. 4.2.1 Ultravysokoúčinná kapalinová chromatografie, UHPLC Nedávný technologický pokrok zpřístupnil LC systém, který využívá částice o velikosti < 2 µm. Jeho název je ultravysokoúčinná kapalinová chromatografie (UHPLC) a přináší významný pokrok v citlivosti, rychlosti a rozlišení [11]. Zájem o UHPLC stále roste [12]. Velikost částic je postupně snižována již od 50. let minulého století [1]. Částice pocházející ze 70. let byly zmenšovány z velikosti 10 µm až k velikosti 3 µm používaných v 90. letech 20. století. Díky tomu se významně zvýšily účinnost a rozlišení konvenčních HPLC kolon. Nicméně použití krátkých kolon plněných částicemi o velikosti < 3 µm má svá omezení, která jsou kombinací chromatografické rychlosti a rozlišení, protože čerpadlo vytváří tlaky velikosti až několik desítek MPa [11]. Byla proto snaha změnit design konvenční LC instrumentace, jenž by vyhovoval tlakům, které vznikají díky použití částic menších než 2 µm [13]. UHPLC systém byl původně použit v akademických výzkumných laboratořích pro použití s kapilárními kolonami [1]. V roce 2004 firma Waters uvedla na trh první komerčně dostupný UHPLC systém [1, 13]. Firma Waters byla následována nejprve pozvolna a poté ve vysoké míře i ostatními významnými výrobci, jakými jsou Agilent Technologies, Thermo Electron Corporation, Jasco, Shimadzu Corporation, Hitachi, Dionex a Perkin Elmer. Celá koncepce UHPLC se podobá stávající LC technologii. Liší se v možnosti dosažení maximálního zpětného tlaku, miniaturním objemem vzorku, rozmezím průtokových rychlostí, mrtvým objemem a dalšími parametry [1] Současná komercializace částic s velikostí < 2 µm umožňuje nový stupeň účinnosti [11]. UHPLC musí v první řadě odolat obrovským zpětným tlakům až 1 030 bar (15 000 psi), který v systému vzniká a musí umět pracovat v ultra rychlém módu [1, 13]. Při práci musí být omezena tvorba třecího tepla [1]. 18

Hlavní podstatou pro vykonání účinné separace za ultravysokého tlaku je použití kvalitní a stabilní stacionární fáze. Nedávno byly na trh uvedeny nové geometrie kolon a nové stacionární fáze založené na částicích o velikosti 1, 5 2, 0 µm. Vývoj stacionárních fází vedl k vyšší chemické (široké rozmezí ph) a mechanické (vysoký zpětný tlak) stabilitě. Obojí, jak hybridní, tak silikagelové materiály, jsou široce používány. Jedním z klíčových přínosů hybridních sorbentů je výjimečná chemická stabilita dovolující jejich použití v témeř celém rozmezí hodnot ph, typicky 1-12. Již není pravdou, že UHPLC stacionární fáze nejsou dobře dostupné [1]. Obrázek 4.6 srovnává výsledky chromatogramů HPLC a UHPLC. Lze si všimnout významného zlepšení účinnosti, rozlišení a tvaru celého píku v systému UHPLC. V tomto případě byl stejný vzorek separován při použití totožných chromatografických podmínek, s výjimkou průtokové rychlosti, na zcela stejné analytické koloně, ale na jiném chromatografickém systému [13]. Účelem použití UHPLC techniky je zkrácení doby analýzy a zároveň udržení vysokého rozlišení. Optimální separace jsou dosáhnuty za vysokých lineární průtokových rychlostí [1, 12]. Zlepšení chromatografického rozlišení UHPLC je znatelné, protože píky jsou užší [11]. V bioanalytických aplikacích se UHPLC separace ukázala jako 2-21 rychlejší při zachování nebo zlepšení rozlišení a citlivosti [1]. HPLC UHPLC Tf = 1.8 min 2 3 1 4 Odezva detektoru Tf = 2.6 min 2 3 4 Odezva detektoru 1 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 x 50 mm, 1.7 μm Průtoková rychlost 0.3 ml/min Maximální tlak 4200 psi Retenční čas [min] 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 x 50 mm, 1.7 μm Průtoková rychlost 0.6 