NÁDOROVÉ MARKERY U KARCINOMU MOČOVÉHO MĚCHÝŘE

NÁDOROVÉ MARKERY U KARCINOMU MOČOVÉHO MĚCHÝŘE J. Klečka, M. Hora SOUHRN Karcinom močového měchýře (KMM) má celosvětově zvyšující se incidenci spojenou s vysokou mírou recidiv. Vyžaduje včasné určení diagnózy, léčbu a dlouhodobé sledování. Současné metody diagnostiky karcinomu močového měchýře zahrnují ultrazvukové vyšetření, vylučovací urografii, počítačovou tomografii, cytologické vyšetření moči a invazivní cystoskopické vyšetření. Tyto metody, přestože mají vysokou výtěžnost, jsou finančně a časově náročné a invazivní, a pro pacienta nekomfortní. Proto vyvstává potřeba levného, neinvazivního, rychlého a jednoduchého vyšetření s vysokou senzitivitou a specifitou. V současné době narůstá paleta radioizotopových imunoanalytických esejí určených k detekci KMM. Autoři textu předkládají přehledný článek, týkající se problematiky nádorových markerů u karcinomu močového měchýře. Jedná se o výčet a souhrn v současné době známých nádorových markerů, stanovovaných především z moči. Do přehledu autoři zařadili jak v praxi využívané a pro běžnou praxi schválené nádorové markery, tak markery, které se nacházejí ve fázi výzkumu. KLÍČOVÁ SLOVA nádorový marker karcinom močového měchýře detekce sledování SUMMARY CANCER MARKERS AT BLADDER CANCER Bladder cancer has worldwide increasing incidence connected with high rate of relapses, which need early diagnosis, treatment and long term follow up. Current methods of bladder cancer diagnostics include ultrasound examination, intravenose pyelography, computer tomography, cytology urine examination and invasive cystoscopy. Although are these methods highly successful, they are financially and time consuming and invansive, and uncomfortable for the patient. Therefore arises the need for cheap, non invasive, fast and simple examination with high sensitivity and specifity. Nowadays cumulates variety of immuno analytic radioisotope essays designated for detection of bladder cancer. Authors of this text present overwiew article, concerning problems of tumour markers in bladder carcinoma. They are discussing the listing and summary of currently known tumour markers, determined particularly from the urine. The authors of the abstract included in daily practise used and already approved tumour markers, and also markers which are in the stadium of research. KEY WORDS tumour marker bladder cancer detection follow - up ÚVOD Uroteliální karcinom močového měchýře (KMM) má vysokou prevalenci v mnoha průmyslových zemích, což je částečně následkem skupiny onemocnění sdružených s kouřením cigaret, gumárenským a kožedělným průmyslem a užíváním organických rozpouštědel [1]. Incidence KMM se globálně odhaduje na 20 případů na 100 000 obyvatel [2], což je zhruba 200 000 nových případů za rok. V České 17

republice bylo za rok 1999 hlášeno celkem 2 013 případů KMM. Celková incidence bez ohledu na pohlaví činí 19,6 případu/100 000, z toho u mužů je incidence 29,2/100 000, u žen pak 10,5/100 000 [3]. Asi u 80 % nádorů močového měchýře se jedná o povrchové formy. Zhruba 70 % povrchových tumorů močového měchýře recidivuje do 5 let od prvé resekce. V časovém horizontu 15 let je četnost recidiv onemocnění až 90 %. Přestože cystoskopie s cytologii moče, vylučovací urografie a ultrasonografie jsou v současné době nejpoužívanějšími metodami pro diagnostiku a monitorování KMM, jedná se o metody nekomfortní, časově a finančně náročné a v případě cystoskopie invazivní. Současný standard sledování pacientů s KMM vyžaduje v prvých 2 letech po iniciální terapii, což je nejčastěji transuretrální resekce, cystoskopii každé 3 měsíce, následně každého půl roku v následujících 2 letech a 1krát ročně po dobu 10 let. Přestože má cystoskopie udávanou senzitivitu 90 %, je vyšetřením invazivním a někdy neumožní dosažení definitivní diagnózy, zvláště v případech, kdy je ložisko karcinomu příliš malé, nebo jedná-li se o carcinoma in situ (CIS). Pomocnou metodou zlepšení senzitivity cystoskopie právě a především u pacientů s CIS je použití fluorescenční cystoskopie po předchozí aplikaci kyseliny 5-aminolevulonové. Cytologie moči, přestože se jedná o více než 50 let staré vyšetření, by měla být standardem neinvazivní části vyšetřovacího postupu při prvozáchytu i při sledování pacientů KMM. Potřeba jednodušších, neinvazivních metod pro detekci a sledování pacientů s uroteliálním karcinomem močového měchýře, vyvolala odezvu v podobě několik let trvajícího výzkumu a vývoje