Indikátory vitality dřevin (INVID)

Transkript

1 Vzdělávací materiál projektu Indikátory vitality dřevin (INVID) Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a Státním rozpočtem ČR INVID CZ.1.07/2.3.00/

2 1. Úvodní obecné informace Vznik mikroskopu Jeho historie vývoje je již více než 400 let dlouhá. Jeho vynález není připisován jedinému člověku. První mikroskop jehož základem byly čočky, sestrojili roku 1590 otec a syn Jensenovi, brusiči skla a diamantů. Pro svou nepatrnou zvětšovací a rozlišovací schopnost však nebylo možno tento přístroj používat k vědecké práci. Další vylepšení přinesl Italský astronom a matematik Galileo Galilei a již jej začal používat k vědeckým účelům, např. aby prozkoumal mravenčí oko. Je třeba dodat, že mikroskopy byly vlastně vedlejším produktem při objevení a vývoji teleskopů (Johaness Kepler). Zásadní zdokonalení přinesl čalouník, později optik z Delftu, Antonio van Leeuwenhoek ( ). Vymyslel, jak přesně vybrousit čočky a jak je sestavit a upevnit, aby vytvořily silný zvětšovací efekt. Vytvořil základy nejen mikroskopické techniky, ale ve skutečnosti i základy mikrobiologie jako samostatné vědy. Objevil oběh krve v kapilárách, živorodost mšic, jako první spatřil svoje spermie, v krvi našel červené krvinky. Nevýhodou Leeuwenhoekova mikroskopu však bylo to, že byl jednočočkový. Tím byly možnosti mikroskopu značně omezeny (přestože jeho čočky zvětšovaly až 270x). V roce 1665 vynalezl anglický fyzik a chemik Robert Hooke tzv. složený mikroskop s více čočkami. Optickou teorii mikroskopu však vytvořil až kolem roku 1873 německý fyzik Ernst Abbe. K dalšímu dramatickému vývoji mikroskopu přispěli v průběhu 19.století především Carl Zeiss (výroba mikroskopů), Ernst Abbe (studie optických principů) a Otto Schott (výzkum optického skla). Optický (paprskový) mikroskop dosáhl ve 30. letech 20. století své teoretické hranice. Ta je limitována 1000 násobným (resp násobným) zvětšením a rozlišením 0,2 mikrometru. Vědci však chtěli vidět detaily buněk. To vyžadovalo zvětšení řádově násobné. Bylo tedy zřejmé, že je nutno zkonstruovat mikroskop na jiném principu. Místo světelného paprsku se zde využívá elektronový paprsek (tok rychlých elektronů), místo skleněné čočky pak magnetická. První mikroskop na tomto principu (tzv. prozařovací elektronový mikroskop) byl vyvinut v Německu v roce 1931 a zasloužili se o to především Max Knoll a Ernst Ruska.

3 Základní princip světelného mikroskopu Mikroskop je optická soustava, určená k pozorování drobných - mikroskopických - objektů při velkém zvětšení až 1000x, případně 1500x. Hranice zvětšení ve světelném mikroskopu je dána vlnovými vlastnostmi světla. Obrazy z mikroskopu pozorujeme zrakem, takže o výsledné kvalitě obrazu rozhoduje nejen technická dokonalost mikroskopu, ale také psychofyziologická kondice uživatele. Chceme-li zřetelně vidět malý předmět, přibližujeme ho k oku. Zvětšujeme tak zorný úhel pozorovaného předmětu a předmět se jeví zdánlivě větší. Při pohledu pouhým okem však předmět nemůžeme přiblížit na vzdálenost menší než 25cm od oka (u zdravého oka). Je-li předmět blíže, vidíme jej nezřetelně, rozmazaně.proto nám ke nezvětšení malého nebo nepatrného předmětu slouží mikroskop, který může zvětšovat až dvoutisíckrát. Mikroskop tak pracuje na principu zvětšení zorného úhlu, které nám pomocí čoček nebo zrcadel umožní zřetelně si prohlédnout malé předměty. Složení mikroskopu Optická soustava Osvětlovací soustava Mechanické zařízení (tělo zaostřovací mechanismy) Optická soustava je složena ze tří hlavních součástí: Objektiv vytváří zvětšený, skutečný a převrácený obraz předmětu, který se klade za jeho předmětové ohnisko ve vzdálenosti optické délky-d od obrazového ohniska. Okulár umožňuje pozorování obrazu pouhým okem. Předmětem pro okulár se stává obraz vytvořený objektivem. Okulár tento obraz mění na zvětšený, převrácený a zdánlivý. Pro běžné pozorování se u mikroskopu využívá okuláru Huygensova typu (je složen ze dvou ploskovypuklých čoček, obrácených rovinnými plochami k oku). První z obou čoček, bližší k oku, se nazývá čočka oční, druhá má název kolektiv. V měřicích mikroskopech se často užívá okuláru Ramsdenova. Pro náročnější účely se užívá složitějších typů okulárů např. okuláry periplantické nebo ortoskopické. Tubus - nastavuje vzájemné polohy objektivu a okuláru (veličina D optická délka /interval mikroskopu). Optická délka tubusu leží obvykle v rozmezí hodnot 150 až 200 mm. Konstrukce optických soustav také závisí na způsobu využití mikroskopu: Pro pozorování jedním okem (monokulární mikroskopy), oběma očima (binokulární mikroskopy). Ty jsou výhodnější, protože při pozorování oběma očima dochází k menší únavě. Pro možnost propojení se záznamovým zařízením (kamera, fotoaparát) jsou využívány hlavice trinokulární. Osvětlovací soustava - zajišťuje osvětlení pozorovaného předmětu: Mikroskopem můžeme pozorovat předměty průhledné i neprůhledné. V prvním případě se předmět osvětluje procházejícím světlem a v druhém případě světlem odraženým. Kromě toho je v obou případech možné konstruovat osvětlovací soustavu pro práci v tmavém nebo ve světlém poli. Mechanické zařízení: Stativová část umožňující zaostřování, manipulaci preparátem a další formy ovládání.