ml/min Maximální tlak 8400 psi Retenční čas [min] Obrázek 4.6: Porovnání chromatogramů HPLC a UHPLC [13]. UHPLC je ideálním nástrojem pro rychlé separace komplexních směsí analytů jak při izokratické, tak při gradientové eluci. Typická UHPLC analýza jedné sloučeniny v biologické matrici za použití vnitřního standardu vyžaduje 1-2 minuty. Vysoká rychlost analýz je extrémně důležitá pro vysokou produktivitu laboratoří. Rychlost analytického cyklu je bohužel v kontrastu s laboratorně a časově náročnou přípravou vzorků, která obvykle zahrnuje použití SPE nebo LLE jako přečišťujícího kroku [1]. Pořízení UHPLC systému je finančně náročnější a náklady převyšují pořizovací cenu konvenčního HPLC [12]. Cena byla zhruba 2 vyšší než v případě HPLC instrumentace [13]. Nicméně cena se nyní snižuje s běžným používání techniky v analytických laboratořích [12]. 19

Koncept UHPLC přináší řadu předností oproti klasické HPLC technice [13]: malé částice odolávající vysokým tlakům (až 100 MPa) menší objemy vzorků menší objem mobilní fáze a s tím související snížení nákladů velmi krátký čas separace (do 10 minut) a z toho plynoucí vyšší produktivita širší rozmezí použitelných lineárních průtokových rychlostí snížení meze detekce a navýšení citlivosti vysoké rozlišení a zvýšení separační účinnosti více kvalitativních informací UHPLC se v poslední době rozšiřuje do laboratoří všech specializací jak konvenčních, tak výzkumných, které se zaměřují na rychlá bioanalytická měření s vyšší citlivostí a které chtějí snížit spotřebu rozpouštědel [1]. UHPLC s vysoce citlivým detektorem jsou vhodné ke splnění vysoce náročných požadavků. Jedná se o vyhovující přístup, který splňuje klíčové požadavky, jakými jsou selektivita, citlivost, rychlé stanovení analytů o nízké koncentraci v komplexní matrici [12]. Nároky zahrnují vývoj rychlé LC-MS metody schopné rozdělit úzce související sloučeniny od endogenních složek. Kromě farmaceutické analýzy tato technika našla uplatnění na poli proteomiky, metabolomiky, analýzy potravin, rostlin i životního prostředí [1]. 4.2.2 Monolitické kolony Monolitické kolony jsou tématem rozsáhlých výzkumů [4, 13]. V posledních několika letech se staly oblíbenými na poli bioanalytických aplikací. Účinnost a rozlišení monolitických sorbentů jsou srovnatelné se silikagelovými částicemi o průměru 3 µm [1]. Monolitické kolony jsou vyráběny technologií sol-gel, která dovoluje vytvoření vysoce porézního materiálu obsahujícího ve své struktuře obojí, jak velké póry, které se nazývají makropóry, tak středně velké póry, neboli mesopóry. Velikost makropórů je obvykle 2 µm a dovolují vysoké průtokové rychlosti. Zatímco malé mesopóry, okolo 12 nm, zajišťují dostatečně velký povrch za účelem dosažení vysoké separační kapacity [1]. Monolity jsou vyráběny v různých formách jako porézní tyčky, membrány nebo disky. V současné době spočívá výroba v kyselé hydrolýze tetrametoxysilanu, tetraetoxysilanu nebo n-alkyltrialkoxysilanu za přítomnosti polyetylenglykolu. Byly již vyvinuty polymerní základy například na bázi polyakrylamidu, polystyrendivinylbenzenu či polyglycidylmetakrylátetylendimetylakrylátu. Taktéž byly zkoušeny polysacharidy jakými jsou agaróza, celulóza a dextran [13]. Monolitické kolony poskytují podstatné snížení času analýzy a ukazují se jako vhodné pro bioanalytická měření. Jsou běžně používány ve spojení s UV detektorem nebo fluorescenčním detektorem [1]. Používají se pro rychlé separace β-blokátorových metabolitů v biologických tekutinách, diastereoizomerů, biologických makromolekul a dalších [20]. Díky tomu, že jsou sorbenty tvořeny jak mesopóry, tak makropóry, mohou tyto kolony pracovat za vysokých průtokových rychlostí (až do 10 ml/min), aniž by generovaly vysoký zpětný tlak [1, 4]. Dosahují však menšího rozlišení nežli částicové materiály. Jinou praktickou výhodou je krátký čas potřebný k ekvilibraci kolony během gradientové eluce. Na druhou stranu monolity mají několik nevýhodných vlastností. Jednou z nich je omezený 20