metodik, jejichž jedním z klíčových cílů bude vytvoření přijatelných pravidel a metod sledování především k vyloučení recidiv maligního onemocnění močového měchýře u asymptomatických pacientů po léčbě. Výše uvedená fakta jsou příčinou výzkumu na poli hledání nádorových markerů, určených k neinvazivní diagnostice KMM. Optimální nádorový marker musí splňovat požadavek neinvazivity, snadné interpretace výsledků a především vysoké senzitivity a specifity. PŘEHLED Nuclear matrix protein 22 (NMP22) Poprvé byla nukleární matrix, základní strukturální element jádra, popsána v roce 1974 [5]. Tato nechromatinová struktura podporuje zachování tvaru jádra, podílí se na organizaci DNA, plní funkci při replikaci DNA a transkripci a tvorbě RNA [6]. NMP-22 je jaderný protein mitotického aparátu, zajišťující správnou distribuci chromatinu do dceřinné buňky. Jaderný mitotický aparát je velice imunogenní, ale v interfázi jádra se vyskytuje pouze v nízkých hladinách. NMP-22 je uvolňován z buněčného jádra maligních buněk během jejich apoptózy. Takto uvolněná bílkovina je přístupna snadné detekci z moči pomocí imunoeseje. Jedná se o Matritech NMP22 assay (Matritech Corp., Newton, Mass., USA), což je laboratorní ELISA test ke kvantitativní detekci NMP22. Soloway et al použili NMP-22 jako prediktivního markeru recidivy KMM po transuretrální resekci tumoru. Použili vzorku moči při prvé cystoskopické kontrole po resekci tumoru [7]. Hodnota nad 10 IU/ml byla považována za pozitivní. Senzitivita metody byla 69,7%, specificita 78,5%. 100% senzitivity dosahoval test při přítomnosti invazivního KMM. NMP-22-protein je vhodný marker pro monitoraci recidivy KMM. Jeho biologický charakter omezuje jeho využití pro primární diagnostiku KMM. Bladder Tumor Antigen Test (BTA) Pod pojmem BTA test se skrývají 3 různé testy. Prvotní test byl založen na latexové aglutinační reakci s kvalitativní detekcí antigenu bazální membrány moči, který se ve zvýšené míře uvolňuje do moči pacientů s KMM při invazi nádorů přes bazální membránu. Antigen, resp. bladder tumor antigen je ve své podstatě human complement factor H-releated protein (hcfhrp- BTA). Jedná se o protein, vyznačující se podobnou strukturou a funkcí jako komplement-faktor H. Během vzniku a růstu tumoru zabezpečuje hcfhrp to, že chrání tumor před imunitním systémem hostitele. Faktor H podporuje disociaci C3-aktivující konvertázy a urychluje degradaci C3b [8]. Na výše uvedeném základě prvotního testu byly do praxe uvedeny 2 variace, a to BTA Stat Test a BTA TRAK. BTA Stat Test Základem metodiky je jednokroková rychlá imunochromatografická esej pro detekci bladder tumor antigenu (BTA). Provedení testu samotného je velice jednoduché: 3 5 kapek čerstvé moči je přidáno na kazetovou malou membránu. Pokud dojde do 5 minut k zčervenání pásku, je test pozitivní. Provedení ještě jedné kontroly nás ujistí o správnosti výsledku testu. Nejčastěji udávaná senzitivita BTA Stattestu se pohybuje mezi 65 až 79 % [9,10]. BTA TRAK BTA TRAK je základní a pro laboratoř určená forma BTA-testu, znovu zaměřená proti hcfhrp-related proteinu. Oproti single step kvalitativnímu BTA Stat-testu je BTA TRAK kvantitativní two step-elisa-esej s pevnou fází. Dalším rozdílem je, že u BTA Stat-testu musíme užít vždy čerstvou moč, kdežto u BTA TRAK testu může být moč uchovávána až 1 týden při teplotě 4 C. Na souboru 220 pacientů, z nichž byla u 100 potvrzena diagnóza KMM, byla vypočtena senzitivita a specificita, jež činily 66 %, respektive 69 %. Následné analýzy vyhodnocují senzitivity v závislosti na grade tumoru: G1 (48 %), G2 (59 %) a G3 (88 %), respektive dle rozsahu malignity pta-pt1 (51 %), ptis (59 %) a pt2-4 (88 %) [24]. Při širším srovnání BTA Stat a BTA TRAK testu s cytologií moči, vykazuje BTA test vyšší senzitivitu, ale nižší specificitu [11]. BCLA-4 Na základě laboratorních analýz byly detekovány hlavní složky komplexu jaderné bílkovinné matrix jednak v maligní tkání a jednak ve tkáni zdravé. Komplex jaderné bílkovinné matrix u KMM se sestává ze 6 různých proteinů: BCLA 1-6, které jsou přítomny pouze v maligní tkáni, naproti tomu, ve zdravé tkáni se vyskytují 3 různé proteiny bílkovinné matrix, a to BLNL 1-3 [12,13]. V současné době probíhá multicentrická prospektivní klinická studie, která má za úkol vyhodnocení klinického využití BLCA-4 pro primární diagnostiku KMM. V porovnání s ostatními močovými nádorovými markery není BCLA-4 konstantně zvýšen v případech nemaligních onemocnění močového měchýře. ImmunoCyt Tato esej je nejmodernějším neinvazivním testem, který obdržel souhlas FDA v USA (Food and Drug Administration) ke komerčnímu použití v diagnostice KMM. ImmunoCyt vyráběný firmou Diagno-Cure Inc. (Sainte Foy, Que., Canada), kombinuje techniku cytologie s imunofluorescencí. Z to- 18