4 Pojmy světelného mikroskopu Základní díly mikroskopu: Úplný mikroskop se skládá z mechanického tělesa, které tvoří stativ se stolkem, tubusem a osvětlovací soupravou s kondenzorem, a z optických dílů: okulárů a objektivů v otočném revolverovém nosiči. U běžných mikroskopů nejsou jednotlivé díly pevnou součástí stativu, lze je vyměňovat a sestavit tak mikroskop různým způsobem podle požadavků metody, kterou chceme použít. Mluvíme pak o stavebnicových mikroskopech. Jednotlivé díly mikroskopů se často nazývají "moduly". Zaostřování obrazu v mikroskopu se provádí změnou pozorovací vzdálenosti dvojitým souosým knoflíkem na obou stranách stativu mikroskopu. Vnější - větší - knoflík je pro hrubé nastavení, vnitřní - menší - knoflík pro jemné zaostřování. Knoflík jemného posunu bývá opatřen stupnicí, nejmenší dílek odpovídá obvykle posunu o 1µm. Posun může být opatřen nastavitelnou zarážkou, vymezující pohyb ve směru zmenšování pozorovací vzdálenosti - to ulehčuje návrat do roviny ostrosti při výměně vzorků. Rovněž je obvyklé, že můžeme nastavit odpor proti pohybu při zaostřování (samostatným prstencem na společné ose se zaostřovacími knoflíky). Zaostřování se u vzpřímených mikroskopů děje svislým pohybem stolku, při zaostřování inverzních mikroskopů se může pohybovat revolverový nosič objektivů - stolek má pak pro uložení preparátu pevnou základní desku, která je součástí stativu a po ní se pohybuje vodič preparátu. Stolek mikroskopu slouží pro uložení pozorovaného vzorku do optické osy mikroskopu. Preparáty jsou nejčastěji na standardních podložních sklíčkách (76x26x1mm), bývají většinou zakryty krycím sklíčkem. U krycího sklíčka je nutno dbát na jeho kvalitu, má mít tloušťku přesně 0,17mm, být zcela čiré a planparalelní. Na tloušťku 0,17mm jsou vesměs korigovány objektivy, není-li tato hodnota dodržena, může to mít za následek zhoršení obrazu. Některé dražší objektivy jsou vybaveny korekcí na tloušťku krycího skla. To má význam hlavně u inverzních mikroskopů, kde preparát často pozorujeme přes Petriho misku nebo dno skleněné kultivační nádoby. Dříve měly jednoduché mikroskopy stolky, opatřené dvěma svorkami, které přidržovaly podložní sklíčko s preparátem - vyhledávání se provádělo ručním posunováním sklíčka po stolku. Moderní mikroskopy mají vodič preparátů, do kterého se upíná podložní sklíčko (nebo jiný nosič) s preparátem. Posun se provádí po ploše stolku ve dvou osách dvojitým souosým vrubovaným knoflíkem, umístěným většinou na pravé straně stolku tak, aby jej bylo možné pohodlně obsluhovat. Většinou je pohyb možné sledovat na stupnicích s milimetrovým dělením. To usnadňuje vyhledání místa na preparátu. Některé vodiče preparátů jsou upraveny k současnému uložení až dvou podložních sklíček. Povrch stolku je často vystaven působení různých chemikálií, bývá opatřen odolným nátěrem nebo volitelně keramickou vrstvou. Stolky inverzních mikroskopů jsou upraveny pro uložení velkých objektů - Petriho misek, Terasakiho komůrek nebo kultivačních lahví. Polarizační mikroskopy mají kruhové otočné stolky, opatřené stupnicí (360 ). Tubus je základním dílem stativu a vsazuje se do něho nástavec pro okuláry, vesměs výměnný a upravený pro jeden nebo dva okuláry (monokulární nebo binokulární tubus), případně s dalším optickým výstupem (trinokulární tubus). Na opačném konci je k tubusu je připevněn otočný revolverový nosič objektivů, do kterého se závitem upevňují objektivy. Optická a mechanická délka tubusu patří k základním parametrům mikroskopu. Osvětlovací soustava se skládá ze síťového transformátoru na 220V/50Hz s regulací výstupního napětí (6V nebo 12V), kterým se napájí halogenová žárovka o výkonu 20 až 100W. Mikroskopy s vyšším výkonem žárovky mají samostatnou lampovou skříňku, nutnou pro lepší odvádění tepla, která

