Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta Ústav ovocnictví. Dědičnost rezistence meruněk k šarce švestky. Dizertační práce

Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta Ústav ovocnictví Dědičnost rezistence meruněk k šarce švestky Dizertační práce Školitel: Prof. Dr. Ing. Boris Krška Vypracovala: Ing. Petra Pilařová Lednice 2010

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem dizertační práci na téma Dědičnost rezistence meruněk k šarce švestky vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Dizertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího dizertační práce a děkana ZF MENDELU v Brně. dne. podpis doktoranda. 2

PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych ráda poděkovala všem, kteří mi jakkoliv pomohli při zpracování této dizertační práce. Nejprve školiteli Prof. Dr. Ing. Borisi Krškovi za připomínky týkající se řešené problematiky, dále školiteli specialistovi Ing. Jaroslavu Salavovi Ph.D. a kolektivu diagnostické a molekulárně genetické laboratoře Mendelea. Molekulárně genetické výsledky v této práci byly získány díky vlídnému přijetí a možnosti pracovat v laboratořích Alberta Abbotta (Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University, Jižní Karolina, USA) a Véronique Decroocq (UMR- Génomique, Diversité, Pouvoir Pathogène, INRA, Francie), čímž jim ještě jednou děkuji a to i za jejich čas, připomínky a cenné rady. Velký dík také patří Grégoire Marandelovi (UMR-Génomique, Diversité, Pouvoir Pathogène, INRA, Francie). Týdenní stáž ve Francii byla hrazena z bilaterálního projektu BARRANDE a půlroční stáž v USA byla částečně hrazena ze získané mobility rozvojových projektů Free movers. Výsledky prezentované v této práci byly získány za částečné finanční podpory výzkumného projektu č. 9/2008/591 Studium dědičnosti rezistence meruněk k šarce švestky u potomstev odrůdy Harlayne Interní grantové agentury ZF MZLU v Brně a projektu FP7 Small collaborative research project č. 204429 s názvem Sharka Containment (SharCo). Na závěr bych také ráda poděkovala za podporu celé své rodině a mému příteli, kteří mě po celou dobu podporovali, starali se a plnili moje povinnosti v době, kdy jsem byla v zahraničí. Ještě jednou všem mnohokrát děkuji. 3

Abstrakt Dědičnost rezistence meruněk k šarce švestky Cílem této práce bylo prohloubit znalosti o dědičnosti rezistence meruněk k šarce švestky, které by byly využity při dalším šlechtění na rezistenci k této chorobě. Rezistence k viru šarky švestky (PPV), původci onemocnění šarky švestky, se přirozeně vyskytuje a patří mezi jednu z nejžádanějších vlastností při šlechtění peckovin. Avšak jen několik málo zdrojů této rezistence bylo doposud identifikováno. Jednou z mála odrůd meruněk rezistentních k šarce švestky je Harlayne. Za účelem studia rezistence proto byla vybrána čtyři potomstva této odrůdy. Jedno vzniklo křížením s rezistentní odrůdou Orangered, další s citlivou odrůdou Vestar a zbylá dvě (reciproké křížení) vzešla z křížení s odrůdou Strepet, u které reakce k PPV nebyla testována. Jedinci těchto potomstev byli inokulováni kmeny PPV-M a PPV-D metodou chipbudding. Do vrcholové části rostliny tří potomstev byl naočkován dřevitý indikátor Prunus persica GF 305. Pozorování symptomů na listech doplněné DAS-ELISA testy bylo prováděno po dobu tří vegetačních sezon. Na základě získaných výsledků během pozorování a testování byli jedinci rozděleni do tří skupin dle odolnosti k PPV, tj. na rezistentní, tolerantní a citlivé. Vypočtené poměry mezi rezistentními a citlivými jedinci v jednotlivých populacích byly porovnány pomocí χ 2 -testu s teoretickými, které vychází z Mendelových zákonů. Zjištěné štěpné poměry svědčí o oligogenní dědičnosti rezistence, i když nelze jednoznačně určit, zda rezistenci k viru šarky švestky kontrolují dva nebo tři dominantní geny. Dvěma genům spíše nasvědčují výsledky získané z potomstev inokulovaných PPV-D, zatímco třem genům výsledky z potomstva inkokulovaného PPV-M. Fakt, že se v potomstvech vyskytují rostliny s různým stupněm odolnosti k PPV, také podporuje výše uvedenou domněnku o oligogenní dědičnosti. Ta je navíc podpořena výsledky analýzy kvantitativních znaků (Kruskal-Wallisův neparametrický test, metoda composite interval mapping) u potomstva Harlayne Vestar, kde byly nalezeny 2 oblasti zainteresované při rezistenci k PPV-D a čtyři k PPV-M. Lokalizace identifikovaných genomových oblastí odrůdy Harlayne se značně shoduje s oblastmi identifikovanými u jiných rezistentních odrůd. Navíc dvě identifikované QTL oblasti pro rezistenci k PPV-M a dvě pro rezistenci k PPV-D spolu silně kolokalizují. Klíčová slova: PPV, šarka švestky, Prunus armeniaca L., štěpný poměr, šlechtění 4

Abstract Inheritance of resistance to Plum pox virus The aim of this PhD thesis was to improve knowledge of the inheritance of PPV resistance in apricots for use in future breeding programmes. Natural resistance to Plum pox virus (PPV), the agent of sharka disease, is one of the most important traits of interest to stone fruit breeders, although few sources of resistance have been identified. One of the few apricot cultivars which does show resistance, Harlayne, was chosen for a study of the genetics of PPV resistance. It was crossed with three different cultivars, Vestar (susceptible), Orangered (resistant) and Strepet (unknown reaction). Four different lines (since there was one reciprocal combination) were established and the F 1 crosses were subsequently inoculated with the PPV-M and PPV-D strains by grafting infected buds. A woody indicator Prunus persica GF 305 was then also top-grafted onto the plants of three of these F 1 populations. The observations of leaf symptoms and accompanying DAS-ELISA tests were performed over three growing seasons and then hybrids were classified accordingly, as either resistant, tolerant or susceptible. The resistant : susceptible ratios were calculated and compared with expected theoretical ratios using the χ 2 -test. The ratios of resistant to susceptible plants in the progeny derived from the four apricot crosses are compatible with the hypothesis about the oligogenic inheritance of resistance to PPV. The obtained results fit the hypothesis of two dominant genes to explain the inheritance of PPV-D resistance whereas the hypothesis of three dominant genes fits better to explain the inheritance of PPV-M resistance, with Harlayne being heterozygous in both cases. The proposed hypotheses about the oligogenic inheritance of resistance to PPV appears to be supported with the fact that plants with different degrees of susceptibility or resistance can be found. In addition, the results obtained from a study involving quantitative trait analysis (Kruskal-Wallis test, composite interval mapping) of resistance to PPV in the Harlayne Vestar cross and in which two regions were identified as being involved in resistance to PPV-D and four for PPV-M of the apricot Harlayne genitor, lend further support to this theory. The identified regions are similar to the one identified in Goldrich and Stark Early Orange. Interestingly, two QTLs for PPV-M and two others for PPV-D were strongly co-localized. Keywords: PPV, sharka disease, Prunus armeniaca L., segregation ratio, breeding 5

