1. Teorie mikroskopových metod A) Mezi první mikroskopové metody patřilo barvení biologických preparátů vhodnými barvivy, což způsobilo ovlivnění amplitudy světla prošlého preparátem, který pak byl snadno pozorovatelný a jeho jednotlivé struktury byly vzájemně barevně rozlišeny. Nevýhodou tohoto způsobu bylo to, že při procesu barvení byly biologické preparáty většinou usmrceny. B) Pozorování v tmavém poli (v zástinu): Při pozorování v tmavém poli je z obrazu vyloučeno světlo, které by dopadalo přímo do objektivu. Princip metody spočívá v tom, že předmět je osvětlen pomocí kondenzoru se clonou ve tvaru mezikruží (která se nachází v jeho předmětové ohniskové rovině) tak, že numerická apertura světelného svazku vystupujícího z kondenzoru je větší než numerická apertura mikroskopového objektivu použitého k pozorování daného předmětu (kondenzor je centrálně zacloněn). Do objektivu se tedy dostane jen to světlo, které je rozptýleno předmětem. Předmět se pak jeví jako svítící na tmavém pozadí a je dobře viditelný. Pro tuto metodu jsou využívány speciální kondenzory (paraboloidní nebo kardioidní), které se zasunou na místo normálního kondenzoru. Pro suché objektivy s numerickou aperturou do 0,65 není třeba zvláštních kondenzorů pro tmavé pole, stačí zastínit výstupní čočku kondenzoru clonou pro tmavé pole, která je ve volitelné výbavě mikroskopu. Protože se při tomto pozorování využívá jen zlomku světlené intenzity zdroje, má mít tento zdroj dostatečný výkon. Z hlediska světelné optiky je důležité, že při pozorování v tmavém poli září na tmavém podkladě ty části objektu, na kterých dochází ve vlastnostech světla k dostatečnému rozdílu při průchodu pozorovaným objektem, jako např. na hranách. Při tvorbě obrazu v tmavém poli nemají význam rozdíly v indexu lomu, které jsou naopak podstatné při pozorování ve fázovém kontrastu, jehož princip uveřejnil holandský fyzik Frederik Zernike již v roce 1932. C) Metodou obdobnou metodě temného pole je metoda vícebarevného osvětlení, jejíž princip spočívá v tom, že do předmětové ohniskové roviny kondenzoru umístíme clonku např. ve tvaru mezikruží, kde střední část obsahuje filtr propouštějící světlo určité barvy (např. zelený filtr) a vnější část obsahuje filtr propouštějící světlo jiné barvy (např. červený filtr). Předmět se pak jeví červeně zabarvený na zeleném pozadí. Průměr středního filtru musí být zvolen analogicky jako u metody temného pole. D) Metoda šikmého osvětlení je další metodou, která nám umožňuje zkontrastnit pozorovaný předmět. Její princip spočívá v tom, že do předmětové ohniskové roviny kondenzoru umístíme clonku s kruhovým otvorem vhodného průměru, jehož střed leží mimo optickou osu kondenzoru a kterou lze volně otáčet. Na předmět pak z kondenzoru dopadá šikmý svazek pod určitým směrem, což má pro pozorovatele ten efekt, že se mu předmět jeví plasticky a je dobře viditelný. Vhodným natočením clonky a vhodnou volbou průměru otvoru v clonce lze tento efekt optimalizovat pro daný předmět. Tuto metodu lze snadno realizovat u mikroskopů opatřených tzv. velkým Abbeho osvětlovacím aparátem (kondenzor doplněný vysunovací irisovou clonou).