5 se ke stativu připevňuje bajonetem. Velké mikroskopy mají v samostatné skříňce také napájecí transformátor. Regulace světelného výkonu žárovky se pak může provádět buď na tomto zdroji, nebo je přenesena do stativu (volitelné). Vzhledem k tomu, že se jen malá část výkonu žárovky promění ve světelné záření a zbytek (kolem 90%) v teplo, je nutné dbát na to, aby kolem lampové skříňky mohl volně proudit vzduch. Otočný revolverový nosič objektivů může pojmout pět až šest objektivů, které se do něj upevňují závitem. Revolverový nosič je připojen ke stativu buď trvale, nebo je výměnný. Výměnný revolver je výhodný při používání více druhů objektivů, pro metodu DIC je to podmínka (revolverový nosič pro tuto metodu musí být upraven pro zasunutí hranolů). Kondenzor. Abychom mohli osvětlení v mikroskopu účelně nastavit, je v dráze paprsků osvětlovací soustavy kondenzor, který je součástí osvětlovací soustavy mikroskopu. Rozlišovací schopnost objektivů mikroskopu může být dokonale využita jen tehdy, je-li osvětlení preparátu provedeno pomocí kondenzoru kuželem paprsků o určité nejmenší apertuře. Kondenzor je umístěn (u vzpřímených mikroskopů) pod stolkem, nesoucím preparát. Bývá většinou svisle posuvný v samostatném pomocném stolku, ze kterého jej lze snadno vyjmout. Důležité je, aby optická osa osvětlovací soustavy procházela středem kondenzoru. Toho dosáhneme přesným vystředěním jeho polohy pomocí středících šroubů. Kondenzor je opatřen irisovou clonou, ovládanou páčkou. V lepším případě se tato páčka pohybuje podél stupnice, udávající numerickou aperturu kondenzoru. Tuto hodnotu potřebujeme ke správnému nastavení. Numerická apertura kondenzoru má být vždy menší, než je apertura objektivu (přibližně 70%). Při nastavování osvětlení (včetně kondenzoru) postupujeme podle návodu, který navrhl Köhler (tzv. Köhlerovo nastavení - je popsáno dále). Základní typy kondenzorů jsou většinou podle svého konstruktéra jsou označeny jako Abbeho kondenzory, jsou vhodné pro objektivy se zvětšením od 4x až do 100x. Při použití objektivů s malým zvětšením mohou nastat potíže, protože se neosvětlí rovnoměrně celé zorné pole. Pro objektivy s malým zvětšením (2x až 0,5x) jsou k dispozici kondenzory s nízkou numerickou aperturou. Takové kondenzory se však nehodí pro objektivy s velkým zvětšením. Velmi kvalitní obraz při použití objektivů s olejovou imerzí zajišťují kondenzory pro olejovou imerzi - na ně se - podobně jako na preparát - nanese kapka imerzního oleje, takže paprsky procházejí po výstupu z kondenzoru homogenním prostředím se stejným indexem lomu. Zvláštní konstrukcí se vyznačují tzv. univerzální kondenzory. Mají vestavěný karusel, ovládaný zvenčí, do kterého jsou vloženy volitelné moduly: fázové prstence, prstenec pro tmavé pole, případně může být tento kondenzor vybaven moduly pro diferenciální interferenční nebo Hoffmanův kontrast. Vložené prstence jsou obvykle příslušné k objektivu. Pro fázový kontrast bývají označeny jako Ph1, Ph-2 atd., tyto údaje jsou též na fázových objektivech. Podobné prstence se vkládají do kondenzoru při použití Hoffmanova kontrastu. Univerzální kondenzor může být upraven pro diferenciální interferenční kontrast podle Nomarského (DIC). Karusel kondenzoru pro DIC má jinou mechanickou konstrukci, která umožňuje vkládání hranolů. Pro pozorování v tmavém poli (v zástinu) musí být kondenzor rovněž vybaven doplňkem (clonou) pro tento způsob pozorování. Inverzní mikroskopy mají optickou soustavu "vzhůru nohama", tj. objektivy jsou pod preparátem a kondenzor s osvětlovací soupravou nad ním. Zde často záleží na tom, aby mezi výstupní čočkou kondenzoru a pozorovaným preparátem byl dostatečný prostor pro manipulaci (např. pro mikromanipulátory). Proto jsou kondenzory a podobně i objektivy u inverzních mikroskopů sestrojeny tak, aby jak pozorovací vzdálenost, tak i vzdálenost mezi preparátem a kondenzorem byly delší, než je běžné. Takové optické prvky bývají označeny LWD (long working distance = dlouhá pracovní vzdálenost), ELWD (extra long working distance), případně i SLWD (super long working distance = mimořádně dlouhá pracovní vzdálenost).