OBSAH 1 Úvod...12 2 Cíl práce...14 3 Literární přehled...15 3.1 Šarka švestky...15 3.1.1 Původ a rozšíření... 15 3.1.2 Charakteristika původce onemocnění... 16 3.1.3 Přenos viru... 18 3.1.4 Hostitelé a symptomy... 19 3.1.5 Detekce viru... 21 3.1.6 Kontrola šíření šarky švestky... 24 3.2 Šlechtění na rezistenci...24 3.2.1 Zdroje rezistence k PPV u meruněk... 26 3.2.2 Dědičnost rezistence k PPV u meruněk... 27 3.2.3 Využití poznatků molekulární genetiky při šlechtění meruněk... 28 4 Materiál...30 4.1 Použitý rostlinný materiál...30 4.1.1 Popis vybraných potomstev... 30 4.1.2 Popis rodičovských odrůd... 31 4.2 Inokulační materiál...32 4.3 Materiál pro biologické testování...32 5 Metody...33 5.1 Hodnocení rezistence k PPV...33 5.1.1 Inokulace virem šarky švestky... 33 5.1.2 Reinokulace... 33 5.1.3 Biologické testování... 33 5.1.4 Vizuální hodnocení... 34 5.1.5 Sérologické testování... 35 6

5.1.5.1 Vlastní postup DAS-ELISA... 35 5.1.5.2 Složení použitých pufrů... 36 5.1.5.3 Vyhodnocení ELISA testu... 37 5.1.6 Statistické zpracování získaných výsledků... 38 5.2 Roztřídění F 1 hybridů dle stupně odolnosti k šarce švestky...38 5.3 Stanovení štěpných poměrů a jejich testování...38 5.4 Identifikace a mapovaní lokusů spjatých s rezistencí k PPV..39 5.4.1 Izolace DNA... 39 5.4.1.1 Vlastní postup izolace... 39 5.4.1.2 Složení použitých pufrů... 40 5.4.2 Stanovení koncentrace DNA... 41 5.4.2.1 Složení použitého pufru a roztoků... 41 5.4.3 Ředění izolované DNA... 42 5.4.4 PCR reakce... 42 5.4.4.1 Složení reakční směsi... 42 5.4.4.2 Teplotní profil... 43 5.4.4.3 Separace SSR produktů na denaturačním PAGE... 43 5.4.5 Testování polymorfismu... 47 5.4.6 Analýza celého potomstva... 47 5.4.7 Konstrukce genetické vazbové mapy... 48 5.4.8 QTL analýza rezistence PPV... 49 6 Výsledky...50 6.1 Hodnocení rezistence k PPV...50 6.1.1 Vizuální hodnocení... 50 6.1.2 Sérologické testování... 60 6.2 Roztřídění F1 hybridů dle stupně odolnosti k šarce švestky...62 6.3 Testování stanovených štěpných poměrů...64 6.4 Identifikace a mapovaní lokusů spjatých s rezistencí k PPV..65 6.4.1 SSR analýza... 66 6.5 Genetické vazbové mapy vybraných skupin...66 7

6.6 QTL analýza...69 6.6.1 Kruskal-Wallisův test... 69 6.6.2 Composite Interval Mapping (CIM)... 73 7 Diskuze...78 8 Závěr...83 9 Použité informační zdroje...85 10 Přílohy...98 8

SEZNAM TABULEK tabulka 1 Referenční primery používané pro detekci PPV... 23 tabulka 2 Srovnání vhodnosti jednotlivých detekčních metod... 24 tabulka 3 Popis souborů genotypů použitých pro studium dědičnosti rezistence k PPV30 tabulka 4 Stupnice intenzity symptomů PPV... 34 tabulka 5 Teplotní profil PCR reakce... 43 tabulka 6 Série SSR markerů použité pro testování polymorfismu... 48 tabulka 7 Popisné charakteristiky a rozdělení četností na základě pozorované intenzity symptomů pro potomstvo H 981... 51 tabulka 8 Popisné charakteristiky a rozdělení četností na základě pozorované intenzity symptomů pro potomstvo H 985... 51 tabulka 9 Popisné charakteristiky a rozdělení četností na základě pozorované intenzity symptomů pro potomstvo H 995... 52 tabulka 10 Pearsonův koeficient korelace pro jednotlivé termíny vizuálního hodnocení u potomstva H 981... 53 tabulka 11 Pearsonův koeficient korelace pro jednotlivé termíny vizuálního hodocení u potomstva H 985... 54 tabulka 12 Pearsonův koeficient korelace pro jednotlivé termíny vizuálního hodocení u potomstva H 995... 55 tabulka 13 Popisné charakteristiky a rozdělení četností na základě pozorované intenzity symptomů pro potomstvo Harlayne Vestar, PPV-M... 57 tabulka 14 Popisné charakteristiky a rozdělení četností na základě pozorované intenzity symptomů pro potomstvo Harlayne Vestar, PPV-D... 57 tabulka 15 Pearsonův koeficient korelace pro jednotlivé termíny vizuálního hodnocení u potomstva Harlayne Vestar PPV-M... 58 tabulka 16 Pearsonův koeficient korelace pro jednotlivé termíny vizuálního hodnocení u potomstva Harlayne Vestar PPV-D... 59 tabulka 17 Pearsonův koeficient korelace mezi vizuálním hodnocením semenáčů potomstev H 981, H 985 a H 995 a na nich naočkovaném dřevitém indikátoru GF 305... 60 tabulka 18 Pearsonův koeficient korelace pro jednotlivé termíny vizuálního hodnocení symptomů PPV na listech GF 305 u potomstev H 981 a H 985 v roce 2008... 60 9

tabulka 19 Pearsonův koeficient korelace pro jednotlivé termíny vizuálního hodnocení symptomů PPV na listech GF 305 u potomstva H 995 v roce 2008... 60 tabulka 20 Procento pozitivních rostlin v jednotlivých potomstvech detekovaných pomocí ELISA testu... 61 tabulka 21 Pearsonův koeficient korelace pro jednotlivé termíny ELISA testů u potomstva H 981... 61 tabulka 22 Pearsonův koeficient korelace pro jednotlivé termíny ELISA testů u potomstva H 985 a H 995... 61 tabulka 23 Pearsonův koeficient korelace pro jednotlivé termíny testování ELISA testem u potomstva Harlayne Vestar... 62 tabulka 24 Pravděpodobnost, se kterou není rozdíl mezi vizuálním hodnocením a výsledkem ELISA testu (znaménkový test) v jednotlivých termínech hodnocení... 62 tabulka 25 Početní a procentické zastoupení jedinců v jednotlivých kategoriích podle stupně odolnosti k PPV... 63 tabulka 26 Pozorované a očekávané štěpné poměry vycházející z teorie jednoho genu 64 tabulka 27 Pozorované a očekávané štěpné poměry vycházející z teorie dvou nebo třech genů... 65 tabulka 28 Seznam použitých markerů a jejich genotypový projev u rodičovských odrůd s výsledky χ 2 testu... 67 tabulka 29 Statisticky průkazné markery pro PPV-M u odrůdy Harlayne zjištěné pomocí Kruskal-Wallisova testu s uvedenou pravděpodobností... 70 tabulka 30 Statisticky průkazné markery pro PPV-D u odrůdy Harlayne zjištěné pomocí Kruskal-Wallisova testu s uvedenou pravděpodobností... 71 tabulka 31 Statisticky průkazné markery pro PPV-D u odrůdy Vestar zjištěné pomocí Kruskal-Wallisova testu s uvedenou pravděpodobností... 72 tabulka 32 Detekované oblasti QTL pomocí metody CIM a Kruskal-Wallisova testu v jednotlivých termínech s popisnými charakteristikami u odrůdy Harlayne pro PPV-M... 74 tabulka 33 Detekované oblasti QTL pomocí metody CIM a Kruskal-Wallisova testu v jednotlivých termínech s popisnými charakteristikami u odrůdy Harlayne pro PPV-D... 75 10

tabulka 34 Detekované oblasti QTL pomocí metody CIM a Kruskal-Wallisova testu v jednotlivých termínech s popisnými charakteristikami u odrůdy Vestar pro PPV-D... 76 SEZNAM OBRÁZKŮ obrázek 1 Genetické vazbové mapy vybraných skupin odrůdy Harlayne a Vestar.. 68 obrázek 2 Genetické vazbové skupiny 1 rodičovských odrůd s vyobrazenými detekovanými oblastmi QTL pro jednotlivé kmeny PPV 74 obrázek 3 Genetické vazbové skupiny 1 rezistentní odrůdy Harlayne a Stark Early Orange s vyznačenými identifikovanými oblastmi QTL pro rezistenci k PPV... 77 SEZNAM GRAFŮ graf 1 Vývoj intenzity napadení v průběhu tří let u jednotlivých potomstev... 50 graf 2 Procentické zastoupení citlivých rostlin v jednotlivých letech hodnocení u sledovaných potomstev... 63 11