hoto důvodu je tento test shledáván spíše pomocnou metodou pro cytologii než molekulární esejí. Test detekuje buněčné markery specifické pro KMM na buňkách získaných z moči. Jsou využívány 3 monoklonální fluorescenční protilátky detekující odpovídající antigeny: 19A211, M344 a LDQ10. Protilátka 19A211 je označena texaskou červení a identifikuje přítomnost povrchového buněčného sialoglykoproteinu s vysokou molekulární hmotností, který se vyskytuje pouze na nádorových buňkách, častěji u povrchových forem KMM s nízkým gradem. 19A211 antigenu má 77% senzitivitu u povrchových KMM (Ta-T1), ale jen 10% senzitivitu u T3-T4 KMM [15]. M344 a LDQ10 jsou značeny fluorescinem a namířeny proti skupině mucinů, které jsou vyjádřeny na většině maligních buněk KMM, ale nikoliv na buňkách zdravého urotelu. Bonner et al informují, že potvrzení přítomnosti M344 antigenu na odloupaných uroteliích zlepšuje senzitivitu konvenční cytologie [14]. Autor uvádí 78% senzitivitu při využití kvantitativní fluorescenční obrazové analýzy. Jako cut off stanovuje 2 a více pozitivních buněk na 10 000 vyšetřených buněk. Výhodou Immunocyt-testu je vysoká schopnost detekce dobře diferencovaných tumorů s nízkým gradingem. Navzdory limitujícím faktorům (falešná pozitivita a negativita), zvyšuje kombinace ImmunoCytu s cytologií senzitivitu oproti cytologii samotné nebo samotným molekulárním esejím. Mezi nesporné výhody patří i možnost vizuální identifikace. Průtoková cytometrie a Quanticyt Badalament et al zavedli do praxe senzitivnější metodu detekce KMM než cytologii moči, a to průtokovou cytometrii [16]. Základní myšlenkou bylo, že pacienti s KMM by měli mít větší počet buněk s aneuploidním jádrem než zdravý jedinci. K získání dostatečného množství vhodných buněk je potřeba výplachu močového měchýře za pomoci brush-katétru nebo cystoskopu. Prvotní studie poukazují, že průtoková cytometrie má jen lehce vyšší senzitivitu než klasická cytologie moči při lehce snížené specificitě [17]. Systém Quanticyt je založen na karyometrické analýze mikroskopických obrázků buněk z výplachu močového měchýře a hodnotí tvar jádra a obsah DNA. Hlavní nevýhodou testu je potřeba velkého množství buněk, které ovšem nejsou vždy obsaženy v moči získané při normální mikci. Fibrin - fibrinogen degradační produkty (FDPs) Fibrin-fibrinogen degradační produkty jsou bílkovinné fragmenty vzniklé působením plazminogenu na fibrin a fibrinogen. Vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), který je přímo produkován buňkami KMM, vede ke zvýšené permeabilitě peritumorózních cév, a tím pádem ke zvýšené koncentraci proteinů v plazmě. Krevní faktory hemokoagulace rychle rozkládají fibrinogen na fibrin a tento je dále působením plazminu štěpen na fibrindegradační produkty (FDPs). Výzkum FDPs v moči jako markerů KMM probíhá od roku 1970 [18]. Prvotní AuraTek FDPs-test, určený k detekci FDP z moči, byl před nedávnem nahrazen Accu-Dx-testem (Intracel, Inc., Rockville, Maryland). Tento test umožňuje kvantitativní měření fibrin-degradačních produktů v moči a výsledek testu je k dispozici do 10 minut. Tato esej je založena na hemaglutinační imunoinhibiční reakci. Alternativou je užití latex-aglutinační eseje při zachování stejné senzitivity jako u předchozí metody. V literatuře udávané senzitivity a specificity testu se pohybují od souhrnné 68% senzitivity a 96% specifity až k 81% senzitivitě s odpovídající 75% specificitou [19]. Stanovení telomerázové aktivity Telomery jsou koncové struktury chromozomu, které jsou u člověka tvořeny stovkami opakujících se identických sekvencí TTAGGG. Jejich funkcí je stabilizovat a chránit chromozomy před spojením, rekombinací jejich ramének a přichycení se pomocí nukleární matrix k jaderné membráně [20]. Při každém buněčném cyklu dochází ke zkracování konců telomer (o 50 200 nukleotidů). Po zkrácení na kritickou délku dojde k rozdělení buňky a přetržení telomery. Telomeráza je nukleoproteinový enzym, který se připojuje k TTAGGG sekvencím, a tím prodlužuje délku telomery, zvyšuje stabilitu chromozomu, zachovává jeho délku, a tím přispívá k nesmrtelnosti buňky - základnímu znaku malignity [20]. Telomeráza, jak se zdá, je inaktivní v normálním lidské epitelové tkáni, ale