počet komerčně dostupných stacionárních fází (C8, C18 a samotné silikagelové částice). Silikagelové monolity mají limitovanou chemickou stabilitu (ph je v rozmezí 2-8), která omezuje jejich aplikaci v praxi [1]. Jinou nevýhodou je omezený výběr velikostí vnitřních průměrů. Typické jsou 4, 6 mm a 3, 0 mm. Snadno dostupné větší vnitřní průměry nejsou plně kompatibilní s MS a způsobují vysokou spotřebu organických rozpouštědel, obzvláště při průtocích větších než 10 ml/min. Tyto nevýhody snižují podstatně jejich aplikační využití v LC-MS [1]. 4.2.3 Kolony s částicemi obsahujícími porézní slupku První použití kolon s částicemi obsahujícími porézní slupku (fused core columns) se datuje do 60. let 20. století. Cílem vývoje bylo zmenšit prostory, v nichž dochází k převodu hmoty a docílit tak zmenšení negativního jevu, kterým je rozmývání analytických zón [1, 13]. V roce 1992 byl uveden nový proces výroby částic s porézním povrchem, který byl později označován HALO R [1]. Částice, jimiž jsou kolony plněny, mají speciální architekturu. Každá částice obsahuje pevné jádro, jehož velikost je pro všechny částice stejná a tenkou porézní slupku (viz obr. 4.7). Porézní slupka je slabě nanesená vrstva sorbentu na pevném jádru [13]. HALO R silikagelové částice obsahují 1, 7 µm pevné jádro a 0, 5 µm silnou porézní vrstvu. Dohromady tvoří celkový poloměr částice 2, 7 µm [1]. Dostupná výrobní technologie se snaží zajistit co nejmenší distribuci velikosti částic [13]. Porézní slupka Pevné jádro Obrázek 4.7: Znázornění jedné silikagelové částice v koloně "fused core"[13]. Využití "fused core kolon"je současným trendem v chromatografické separaci [13]. V mnoha studiích bylo potvrzeno, že tyto kolony jsou cenným nástrojem pro bioanalytické účely [1]. Jejich používání má významný dopad na zlepšení tvaru chromatografických píků, protože umožňují lepší převod hmoty. Zlepšení je důsledkem větší homogenity velikosti částic, jimiž jsou kolony naplněny [13]. Přínosem používání těchto povrchově porézních částic je jejich vynikající účinnost při vysokých rychlostech analýzy, aniž by generovaly vysoký zpětný tlak, který je zcela typický pro UHPLC s plně porézními částicemi o velikosti pod 2 µm [1, 13]. 4.2.4 Hydrofilní interakční kapalinová chromatografie, HILIC Hydrofilní interakční kapalinová chromatografie neboli HILIC je alternativou pro konvenční systém jak s reverzní, tak s normální fází. Ukázala se jako velmi vhodná pro analýzu malých polárních molekul, které mají slabou retenci, nebo které se eluují s mrtvým objemem v uspořádání na reverzní fázi. Vodou obohacená vrstva je zakotvena na stacionární fázi, která je vždy polárního charakteru. Jedná se o polární silikagelový nebo hybridní základ. Stacionární fáze obvykle obsahuje hydroxyetylovou, diolovou nebo amino funkční skupinu. Další možností je 21