1 Úvod Meruňky patří do čeledi Rosaceae, rodu Prunus L.. V České republice jsou čtvrtým nejpěstovanějším ovocným druhem v produkčních výsadbách a zaujímají více jak 1500 ha. Roční produkce z produkčních sadů se pohybuje v rozmezí od 3 do 5 tisíc tun. Rod Prunus L. zahrnuje dalších pět ekonomicky důležitých ovocných dřevin mírného pásma. Jedná se o broskvoně, švestky, mandloně, třešně a višně. Nejškodlivějším činitelem ovlivňujícím produkci peckovin v sadech a ovocných školkách je šarka švestky. Toto onemocnění, které je způsobeno virem šarky švestky (Plum pox virus, PPV), negativně ovlivňuje nejen produkci, ale i kvalitu plodů, které jsou často neprodejné. Ztráty za posledních třicet let způsobené šarkou švestky a náklady na boj proti ní byly vyčísleny na 10 miliard euro (CAMBRA et al. 2006). Šarka švestky byla poprvé popsána již téměř před sto lety v Bulharsku. V současnosti je rozšířena téměř do všech významných oblastí pěstování peckovin. Z 6 kmenů viru šarky švestky (CANDRESSE, CAMBRA 2006) se v České republice vyskytují tři: PPV-D, PPV-M a PPV-Rec (POLÁK, PÍVALOVÁ 2005; GADIOU et al. 2008). V sadech a ovocných školkách se virus šíří hlavně pomocí mšic. Největším rizikem přenosu na delší vzdálenost, mezi sady nebo mezi produkčními oblastmi, je transport a výměna množitelského materiálu (rouby, roubovance, očkovance, podnože). Potlačení této choroby je téměř nemožné, protože chemická kontrola mšic začíná být neúčinná. V některých zemích, kde se tato choroba vyskytuje ojediněle, je šíření této choroby kontrolováno tak, že infikované stromy jsou likvidovány. Takovéto opatření by však v zemích, kde je výskyt této choroby běžný, bylo ekonomicky nepředstavitelné (LÓPEZ-MOYA et al. 2000; MARTÍNEZ-GÓMEZ et al. 2003). Introdukce a použití rezistentních odrůd k viru šarky švestky v šlechtitelský programech jednotlivých druhů rodu Prunus L. nabízí ekonomickou a přirozenou alternativu pro potlačení dalšího rozšiřování choroby. Přirozené zdroje rezistence k viru šarky švestky existují mezi zástupci rodu Prunus L., ale nejsou časté. Do dnešní doby rezistence k PPV-M a PPV-D byla nalezena pouze u několika odrůd meruněk ( Goldrich, Harlayne, Stark Early Orange, Stella, Harcot ) (DOSBA et al. 1991; KARAYIANNIS et al. 1999; FUCHS et al. 2001). Většina z nich pochází z 30 až 50 let starých severoamerických šlechtitelských programů. V současnosti jsou tyto donory 12

rezistence používány v několika evropských šlechtitelských programech (Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 2006). Severoamerické zdroje rezistence k PPV u meruněk nejsou důkladně popsány. Podle studie genetické podobnosti (BADENES et al. 1996; ZHEBENTYAYEVA et al. 2008) severoamerické odrůdy rezistentní k PPV jsou příbuzné evropským odrůdám, ale zdá se, že sdílejí společného předchůdce, který je donorem rezistence k PPV a pravděpodobně pochází se střední Asie (BADENES et al. 1996) nebo čínského genového centra (ZHEBENTYAYEVA et al. 2008). Navíc zatím není vyloučena možnost introgrese rezistence k PPV z planých meruněk (BADENES et al. 1996; ZHEBENTYAYEVA et al. 2008). Předpokládá se, že pochopení genetické kontroly resistence k viru šarky švestky by mohlo urychlit introgresi resistence k viru šarky švestky do cenných odrůd. Přesto několik rozporuplných hypotéz o dědičnosti rezistence k viru šarky švestky bylo úspěšně opublikováno. Tyto hypotézy uvádějí, že rezistence k viru šarky švestky je kontrolována buď jedním (DICENTA et al. 2000; KARAYIANNIS et al. 2008), dvěma (DOSBA et al. 1991; KRŠKA et al. 2002; MOUSTAFA et al. 2001a; RUBIO et al. 2004) nebo třemi geny (GUILLET-BELLANGER, AUDERGON 2001; SALAVA et al. 2005). K dalšímu zefektivnění šlechtění dochází i díky použití molekulárně genetických metod. Jedná se hlavně o využití molekulárně genetických markerů, které jsou ve vazbě s žádaným znakem, v procesu selekce (MAS, marker assisted selection). Použití této metody při šlechtění na rezistenci vůči PPV je vhodné hlavně z hlediska zvýšení efektivity šlechtění. K usnadnění pochopení dědičnosti rezistence jednotlivých druhů rodu Prunus by mělo přispět i sestrojení mapy rezistence pro rod Prunus L., kterou vytvořila LALLI et al. (2005) za použití kandidátních genů, a také několik genetických vazbových map vycházejících z vnitrodruhových křížení meruněk, u kterých byl(y) zmapován(y) i lokus(y) pro rezistenci k PPV (HURTADO et al. 2002; SALAVA et al. 2002; VILANOVA et al. 2003; LAMBERT et al. 2007; LALLI et al. 2008). 13

2 Cíl práce U vybraných potomstev meruněk provést vyhodnocení dědičnosti rezistence k viru šarky švestky (PPV). Jednotlivé hybridy roztřídit do skupin podle stupně odolnosti k šarce švestky (PPV). Na základě analýzy štěpných poměrů stanovit dědičnost rezistence k PPV u jednotlivých potomstev. Provést mapování genu rezistence k PPV pomocí molekulárních markerů a získané výsledky porovnat s doposud dosaženými. 14