6 Okuláry a tubusy Obraz v mikroskopu pozorujeme okulárem. Novější mikroskopy jsou vybaveny tubusem pro dva okuláry (binokulární tubus), takže obraz pozorujeme současně oběma očima. Obraz však u běžného mikroskopu není stereoskopický, protože se díváme přes jeden, oběma okulárům společný objektiv. Pro malá zvětšení jsou používány stereomikroskopy (preparační lupy), které pozorují obraz stereoskopicky současně dvěma samostatnými optickými systémy. Tubus se dvěma okuláry se nazývá binokulární tubus. Pro přesměrování světla do fotografického přístroje nebo televizní kamery jsou určeny tubusy s dalším výstupem, které se nazývají trinokulární tubusy. Mikroskop však může mít pro fotografický přístroj nebo televizní kameru jeden i více samostatných výstupů. Jednoduché trinokuláry dělí světelné paprsky zrcadly, lepší jsou vybavené hranoly. Poměr mezi množstvím světla, které je vedeno do okuláru a do třetího výstupu může být 100-0% a naopak nebo u lepších trinokulárů kromě toho ještě 80-20% i jiný. Okuláry jsou výměnné. Mohou být rozděleny podle optické konstrukce, podle zvětšení a podle velikosti pozorovaného obrazového pole (které je kruhové). Kritériem pro jakost okulárů je stupeň odstranění tzv. zbytkových vad: barevné vady, sklenutí a astigmatismu. Běžné okuláry mají zvětšení 10x, jsou však okuláry se zvětšením 5x, 12,5x, 15 x a jiné. Průměr zorného pole v okuláru se zmenšuje se stoupajícím zvětšením. Někdy se této veličině říká "číslo pole" - z anglického "field number" (zkratka "F.N."). Průměr zorného pole je závislý též na objektivu. Dobrý mikroskop má pro okuláry 10x průměr zorného pole kolem 20mm, velmi kvalitní mikroskopy mohou mít průměr zorného pole až 25mm. Dobré okuláry mají možnost nastavit dioptrickou korekci pro uživatele, kteří nosí brýle. Zaostření obrazu pak závisí též na nastavení dioptrických korekcí v okulárech. Binokulární tubus má vždy možnost nastavit podle tvaru hlavy uživatele vzdálenost očních pupil. To je nezbytné, mají-li se obraz, pozorovaný každým okem zvlášť, spojit do jediného obrazu. Některým uživatelům to může činit zpočátku potíže. Numerická apertura (zkratka n.a.) je součin indexu lomu prostředí mezi vstupní čočkou objektivu a preparátem (krycím sklem) a sinem poloviny otvorového úhlu objektivu. Je měřítkem pro dosažitelnou rozlišovací schopnost objektivu a tím též pro jeho zvětšení a pro světelný tok, který může objektiv zachytit. Numerická apertura je vyryta do objímky na každém objektivu dosahuje u objektivů se zvětšením 100x hodnot až 1,4. Parfokální vzdálenost je vzdálenost v milimetrech od závitu objektivu k povrchu preparátu, případně krycího skla. Má být pro všechny objektivy na jednom mikroskopu stejná, pak odpadá zaostřování při otáčení revolverovým nosičem. Pozorovací (pracovní) vzdálenost se měří od vstupní čočky objektivu k rovině preparátu (krycího skla), se stoupajícím zvětšením klesá až na zlomky milimetru. Některé objektivy mají pozorovací vzdálenost prodlouženou, označují se pak LWD nebo ELDW. Průměry pupil (vstupní / výstupní) určují numerickou aperturu a tím i jas obrazu. Jsou závislé na parfokální vzdálenosti Delší parfokální vzdálenost dovoluje vyšší numerickou aperturu.