speciální druh zwitterionická stacionární fáze. Příčinou zachycení analytu je jeho rozdělení mezi vodou obohacenou vrstvu navázanou na stacionární fázi a mezi relativně velký objem hydrofóbního elučního činidla. Mobilní fáze je složena z vysokého procenta organického rozpouštědla (typicky acetonitrilu), které je doplněno malým procentem vody či těkavého pufru 5-40%. Eluce je umožněna zvyšující se polaritou mobilní fáze [1]. Tato technika si v poslední době získává pozornost. V současnosti její využití zahrnuje mnoho polárních sloučenin, částice nabité, nenabité i neutrální. Jiným důvodem rostoucí oblíbenosti je spojení hmotnostního spektrometru s LC, jež jsou navzájem dobře kompatibilní a poskytují vysokou citlivost. HILIC metoda je schopná vyřešit problematické retenční a separační problémy díky odlišné selektivitě. Stává se velice populární metodou v bioanalytických aplikacích, protože léčiva a jejich metabolity jsou velmi často polárními strukturami [1]. 4.2.5 Vysokoteplotní kapalinová chromatografie, HTLC Vysokoteplotní kapalinová chromatografie (HTLC) využívá teplot přesahujících 60 C. Nízká viskozita a vysoká difuzivita mobilní fáze vytvářejí při vysoké teplotě mnohem nižší odpor při převodu hmoty na rozdíl od klasické HPLC metody. Vysoká teplota snižuje zpětný tlak vznikající v systému a dovoluje aplikovat rychlejší průtok mobilní fáze. Se vzrůstající teplotou se zvyšuje eluční síla vodného roztoku v roli mobilní fáze. Nepřítomnost organických rozpouštědel dělá z HTLC technologii přátelskou k životnímu prostředí, proto je nazývána zelenou chromatografií. Nicméně i přes výše uvedené přínosy této techniky není HTLC rutinně používána. Prvním záporem je nutnost komplikované instrumentace, která zajistí dokonalý předehřev mobilní fáze a její následné chlazení. Druhým negativem je omezená dostupnost stabilních teplotně odolných plnících materiálů. Za třetí může docházet k potenciálnímu rozkladu analyzovaných sloučenin. Z tohoto důvodu nebyly zatím HTLC technologie zastoupeny ve větší míře při bioanalytických analýzách [1]. 22

4.3 Trendy ve spojení LC-MS V 90. letech minulého století došlo k posunu výzkumu v oblasti bioanalytických metod z HPLC-UV směrem k detekci pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie MS/MS. HPLC-MS/MS analýza založená na SRM módu se stala zlatým standardem pro bioanalytická měření a je i nadále používána většinou farmaceutických společností pro kvantitativní analýzu nových léčiv [14]. Zavedení měkkých ionizačních technik za atmosférického tlaku rozšířilo aplikační rozmezí MS obzvláště pro biologické materiály. V současnosti je MS důležitou technologií v klinické praxi jak pro výzkumné účely, tak pro rutinní analýzu, hlavně pro cílenou analýzu v monitorování lékových hladin a diagnostice metabolomických poruch [10]. Nové směry zahrnují hmotnostní spektrometrii s vysokým rozlišením (HRMS) a UHPLC [14]. UHPLC ve spojení s hmotnostním detektorem nabízí významné přednosti jak v rozlišení a rychlosti, tak v citlivosti [11]. Protože UHPLC významně zkracuje dobu analýzy bez snížení chromatografického rozlišení, hlavní nesnáz se přesunula na přípravu vzorků a zpracování dat [11, 12]. Hmotnostní detekce se stala volbou ve více než 60% separací provedených na UHPLC systému. Ve spojení s MS nebo MS/MS poskytuje mocný analytický nástroj pro analýzy komplexních matric, jakými jsou biologické tekutiny, rostlinné extrakty, vzorky potravin a vzorky ze životního prostředí [12]. 4.3.1 Hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením, HRMS K dostání jsou hmotnostní spektrometry s vysokým rozlišením (HRMS) na základě analyzátoru doby letu (TOF) a orbitální pasti (Orbitrap) ve stejném cenovém rozmezí jako QqQ používaný v tandemové hmotnostní spektrometrii. Orbitální past má výhodu ve vyšším rozlišení, ale trpí pomalejším získáváním dat, kdežto systém TOF vykazuje opačnou charakteristiku. Oba systémy mohou nabídnout přesné hmotnostní údaje, které jsou užitečné v nejrůznějších medicínských odvětvích, jakými jsou