3 Literární přehled 3.1 Šarka švestky Tato choroba je jedna z hospodářsky nejzávažnějších virových onemocnění u peckovin rodu Prunus L. způsobená virem šarky švestky. Nově doporučovaný český název choroby je virové neštovice slivoně / meruňky / broskvoně (KVIČERA, NOVÁKOVÁ 2008). 3.1.1 Původ a rozšíření První symptomy tohoto onemocnění byly pozorovány na švestkách v jihozápadním Bulharsku na konci 1. světové války. Popsáno však bylo až v roce 1932 Dr. Atanasovem, který také tuto chorobu pojmenoval jako šarka švestky a poukázal na její virový původ. O dva roky později pak publikoval první fotografie symptomů této choroby na listech a plodech třešně, broskvoně a listech meruňky (DZHUVINOV et al. 2007). Toto virové onemocnění se pomalu rozšířilo do střední a západní Evropy a okolo Středozemního moře. Šíření pokračuje dále východním směrem do Eurasie, bylo nalezeno v Indii (BHARDWAJ et al. 1995) a Číně (NAVRÁTIL et al. 2005). V roce 1992 bylo poprvé detekováno na západní hemisféře v Čile (MUÑOZ, COLLAO 2006), na podzim roku 1999 v USA (LEVY et al. 2000), v roce 2000 v Kanadě (THOMPSON et al. 2001). V současnosti jediným kontinentem s příhodnými podmínkami pro pěstování ovocných dřevin rodu Prunus L., kde se šarka švestky nevyskytla, je Austrálie (RODONI et al. 2006) a s ní i Nový Zéland (LEBAS et al. 2006). V těchto zemích jsou zavedena přísná fytosanitární opatření. Na území České republiky byly první příznaky tohoto onemocnění pozorovány na počátku 40. let 20. století ve východních Čechách. Od té doby se virus rozšířil do hlavních oblastí pěstování peckovin. Značná část švestek a myrobalánů v Čechách i na Moravě je infikována, naproti tomu meruňky a broskvoně jsou infikovány méně často. Plané druhy slivoní, trnky a myrobalány, stejně jako švestková stromořadí podél cest, jsou hlavním zdrojem a rezervoárem virového onemocnění (NAVRÁTIL 2006). 15

3.1.2 Charakteristika původce onemocnění Onemocnění šarka švestky je způsobené virem šarky švestky (Plum pox virus PPV, synonyma prunus virus 7, Scharka-Virus, Sarka virus). Virus je zařazen do čeledi Potyviridae, rodu Potyvirus (Virus Taxonomy-Classification and Nomenclature of Viruses 2000). Viriony viru šarky švestky jsou dlouhé, ohybné a kyjovité částice o délce 660 750 nm a šířce 12,5 20 nm uspořádané pomocí obalového proteinu (CP, coat protein) o hmotnosti přibližně 36 kda spirálovitě okolo jednovláknové RNA s pozitivní polaritou o délce 9,7 kb (BRUNT et al. 1996). Genomová RNA viru šarky švestky má na svém 5'- konci VPg protein (viral protein genome-linked, protein kódovaný virem kovalentně vázaný k nukleotidovému řetězci) (REICHMANN et al. 1989) a dlouhý polyadenilový řetězec na 3'- konci (LAÍN et al. 1988). Výsledkem translace genomu PPV je jednoduchý polyprotein, který je štěpen pomocí tří proteáz na 10 konečných proteinů, ačkoli vzniká také celá řada částečně zpracovaných polyproteinů (SALVADOR et al. 2006). Mnoho izolátů viru šarky švestky se liší v biologických a epidemiologických vlastnostech jako agresivita, přenos mšicemi a symptomy. Právě na těchto vlastnostech byly založeny první identifikace a rozlišení. Hlavní pokrok přišel v roce 1979 (KERLAN, DUNEZ 1979 in CANDRESSE, CAMBRA 2006), kdy se podařilo rozdělit 5 izolátů PPV do 2 skupin. Toto rozlišení bylo provedeno dvojitou difúzí v agaru pomocí polyklonálních protilátek a čistých nedegradovaných virových částic. To vedlo k rychlému pojmenování obou dvou skupin podle jednoho z izolátů zastoupeného ve skupině, tj. Marcus a Diderot. Tak vzniklo označení kmenů PPV-M a PPV-D. S rozvojem molekulárních metod byly výsledky sérologických pokusů potvrzeny i molekulárně a následně došlo k identifikaci dalších izolátů PPV lišících se v sekvenci genomu. To rychle vedlo k tomu, že tyto izoláty začaly být považovány za další kmeny označované jako PPV-EA, PPV-C a PPV-Rec. V současnosti mají převahu v zastoupení a počtu izolátů kmeny PPV-D, PPV-M a PPV-Rec. PPV-D (Diderot) Izoláty kmenu PPV-D přirozeně infikují meruňky a švestky a zřídka se z těchto hostitelů rozšiřují na broskvoně. Byly poprvé izolovány z meruněk v jihovýchodní Francii. Kmen PPV-D se objevuje v mnoha evropských zemích a byl detekován v Severní a Jižní Americe. 16

PPV-M (Marcus) Zdá se, že v porovnání s izoláty kmene PPV-D se izoláty kmene PPV-M snadněji rozšiřují pomocí mšic na broskvoně. Dále tyto izoláty způsobují rychlejší epidemii a silnější příznaky na květech, listech a plodech broskvoní. Kmen byl poprvé identifikován na broskvoních v Řecku a častěji se vyskytuje ve střední a jihovýchodní Evropě. PPV-Rec (Recombinant) Izoláty zařazené do tohoto kmenu vznikly přirozenou rekombinací RNA mezi izolátem kmene PPV-M a PPV-D nebo jejich předků (CERVERA et al. 1993; GLASA et al. 2004). Tento kmen se vyskytuje v Albánii, Bulharsku, České republice, Německu, Maďarsku a Slovensku (GLASA et al. 2004). Byl také detekován v Pákistánu (KOLLEROVÁ et al. 2006). Izoláty tohoto kmenu jsou přenosné mšicemi, i když s různou úspěšností (GLASA et al. 2004). PPV-EA (El Amar) Izolát podle nějž je pojmenován tento kmen byl izolován v Egyptě. Způsobuje typické symptomy šarky švestky na listech, plodech a peckách, je přenášen mšicemi a je možné ho detekovat protilátkami proti PPV-D. Od tohoto kmenu se však liší v nukleotidové sekvenci, míra podobnosti je 81 % (WETZEL et al. 1991a). PPV-C (Cherry) Třešně a višně byly považovány za rezistentní vůči PPV, neboť žádný ze známých kmenů je neinfikoval přirozeně. V 90. letech minulého století však byl PPV-C izolován z višní v Moldavsku (KALASHYAN et al. 1994) a třešní v Itálii (CRESCENZI et al. 1995). Na plodech třešní a višní se vyskytují propadliny a kroužky, které se s postupujícím dozráváním ztrácí. Infekce viru je systematická (NEMCHINOV, HADIDI 1996). Tento kmen byl uměle přenesen očkováním na broskvoně a je přenosný mšicemi (CRESCENZI et al. 1997). Byl detekován také v Bulharsku a Maďarsku a pravděpodobně je rozšířen více, než se původně myslelo (JAMES, GLASA 2006). PPV-W (Winona) Jediný izolát W3174 patřící do tohoto kmenu byl poprvé detekován na švestce v soukromé zahradě v Stoney Creek, Ontario, Kanada (JAMES et al. 2003). Švestka neměla žádné symptomy na plodech a pouze mírné symptomy na listech. V porovnání s izoláty ostatních kmenů je patrné, že tento izolát je geneticky odlišný. S PPV-D, PPV- M, PPV-EA a PPV-C se hladina shodnosti nukleotidů celého genomu pohybuje od 79 do 80 % (JAMES, VARGA 2005). 17