7 Názvy objektivů se u různých výrobců liší, přesto však mají hlavní skupiny podobné názvy, popisující jejich vlastnosti. Podle toho rozeznáváme: achromáty - mají barevnou zbytkovou vadu odstraněnou jen pro dvě barvy, optimální barevná korekce je provedena pro žlutozelenou barvu, na kterou je oko nejcitlivější. Achromáty jsou nejekonomičtější objektivy, mohou však být výhodné např. při fluorescenci, protože jsou složeny z méně čoček, takže pohlcují méně ultrafialového záření. plan-objektivy, např. planachromáty, mají dokonale odstraněnou vadu sklenutí, používají se hlavně pro mikrofotografické práce. Korekce barevné vady je stejná, jako u achromátů. apochromáty - mají již provedenou korekci barevné vady pro tři základní barvy spektra. Dosahují vyšší numerické aparatury a lepšího rozlišení pozorovaných detailů. planapochromáty spojují vlastnosti apochromátů s plan-objektivy. Patří k nejlepším a k nejdražším objektivům. fluoritové objektivy, - např. plan fluory, využívají vynikajících optických vlastností fluoritového skla, které dobře propouští ultrafialové záření. Používají se hlavně pro speciální účely, např. při fluorescenční mikroskopii. Imerzní objektivy. Objektivy se dále mohou lišit tím, zda jsou suché nebo určené pro imerzi. U suchých objektivů je korekce provedena tak, že mezi objektivem a krycím sklem preparátu se předpokládá vrstva vzduchu. K imerzi se nejčastěji používá zvláštní imerzní olej, méně často voda. Imerzní olej má podobný index lomu jako sklo, takže vznikne opticky homogenní prostředí: krycí sklo imerzní olej objektiv, ve kterém objektiv zachytí maximum světla, které tvoří obraz v mikroskopu Podobný - i když slabší - účinek má vodní imerze. Index lomu vody je vyšší, než vzduchu, avšak nižší, než u imerzního oleje. Objektivy pro vodní imerzi mají význam hlavně tehdy, pozorujeme-li objekty, plovoucí ve vodě. Práce s vodní imerzí je méně náročná, objektivy není třeba pracně čistit od imerzního oleje. Objektivy pro práci bez krycího skla. Dále můžeme rozlišovat objektivy, vyžadující krycí sklo a objektivy pro práci bez krycího skla, označované NCG (no cover glass). Krycí sklo je součástí optické soustavy mikroskopu a musí mít tloušťku, na kterou jsou objektivy korigovány ( 0,17 mm). Rozdíly v tloušťce krycího skla mohou být příčinou pro snížení jakosti pozorovaného obrazu. Objektivy, korigované na práci bez krycího skla se používají hlavně v hematologii. Dokonalejší objektivy jsou vybaveny možností pro korekci na tloušťku krycího skla. Provádí se otočným prstencem na objektivu. Tato korekce má zvláštní význam u inverzních mikroskopů. Objektivy s irisovou clonou. Některé velmi kvalitní objektivy mohou být opatřeny irisovou clonou, která má podobnou funkci jako u fotografických objektivů. Vliv zaclonění objektivu mikroskopu na hloubku ostré kresby je však vzhledem k malým pozorovacím vzdálenostem velmi omezený, irisová clona se používá hlavně k omezení světelného toku objektivem. Optická délka tubusu. Objektivy jsou konstrukčně přizpůsobeny tzv. optické délce tubusu, která se může shodovat s jeho mechanickou délkou. Až donedávna byla optická (a současně i mechanická) délka tubusu u většiny mikroskopů 160mm. V posledních letech se vyrábějí mikroskopy s nekonečnou délkou tubusu, které mají četné výhody. Objektivy pro délku tubusu 160 mm nelze používat u mikroskopů s nekonečnou délkou tubusu a naopak. Odpružené objektivy. Výstupní čočka objektivů s velkým zvětšením je při zaostření na preparát velmi blízko krycímu sklu a může dojít k mechanickému dotyku. Proto jsou objektivy s velkým zvětšením vybaveny pružným uložením vstupní čočky, která se při dotyku krycího skla částečně zasune do pouzdra, čímž je objektiv chráněn před poškozením. Takovým objektivům se říká odpružené, zpravidla v literatuře nesou označení S (Spring).