při vzniku malignity dochází ke její reaktivaci [21]. TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) TRAP-esej je jednoduchou metodou prokazující telomerázovou aktivaci, resp. reaktivaci [21]. Přestože bylo vytvořeno několik variant originální TRAP-eseje, jejich podstata zůstává stejná, tj. navázání DNA na gel a digitální odečtení ELISAmetodou. Aktivní telomeráza je extrahována ze vzorků tkáně, nebo odloučených buněk. TTAGGG-telomerové sekvence jsou syntetizovány in vitro a namnoženy pomocí PCR (Polymerase Chain Reaction), a produkty jsou pak patřičnou metodou vizualizovány. Všechny na ELISA-metodice založené TRAP-testy (např. TRAPeze - Appligene Oncor a verze Boehringer, Mannheim - oba určeny zatím pouze pro výzkumné účely) nabízejí vhodnou formu využitelnou v budoucnu v rutinní praxi detekce KMM. Senzitivita telomerázové aktivity odloučených uroteliálních buněk u tohoto souboru pacientů byla 62% a specificita 96,4% [16]. Detekce RNA-komponent-telomerázy Před nedávnem bylo započato s detekcí exprese lidské telomerázové template RNA (htr) [22] a lidské telomerázové reverzní transkriptázy (htert) [23] v moči a dosavadní výsledky jsou slibné. Provedené studie potvrzují 83% senzitivitu pro telomerázovou htr a 80% senzitivitu telomerázové htert za podmínky, že je pro oba markery použita reverzní transkriptázová PCR (RT-PCR). Tyto, na molekulárních elementech založené eseje jsou časově rychlejší a mají jednodušší provedení. Cytokeratiny (CK) CK jsou proteiny intermediálních filament, tvořících cytoskeleton buňky. Přítomnost CK je typická pro buňky epitelu. V lidských buňkách bylo popsáno více než 20 různých typů CK. Existující epitel může být charakterizován specifickou kombinací cytokeratinové exprese [24]. Epiteliální buňky tvoří od 2 do 10 podtypů CK a výsledná kombinace je odrazem jak typu epitelu, tak stupně jeho diferenciace, čehož je možno využít při diagnostice malignity [25]. Zvýšená exprese CK byla pozorována taktéž u pacientů s KMM. Na základě tohoto bylo vyvinuto mnoho jak komerčních, tak výzkumně zaměřených esejí, založených na detekci CK fragmentů v moči pacientů s KMM. The IdeaL Monoclonal Urinary Bladder Cancer UBC - ELISA Test UBC (Urinary Bladder Cancer) je test vyvinutý k detekci KMM. Výrobcem je firma IDL Biotech (Borlange, Sweden). Jedná se 19

o 2 hodiny trvající ELISA-metodiku detekující ve vodném prostředí rozpustné fragmenty CK 8 a CK 18. Esej je 2stupňová a využívá pevné fáze. V nedávno publikované studii, zahrnující 54 pacientů s histologicky ověřeným KMM, vykazoval UBCtest všeobecnou 64,8% senzitivitu a 92% specificitu [26]. UBC Rapid Test Tento test, taktéž vyvinutý firmou IDL Biotech, je určen k in vitro kvalitativnímu měření fragmentů CK 8 a CK 18. Pozitivní výsledek je vyjádřen barevnou změnou testovacího proužku, který v případě pozitivního výsledku ztmavne. Tento test je srovnatelný svým použitím s BTA Stattestem. Ve studii Miana et al, zahrnující celkem 180 pacientů, z čehož u 53 byl histologicky verifikovaný KMM, byla prokázána 66% senzitivita a 90% specifita [26]. CYFRA - 21-1 Jedná se o elektrochemoluminiscenční imunoesej, založenou na detekci fragmentu cytokeratinu 19 z moči i séra pomocí 2 monoklonálních protilátek (BM 19.21 a KS 19.1). Pariente et al stanovuje všeobecnou 96,9% senzitivitu testu a 67,2% specificitu [27]. Tissue Polypeptide - Specific Antigen (TPS) Assay Jedná se o ELISA-esej, vyráběnou firmou IDL Biotech a založenou na TPS protilátkách, které se přednostně váží na CK fragmenty 18 a 8. Všeobecná senzitivita testu je 64% a specificita 84% [28]. Tissue Polypeptide Antigen (TPA) TPA je součástí cytoskeletonu normální epiteliální buňky. TPA-esej (producent Sangtec Medical, Sweden) je zaměřena na detekci cytokeratinových fragmentů 8, 18 a 19. Sanchez-Carbayo et al prokazuje ve své práci všeobecnou 80,2% senzitivitu a 68% specificitu. Cytokeratin 20 Assay (CK 20) Posledním ze skupiny cytokeratinů, poskytující slibné výsledky, je CK 20. CK 20 se vyskytuje selektivně v epiteliálních buňkách gastrointestinálního a močového traktu [29]. Genovou přítomnost CK 20 je možno stanovit z buněk močového sedimentu pacientů s KMM pomocí RT-PCR metodiky. Rotem et al demonstruje ve své práci všeobecnou 86,7% senzitivitu a 96,7% specifitu [30]. Cytokeratiny stanovované z moči jsou slibnou skupinou nádorových markerů vykazujících jak vysokou senzitivitu, tak specificitu pro diagnostiku KMM. Cytokeratiny je možno nejen stanovovat pomocí imunoanalytických metod, ale zároveň je možno je vizualizovat při histologickém vyšetření resekátů tumoru, resp. biopsií z močového měchýře, a tím přispět k upřesnění diagnózy v nejednoznačných případech. Buněčné adhezivní molekuly a ligandy CD44 Glykoprotein CD44 je transmembránový glykoprotein kódovaný skupinou genů [31], lokalizovaných na krátkém raménku 11 chromozomu. Délka komplexu kódujících genů je 60-80kb. Lidský typ obsazuje posledních 20 exonů řetězce chromozomu [32]. 