3.1.3 Přenos viru Virus je přenášen na krátké vzdálenosti hmyzími vektory neperzistentním způsobem. Mezi nejčastější vektory patří mšice rodů Aphis, Brachycaudus a Myzus. Mšice mohou nasát virové částice nejen z listů, ale i plodů infikovaných rostlin (LABONNE, QUIOT 2001). Přenos na dlouhé vzdálenosti je zapříčiněn lidskou činností, neboť jde většinou o výsledek pohybu a použití infikovaného rozmnožovacího materiálu. Virus se přenáší mechanicky roubováním, očkováním, transplantací štítku kůry a rostlinnou šťávou. Této vlastnosti se často využívá při inokulaci rostlin. Naproti tomu se nepřenáší kontaktem mezi rostlinami (BRUNT et al. 1996). Také pylem je nepřenosný (ELIBUYUK 2006). Možnost přenosu viru šarky švestky semenem z napadených stromů je sporná. Dlouhou dobu se považoval PPV za přenosný semenem. K prvním studiím o přenosu viru semenem byly použity bylinné indikátory a s rozvojem sérologických detekčních metod založených na polyklonálních antisérech byly původní pozitivní výsledky potvrzeny. Míra infekce však byla různá v závislosti na druhu a části semene použité k testování. V práci NEMÉTH, KÖLBER (1982) byla studována míra přenosu u meruněk, švestek a broskvoní. Z výsledků této práce vyplývá, že až 91 % semen meruněk bylo infikováno a přenos do semenáčů se pohyboval v rozmezí od 0-14 %. Přítomnost PPV v semeni meruněk a broskvoní byla studována také v práci PASQUINI et al. (2000) s poněkud odlišným výsledkem. PPV byla přítomna v semeni, hlavně v osemení, ale také v dělohách, ale semenáče byly negativní. Stejně tak nebyl PPV detekován u semenáčů v práci THOMIDIS, KARAJIANNIS (2003), navíc při testování přenosu PPV semenem u myrobalánu a švestky domácí nebyl virus detekován ani v semeni (GLASA et al. 1999). Také práci ELIBUYUK (2006) nebyl virus šarky švestky detekován v semenáčích, ani v semeni infikovaných meruněk a švestek. V současnosti se u žádného izolátu PPV nepředpokládá, že by byl přenosný semenem (PASQUINI, BARBA 2006). Přestože byl virus detekován v několika druzích plevelných rostlin, není jejich role při šíření viru šarky švestky zatím dostatečně objasněna. Většinou se přijímá názor, že plevele a jednoleté rostliny nejsou důležité v epidemiologii viru (LLÁCER 2006). 18

3.1.4 Hostitelé a symptomy V přírodních podmínkách virus šarky švestky snadno napadá odrůdy ovocných dřevin rodu Prunus L. jako jsou meruňky, švestky, slívy, broskvoně a myrobalány. Višně, třešně a mandloně bývají infikovány příležitostně. Virus napadá také mnoho planě rostoucích a okrasných druhů rodu Prunus L. jako P. besseyi L.H. Baley, P. insititia L., P. tomentosa Thunb., P. triloba Lindl. a P. spinosa L.. Virus šarky švestky může být uměle přenesen na mnoho druhů rodu Prunus L., na Sorbus domestica L. a mnoho bylin (Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 2006). V přírodních podmínkách jsou také snadno infikovány druhy rodu Prunus L. a kříženci používané jako podnože. Obecně semenáče používané jako podnože jsou velmi citlivé k viru šarky švestky (LLÁCER, CAMBRA 2006). RUBIO et al. (2005) při testování 15 podnoží rodu Prunus L. nalezl tři, které označil za rezistentní, jedná se o podnože GF677 (P. dulcis (Mill.) D. A. Webb P. persica L.), myrobalán 29C (P. cerasifera Ehrh.) a L2 (P. serrulata var. lannesiana (Carriere) Makino). Projevy přítomnosti viru šarky švestky mohou být odlišné v závislosti na druhu, odrůdě, věku, výživě a zdravotním stavu rostliny, a také na teplotě (GILDOW et al. 2000). Obecně lze říci, že příznaky napadení virem šarky švestky se mohou objevit na listech, korunních plátcích a pecce. Obzvláště jsou zřetelné na listech v jarním období. Jedná se o mírné světle zelené diskolorace, chlorotické skvrny, pruhy a prstence, vybělení nebo žloutnutí žilnatiny, nebo dokonce listové deformace. Projevy infekce na květech se mohou objevit na květních plátcích některých odrůd broskvoní v podobě diskolorace. Infikované plody mohou být deformované nebo nepravidelného tvaru s chlorotickými skvrnami nebo lehce pigmentovanými žlutými prstenci nebo pruhy. Na plodech mohou vznikat malá hnědá nebo nekrotická místa. Dužnina napadených plodů může hnědnout a mít sníženou kvalitu. V některých případech plody nemocných stromů předčasně opadají. Obecně lze říci, že na plodech raných odrůd se projevy přítomnosti viru objevují mnohem častěji než na pozdnějších odrůdách. Na pecce infikovaných plodů se vyskytují světlé kroužky nebo skvrny (EPPO Standards 2004). Kromě pozorovatelných příznaků dochází také k celé řadě fyziologických změn. U citlivých odrůd dochází následkem infekce PPV k oxidačním stresům, ke snížení kvantového výtěžku fotosystému II, ke změnám aktivity peroxidáz a kataláz, změnám 19

hladiny antioxidačních enzymů v chloroplastech a změnám v chloroplastové struktuře (GYÖRGY 1976; HERNÁNDEZ et al. 2006). Meruňka (Prunus armeniaca L.) Symptomy na listech meruněk se objevují jako zelené skvrny a kroužky různé velikosti. Hlavní žilnatina je často lemována světle zelenými proužky 1 až 2 mm širokými, které vytváří elipsovité vzory. Během léta jsou příznaky šarky švestky mírnější a méně nápadné, v období s vysokými teplotami se mohou dokonce i ztratit úplně. Symptomy PPV na mladých listech jsou viditelnější opět na podzim (ŠUTIĆ et al. 1999). Symptomy na plodech se projevují jako mramorovité kresby, prstence, otevřené prstence nebo pruhy na pokožce. Při silné infekci jsou plody boulovité. Dužnina je bez chuti, vláknitá a na vzduchu snadno hnědne. Projevy viru na pecce jsou velice charakteristické. Ohraničené prstencové skvrny mohou při silné infekci připomínat leopardí srst. Tyto příznaky se objevují brzy, již při začátku tvrdnutí pecky (LLÁCER, CAMBRA 2006). Broskvoň (Prunus persica L.) Příznaky viru šarky švestky u broskvoní závisí na kmenu viru. Kmen PPV-M vytváří silné příznaky na listech mladých semenáčů. U většiny kultivarů však nelze pozorovat příznaky na listech, když se jedná o PPV-D. Infikované plody se mohou vyznačovat chlorotickými skvrnami nebo žlutými prstenci nebo liniovým vzorem. Naproti tomu kmen PPV-M se považuje za jedno z hlavních virových onemocnění broskvoní. Symptomy se objevují na korunních plátcích, listech a plodech. Na korunních plátcích některých odrůd broskvoní se mohou objevit barevné diskolorace. Příznaky na prvních listech nových letorostů jsou velmi nápadné, projevují se jako mírné světle zelené diskolorace, chlorotické skvrny, pruhy a kroužky, vybělením žilnatiny nebo jejím žloutnutím, nebo dokonce jako listové deformace (LLÁCER, CAMBRA 2006). Příznaky na plodech jsou obvykle silnější při napadením PPV-M. Výnos z infikovaných stromů je prokazatelně nižší a to průměrně o 17 % (VIRŠČEK- MARN et al. 2005). Švestka (Prunus domestica L.) Příznaky na listech se projevují od nažloutlých až po olivově zelené (výjimečně načervenalé) skvrny, pruhy a kroužky, které někdy mohou být lemovány hnědočerveným okrajem. Někdy může dojít až k listovým deformacím. 20