8 Druhy čoček Paprsek, dopadající na libovolné místo povrchu čočky se uvnitř čočky láme podle Snellova zákona a podle stejného zákona se lomí na protilehlém povrchu. Kromě toho se malá část světla odráží zpět. Čočky jsou většinou kulové, tj. alespoň jeden jejich povrch je tvořen částí kulové plochy. Ve zvláštních případech se používají čočky jiných tvarů, viz níže. Základní dělení čoček vychází z toho, jak působí na prošlý rovnoběžný (kolimovaný) optický svazek. Spojné čočky neboli spojky mění svazek na sbíhavý, takže paprsky se za nimi protínají v bodě označovaném jako ohnisko. Vzniká tak skutečný obraz předmětu před čočkou. Naproti tomu rozptylné čočky neboli rozptylky svazek mění na rozbíhavý, který zdánlivě vychází z ohniska před čočkou vytvářejí zdánlivý obraz. Spojky jsou vždy uprostřed silnější než na okrajích a mají vždy jeden vypuklý povrch; dále se dělí na: dvojvypuklé druhý povrch je také vypuklý ploskovypuklé druhý povrch je rovinný dutovypuklé druhý povrch je dutý. Rozptylky jsou naopak uprostřed tenčí než na okrajích a mají jeden povrch dutý. Podle tvaru druhého povrchu se dělí na: dvojduté druhý povrch je také dutý ploskoduté druhý povrch je rovinný vypukloduté druhý povrch je vypuklý. Čočky jiných tvarů Existují také čočky, které mají jiný tvar povrchu, než je kulová výseč: válcová neboli cylindrická čočka - aspoň jeden její povrch je tvořen částí válce; taková čočka ovlivňuje chod paprsků jen v rovině kolmé na osu tohoto válce, zatímco v rovině určené směrem paprsku a osou válce není sbíhavost ovlivněna. Používá se mj. ke korekci některých vad zraku. multifokální čočka - má v různých místech různou ohniskovou vzdálenost, používá se u multifokálních brýlí. Fresnelova čočka - je to plochá čočka vzniklá rastrováním obvyklé kulové nebo válcové čočky asférická čočka - je rotačně symetrická ale má jiný, než kulový tvar. Speciálně navržené tvary takovýchto čoček umožnily například konstrukci nových druhů fotografických objektivů a astronomických přístrojů. Používá se u kontaktních čoček, je též vhodná pro korekci některých forem astigmatismu. toroidní čočka - ve dvou navzájem kolmých rovinách má jiné zakřivení, takže v každé z nich ovlivňuje sbíhavost paprsků jinak. Lze ji použít pro korekci astigmatismu.

9 1. Teorie mikroskopových metod A) Mezi první mikroskopové metody patřilo barvení biologických preparátů vhodnými barvivy, což způsobilo ovlivnění amplitudy světla prošlého preparátem, který pak byl snadno pozorovatelný a jeho jednotlivé struktury byly vzájemně barevně rozlišeny. Nevýhodou tohoto způsobu bylo to, že při procesu barvení byly biologické preparáty většinou usmrceny. B) Pozorování v tmavém poli (v zástinu): Při pozorování v tmavém poli je z obrazu vyloučeno světlo, které by dopadalo přímo do objektivu. Princip metody spočívá v tom, že předmět je osvětlen pomocí kondenzoru se clonou ve tvaru mezikruží (která se nachází v jeho předmětové ohniskové rovině) tak, že numerická apertura světelného svazku vystupujícího z kondenzoru je větší než numerická apertura mikroskopového objektivu použitého k pozorování daného předmětu (kondenzor je centrálně zacloněn). Do objektivu se tedy dostane jen to světlo, které je rozptýleno předmětem. Předmět se pak jeví jako svítící na tmavém pozadí a je dobře viditelný. Pro tuto metodu jsou využívány speciální kondenzory (paraboloidní nebo kardioidní), které se zasunou na místo normálního kondenzoru. Pro suché objektivy s numerickou aperturou do 0,65 není třeba zvláštních kondenzorů pro tmavé pole, stačí zastínit výstupní čočku kondenzoru clonou pro tmavé pole, která je ve volitelné výbavě mikroskopu. Protože se při tomto pozorování využívá jen zlomku světlené intenzity zdroje, má mít tento zdroj dostatečný výkon. Z hlediska světelné optiky je důležité, že při pozorování v tmavém poli září na tmavém podkladě ty části objektu, na kterých dochází ve vlastnostech světla k dostatečnému rozdílu při průchodu pozorovaným objektem, jako např. na hranách. Při tvorbě obrazu v tmavém poli nemají význam rozdíly v indexu lomu, které jsou naopak podstatné při pozorování ve fázovém kontrastu, jehož princip uveřejnil holandský fyzik Frederik Zernike již v roce C) Metodou obdobnou metodě temného pole je metoda vícebarevného osvětlení, jejíž princip spočívá v tom, že do předmětové ohniskové roviny kondenzoru umístíme clonku např. ve tvaru mezikruží, kde střední část obsahuje filtr propouštějící světlo určité barvy (např. zelený filtr) a vnější část obsahuje filtr propouštějící světlo jiné barvy (např. červený filtr). Předmět se pak jeví červeně zabarvený na zeleném pozadí. Průměr středního filtru musí být zvolen analogicky jako u metody temného pole. D) Metoda šikmého osvětlení je další metodou, která nám umožňuje zkontrastnit pozorovaný předmět. Její princip spočívá v tom, že do předmětové ohniskové roviny kondenzoru umístíme clonku s kruhovým otvorem vhodného průměru, jehož střed leží mimo optickou osu kondenzoru a kterou lze volně otáčet. Na předmět pak z kondenzoru dopadá šikmý svazek pod určitým směrem, což má pro pozorovatele ten efekt, že se mu předmět jeví plasticky a je dobře viditelný. Vhodným natočením clonky a vhodnou volbou průměru otvoru v clonce lze tento efekt optimalizovat pro daný předmět. Tuto metodu lze snadno realizovat u mikroskopů opatřených tzv. velkým Abbeho osvětlovacím aparátem (kondenzor doplněný vysunovací irisovou clonou).