E) Pozorování ve fázovém kontrastu Po průchodu preparátem se světlo mění dvěma způsoby: změna amplitudy procházejícího světla nám zprostředkuje vnímání detailů kontrastů jak intenzity, tak i barev. Výsledný vjem je běžný kontrastní barevný obraz. Změna fáze světla, která nastává při průchodu objektem, není zrakem přímo viditelná. Nemá-li tedy objekt detaily lišící se kontrastem, je pro lidský zrak průhledný, čirý. U řady biologických objektů tyto vlastnosti převažují a proto je zrakem obtížně identifikujeme. Mikroskop vybavený pro pozorování ve fázovém kontrastu nám umožňuje pozorovat i takové objekty, které způsobují jen fázový posun světla. Hlubší poznatky o tomto principu jsou součástí fyzikální optiky. Mikroskop pro pozorování ve fázovém kontrastu musí být pro tuto metodu patřičně vybaven. Potřebujeme objektivy pro fázový kontrast a kondenzor pro fázový kontrast. Oba tyto optické díly jsou opatřeny tzv. fázovými prstenci. U objektivů jsou jejich trvalou částí, u kondenzoru jsou používány podle potřeby. Objektivy pro fázový kontrast mají na jedné ze svých čoček nanesený neprůhledný "fázový" prstenec, na kterém nastává posun fáze světelné vlny. Objektivy pro fázový kontrast mohou sloužit též pro pozorování bez fázového kontrastu, avšak prstenec v objektivu způsobuje v tomto případě mírné snížení jakosti (a světelnosti) obrazu - udává se přibližně 10 %. U objektivu s malým zvětšením se však toto zhoršení prakticky neprojevuje. Fázový kontrast je značně závislý na seřízení mikroskopu. K tomu se dodává účelná pomůcka, tzv. středící (centrovací) dalekohled. Ten se nasadí místo jednoho okuláru a pak pozorujeme polohu fázových prstenců, které můžeme vystředit pomocí nastavovacích prvků. Přesný postup je v návodu ke každému mikroskopu, nicméně vyžaduje trochu zkušeností. Je běžné používat pro světlé pole a fázový kontrast společné objektivy až do zvětšení 40x, pro vyšší zvětšení je téměř nutné používat pro každou metodu jednoúčelový objektiv. Pro získání výraznějších výsledků se někdy pro plně profesionální využití navíc zhotovují fázové vrstvy částečně absorbující (v průhledu se jeví šedě). Užitím takové vrstvy dosáhneme vedle změny fáze, navíc i změnu amplitudy vlnění, což dává zvláště při pozitivním fázovém kontrastu možnost pozorovat i ty nejméně odlišné detaily preparátů Apodizovaný FK. Optické schéma fázového kontrastu
Obraz preparátu získaný pomocí klasického fázového kontrastu neumožňuje kvůli halaci pozorování detailů uvnitř živých buněk. Naopak u apodizovaného fázového kontrastu jsou ztlumeny okraje velkých objektů, čímž je halace redukována, což zvyšuje kontrast struktur uvnitř buňky. F) Fluorescenční mikroskopie Fluorescenční mikroskopie se dělí na dvě metody: pozorování v odraženém světle (epifluorescence) a pozorování v procházejícím světle (diafluorescence). Fluorescenční pozorování v procházejícím světle se v současné době téměř nepoužívá, pod pojmem fluorescence budeme rozumět výhradně pozorování odraženého fluorescenčního světla, tj. epifluorescenci. Jedná se o jev spočívající v tom, že některé látky (fluorofory) po ozáření (excitaci) světlem určité vlnové délky λexcit vyzařují (emitují) světlo jiné vlnové délky λemit > λexcit. Podstatou fluorescence je tedy buzení viditelného záření v objektech, které obsahují chemické sloučeniny (fluorochromy), schopné specificky měnit dopadající ultrafialové záření na odražené barevné viditelné záření. Některé biologické objekty již takové sloučeniny samy obsahují (např. chlorofyl), jiným je musíme dodávat specifickým barvením. Takové preparáty jsou však často zdrojem viditelného záření pouze dočasně. Zdroj světla λemit λexci