10 z nich je vyjádřeno prakticky ve všech buněčných typech a je zodpovědno za produkci glykosylovaného izotypu nazývaného jako standardní typ (CD44s). Zbylých 10 chromozomálních exonů je alternativně zapojeno do produkce nadbytku bílkovinných izotypů. Tyto jsou známy jako exonové varianty (CD44v) [31] a jsou zastoupeny rozdílně v závislosti na typu buňky a druhu tkáně [33]. Různé studie zaměřené na hodnocení tkáně tumorů prokazují expresi CD44 v buňkách a čerstvých biopsiích v různých histologických typech malignit [34]. Kyselina hyaluronová (HK) a hyaluronidáza (HK-áza) Kyselina hyaluronová (KH) je nesulfurikovaný glykosaminoglykan, který je promotorem adheze maligních buněk a jejich migrace a zároveň je součástí tkáňové matrix a tkáňového moku. KH se může vázat s receptory na povrchu buněk, nejčastěji s CD44, a tímto regulovat buněčnou adhezi, proliferaci a migraci. KH se ve zvýšené míře vyskytuje u karcinomu tračníku, prsu, plic a taktéž u Wilmsova tumoru [35]. Součásti KH taktéž stimulují angiogenezi. V případě KMM se zdá, že buňky KMM indukují tvorbu KH ve fibroblastech [36]. Při použití enzymem značené imunosorbentní eseje (ELISA)-like-esej s proteinem vázajícím KH místo protilátky proti KH, prokázal Lokeshwar vyšší hladiny KH u pacientů s KMM [37]. Stanovil cut-off 100 ng/ml KH v moči a došel k 92% senzitivitě detekce KMM při 93% specificitě. Hyaluronidáza (HKáza), resp. hyaluronidázy jsou endoglykozidázy štěpící KH. U lidí jsou hlavní lokalizací produkce HKázy játra. Produkce HKázy maligními buňkami je závislá přímo úměrně na invazivním potenciálu KMM. Při srovnání HK a HKázy je senzitivita HKázy nižší při detekci dobře diferencovaných KMMs grade l než pro průkaz hůře diferencovaných karcinomů, a naopak. E-Cadherin Na rozdíl od CD44 proteinu, u nějž v případě malignity roste jeho chybná exprese [34], v případě E-Cadherinu dochází k jeho snížení v maligní tkáni [38]. Ve studii zahrnující 40 pacientů s KMM, byla zaznamenána ztráta E-Cadherinu pouze ve 35 % případů [38]. Nízký diagnostický potenciál měl E-Cadherin i ve studii Protheroea et al [39], který se zaměřil na vztah hladin v moči rozpuštěného E- Cadherinu (se-cadherin) ke stadiu tumoru. LEWIS - X Antigen S antigenem X související antigeny jsou buněčné povrchové antigeny, složené ze 4 podskupin, ale jen LEWIS - X vykazuje korelaci s KMM. U normálních uroteliálních buněk se nevyskytuje, ale bývá prokázán ve více než 90 % u KMM (nezávisle na stagingu a gradingu karcinomu) [3]. Detekce chromozomálních abnormalitmikrosatelitní detekce Jedná se o detekci chromozomálně aberantních DNA lokusů, resp ztrátu heterozygozity (LOH - loss of heterozygosity). Individuálně nebo společně se vyskytující ztráty (LOH) byly pozorovány na 4, 8, 9, 11, 17 a 18 chromozomu, a tyto následně vedou k deleci tumor supresorového genu p16 a p53 na 9 a 17 chromozomu [74]. Jako substrát se používá DNA, extrahovaná z odloučených buněk močového sedimentu, která je testována na soubor 24 markerů, lokalizovaných na různých chromozomech. LOH-detekce je založena na rozdílu výsledků testu genotypu získaného z krve ( normální genotyp ) a genotypu získaného z DNA odloučených buněk močového sedimentu ( maligní genotyp ). Mezi nejvýznamnější močové markery, resp. markerové alely patří ABL1, D9S162, D9S172, MJD58 a D18S364. Všechny tyto markery byly alterovány minimálně ve 30 % KMM. Molekuly (markery) asociované s karcinomem močového měchýře Nejnovější a potenciálně významnou skupinou nádorových markerů jsou antigeny spojené s přítomnosti tumoru, resp. KMM. Většina esejí detekujících tyto molekuly je v současnosti ve fázi vývoje a bude 20