10 E) Pozorování ve fázovém kontrastu Po průchodu preparátem se světlo mění dvěma způsoby: změna amplitudy procházejícího světla nám zprostředkuje vnímání detailů kontrastů jak intenzity, tak i barev. Výsledný vjem je běžný kontrastní barevný obraz. Změna fáze světla, která nastává při průchodu objektem, není zrakem přímo viditelná. Nemá-li tedy objekt detaily lišící se kontrastem, je pro lidský zrak průhledný, čirý. U řady biologických objektů tyto vlastnosti převažují a proto je zrakem obtížně identifikujeme. Mikroskop vybavený pro pozorování ve fázovém kontrastu nám umožňuje pozorovat i takové objekty, které způsobují jen fázový posun světla. Hlubší poznatky o tomto principu jsou součástí fyzikální optiky. Mikroskop pro pozorování ve fázovém kontrastu musí být pro tuto metodu patřičně vybaven. Potřebujeme objektivy pro fázový kontrast a kondenzor pro fázový kontrast. Oba tyto optické díly jsou opatřeny tzv. fázovými prstenci. U objektivů jsou jejich trvalou částí, u kondenzoru jsou používány podle potřeby. Objektivy pro fázový kontrast mají na jedné ze svých čoček nanesený neprůhledný "fázový" prstenec, na kterém nastává posun fáze světelné vlny. Objektivy pro fázový kontrast mohou sloužit též pro pozorování bez fázového kontrastu, avšak prstenec v objektivu způsobuje v tomto případě mírné snížení jakosti (a světelnosti) obrazu - udává se přibližně 10 %. U objektivu s malým zvětšením se však toto zhoršení prakticky neprojevuje. Fázový kontrast je značně závislý na seřízení mikroskopu. K tomu se dodává účelná pomůcka, tzv. středící (centrovací) dalekohled. Ten se nasadí místo jednoho okuláru a pak pozorujeme polohu fázových prstenců, které můžeme vystředit pomocí nastavovacích prvků. Přesný postup je v návodu ke každému mikroskopu, nicméně vyžaduje trochu zkušeností. Je běžné používat pro světlé pole a fázový kontrast společné objektivy až do zvětšení 40x, pro vyšší zvětšení je téměř nutné používat pro každou metodu jednoúčelový objektiv. Pro získání výraznějších výsledků se někdy pro plně profesionální využití navíc zhotovují fázové vrstvy částečně absorbující (v průhledu se jeví šedě). Užitím takové vrstvy dosáhneme vedle změny fáze, navíc i změnu amplitudy vlnění, což dává zvláště při pozitivním fázovém kontrastu možnost pozorovat i ty nejméně odlišné detaily preparátů Apodizovaný FK. Optické schéma fázového kontrastu Obraz preparátu získaný pomocí klasického fázového kontrastu neumožňuje kvůli halaci pozorování detailů uvnitř živých buněk. Naopak u apodizovaného fázového kontrastu jsou ztlumeny okraje velkých objektů, čímž je halace redukována, což zvyšuje kontrast struktur uvnitř buňky.

11 F) Fluorescenční mikroskopie Fluorescenční mikroskopie se dělí na dvě metody: pozorování v odraženém světle (epifluorescence) a pozorování v procházejícím světle (diafluorescence). Fluorescenční pozorování v procházejícím světle se v současné době téměř nepoužívá, pod pojmem fluorescence budeme rozumět výhradně pozorování odraženého fluorescenčního světla, tj. epifluorescenci. Jedná se o jev spočívající v tom, že některé látky (fluorofory) po ozáření (excitaci) světlem určité vlnové délky λexcit vyzařují (emitují) světlo jiné vlnové délky λemit > λexcit. Podstatou fluorescence je tedy buzení viditelného záření v objektech, které obsahují chemické sloučeniny (fluorochromy), schopné specificky měnit dopadající ultrafialové záření na odražené barevné viditelné záření. Některé biologické objekty již takové sloučeniny samy obsahují (např. chlorofyl), jiným je musíme dodávat specifickým barvením. Takové preparáty jsou však často zdrojem viditelného záření pouze dočasně. Zdroj světla λemit λexci Na obrázku výše je ukázán princip optických přístrojů využívajících fluorescence světla. Ze zdroje světla je pomocí tzv. excitačního filtru propuštěno pouze světlo určité vlnové délky λexci, které dopadá na vyšetřovaný vzorek. Zde dochází k fluorescenci, přičemž vzorek emituje světlo o vlnové délce λemit > λexcit. Pomocí tzv. bariérového filtru je do oka pozorovatele propuštěno jen světlo emitované vzorkem a oko vidí jen ty části vzorku, které emitují světlo o vlnové délce λemit. Pro fluorescenci potřebujeme samostatnou osvětlovací soustavu. Jednak musí světlo dopadat na objekt (podstata epifluorescence) a