Symptomy na plodech jsou viditelné jako modré mělké propadliny na nezralých plodech. Jak plod dozrává příznaky nabývají na intenzitě a mohou vést až k deformacím. Na povrchu plodů se objevují hluboce propadlé kruhy, polokruhy nebo nepravidelné pruhy. Pokožka a k ní přilehlá vrstva buněk nekrotizuje, dužnina je červenohnědá a pevně drží při pecce. Plody jsou bez chuti a vláknité (LLÁCER, CAMBRA 2006). Výnos je snížen o 16 48 % (KALASHIAN, CHERNETS 2006). Třešně a višně (Prunus avium L. a Prunus cerasus L.) Na plodech napadených stromů se objevují chlorotické a nekrotické flíčky a dutiny. Na listech jsou viditelné chlorotické skvrny a kroužky (CRESCENZI et al. 1995). Někdy může docházet i k nekrózám a deformacím listů (FANIGLIULO et al. 2004). 3.1.5 Detekce viru Biologické metody Podstatou biologického testování přítomnosti viru je sledování příznaků na citlivých rostlinách za tímto účelem pěstovaných, které se nazývají rostlinné indikátory. Tato metoda se zdá jako spolehlivější, dokáže detekovat i nerovnoměrnou distribuci viru, je však nutné použít vhodný počet opakovaní. Jedná se o praktickou metodu používanou pro testování rozmnožovacího materiálu. Je však náročná na vybavení (skleník, chladná komora, atd.) a prostor. Vhodných bylinných indikátorů pro PPV je více, ale mezi nejdoporučovanější patří Chenopodium schraderianum Schult. a Nicotiana clevelandii A.Gray. Infekce se projeví za 10 15 dní, na listech Ch. schraderianum Schult. se objevují difúzní žluté nebo nekrotické lokální skvrny. Na listech N. clevelandii A.Gray jsou patrné chlorotické a nekrotické kruhové skvrny. Rostliny jsou zakrnělé a rozetovité (GENTIN 2006). Výhodnější ale je použití dřevitých indikátorů, neboť lze testovat více chorob současně. Z nich se široce doporučují Prunus persica GF305 a Prunus tomentosa Thunb. (RANKOVIĆ 1981; DAMSTEEGT et al. 1997). P. persica GF305 je nejčastěji používaným indikátorem, protože je velmi citlivý k mnoha virům a virům podobným chorobám dřevin. Symptomy se na něm objevují při dobrém růstu velmi rychle a přetrvávají minimálně 3 4 týdny. Na starších letorostech se mohou po několika týdnech ztratit a znovu objevit na nově vyrůstajících. Na listech se objevují charakteristické chlorotické vzory, žlutá žilnatina a žluté skvrny. Tyto symptomy jsou často spojené s deformací a kroucením listů. Symptomy jsou stejné pro PPV-M, PPV-D 21

a PPV-EA. Při infekci PPV-C se na několika listech objevují velmi mírné příznaky, které se velmi rychle ztrácejí. Symptomy u P. tomentosa Thunb. se objevují po 20 30 dnech po inokulaci a liší se podle kmenu (DAMSTEEGT et al. 1997). Nejprve se vytvoří chlorotické proužky podél hlavní a sekundární žilnatiny, tyto symptomy mohou být často doprovázeny dubolistostí. Mohou se objevit také chlorotické skvrny, které u stárnoucích listů mohou nekrotizovat. Může také docházek k deformacím a kroucení listů. PPV-M produkuje silnější příznaky než ostatní kmeny (DAMSTEEGT et al. 1997). Sérologické metody Z metod založených na antigenních vlastnostech proteinového obalu virů se nejčastěji používá ELISA test, dále potom Western-blot a imunoelektronová mikroskopie. Aplikace ELISA (enzyme-linked immunosorbent essay) testu (CLARK, ADAMS 1977) pro detekci rostlinných virů znamenala ohromný pokrok v diagnostice patogenů. Dovolila tak jednoduchou a ekonomickou analýzu velkého počtu vzorků. Tuto metodu poprvé použil pro detekci viru šarky švestky DUNEZ (1977 in CAMBRA et al. 2006) a ADAMS (1978) s použitím polyklonálních protilátek. Konvenční DAS-ELISA (double antibody sandwich ELISA) podle CLARK, ADAMS (1977) a DASI-ELISA (double antibody sandwich indirect ELISA) podle CAMBRA et al. (1994) patří mezi nejčastěji používané. Dalším zlomem v diagnostice PPV bylo použití monoklonálních protilátek. Univerzální detekce izolátů PPV je možná díky monoklonální protilátce 5B-IVIA. Tato protilátka reaguje také u Western-blot a imunosorpční elektronové mikroskopie. Některé monoklonální protilátky (CAMBRA et al. 1994; BOSCIA et al. 1997; MYRTA et al. 1998; MYRTA et al. 2000) je také možné použít pro specifickou charakterizaci. Izoláty je tak možné přiřadit k jednotlivým kmenům (PPV-D, PPV-M, PPV-EA, PPV- C). Důležitým faktorem ovlivňujícím výsledek ELISA testu je odběr vzorků. Pro ELISA testy se jako vzorky nejčastěji používají listy, je však možno použít květy (POLÁK 1995), plody, pupeny, kůru a kořeny (DOSBA et al. 1986; ADAMS et al. 1999). Také na době odběru záleží. Nejvhodnější dobou odběru vzorků pro ELISA test jsou jarní měsíce (DOSBA et al. 1986; POLÁK 1995), avšak PPV je možné detekovat ve vzorcích odebraných v podzimních měsících (DOSBA et al. 1986), nebo dokonce i v zimních (ADAMS et al. 1999). 22

Podle metodiky EPPO (EPPO Standards 2004) se vzorky pro ELISA test mají odebírat hlavně v jarních měsících až do příchodu vysokých letních teplot. Na jaře mohou jako vzorky sloužit květy, mladé listy nebo malé plody. Později lze použít vyvinuté listy. Pokud je to možné, odebírají se rostlinná pletiva se symptomy. U bezsymptomatických rostlin jsou to vyvinuté listy z vnitřní části koruny stromu. V zimě lze pro detekci použít spící pupeny nebo kůru z výhonů. Molekulární metody Tyto metody se stále častěji používají pro detekci PPV, neboť překonávají tradiční metody detekce svojí citlivostí a specifičností. Prvotní molekulární hybridizace byly nahrazeny metodami na principu polymerázové řetězové reakce (PCR, Polymerase Chain Reaction). Mezi ně patří reverzní transkripční PCR (RT-PCR, Reverse Transcription PCR), imunovazebná RT-PCR (immunocapture RT-PCR) a další (OLMOS et al. 2006). U RT-PCR je nejprve izolovaná RNA ze zkoumaného vzorku přepsána pomocí reverzní transkriptázy do cdna a ta je pak použita jako templát k PCR amplifikaci. U IC-RT-PCR (WETZEL et al. 1992) jsou virové částice nejprve zachyceny pomocí specifických protilátek, které pokrývají stěny mikrozkumavky. Následně je vzorek odstraněn a mikrozkumavka je v několika krocích promývána. Po přidání chemikálií pro RT-PCR dochází k syntéze cdna. Ačkoli bylo popsáno více primerů rozpoznávajících všechny izoláty PPV, jako referenční pro základní detekci PPV se používají P1, P2 (WETZEL et al. 1991b) a 3 NCR antisence, 3 NCR sence (LEVY, HADIDI 1994). Na základě porovnání nukleotidové sekvence cílové oblasti byly navrženy specifické primery PD a PM (CANDRESSE et al. 1995). tabulka 1 Referenční primery používané pro detekci PPV primer sekvence produkt P1 5 -ACC GAG ACC ACT ACA CTC CC-3 P2 5 -CAG ACT ACA GCC TCG CCA GA-3 243 bp 3 NCR antisence 5 -GTA GTG GTC TCG GTA TCT ATC ATA-3 3 NCR sence 5 -GTC TCT TGC ACA AGA ACT ATA ACC-3 220 bp PD 5 -CTT CAA CGA CAC CCG TAC GG-3 198 bp PM 5 -CTT CAA CAA CGC CTG TGC GT-3 198 bp 23