potřeba nějakého času k dosažení přesnějších výsledků. Zde je přehled těchto markerů. 486 P 3/12 Jedné se glykoproteinový antigen s molekulovou hmotností 200 kd, detekovatelný pomocí IgM-monoklonálních protilátek a vyskytující se u 90 % KMM, bez ohledu na grade a rozsah (staging) tumoru [41]. AN43 a BB369 AN43 a BB369 jsou monoklonální protilátky podskupiny IgG, vážící se na do moči vyloučený s tumorem asociovaný antigen. Vyskytují se ve tkání KMM, výjimečně i ve zdravé tkáni. Obě výše uvedené protilátky soutěží o jedno vazebné místo na stejném antigenu. Větší expresi AN43 zaznamenáváme u karcinomu močového měchýře a karcinomu prsu [42]. Psoriasin (S100A7) Psoriasin je kalcium vázající protein, vyskytující se na povrchu skvamózního epitelu. Zvýšené hladiny psoriasinu jsou nacházeny jak v preinvazivní, tak i infiltrující formě karcinomu prsu. Elevované hladiny byly pozorovány ve vzorcích moči pacientů se skvamózním karcinomem močového měchýře [44]. DD23 DD23 je IgG1 mucine-monoklonální protilátka, vázající se s tumorem asociovaným antigenem vyjádřeným v tkáni KMM a karcinomu prsu [45]. Analýza růstových faktorů - cytokiny Úloha růstových faktorů v iniciaci, růstu a progresu KMM je v literatuře obecně uváděna, ale má určitá omezení. Přesné stanovení možného diagnostického potenciálu těchto markerů bude záležitostí blízké budoucnosti. Fibroblastový růstový faktor - FGF Úlohou těchto proteinů je stimulace angiogeneze a buněčné motility. Oba podtypy, acidický a bazický (afgf, bfgf), jsou spojeny s KMM [46]. Diagnostické využití FGF je omezeno tím, že se vyskytují i v normální tkáni. Vzhledem k tomu, že zvýšené hladiny FGF jsou spojeny hlavně s angiogenezí a progresí tumoru, je jich možno využít jako prognostických faktorů Transformující růstový faktor - β 1 (TGF - β 1 ) TGF-β1 je bílkovina s molekulovou hmotností 25 kd, jejíž funkcí je na jedné straně proliferace osteoblastů a fibroblastů a na druhé straně zpomalení epiteliální a endoteliální proliferace. TGF-β1 má inhibiční potenciál v buněčném cyklu a snížené hladiny markeru u invazivních forem tumorů mohou znamenat nedostatek suprese, a tím progresi tumoru. Epidermální růstový faktor (EGF) a receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR) EGF je ve své biologicky aktivní formě [47] vylučován do moči a má pozitivní vliv na růst tumoru. EGF-receptory (EGFR) jsou za normálních podmínek uloženy podél bazální membrány urotelu, ale v případě KMM z přechodního epitelu se vyskytují ve všech vrstvách epitelu. Kromě toho je přítomnost EGFR nezávislým ukazatelem progrese tumoru a predikce přežívání pacienta [48]. Močový autokrinní faktor motility (uamf) a receptor autokrinního faktoru motility (AMFR) uamf je rozpustný glykoprotein produkovaný maligními buňkami, schopný indukovat buněčnou motilitu. Močový AMF je možno stanovit pomocí ELISA-techniky a jeho zvýšené hodnoty jsou detekovatelné u pacientů s KMM [49]. AMFR se vyskytuje ve 2 formách, buď na odloučených epiteliálních buňkách, nebo rozpuštěný v moči. ZÁVĚR: Většina v současné době dostupných močových nádorových markerů je využívána pro detekci a monitoring KMM, což ale nevylučuje jejich využití i pro jiné malignity urogenitálního traktu. Markery KMM jsou v současnosti více využívány pro vlastní detekci KMM než pro určení prognózy onemocnění. Většina markerů má vyšší senzitivitu než rutinní cytologie moči, zvláště u karcinomu s nižším gradingem. Novější z močových markerů taktéž vykazují korelaci mezi stagingem a gradem onemocnění, podobně jako cytologie. Prakticky všechny močové markery mají nižší specificitu než cytologie, zvláště jsou-li užity jednotlivě. Zlepšení jejich specificity můžeme očekávat při společném hodnocení s cytologií či při použití panelu markerů. Do budoucna bude potřeba rozdělit markery na skupinu vhodnou k detekci malignit horního a dolního močového traktu a taktéž markery vhodné pro primární detekci a recidivu onemocnění. Spolehlivost močových markerů v souvislosti s intravezikální chemo- a imunote-rapií KMM bude potřeba přesněji vyhodnotit. Literatura 1. Burch JD, Rohan TE, Howe GR, Risch HA, Hill GB, Steele R, Miller AB. Risk of bladder cancer by source and type of tabacco exposure, a casecontrol study. Int J Cancer 1989; 44: 622-628. 2. Manhert B, Tauber S, Kreigmair M, Schmitt UM, Hasholzner U, Reiter W, Hofmann K, Schmeller A, Stieber P. BTA TRAK - A useful diagnostic tool in urinary bladder cancer? Anticancer Res 1999;19: 2615-2620. 3. Novotvary 1999 ČR, ÚZIS ČR, 2002. 4. Babjuk M, Petřík V, Soukup M, Jirsa M et al. Fluoroscenční cystoskopie s intravezikální instilací kyseliny 5-aminolevulonové a její využití k diagnostice nádorů močového měchýře - výsledky 125 vyšetření. Česká urologie 2003; 1: 11-15. 5. Pardoll DM, Vogelstein B, Coffey DS. A fixed dite of DNA replication in eucaryotic cells. Cell 1980; 19: 527. 