za druhé musí mít určitou vlnovou délku, často z oblasti ultrafialového záření. Výbava mikroskopu pro fluorescenci se skládá ze zdroje záření, nástavce pro osvětlení dopadajícím světlem, držáku s výměnnými fluorescenčními filtry a ochranného oranžového štítu. Zdrojem záření je téměř vždy vysokotlaká rtuťová výbojka (Hg). Výbojka je napájená ze sítě přes samostatný zdroj ze sítě 230V/50Hz, obecně zvaný startér. Je umístěna v lampové skříňce, která souvisí s nástavcem pro osvětlení dopadajícím světlem. Tyto díly je nutné stavebnicově vsadit do stativu mikroskopu, současně s držákem fluorescenčních filtrů. Výbojku v lampové skříňce je nutné vystředit a zaostřit tak, aby její světelný tok při dopadu na preparát byl maximální. To se provádí pomocí kolektorové čočky a středících šroubů na lampové skříňce při pozorování obrazu výboje ve středící pomůcce, která se upevní místo jednoho objektivu v revolverovém nosiči. Dokonalé vystředění výbojky je podmínkou pro dobrý výsledek a je nutné

12 jej občas překontrolovat. Výbojka má životnost kolem 200h, délka jejího života se měří hodinovým počitadlem na startéru. Život výbojky může být i delší, po překročení mezní doby nehrozí imploze, avšak uvnitř výbojky se usazuje kovový nálet, který snižuje její světelný výkon. Důležitou součástí fluorescenční výbavy jsou fluorescenční filtry. Fluorescenční filtr je obvykle vyroben jako kostka, která se skládá z excitačního filtru, barierového filtru a dichroického zrcadla. Filtry se od sebe liší vlnovými délkami, které vymezují pásma propustnosti excitačního a barierového filtru. Dichroické zrcadlo odráží přednostně krátkovlnné záření na preparát a propouští dlouhovlnné "fluorescenční" záření do okuláru. Pro praxi je důležité, že ke každému fluorescenčnímu barvivu je nutné přiřadit určitý fluorescenční filtr (mluvíme o jednom filtru, ačkoliv jde o soustavu dvou filtrů a zrcadla v kostce). Výrobci nabízejí množství různých filtrů, některé z nich jsou i vícepásmové. Běžné filtry jsou označeny písmenem, určujícím barevnou oblast světla (B = modrá, G = zelená), ve které pracují. Čísla v označení pak charakterizují pásma vlnových délek pro barierový a excitační filtr, případně pro dichriocké zrcadlo. Volba správného filtru je podstatnou podmínkou pro úspěšnou metodiku fluorescenční mikroskopie. Epifluorescence spočívá ve vertikálním fluorescenčním osvětlení excitačním světlem o požadované vlnové délce. Objekt je pozorován přes objektiv, světlo dopadá shora přes excitační filtr a dichronické zrcadlo, obraz předmětu je pozorován přes emisní filtr. Dichronické zrcadlo odráží excitační světlo o určité vlnové délce směrem do vzorku a propouští ostatní vlnové délky. Bariérový filtr umístěný mezi objektiv a okulár blokuje nechtěné vlnové délky, čímž poskytuje černé pozadí k fluorescenčnímu obrazu. G) Pozorování v polarizovaném světle. Mikroskop může též sloužit pro pozorování v polarizovaném světle. Tato metoda pokud se používá pro kvantitativní stanovení polarizačního úhlu vyžaduje speciální okuláry a objektivy, které nemají vlastní polarizační účinky (bez vnitřního pnutí). Mikroskop musí být doplněn o polarizátor a analyzátor, může být vybaven kruhovým otočným stolkem se stupnicí. Kvalitativní polarizace v procházejícím světle se provádí s běžnými objektivy a s jednoduchou výbavou. K polarizačním mikroskopům se užívají kruhové stolky. Barevné a neutrální filtry. Součástí osvětlovací soustavy jsou filtry, které se vkládají do dráhy světla. Mohou se pokládat na výstupní čočku osvětlovací soustavy ve stativu mikroskopu, nasazovat na kondenzor nebo jsou uloženy ve stativu a vkládány pomocnými mechanizmy (páčkou apod.). Filtry můžeme rozdělit na pestré (barevné) a nepestré (neutrálně šedé). Barevné filtry mění chromatičnost pozorovaného obrazu. Běžný je modrý filtr, používaný při pozorování i při fotografické dokumentaci (označený běžně jako filtr pro "denní světlo") a zelený interferenční filtr (označovaný zkratkou "GIF"), velmi prospěšný při pozorování ve fázovém kontrastu. Nepestré - neutrálně šedé filtry slouží k zeslabení intenzity osvětlení (podobně jako "polní" clona), přitom se však nemění chromatičnost. Kromě těchto filtrů se v některých případech používají také filtry, absorbující tepelné záření.