Na obrázku výše je ukázán princip optických přístrojů využívajících fluorescence světla. Ze zdroje světla je pomocí tzv. excitačního filtru propuštěno pouze světlo určité vlnové délky λexci, které dopadá na vyšetřovaný vzorek. Zde dochází k fluorescenci, přičemž vzorek emituje světlo o vlnové délce λemit > λexcit. Pomocí tzv. bariérového filtru je do oka pozorovatele propuštěno jen světlo emitované vzorkem a oko vidí jen ty části vzorku, které emitují světlo o vlnové délce λemit. Pro fluorescenci potřebujeme samostatnou osvětlovací soustavu. Jednak musí světlo dopadat na objekt (podstata epifluorescence) a za druhé musí mít určitou vlnovou délku, často z oblasti ultrafialového záření. Výbava mikroskopu pro fluorescenci se skládá ze zdroje záření, nástavce pro osvětlení dopadajícím světlem, držáku s výměnnými fluorescenčními filtry a ochranného oranžového štítu. Zdrojem záření je téměř vždy vysokotlaká rtuťová výbojka (Hg). Výbojka je napájená ze sítě přes samostatný zdroj ze sítě 230V/50Hz, obecně zvaný startér. Je umístěna v lampové skříňce, která souvisí s nástavcem pro osvětlení dopadajícím světlem. Tyto díly je nutné stavebnicově vsadit do stativu mikroskopu, současně s držákem fluorescenčních filtrů. Výbojku v lampové skříňce je nutné vystředit a zaostřit tak, aby její světelný tok při dopadu na preparát byl maximální. To se provádí pomocí kolektorové čočky a středících šroubů na lampové skříňce při pozorování obrazu výboje ve středící pomůcce, která se upevní místo jednoho objektivu v revolverovém nosiči. Dokonalé vystředění výbojky je podmínkou pro dobrý výsledek a je nutné jej občas překontrolovat. Výbojka má životnost kolem 200h, délka jejího života se měří hodinovým počitadlem na startéru. Život výbojky může být i delší, po překročení mezní doby nehrozí imploze, avšak uvnitř výbojky se usazuje kovový nálet, který snižuje její světelný výkon. Důležitou součástí fluorescenční výbavy jsou fluorescenční filtry. Fluorescenční filtr je obvykle vyroben jako kostka, která se skládá z excitačního filtru, barierového filtru a dichroického zrcadla. Filtry se od sebe liší vlnovými délkami, které vymezují pásma propustnosti excitačního a barierového filtru. Dichroické zrcadlo odráží přednostně krátkovlnné záření na preparát a propouští dlouhovlnné "fluorescenční" záření do okuláru. Pro praxi je důležité, že ke každému fluorescenčnímu barvivu je nutné přiřadit určitý fluorescenční filtr (mluvíme o jednom filtru, ačkoliv jde o soustavu dvou filtrů a zrcadla v kostce). Výrobci nabízejí množství různých filtrů, některé z nich jsou i vícepásmové. Běžné filtry jsou označeny písmenem, určujícím barevnou oblast světla (B = modrá, G = zelená), ve které pracují. Čísla v označení pak charakterizují pásma vlnových délek pro barierový a excitační filtr, případně pro dichriocké zrcadlo. Volba správného filtru je podstatnou podmínkou pro úspěšnou metodiku fluorescenční mikroskopie. Epifluorescence spočívá ve vertikálním fluorescenčním osvětlení excitačním světlem o požadované vlnové délce. Objekt je pozorován přes objektiv, světlo dopadá shora přes excitační filtr a dichronické zrcadlo, obraz předmětu je pozorován přes emisní filtr. Dichronické zrcadlo odráží excitační světlo o určité vlnové délce směrem do vzorku a propouští ostatní vlnové délky. Bariérový filtr umístěný mezi objektiv a okulár blokuje nechtěné vlnové délky, čímž poskytuje černé pozadí k fluorescenčnímu obrazu. G) Pozorování v polarizovaném světle. Mikroskop může též sloužit pro pozorování v polarizovaném světle. Tato metoda pokud se používá pro kvantitativní stanovení polarizačního úhlu vyžaduje
speciální okuláry a objektivy, které nemají vlastní polarizační účinky (bez vnitřního pnutí). Mikroskop musí být doplněn o polarizátor a analyzátor, může být vybaven kruhovým otočným stolkem se stupnicí. Kvalitativní polarizace v procházejícím světle se provádí s běžnými objektivy a s jednoduchou výbavou. K polarizačním mikroskopům se užívají kruhové stolky. Barevné a neutrální filtry. Součástí osvětlovací soustavy jsou filtry, které se vkládají do dráhy světla. Mohou se pokládat na výstupní čočku osvětlovací soustavy ve stativu mikroskopu, nasazovat na kondenzor nebo jsou uloženy ve stativu a vkládány pomocnými mechanizmy (páčkou apod.). Filtry můžeme rozdělit na pestré (barevné) a nepestré (neutrálně šedé). Barevné filtry mění chromatičnost pozorovaného obrazu. Běžný je modrý filtr, používaný při pozorování i při fotografické dokumentaci (označený běžně jako filtr pro "denní světlo") a zelený interferenční filtr (označovaný zkratkou "GIF"), velmi prospěšný při pozorování ve fázovém kontrastu. Nepestré - neutrálně šedé filtry slouží k zeslabení intenzity osvětlení (podobně jako "polní" clona), přitom se však nemění chromatičnost. Kromě těchto filtrů se v některých případech používají také filtry, absorbující tepelné záření.