6. Gordon JN, Shu WP, Schlussel RN. Altered extracellular matrices influence cellular proces-ses and nuclear matrix organizations of overlying human bladder urothelial cells. Cancer Res 1993; 53: 4971-4977. 7. Carpinito GA, Stadler WM, Briggman JV. Urinary nuclear matrix protein as a marker for transitional cell carcinoma of the urinary tract. J Urol 1996; 156: 1280-1284. 8. Takashi M, Schenek U, Kissel K, Leyh H, Treiber U. Use of diagnostic catogories in urinary cytology in comparsion with the bladder tumour antigen test in bladder cancer patienta. Int Urol Nephrol 1999; 31: 189-196. 9. Leyh H, Marberger M, Conort P, Sternberg C, Pansadoro V, Pagano F, Bassi P, Boccon-Gibod l, Ravery V, Treiber U, Ishak L. Comparsion of the BTA stat test with voided urine cytology and bladder wash cytology in the diagnosis and monitoring of bladder cancer. Eur Urol 1999; 3: 52-56. 10. Leyh H, Mazeman E. Bard BTA test compared with voided urine cytology in the diagnosis of reccurent bladder cancer. Eur Urol 1997; 32: 425-428. 11. Heicappall R, Wettig IC, Schostak M, Muller M, Steiner U, Sauter T, Miller K. Quantitative detection of human complement factor H-related protein in transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Eur Urol 1999; 35: 81-88. 12. Konety BR, Nguyen TS, Dhur R et al. Detection of bladder cancer using a novel nuclear matrix protein, BCLA-4. Clin Cancer Res 2000; 6: 2618-2622. 13. Bonner RB, Hemstreet GP, Fradet Y et al. Bladder cancer risk assessment with quantitativa fluorescence image analysis of tumor markers in exfoliated bladder cells. Cancer 1993; 72: 2461-68. 14. Cordon-Cardo C, Wartinger DD, Melamed MR, Fair W, Fradet Y. Immunopathologic analysis of human urinary bladder cancer. Characterisation of two new antigens associated with low-grade superficial bladder tumours. Am J Pathol 1992;140: 375-385. 15. Sagerman PM, Saigo PE, Scheinfield J, Charitonowics E, Cordon-Cardo C. Enhanced detection of bladder cancer in urine cytology with Lewis X, M344 and 19A211 antigens. Acta Cytol 1994; 38: 517-523. 16. Gregoire M, Fradet Y, Meyer F et al. Diagnostic accuracy of urinary cytology, and deoxyri-bonucleotic acid flow cytometry and cytology on bladder washings during follow up for bladder tumors. J Urol 1997; 157: 1660-1666. 17. Cajulis RS, Haines GK, Frias-Hidvegi D et al. Cytology, flow cytometry, image analysis, and interphase cytogenetics by fluorescence in situ hybridization in the diagnosis of transitional cell carcinoma in bladder washes: a comparative study. Diagn Cytopathol 195; 13: 214. 21

18. McCabe RP, Lamm DL, Haspel MV et al. A diagnostic-prognostic test for bladder cancer using a monoclonal antibody-based enzyme linked immunoassay for detection of urinary fibrin(ogen) degradation products. Cancer Res 1984; 44: 5886. 19. Johnston B, Morales A, Emerson L, Lundie M. Rapid detection of bladder cancer: A comparative study of point of care tests. J Urol 1997; 158: 2098-2101. 20. Kim NW, Piatyzsek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PLC, Coviello GM, Wright WE, Weinrich SL, Shay JW. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 1994; 266: 2011-2015. 21. Yoshida K, Sugino T, Tahara W, Woodmann A, Bolodeoku J, Nargund V, Fellows G, Goodison S, Tahata E, Tarin D. Telomerase activity in bladder carcinoma and its implication for noninvasive diagnosis by detection of exfoliated cancer cells in urine. Cancer 1997; 79: 362-369. 22. de Kok JB, Ruers TJ, van Muijen GN, van Bokhoven A, Williems HL, Swinkels DW. Real - time quantification of human telomerase reverse transcriptase mrny in tumours and healthy tissues. Clin Chem 2000; 46: 313-318. 23. Ito H, Kyo S, Kanaya T, Takakura M, Koshida K, Namiki M, Inoue M. detection of human telomerase reverse transcriptase messenger RNA in voided urine samples as a useful diagnostic tool for bladder cancer. Clin Canceres 1998; 4: 2807-2810. 24. Southgate J, Harden P, Trejdosiewitz LK. Cytokeratin expression patterns in normal and malignant urothelium: A review of tje biological and diagnostic impications. Histol Histopathol 1999; 14: 657-664. 25. Fruchs E. Keratins as biochemical markers of epithelial differentiation. Trends Genet 1988; 4: 277-281. 26. Mian C, Lodde M, Haitel A, Vigl EE, Marberger M, Pycha A. Comparsion of two qualitative assays, the UBC Rapid Test and the BTA Stat Test, in the diagnosis of urothelial cell carci-noma of the bladder. Urology 2000; 56: 228-231. 