Další významnou a velmi výhodnou metodou nejen detekce, ale i kvantifikace a rozlišení kmenů PPV je real-time PCR (SCHNEIDER et al. 2004; OLMOS et al. 2005; VARGA, JAMES 2005). Tato metoda patří mezi rychlé, citlivé a spolehlivé diagnostiky PPV. Její další výhodou je, že není nutné provádět elektroforetické nebo kolorimetrické stanovení. Porovnání jednotlivých detekčních metod Každá z uvedených metod má své výhody, ale i nevýhody. Jednotlivé metody se liší pracovní náročností, rychlostí detekce, vhodností použití v zimních měsících, citlivostí atd.. Tyto údaje pro jednotlivé metody jsou shrnuty v tabulka 2. tabulka 2 Srovnání vhodnosti jednotlivých detekčních metod (LÓPEZ-MOYA et al. 2000) Metoda Jednoduchost Rychlost detekce Běžné použití Spolehlivost v zimních měsících Teoret. citlivost a Biologické testy + + + + + + + + + + + + + + ELISA b + + + + + + + + + + + + + + + 0,1-0,5 RT-PCR + + + + + + + + 10-3 IC-RT-PCR + + + + + + + + + 10-4 PCR-ELISA + + + + + + + 10-6 počet symbolů (+) značí vhodnost metody od akceptovatelné (+) až po optimální (+ + + + + ) a ng viru b s použitím monoklonálních protilátek 3.1.6 Kontrola šíření šarky švestky Proti viru šarky švestky neexistují žádné ochranné prostředky. Možností je pouze ochrana proti vektorům přenášejícím tento virus. Dále se doporučuje použití zdravého viru prostého školkařského materiálu, to však nezaručuje, že nedojde k infikování virem šarky švestky později. V zemích, kde šarka švestky doposud nebyla detekována, jsou zavedena přísná fytosanitární opatření (LEBAS et al. 2006; RODONI et al. 2006), aby nedošlo k jejímu zavlečení. V zemích s ojedinělým výskytem choroby se provádějí eradikace napadených a podezřelých stromů (RAMEL et al. 2006; THOMPSON 2006). V oblastech, kde je výskyt této choroby hojnější, je jedinou možností účinné ochrany pěstování odolnýchrezistentních odrůd. Šlechtění s cílem získat rezistentní odrůdy k viru šarky švestky probíhá od 80. let minulého století. 3.2 Šlechtění na rezistenci Předpokladem rezistentního šlechtění je znalost a dostupnost zdroje rezistence. Nejčastěji se provádí vnitrodruhová křížení, pokud se ale zdroj rezistence nenachází v 24

rámci stejného druhu je nutné provést mezidruhová křížení. Za rezistenci jsou odpovědné buď dominantní (R geny) nebo recesivní geny. Některé dominantní geny rezistence byly použity pro získání rezistentních jedinců pomocí transgenního přístupu. Přirozeně se vyskytující recesivní geny rezistence jsou také známy. Řada rostlinných recesivních genů rezistence souvisí s eukariotickými iniciačními faktory 4E (eif4e), 4G (eif4g) nebo jejich isoformami iso4e a iso4g (SATO et al. 2005; RUFFEL et al. 2006), které jsou nutné pro dokončení infekčního cyklu viru v rostlinných buňkách. Viry ovlivněné těmito geny patří převážně do rodu Potyvirus (ROBAGLIA, CARANTA 2006). K pochopení a racionálnímu využití rezistence přirozeně se vyskytující je také nutné vědět o jakou kategorii rezistence se jedná, zda o rezistenci horizontální nebo vertikální. Vertikální rezistence je rezistence rasově specifická. Odolnost tohoto typu je řízena převážně jedním genem (monogenní dědičnost) tzv. major geny (geny velkého účinku). Projev vertikální rezistence řídí zpravidla alely s dominantním účinkem, méně často se jedná o odchylky od dominance a jen velmi zřídka je odolnost řízena recesivními alelami. Horizontální rezistence je účinná proti všem (nebo většině) fyziologickým rasám patogena. Zpravidla je založena polygenně, geny s malým účinkem, tzv. minor geny, které zabezpečují odolnost proti všem rasám patogena, mají kvantitativní účinek. Tento typ rezistence je značně závislý na vnějších podmínkách (BEDNÁŘ 1997; KELLER et al. 2000). Kromě klasických šlechtitelských postupů lze pro získání rezistentních odrůd použít genetické transformace. Strategie založená na expresi obalového proteinu (CP, coat protein) PPV u transgenních rostlin byla testována u mnoha druhů. Zpočátku byly transgenním přístupem získány hlavně byliny, ale poté také i dřeviny, které jsou přirozenými hostiteli viru. Tak byly získány transgenní rostliny meruňky obsahující sekvenci odpovídající genu CP PPV (LAIMER DA CAMARA MACHADO et al. 1992) a později i švestky (SCORZA et al. 1994). Ze získaných transgenních klonů švestky odrůdy Stanley byl vybrán klon C5 vykazující nejvyšší stupeň rezistence k PPV (RAVELONANDRO et al. 1997). Tento klon je dlouhodobě sledován v polních podmínkách a dnes je možné ho nalézt pod názvem HoneySweet (SCORZA et al. 2004). Z dosavadních výsledků vyplývá, že je značně odolný k PPV-M, PPV-D a PPV- Rec (RAVELONANDRO et al. 1997; MALINOWSKI et al. 2006; POLÁK et al. 2008). Tato odrůda je proto využívána v klasickém šlechtění odrůd a podnoží jako vhodný 25