klinická toxikologie a antidopingové kontroly či toxikologie životního prostředí apod. Dalšími HRMS technologiemi jsou iontová cyklotronová rezonance (ICR) a sektorová instrumentace. Technologie ICR dosahuje zcela nejvyššího rozlišení a nejlepší přesnosti, avšak při velmi vysokých nákladech na pořízení i údržbu [10]. UHPLC-HRMS jsou techniky vhodné jak pro kvalitativní, tak pro kvantitativní analýzu [14]. Castro-Perez a kolektiv byli první, kteří zveřejnili použití UHPLC technologie ve spojení s QqTOF analyzátorem při analýze léčiv [12]. Není pochyb o tom, že si vybavení HRMS najde své místo v klinických laboratořích [10]. HRMS techniky Sektory ICR Orbitální past TOF Obrázek 4.8: Přehled HRMS technik. Analyzátor doby letu, TOF První popis konceptu TOF, který byl vytvořen Stephensem, pochází z roku 1946. O téměř 10 let později Wiley a McLaren publikovali popis lineárního hmotnostního spektrometru typu TOF, který se stal prvním komerčním nástrojem tohoto typu. Na konci 80. let se zvýšil zájem o tento přístroj [10]. Principem separace TOF lineárního typu je vysílání iontových svazků pulzním procesem. Grafické znázornění je na obrázku 4.9(a). Ionty jsou dále urychleny k letové trubici 23

díky rozdílu potenciálu vkládanému mezi extrakční síť a elektrodu. Ionty získají stejnou kinetickou energii a vstupují do letové trubice, kde se rozdělí podle svých rychlostí. Různé rychlosti jsou důsledkem rozložení jejich hmotností. Ionty s vysokou hmotností mají nižší rychlost, zatímco ionty s menší hmotností dosahují rychlostí vyšších. Nakonec všechny ionty dosáhnou detektoru umístěného na konci trubice. Poměr mass-to-charge (hmota/náboj) je stanoven na základě měření doby, za jakou iont dosáhne detektoru. Spojení TOF s kontinuálním iontovým zdrojem (ESI nebo APCI) transformuje plynulý iontový svazek do pulzujícího. Tento analyzátor je přímo kompatibilní s pulzní ionizační technikou jakou, je laserová desorpce [10]. Letová trubice 3. 1. Iontový zdroj Iontový zdroj (a) Lineární typ 2. Detekce iontů 1. 2. 3. 1. 2. 3. Letová trubice Iontový reflektron Detekce iontů (b) Ortogonální typ Obrázek 4.9: Porovnání typů analyzátoru TOF. TOF nemá žádnou horní hranici pro hmotnost iontů a dosahuje vysoké citlivosti díky efektivitě přenosu. Velmi rychlé analýzy jsou zajímavou vlastností tohoto analyzátoru, který vyprodukuje několik tisíc spekter každou vteřinu [10]. TOF má schopnost sbírat full sken spektra s vynikající přesností hmoty, rozlišením a rychlostí skenování 10 250 ms [14]. Rozlišení TOF analyzátoru je omezeno počáteční rychlostí předané iontům. Pro kompenzaci této distribuce jsou k dispozici výkonná zařízení. Nejběžnější metodou jsou opožděná extrakce iontů (Delayed extraction) a použití elektrostatického reflektronu nazývaného iontový reflektron. Takovému analyzátoru se říká TOF ortogonálního typu, viz obrázek 4.9 b. Reflektron zavedl v roce 1973 Mamyrin a kolektiv. Pokud je použit, ionty nejdou přímo na detektor, ale jejich dráhy jsou ovlivněny odrazovým elektrickým polem iontového reflektronu. Rychlejší ionty proniknou hlouběji do jeho elektrického pole a tím se prodlouží jejich dráha letu. Naopak dráha pomalých iontů je kratší [10]. Q-TOF poskytuje atraktivní alternativu QqQ analyzátorům, protože Q-TOF mohou poskytnout vyšší míru rozlišení. Navíc jsou vhodné jak pro cílené, tak necílené stanovování látek. Pomáhají vysvětlit strukturu necílených sloučenin a sledují obrovské množství sloučenin bez omezení frekvence sběru dat v metabolomice a metabolismu léčiv. Nevýhodou analyzátoru TOF jsou jeho nízká citlivost a jeho relativně vysoké pořizovací náklady [12]. 24