27. Sanchez-Carbayo M, Urrutia M, Silva JM, Romani R, Garcia J, Alferez F, Gonzales de Buit-rago, M, Navajo JA. Urinary tissue polypeptide-specific antigen for the diagnosis of bladder cancer. Urology 2000; 55: 526-532. 28. Miettinen M. Keratin 20: Imunohistochemical marker for gastrointestinal, urothelial and Merkel cell carcinomas. Mod Pathol 1995; 8: 384-388. 29. Rotem D, Cassel A, Lindenfeld A, Mecz Y, Sova Y, Resnick M, Stein A. Urinary cytokeratins 20 as a marker for transitional cell carcinoma. Eur Urol 2000; 37: 601-604. 30. Tolg C, Hofman M, Herrlich P, Ponta H. Splicing choice from the variant exons establishes CD 44 variability. Nucleic Acids Res 1993; 21: 1225-1229. 31. Matsumara Y, Sugiyama M, Matsumara S, Hayle AJ, Robinson P, Smith JC, Tarin D. Unusual retention of introns in CD44 gene transcripts in bladder cancer provides new diagnostic and clinical oncological opportunities. J Pathol 1995; 177: 11-20. 32. Mackay CR, Terpe HJ, Strauder R, Marston WL, Stark H, Gunther U. Expression and modulation od CD44 variant isoforms in humans. J Cell Biol 1994; 124: 71-82. 33. Woodman AC, Sugiyama M, Yoshida K, Sugino T, Borgya A, Goodison S, Matsumara Y, Tarin D. Analysis of anomalous CD44 gene expression in human breast, bladder, and colon cancer and correlation of observed mrnaand protein isoforms. Am J Pathol 1996;149: 1519-1530. 34. Matsumara Y, Hanbury D, Smith J, Tarin D. Noninvasive detection of malignancy by iden-tification of unusualcd44 gene activity in exfoliated cencer cells. BMJ 1994;308: 619-624. 35. Knudsom W, Biswas C, Li XQ et al. The role and regulation of tumor associated hyaluronan. In: The Biology of Hyaluronan. CIBA Foundation Symposium No. 143. Ed. by J. Whelan. New York, John Wiley & Sons, 1989, p. 150. 36. Lokeshwar VB, Obek C, Soloway MS et al. Tumor asociated hyaluronic acid: a new sensitive and specific urine marker for bladder cancer. Cancer Res 1997; 57: 773. 37. Lokeshwar VB, Block NL. HA-Haase urine test. A sensitive ans specific method for detecting bladder cancer and evaluating its grade. Urol Clin North Am 2000; 27: 53. 38. Protheroe AS, Banks RE, Mzimba M, Porter WH, Southgate J, Singh PN, Bosomworth M, Harnden P, Smith PD, Whelan P, Selby PJ. Urinary concentrations of the soluble adhesion molecul E-cadherin and total protein in patients with bladder cancer. Br J Cancer 1999; 82: 273-278. 39. Pode D, Golijanin A, Sherman Y, Lebensart P, Shapiro A. Immunostainig of Lewis X in cells from voided urine, cythopathology and ultrasound for noninvasive detection of bladder tumours. J Urol 1998; 159: 389-393. 40. Orntoft T, Wolf H. Molecular alterations in bladder cancer. Urol Res 1998; 26: 223. 41. Huland E, Huland H, Schneider A. Quantitative imunocytology in the management of patients with superficial bladder carcinoma. A marker to identify patients who do not require prophylaxis. J Urol 1990; 144: 637-640. 42. Liebert M, Wedemeyer GA, Stein JA, Washington RW, Flint A, Ren L, Barton Grossman H. Identification by monoclonal antibodies of an antigen shed by human bladder cancer cells. Cancer Res 1989; 49: 6720-6726. 43. Barton Grossman H, Washington RW, Carey TE, Liebert M. Alterations in antigen expresion in superficial bladder cancer. J Cell Biochem 1992; 161: 63-68. 44. Bonner RB, Liebert M, Hurst RE, Barton Grossman H, Bane BL, Hemstreet JP and the Marker Network for Bladder Cancer: Characterisations of the DD23 tumour associated antigen for bladder cancer detection and recurrence monitoring. Cancer Epid Biomarkers Prev 1996; 5: 971-978. 45. Chopin D, Caruelle J, Colombel M, Palcy S, Ravery V, Caruelle D, Abou CC, Barritault D. Increased immunodetection of acidic fibroblast growth factor regulates in bladder cancer, de-tectable in urine. J Urol 1993; 150: 1123-1130. 46. Miyamoto H, Kubota Y, Shuin T, Torigoe S, Dobashi Y, Hosaka M. Expression of transforming growth factor beta in human bladder cancer. Cancer 1995; 75: 2565-2570. 47. Krupski T, Moskaluk C, Boyd JC, Theodorescu D. A prospective pilot evaluation of urinary and immunohistochemical markers as predictors of clinical stage of urothelial carcinoma of the bladder. BJU Int 2000; 85: 1027-1032. 48. Messing EM, Murphy-Brooks N. Recovery of epidermal growth factor in voided urine of patients with bladder cancer. Urology 1994; 44: 502-506. 49. Korman HJ, Peabody JO, Cerny JC, Farah RN, Yao J, Raz A. A autocrine motility factor receptor as possible urine marker for transitional cell carcinoma of the bladder. J Urol 1996; 155: 347-349. MUDr. Jiří Klečka Urologická klinika LF UK a FN v Plzni kleckaj@fnplzen.cz 22