rodič pro přenos genu CP PPV a rezistence k PPV (RAVELONANDRO et al. 2001, RAVELONANDRO et al. 2002). Transgen je přenášen jako jediný genetický lokus a rezistence je děděna dominantně (SCORZA et al. 1998). 3.2.1 Zdroje rezistence k PPV u meruněk Přirozené zdroje rezistence se u meruněk vyskytují. Jsou to hlavně odrůdy pocházející z USA a Kanady. Mezi odrůdy, u nichž byla rezistence k PPV nalezena, patří Stark Early Orange a Stella, následně pak byla prokázána u dalších introdukovaných odrůd z USA a Kanady, tj. u odrůd Goldrich, Harcot, Harlayne, Henderson, NJA2, Orangered, Sunglo a Veecot (DOSBA et al. 1988; KARAYIANNIS 1988; DOSBA et al. 1992; KARAYIANNIS et al. 1999; FUCHS et al. 2001). Ačkoli jsou severoamerické odrůdy rezistentní, často mají některé negativní vlastnosti (autoinkompatibilita, nízká kvalita plodů, vysoké chladové nároky), které předem omezují jejich širší použití v tradičních evropských oblastech pěstování meruněk. Z tohoto důvodu v 80. letech započalo mnoho šlechtitelských programů s cílem získat rezistentní odrůdy s dalšími požadovanými vlastnostmi. Tak vznikly například odrůdy Lito, Pandora (SYRGIANNIDIS, MAINOU 1991 in MARTÍNEZ- GÓMEZ et al. 2003), Avilare a české odrůdy Leronda a Betinka (POLÁK et al. 2003; POLÁK et al. 2005). Základní otázkou však stále zůstává, odkud rezistence k PPV pochází. Při studiu genetické diverzity pomocí 10 enzymatických systémů bylo zjištěno, že severoamerické odrůdy rezistentní k viru šarky švestky jsou příbuzné s evropskými, ale zároveň se od nich liší. Hlavní příčinou odlišnosti je přítomnosti vzácné alely, kterou mají také zástupci středoasijské skupiny (BADENES et al. 1996). Analýza původu rezistence k PPV u severoamerických odrůd pomocí AFLP a SSR markerů (ZHEBENTYAYEVA et al. 2008) dále naznačila jako možný zdroj původní čínský materiál. Nelze také opomenout možnost, že určitou roli v introdukci rezistence k PPV u těchto odrůd mohly mít i druhy Prunus davidiana (Carriere) Franch., P. mume Siebold & Zucc. a P. mandshurica (Maxim.) Koehne (BADENES et al. 1996, ZHEBENTYAYEVA et al. 2008). Avšak v práci RUBIO et al. (2003) byl druh P. mandshurica (Maxim.) Koehne, stejně jako všechny potomci křížení s P. armeniaca L., hodnocen jako citlivý k PPV. 26

3.2.2 Dědičnost rezistence k PPV u meruněk Je dobře známo, že rezistence k PPV je děděna (DOSBA et al. 1988; DOSBA et al. 1991), ačkoli pravděpodobnost získání rezistentních semenáčů z daných křížení a schopnost rodičů přenášet žádaný znak nejsou přesně známé. Informace o dědičnosti rezistence k PPV u meruněk jsou nejednoznačné. Na základě analýzy štěpných poměrů u sledovaných potomstev z odlišných programů byla publikována kontroverzní data o genetické kontrole. Publikované hypotézy hovoří o jednom, dvou nebo třech genech kontrolujících rezistenci k PPV u meruněk. DICENTA et al. (2000) hodnotil 291 semenáčů z 20 různých záměrných křížení. Jako zdroje rezistence byly použity odrůdy Goldrich, Stark Early Orange, Avilara a Lito. Pozorované štěpné poměry se blížily teoretickým, které odpovídají štěpení monogenně děděného znaku, kde znak rezistence je dominantní a rezistentní rodič je heterozygotní pro tento znak. Tato hypotéza se také zdá jako nejpravděpodobnější v práci RUBIO et al. (2007) u potomstev odrůdy Stark Early Orange. Podobné výsledky byly dále publikovány KARAYIANNIS (2006) a KARAYANNIS et al. (2008) u odrůd NJA, Harlayne, Veecot, Sunglo a Orangered s použitím PPV-M. Ti dále hodnotili potomstva křížení s odrůdou Stella. Všichni potomci byli rezistentní, což naznačuje, že odrůda Stella je homozygotní pro dominantní alelu odpovědnou za rezistenci. Podobné výsledky byly dosaženy i u volného opylení této odrůdy inokulované PPV-D (DICENTA, AUDERGON 1998). Naproti tomu v pracích DOSBA et al. (1991) a MOUSTAFA et al. (2001b) štěpný poměr v potomstvech odrůd Stark Early Orange, Goldrich a Harcot za použití PPV-D odpovídal lépe dvěma dominantním genům, kde použité odrůdy by byly heterozygotní pro oba geny. K podobným závěrům došel i KRŠKA et al. (2006) a SALAVA et al. (2008) ve svých pracích, kde jako zdroj rezistence byla použita odrůda Stark Early Orange. Štěpné poměry byly určeny z recipročního zpětného křížení mezi LE-3241 ( SEO Vestar ) a Vestar a zpětných křížení LE-3246 ( SEO Vestar ) Vestar a LE-3218 ( SEO Vestar ) SEO za použití PPV-M. Stejné rodičovské kombinace zpětného křížení a kmen PPV-M použili SALAVA et al. (2005), ale z výsledků vyplývá, že rezistence u meruněk je spíše kontrolována třemi nezávislými komplementárními geny, kde rezistence by byla dominantní znak a rezistentní rodiče ( SEO, LE-3241, LE-3246 ) jsou pro tento znak heterozygoty. Podobně je tomu u odrůdy Harlayne na základě výsledků štěpných poměrů v F 1 27

populacích za použití PPV-M (KRŠKA et al. 2006). Také GUILLET-BELLANGER, AUDERGON (2001) publikovali tyto závěry pro odrůdu Stark Early Orange. Neshody ve stanovení hypotézy o genetické kontrole LLÁCER et al. (2008) odůvodňuje hned několika možnostmi. Mezi ně patří nesjednocený postup stanovování odolnosti vůči PPV, možnost započtení jedinců, kteří však nevznikli záměrným křížením (outcrossing), do výsledného štěpného poměru a špatné označení rodičovských odrůd. Dále je nutné přihlédnout k tomu, že se používají různé izoláty viru a zdroje inokula, podnože, inokulační metody, dále se liší i počet vegetačních sezón, po které jsou rostliny hodnoceny, počet jedinců od genotypu, období hodnocení atd.. 3.2.3 Využití poznatků molekulární genetiky při šlechtění meruněk Rozvoj metod v molekulární genetice v posledních letech se odrazil i v oblasti šlechtění. Díky tomu je dnes možné mapovat a klonovat řadu genů a sekvenovat genom nebo jeho části. Získané informace je pak možné využít ve šlechtění a to hlavně v procesu selekce za použití molekulárních markerů (MAS, marker assisted selection), které jsou ve vazbě s žádaným znakem. Použití této metody při šlechtění na rezistenci vůči PPV je vhodné hlavně z hlediska zvýšení efektivity šlechtění. Několik genetických vazbových map vycházejících z vnitrodruhových křížení meruněk bylo zkonstruováno a u některých z nich byl zmapován i lokus pro rezistenci k PPV jako monogenně děděný znak (HURTADO et al. 2002; SALAVA et al. 2002; VILANOVA et al. 2003; LALLI et al. 2008). Zdrojem rezistence v potomstvu, které použili HURTADO et al. (2002), je odrůda Goldrich. Naproti tomu SALAVA et al. (2002), VILANOVA et al. (2003) a LALLI et al. (2008) použili jako výchozí zdroj rezistence odrůdu Stark Early Orange. Ve všech případech byl lokus pro rezistenci k PPV umístěn v genetické vazbové skupině 1 (LG 1, linkage group). Mezi další možnosti detekce oblastí kódujících hledaný znak patří metody analýzy kvantitativních znaků (QTL analyses, quantitative trait loci). Mezi ně patří analýza jednotlivých markerů (single-marker analysis). Tato skupina metod nevyžaduje sestrojení genetické vazbové mapy a využívá klasické statistické metody jako jsou t- test, analýza variance, lineární regrese a Kruskal-Wallisův test. Další metody, tj. metoda interval mapping (IM) a metoda composite interval mapping (CIM), již pro stanovení hledané oblasti využívají informací genetické vazbové mapy. Metoda CIM kombinuje metodu interval mapping s metodou lineární regrese a je při hledání oblastí 28